Artykuł metodologiczny

Niekodujący mały RNA MicC przyczynia się do zjadliwości białek błony zewnętrznej w Salmonella enteritidis

DOI:

10.3791/61808

⸱

27 stycznia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, 2Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, 3Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Agricultural Vocational College

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System rekombinacji za pośrednictwem λ-czerwieni został użyty do stworzenia mutanta delecji małego niekodującego RNA micC.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niekodujące małe RNA (sRNA) to nowy czynnik regulujący ekspresję genów na poziomie posttranskrypcyjnym. Rodzaj sRNA MicC, znany z Escherichia coli i Salmonella Typhimurium, może hamować ekspresję białek błony zewnętrznej. Aby dokładniej zbadać funkcję regulacyjną micC w Salmonella Enteritidis, sklonowaliśmy gen micC w szczepie Salmonella Enteritidis 50336, a następnie skonstruowaliśmy zmutowany 50336ΔmicC za pomocą systemu rekombinacji λ opartego na czerwieni i uzupełnionego mutanta 50336ΔmicC / pmicC przenoszącego rekombinowany plazmid pBR322 eksprymujący micC. Wyniki qRT-PCR wykazały, że transkrypcja ompD w 50336ΔmicC była 1,3-krotnie wyższa niż w szczepie typu dzikiego, podczas gdy transkrypcja ompA i ompC w 50336ΔmicC była 2,2-krotnie i 3-krotnie wyższa niż w szczepie typu dzikiego. Wykazały one, że micC hamuje ekspresję ompA i ompC. W poniższym badaniu patogenność 50336ΔmicC wykryto zarówno u zakażonych 6-tygodniowych myszy Balb/c, jak i 1-dniowych kurczaków. Wynik wykazał, że LD50 szczepu typu dzikiego 50336, mutanty 50336ΔmicC i 50336ΔmicC/pmicC dla 6-tygodniowych myszy Balb/c wynosiły odpowiednio 12,59 CFU, 5,01 CFU i 19,95 CFU. LD50 szczepów dla kurcząt jednodniowych wynosiły odpowiednio 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 108 CFU i 2,54 x 108 CFU. Wykazano, że delecja micC zwiększa zjadliwość S. Enteritidis u myszy i kurczaków poprzez regulację ekspresji białek błony zewnętrznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niekodujące małe RNA (sRNA) mają długość 40-400 nukleotydów, które zazwyczaj nie kodują białek, ale mogą być transkrybowane niezależnie w chromosomach bakteryjnych1,2,3. Większość sRNA jest kodowana w regionach międzygenowych (IGR) między regionami kodującymi geny i oddziałuje z docelowymi mRNA poprzez działania parowania zasad i reguluje ekspresję docelowych genów na poziomie potranskrypcyjnym4,5. Odgrywają ważną rolę regulacyjną w metabolizmie substancji, syntezie białek błony zewnętrznej, wyczuwaniu kworum i ekspresji genów wirulencji5.

