Behawioralna ocena funkcji wzrokowych poprzez reakcję optomotoryczną i funkcję poznawczą za pomocą labiryntu Y u szczurów z cukrzycą

Summary

Zwyrodnienie neuronów zarówno w oczach, jak i mózgu w wyniku cukrzycy można zaobserwować dzięki testom behawioralnym przeprowadzonym na gryzoniach. Labirynt Y, miara poznania przestrzennego, i odpowiedź optomotoryczna, miara funkcji wzrokowych, zapewniają wgląd w potencjalne diagnozy i leczenie.

Abstract

Odpowiedź optomotoryczna i labirynt Y są testami behawioralnymi przydatnymi do oceny funkcji wzrokowych i poznawczych. Odpowiedź optomotoryczna jest cennym narzędziem do śledzenia zmian progów częstotliwości przestrzennej (SF) i wrażliwości na kontrast (CS) w czasie w wielu modelach chorób siatkówki, w tym retinopatii cukrzycowej. Podobnie, labirynt Y może być używany do monitorowania poznania przestrzennego (mierzonego spontaniczną naprzemiennością) i zachowań eksploracyjnych (mierzonych liczbą wpisów) w wielu modelach chorób, które wpływają na ośrodkowy układ nerwowy. Zalety odpowiedzi optomotorycznej i labiryntu Y obejmują czułość, szybkość testowania, wykorzystanie reakcji wrodzonych (trening nie jest potrzebny) oraz możliwość wykonania na wybudzonych (nieznieczulonych) zwierzętach. Opisano tu protokoły zarówno dla odpowiedzi optomotorycznej, jak i labiryntu Y, a przykłady ich zastosowania pokazano w modelach cukrzycy typu I i typu II. Metody obejmują przygotowanie gryzoni i sprzętu, wykonanie odpowiedzi optomotorycznej i labiryntu Y oraz analizę danych po teście.

Introduction

Ponad 463 miliony ludzi żyje z cukrzycą, co czyni ją jedną z największych globalnych epidemii chorób¹. Jednym z poważnych powikłań wynikających z cukrzycy jest retinopatia cukrzycowa (DR), główna przyczyna ślepoty u dorosłych Amerykanów w wieku produkcyjnym². Przewiduje się, że w ciągu najbliższych 30 lat odsetek populacji zagrożonej DR podwoi się, dlatego tak ważne jest znalezienie nowych sposobów diagnozowania DR we wcześniejszych stadiach, aby zapobiec i złagodzić rozwój DR³. Tradycyjnie uważa się, że DR jest chorobą naczyniową^4,5,6. Jednak teraz, gdy istnieją dowody na dysfunkcję neuronów i apoptozę w siatkówce, która poprzedza patologię naczyniową, DR definiuje się jako składnik neuronalny i naczyniowy^4,5,6,7,8,9. Jednym ze sposobów diagnozowania DR byłoby zbadanie nieprawidłowości neuronalnych w siatkówce, tkance, która może być bardziej podatna na stres oksydacyjny i obciążenie metaboliczne spowodowane cukrzycą niż inne tkanki nerwowe¹⁰.