MicC to 109-nukleotydowy mały transkrypt RNA obecny w Escherichia coli i serowar Salmonella enterica Typhimurium, który może regulować ekspresję wielu białek błony zewnętrznej, takich jak OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 i Omp366,7,8,9. MicC reguluje ekspresję OmpC poprzez hamowanie wiązania rybosomów z liderem mRNA ompC in vitro i wymaga chaperonu RNA Hfq do swojej funkcji w Escherichia coli6. W Salmonella Typhimurium MicC wycisza mRNA ompD za pośrednictwem dupleksu RNA ≤12-bp w sekwencji kodującej (kodony 23-26), a następnie destabilizuje endonukleolityczne mRNA7. Ten proces regulacji jest wspomagany przez białko opiekuńcze Hfq10. OmpC jest licznie występującym białkiem błony zewnętrznej, które uważano za ważne w środowiskach, w których stężenia składników odżywczych i toksyn były wysokie, takich jak w jelicie6. Poryna OmpD jest najliczniej występującym białkiem błony zewnętrznej w Salmonella Typhimurium i stanowi około 1% całkowitego białka komórkowego11. OmpD bierze udział w przyleganiu do ludzkich makrofagów i komórek nabłonka jelitowego12. MicC hamuje również ekspresję zarówno porin OmpC, jak i OmpD. Uważa się, że MicC może regulować zjadliwość. Aby zbadać nowe geny docelowe regulowane przez MicC i zbadać funkcję regulacji wirulencji micC, sklonowaliśmy gen micC w szczepie Salmonella Enteritidis (SE) szczep 50336, a następnie skonstruowaliśmy zmutowany 50336ΔmicC i uzupełniony mutant 50336ΔmicC / pmicC. Nowe geny docelowe poddano badaniom przesiewowym za pomocą qRT-PCR. Zjadliwość 50336ΔmicC wykryto u zakażeń myszy i kurczaków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych Narodowej Rady ds. Badań Naukowych. Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Yangzhou zatwierdził wszystkie eksperymenty i procedury stosowane na zwierzętach (SYXK2016-0020).

1. Szczepy bakterii, plazmidy i warunki hodowli

  1. Użyj bakterii i plazmidów wymienionych w Tabeli 1.
  2. Hodowla bakterii w bulionie LB lub na płytkach agarowych LB w temperaturze 37 °C, w obecności 50 μg/ml ampicyliny (Amp), jeśli jest to właściwe.
  3. Szczepy hodowlane zawierające plazmidy wrażliwe na temperaturę stosuje się do budowy mutantów delecyjnych w temperaturze 30 °C.

2. Klon genu micC S. Szczep Enteritidis 50336

  1. Na podstawie sekwencji przed i za genem micC S. Szczep Typhimurium SL1344, projektuje startery vmicC-F i vmicC-R do amplifikacji fragmentu zawierającego gen micC metodą PCR przy użyciu SE50336 genomowego DNA jako matrycy.
  2. Zmieszać 5 μl 10x buforu reakcyjnego PCR, 2 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM), 1 μl starterów vmicC-F i vmicC-R, odpowiednio, 5 μl matrycy, 1 μl polimerazy Taq DNA i 35 μl ddH2O razem do PCR.
  3. Stosować następujące warunki reakcji PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 94 °C przez 4 min; 94 °C przez 30 s, 53 °C przez 1 min, 72 °C przez 1 min przez 25 cykli i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.
  4. Sekwencjonować produkt PCR, aby uzyskać sekwencję genu micC.

3. Budowa mutanta delecji micC

UWAGA: Mutant micC-ujemny szczepu Salmonella Enteritidis 50336 został skonstruowany przy użyciu rekombinacji za pośrednictwem λ-Red, jak opisano wcześniej13,14. Stosowane startery są wymienione w tabeli 2.

  1. Amplifikacja kasety chloramfenikolu zawierającej fragmenty homologii genu micC.
    1. Zaprojektuj startery micC-F i micC-R do amplifikacji kasety chloramfenikolu (Cm) z plazmidu pKD3, w tym rozszerzeń homologii 50 pz z 5' i 3' genu micC.
    2. Wyodrębnij plazmid pKD3 jako matrycę PCR.
    3. Zmieszać 5 μl 10x buforu reakcyjnego PCR, 2 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM), 1 μl odpowiednio starterów micC-F i micC-R, 5 μl matrycy, 1 μl polimerazy Taq DNA i 35 μl ddH2O razem jako mieszaninę reakcyjną PCR
    4. Amplifikować kasetę Cm w następujących warunkach reakcji PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 94 °C przez 4 min; 94 °C przez 1 min, 52 °C przez 1 min, 72 °C przez 1 minutę przez 10 cykli; 94 °C przez 1 min, 63 °C przez 1 min, 72 °C przez 1 min przez 25 cykli, i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.
    5. Wykryj wielkość produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Oczyść i odzyskaj produkt PCR za pomocą zestawu do odzyskiwania żelu DNA i określ stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: PCR należy przeprowadzić dwukrotnie. Pierwszy produkt PCR rozcieńczono w stosunku 1:200 i użyto jako matrycy do wtórnego PCR, w celu wyeliminowania interferencji dalszej rekombinacji przez plazmid pKD3.
  2. Skonstruuj 1st rekombinowany szczep 50336ΔmicC::cat
    1. Wymieszać równomiernie 100 μl SE50336 kompetentnych komórek z 5 μl plazmidu pKD46 i inkubować na lodzie przez 30 minut. Szok termiczny powyższej mieszaniny w temperaturze 42 °C przez 90 s i szybko przenieść mieszaninę do lodu na 2 minuty, aby przekształcić plazmid pKD46 w SE50336. Przesiewać dodatnie kolonie, hodując je przez noc w temperaturze 30 °C na płytce odpornej na Amp (50 μg/ml).
    2. Dodać 30 mM L-arabinozy do płynnej kultury SE50336/pKD46 i indukować ekspresję rekombinazy przez kulturę wstrząsającą w temperaturze 30 °C przez 1 godzinę. Następnie przygotuj kompetentne komórki.
    3. Wymieszać 100 ng oczyszczonego produktu PCR (krok 3.1) i 40 μl kompetentnych komórek SE50336/pKD46 w kubku na wstrząs elektryczny (np. Bio-Rad). Przeprowadzić transformację porażeniową o parametrach napięcia 1,8 kV, impulsu 25 μF i rezystancji 200 Ω.
    4. Po elektrotransformacji przenieść mieszaninę do 1 ml pożywki SOC i kultury wstrząsającej przy 150 obr./min i temperaturze 30 °C przez 1 godzinę. Następnie rozsmarować mieszaninę na płytce LB odpornej na Cm (34 μg/ml) i wyhodować ją w temperaturze 37 °C przez noc w celu przesiewu kolonii dodatniej.
    5. Hodować wyżej wymienioną dodatnią kolonię w temperaturze 42 °C przez 2 godziny. Przesiać kolonię, która jest wrażliwa na Amp (50 μg/ml), ale odporna na Cm (34 μg/ml) w temperaturze 37 °C przez noc, aby uzyskać pierwszy rekombinowany szczep bez pKD46.
  3. Zidentyfikuj pierwszy rekombinowany szczep 50336ΔmicC::Cat.
    1. Ekstrakt 50336ΔmicC::Cat genomowe DNA jako matryca PCR. Użyj tych samych składników reakcji PCR, co w kroku 2.1. Przeprowadzić reakcję PCR w takich samych warunkach, jak w kroku 2.1.
    2. Wykryj wielkość produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i zsekwencjonuj produkt PCR.
  4. Skonstruuj mutanta delecyjnego 50336ΔmicC.
    1. Elektroporować 100 ng plazmidu pCP20 do 40 μl 50336ΔmicC::Kompetentne ogniwa Cat o parametrach napięcia 1,8 kV, impulsu 25 μF i rezystancji 200 Ω, ekranować transformanty dodatnie na płytce o odporności na Amp (50 μg/mL) i Cm (34 μg/ml) w temperaturze 30 °C.
    2. Przenieść powyżej dodatnich transformantów do nieopornych LB i hodować je przez noc w temperaturze 42 °C, a następnie wyizolować pojedyncze kolonie na płytce LB w temperaturze 37 °C. Wybierz kolonię, która jest wrażliwa zarówno na Amp, jak i Cm. Ten mutant to mutant delecji micC SE50336ΔmicC.
    3. Sprawdź 50336ΔmicC metodą PCR.
      1. Wyodrębnij genomowe DNA 50336ΔmicC jako matrycę PCR. Zmieszać 5 μl 10x buforu reakcyjnego PCR, 2 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM), 1 μl startera vmicC-F, 1 μl startera vmicC-R, 5 μl matrycy, 1 μl polimerazy DNA Taq i 35 μl ddH2O razem do PCR.
      2. Stosować następujące warunki reakcji PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 94 °C przez 4 min; 94 °C przez 30 s, 53 °C przez 1 min, 72 °C przez 1 min przez 25 cykli i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.