Spadki funkcji poznawczych i motorycznych występują również w przypadku cukrzycy i często są skorelowane ze zmianami w siatkówce. Starsze osoby z cukrzycą typu II wykazują gorszą wyjściową wydajność poznawczą i wykazują bardziej nasilony spadek funkcji poznawczych niż uczestnicy z grupy kontrolnej¹¹. Dodatkowo, siatkówka została uznana za przedłużenie ośrodkowego układu nerwowego, a patologie mogą objawiać się w siatkówce¹². Klinicznie związek między siatkówką a mózgiem był badany w kontekście choroby Alzheimera i innych chorób, ale nie jest powszechnie badany w przypadku cukrzycy^{12,13,14,15,16}. Zmiany w mózgu i siatkówce podczas progresji cukrzycy można badać za pomocą modeli zwierzęcych, w tym szczura STZ (model cukrzycy typu I, w którym toksyna, streptozotocyna lub STZ, jest używana do uszkodzenia komórek beta trzustki) i szczura Goto-Kakizaki (poligenowy model cukrzycy typu II, w którym zwierzęta rozwijają hiperglikemię spontanicznie w wieku około 3 tygodni). W tym protokole przedstawiono opis labiryntu Y i odpowiedzi optomotorycznej w celu oceny odpowiednio zmian poznawczych i wizualnych u gryzoni z cukrzycą. Odpowiedź optomotoryczna (OMR) ocenia częstotliwość przestrzenną (podobną do ostrości wzroku) i wrażliwość na kontrast poprzez monitorowanie charakterystycznych odruchowych ruchów głowy w celu zmierzenia progów wzrokowych dla każdego oka¹⁷. Częstotliwość przestrzenna odnosi się do grubości lub stopnia rozdrobnienia pasków, a wrażliwość na kontrast odnosi się do stopnia kontrastu między paskami a tłem (Rysunek 1E). Tymczasem labirynt Y testuje krótkotrwałą pamięć przestrzenną i funkcję eksploracyjną, obserwowaną poprzez spontaniczne przemiany i wejścia przez ramiona labiryntu.

Oba testy mogą być wykonywane na przytomnych, nieznieczulonych zwierzętach i mają tę zaletę, że wykorzystują wrodzone reakcje zwierząt, co oznacza, że nie wymagają treningu. Oba są stosunkowo czułe, ponieważ mogą być używane do wykrywania deficytów na wczesnym etapie rozwoju cukrzycy u gryzoni i niezawodne, ponieważ dają wyniki, które korelują z innymi testami wzrokowymi, siatkówkowymi lub behawioralnymi. Dodatkowo, korzystanie z OMR i Y-maze w połączeniu z testami, takimi jak elektroretinogram i skany optycznej koherentnej tomografii, może dostarczyć informacji o tym, kiedy zmiany siatkówkowe, strukturalne i poznawcze rozwijają się względem siebie w modelach choroby. Badania te mogą być przydatne w identyfikacji zwyrodnień neuronalnych, które występują z powodu cukrzycy. Ostatecznie może to doprowadzić do opracowania nowych metod diagnostycznych, które skutecznie identyfikują DR we wczesnych stadiach progresji.

Systemy OMR i Y-maze użyte do opracowania tego protokołu są opisane w Tabeli Materiałów. Poprzednie badania nad OMR, przeprowadzone przez Prusky et al.¹⁸, oraz Y-maze, autorstwa Maurice et al.¹⁹, zostały wykorzystane jako punkt wyjścia do opracowania tego protokołu.

Protocol

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee i są zgodne z przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (NIH Publications, 8^th edition, updated 2011).