4. Budowa szczepu uzupełnionego micC

  1. Zaprojektuj startery pBR-micC-F i pBR-micC-R z miejscami restrykcyjnymi NheI i SalI.
    1. Amplifikować pełnowymiarowy gen micC sekwencjami bocznymi za pomocą mieszaniny reakcyjnej PCR, która zawiera 5 μl SE50336 genomowego DNA jako matrycę, startery 1 μl pBR-micC-F i 1 μL pBR-micC-R jako startery, 5 μl 10x buforu reakcyjnego PCR, 2 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM), 2 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM) i 35 μL ddH2O.
    2. Stosować następujące warunki reakcji PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 94 °C przez 4 min; 94 °C przez 30 s, 52 °C przez 50 s, 72 °C przez 1 minutę przez 25 cykli i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min. Oczyść i odzyskaj produkt PCR.
  2. Trawić produkt PCR i plazmid pBR322 odpowiednio przy użyciu enzymu restrykcyjnego NheI i SalI, a następnie lichlorować je za pomocą ligazy T4 w temperaturze 16 °C przez noc w celu uzyskania plazmidu pBR322-micC.
  3. Przekształć pBR322-micC w kompetentne komórki SE50336ΔmicC i przesiewaj dodatni transformant, aby uzyskać uzupełniony szczep SE50336ΔmicC/pmicC. Ekstrahuj plazmid pBR322-micC z uzupełnionego szczepu i zweryfikuj go przez trawienie i sekwencjonowanie enzymów restrykcyjnych.

5. Izolacja RNA i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym

  1. Kultura SE50336, 50336ΔmicC i 50336ΔmicC/pmicC w pożywce LB przez noc w temperaturze 24 °C z 180 obr./min, wstrząsając do OD600 2,0. Zebrać kulturę bakteryjną przez odwirowanie z prędkością 13000 obr./min przez 2 min.
  2. Ekstrahować całkowite RNA za pomocą odczynnika TRIzol. Inkubować 50 μl wyizolowanego RNA z 2 μl DNazyI i 6 μl 10-krotnego buforu w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu usunięcia DNA. Oznaczyć ilość RNA, pipetując 1 μl próbki RNA do mikrospektrofotometru.
  3. Synteza cDNA
    1. Użyj 1 μg całkowitego RNA do syntezy cDNA w 20 μl systemu reakcji odwrotnej transkrypcji (4 μl buforu 5x, 1 μl mieszanki enzymów RT, 1 μl mieszaniny starterów RT, 10 μl całkowitego RNA i 4 μl ddH2O). Inkubować powyżej układu reakcyjnego w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a następnie w temperaturze 85 °C przez 5 sekund.
  4. Projektowanie starterów w oparciu o sekwencję docelowych genów ompA, ompC i ompD. Wykonaj odwrotną transkrypcję-PCR przy użyciu zestawu odczynników RT. Składniki reakcji PCR zawierają 2,5 μl 10x buforu reakcyjnego PCR, 1 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM), 1 μl starterów genu docelowego (ompA, ompC lub ompD), 2,5 μl matrycy, 0,5 μl polimerazy DNA Taq i 17,5 μl ddH2O.
    1. Stosować następujące warunki reakcji PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 94 °C przez 4 min; 94 °C przez 30 s, 60 °C przez 1 min, 72 °C przez 1 min przez 25 cykli i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.
  5. Przeprowadź PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu zielonego zestawu SYBR RT-PCR w instrumencie RT-PCT w trzech egzemplarzach.
    1. Użyj następujących składników reakcji PCR: 10 μl 2x buforu SYBR, odpowiednio 0,4 μl startera do przodu i startera wstecznego, 0,4 μl RoxDye II, 2 μL cDNA i 6,8 μl H2O.
    2. Stosować następujące warunki reakcji PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 1 minutę przez jeden cykl; 95 °C przez 5 s, 60 °C przez 34 s przez 40 cykli.
    3. Znormalizuj wszystkie dane do endogennego genu referencyjnego gyrA. Do kwantyfikacji danych należy użyć metody 2-ΔΔCT 15.