1. Odpowiedź optomotoryczna (OMR)

1. Konfiguracja aparatury OMR (szczegóły dotyczące aparatury i oprogramowania w Tabeli materiałów)
   1. Wybierz platformę o odpowiedniej wielkości dla gryzonia: mysz, szczur lub duży/upośledzony szczur (Rysunek 1A).
   2. Otwórz oprogramowanie OMR, które powinno otworzyć się w oknie z kilkoma zakładkami opcji i obrazem wideo na żywo z wnętrza OMR/wirtualnego bębna (Rysunek 1B). W razie potrzeby przybliż lub pomniejsz za pomocą kamery wideo, aby platforma i jej otoczenie były widoczne.
   3. Zwróć uwagę na ikony po lewej stronie obrazu na żywo (Rysunek 1C). Kliknij ikonę gwiazdki i ikonę obracających się pasków, aby zarówno zielona gwiazdka, jak i zielone obracające się paski zniknęły z kanału na żywo.
   4. Kliknij ikonę kompasu, aby pojawiło się zielone kółko i dwie prostopadłe linie. Rozciągnij zielone kółko tak, aby idealnie pokrywało się z czarnym okręgiem na platformie, co zapewni, że OMR będzie idealnie wyrównany.
   5. Kliknij ikonę kompasu, ponieważ nie jest konieczne, aby widzieć okrąg podczas testowania. Kliknij ikonę zielonej gwiazdki i zieloną ikonę obracających się pasków, aby pojawiły się ponownie. Zwróć uwagę, że zielone paski obracają się w tym samym kierunku, co paski w bębnie, co pozwala badaczowi poznać kierunek pasków.
   6. Kliknij zakładkę Testowanie. W sekcji Testowanie kliknij zakładkę Psychofizyka. W obszarze Próg wybierz opcję Częstotliwość, aby zmierzyć częstotliwość przestrzenną.
      UWAGA: Oprogramowanie OMR wykorzystuje paradygmat klatki schodowej do automatycznego obliczania częstotliwości przestrzennej (SF). Kontrast zostanie utrzymany na poziomie 100%.
   7. W sekcji Testing (Testowanie) kliknij zakładkę Presets (Ustawienia wstępne). Wybierz ustawienia domyślne dla Mouse¹⁸ lub Rat²⁰.
   8. W obszarze Testing (Testowanie) kliknij kartę Blanking (Wygaszanie). Zaznacz pole Puste przy śledzeniu, które spowoduje wstrzymanie pasków/wygaszenie ekranów komputera w bębnie za każdym razem, gdy mysz zostanie kliknięta prawym przyciskiem myszy.
   9. Kliknij w zakładkę Wyniki, w której zostaną wyświetlone wyniki testu.
2. Ocena częstotliwości przestrzennej
   1. Umieść gryzonia na okrągłej platformie w środku komory wirtualnej rzeczywistości, składającej się z czterech monitorów komputerowych pokazujących pionowe siatki fal sinusoidalnych okrążających komorę z prędkością 12°/s (Rysunek 1D).
   2. Zwróć uwagę, że kamera wideo umieszczona w górnej części komory wyświetla zachowanie gryzonia na żywo na monitorze komputera.
   3. Poszukaj obecności lub braku odruchowych działań głowy gryzonia, gdy siatki poruszają się w kierunku zgodnym lub przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Upewnij się, że w programie widoczne są ilustrowane pręty - pokażą one kierunek ruchu kraty.
      1. Uważaj, aby głowa gryzonia poruszała się w tym samym kierunku co kraty. Poczekaj, aż nastąpi płynny pościg, a nie chaotyczne ruchy głowy, aby zaliczyć to jako śledzenie.
      2. Kliknij odpowiednio Tak lub Nie. Zauważ, że SF zaczyna się od 0,042/deg i dostosowuje się z każdym tak i nie, aby stać się łatwiejszym lub trudniejszym (Rysunek 1E). Kliknij Resetuj, jeśli test musi zostać zresetowany z powodu przypadkowego lub nieprawidłowego kliknięcia tak i nie.
   4. Podczas testowania gryzonia upewnij się, że gwiazdka jest umieszczona nad głową gryzonia.
      UWAGA: Ma to dwa skutki: 1) Utrzymuje prawidłową częstotliwość przestrzenną. Jeśli na przykład gwiazdka zostanie umieszczona między ramionami, częstotliwość przestrzenna będzie niższa, a słupki będą lepiej widoczne, co spowoduje fałszywie wysoki wynik. 2) W przypadku gryzoni z niewielkimi ruchami głowy gwiazdka ułatwia ocenę, czy głowa rzeczywiście się porusza.
   5. Obserwuj, czy system powie "Gotowe", gdy zostanie osiągnięta częstotliwość przestrzenna gryzonia. Pamiętaj, że przycisków Tak i Nie będzie już można kliknąć.
   6. Kliknij kartę Wyniki, która wyświetli częstotliwość przestrzenną dla lewego oka, prawego oka i połączonych oczu.
      UWAGA: Czasami oprogramowanie jest ustawione w taki sposób, że wyniki są odwrócone, tj. prawe oko jest zgłaszane jako lewe oko, a lewe oko jest zgłaszane jako prawe oko. Odkryto to podczas oceny gryzoni, które miały tylko jedno oko uszkodzone w modelu jaskry.
3. Oceń czułość na kontrast
   UWAGA: Badanie wrażliwości na kontrast można przeprowadzić natychmiast po etapie pomiaru częstotliwości przestrzennej lub samodzielnie tego samego dnia lub innego dnia, jeśli gryzoń wydaje się zmęczony po badaniu częstotliwości przestrzennej (wykonaj kroki 1–2.2, jeśli testujesz tylko wrażliwość na kontrast).
   1. Kliknij zakładkę Testowanie, a następnie zakładkę Psychofizyka. W obszarze Próg wybierz opcję Kontrast (pojedynczy), aby zmierzyć czułość kontrastu.
   2. Również korzystając z paradygmatu schodów, rozpocznij siatki ze stałą SF na szczycie krzywej czułości kontrastu (CS). Aby to zrobić, kliknij zakładkę Bodziec, a następnie zakładkę Kraty. W polu Częstotliwość przestrzenna wpisz 0,064 dla szczurów i 0,103 dla myszy.
   3. Rozpocznij kontrast od 100% i poszukaj tych samych odruchowych ruchów głowy, które widać podczas testowania częstotliwości przestrzennych. Należy pamiętać, że kontrast będzie się zmniejszał wraz z postępem testów, aż do momentu, gdy gryzoń nie będzie już miał odruchowych ruchów głowy w odpowiedzi na bodziec (Rysunek 1E).
   4. Uważaj, czy system powie "Gotowe", a przyciski Tak i Nie będą już klikalne, gdy gryzoń przestanie reagować na bodziec wizualny i zostanie osiągnięty próg czułości kontrastu. Kliknij kartę Wyniki, na której zostanie wyświetlona lista czułości kontrastu dla lewego oka, prawego oka i połączonych oczu.
4. Przeprowadzanie analizy po testach
   1. W przypadku badań nad retinopatią cukrzycową, w których oczekuje się, że oba oczy będą miały podobne deficyty, do analizy należy użyć łącznego wyniku (średnia z prawego i lewego oka). W przypadku modeli, które powodują różnicowe uszkodzenie oczu (np. uraz spowodowany wybuchem lub jaskra), należy oddzielić dane dotyczące lewego i prawego oka.
   2. W przypadku częstotliwości przestrzennej użyj surowych wyników (danych z karty Wyniki) do analizy i zsumuj te wyniki razem według grup (np. z cukrzycą, grupą kontrolną itp.).
   3. W polu Czułość kontrastu użyj wartości RAW, aby obliczyć zgłoszoną czułość kontrastu na podstawie kontrastu Michelsona na podstawie poprzedniego pomiaru luminancji ekranu.

2. Labirynt Y

1. Przygotuj gryzonie do testów
   1. Przystosować gryzonie do pomieszczenia na 30 minut przed badaniem.
      UWAGA: Badacz może pozostać w pomieszczeniu przy włączonym świetle, ale w tym czasie powinien zachować ciszę.
   2. Wyczyść labirynt Y roztworem odkażającym bezpiecznym dla zwierząt i wytrzyj cały roztwór odkażający ręcznikami papierowymi. Upewnij się, że labirynt jest suchy.
2. Przeprowadź labirynt Y
   1. Oznacz początkowe ramię labiryntu Y jako B, a pozostałe 2 ramiona jako A i C (Rysunek 2A). Umieść jednego gryzonia w ramieniu znajdującym się najbliżej badacza (ramię B) w pobliżu środka labiryntu Y. Po umieszczeniu gryzonia uruchom odliczanie (szczegóły dotyczące labiryntu i timera w Tabeli Materiałów).
      1. Pozwól każdemu gryzoniowi eksplorować labirynt Y przez 8 minut. W tym czasie rób nagrania i notuj wszelkie obserwacje. Usiądź kilka stóp od labiryntu, trzymając go w zasięgu wzroku i unikając hałasu.
      2. Zapisz lokalizację początkową jako A, a za każdym razem, gdy gryzoń wchodzi do nowego ramienia, zapisz nową lokalizację gryzonia (Rysunek 2B). Zdefiniuj wpis jako wszystkie cztery kończyny gryzonia znajdujące się w jednym z ramion.
      3. Uważaj, czy gryzonie nie chowają się i pozostają nieruchome w jednym ramieniu labiryntu. Jeśli gryzoń pozostaje w tym samym miejscu przez ponad 60 sekund i nie wydaje się wykazywać zachowań eksploracyjnych, przesuń gryzonia w kierunku środka labiryntu Y i kontynuuj próbę.
   2. Po każdym gryzoniu usuń wszelkie odchody i wyczyść labirynt roztworem odkażającym.
      1. Upewnij się, że cały roztwór odkażający został wytarty ręcznikami papierowymi, a labirynt jest całkowicie suchy przed umieszczeniem następnego gryzonia w labiryncie.
3. Obliczanie spontanicznej przemiany i zachowań eksploracyjnych
   1. Oblicz zachowanie eksploracyjne jako całkowitą liczbę wpisów dokonanych w ciągu 8 minut.
   2. Obliczać poznanie przestrzenne mierzone spontaniczną przemianą:
      liczba udanych zmian/(łączna liczba wpisów - 2)
      1. Zdefiniuj udaną przemianę, gdy gryzoń przemieszcza się kolejno do trzech różnych lokalizacji (przykład: ABC, CAB, BCA itp.). Zwróć uwagę na każdą udaną przemianę (Rysunek 2B).
      2. Jeśli ruchy zostały zarejestrowane jako ACABCABABCABC, przy obliczaniu spontanicznej przemiany należy pominąć dwie początkowe lokalizacje początkowe (tak, aby w mianowniku było 11 ruchów). Policz liczbę dokładnych ruchów (dokładne ruchy = 8). Oblicz procentową dokładność jako: 8/(13 - 2) = 72,7%.

Results

OMR jest uważany za udany, jeśli można uzyskać od gryzonia progi częstotliwości przestrzennej i wrażliwości na kontrast. W tym przypadku zastosowanie OMR do oceny częstości przestrzennej jest zilustrowane na przykładzie naiwnych szczurów kontrolnych Brown-Norway i Long-Evans, zarówno młodych (3-6 miesięcy), jak i w wieku (9-12 miesięcy). Szczury brunatno-norweskie zazwyczaj wykazują wyższą wyjściową częstotliwość przestrzenną niż szczury Long-Evans. Dodatkowo zaobserwowano wpływ starzenia się na częstotliwość przestrzenn...

Discussion

OMR i Y-maze pozwalają na nieinwazyjną ocenę deficytów funkcji wzrokowych i poznawczych u gryzoni w czasie. W tym protokole wykazano, że OMR i labirynt Y śledzą deficyty wzrokowe i poznawcze w modelach cukrzycy u gryzoni.

Krytyczne kroki w protokole

W ramach projektu OMR

Niektóre ważne punkty, które należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania OMR w celu oceny funkcji wzrokowej, to zastosowane parametry testowe, projekt eks...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
OptoMotry HD	CerebralMechanics Inc.		Aparatura i oprogramowanie OMR
Timer	Thomas Scientific	810029AR
Aparat Y-Maze	San Diego Instruments	7001-043	Dostępny specjalnie dla szczurów