6. Testy wirulencji

  1. Kultura SE50336, 50336ΔmicC i 50336ΔmicC/pmicC w LB średniej do wczesnej fazy stacjonarnej (OD600 z 2-3) w temperaturze 24 °C, zebrać przez odwirowanie i rozcieńczyć do odpowiedniej CFU mL-1 w sterylnym PBS.
  2. W przypadku zakażeń myszy należy rozcieńczyć wyhodowane szczepy do 10 CFU/200 μL, 102 CFU/200 μL i 103 CFU/200 μL zawiesin gradientowych. Zakażone grupy pięciu 6-8 tygodniowych myszy Balb/c na szczep przez wstrzyknięcie podskórne. Grupie kontrolnej wstrzyknąć 200 μl soli fizjologicznej.
  3. W przypadku zakażeń kurcząt rozcieńczyć powyżej trzech szczepów do 107 CFU/200 μL, 108 CFU/200 μL i 109 CFU/200 μL zawiesin gradientowych. Zakażone grupy po dwadzieścia 1-dniowych kurcząt na szczep przez wstrzyknięcie podskórne.
  4. Codziennie monitoruj oznaki choroby i śmierci zwierząt doświadczalnych. Oblicz LD50 (mediana dawki śmiertelnej) 14 dni po zakażeniu, jak opisano wcześniej16. Przetwarzaj dane za pomocą oprogramowania do analizy danych.
  5. W grupach infekcji należy pobrać serce, wątrobę, śledzionę, płuca i nerki świeżo zmarłych piskląt. Odważyć oddzielnie 0,5 g powyższych tkanek i zmielić je w sterylnej operacji. Rozcieńczać próbki do mielenia stopniowo, rozprowadzać je na płytce LB i hodować przez 8-10 godzin w temperaturze 37 °C. Zanotować ilość szczepów Salmonelli skolonizowanych w tkankach piskląt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Budowa zmutowanego 50336ΔmicC i uzupełnionego szczepu 50336ΔmicC /pmicC
Wynik klonu genu micC wskazał, że gen ten składał się ze 109 pz, wykazując 100% identyczność z genem S. Typhimurium. Na podstawie danych sekwencyjnych udało się skonstruować mutanta delecji 50336ΔmicC i dopełnionego mutanta 50336ΔmicC/pmicC. W szczegółach wynik...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. Enteritidis jest ważnym fakultatywnym patogenem wewnątrzkomórkowym, który może zakażać młode kurczaki i wywołuje objawy od zapalenia jelit po infekcję ogólnoustrojową i śmierć17,18. Ponadto S. enteritidis powoduje utajone infekcje u dorosłych kurcząt, a przewlekli nosiciele zanieczyszczają produkty drobiowe, powodując infekcje przenoszone przez żywność u ludzi19. Mechanizm patogenny S. enteritidis pozostaje do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty z Chińskiej Narodowej Fundacji Nauki (nr 31972651 i 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), Projektu Finansowanego przez Priorytetowy Program Akademicki Rozwoju Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu (PAPD).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
dekstrozaSangon BiotechA610219do przygotowania bulionu
Zestaw do oczyszczania DNATIANGENDP214do oczyszczania DNA
Ex TaqTaKaRaRR01APCR
KH2PO4Sinopharm Odczynnik chemiczny10017608do przygotowania bulionu
K2HPO4Sinopharm Odczynnik chemiczny20032116do przygotowania bulionu
L-ArabinozaSangon BiotechA610071λ-Zestaw
mini plazmidówEkstrakcja plazmiduTIANGENDP106
NaClSinopharm10019308do przygotowania
bulionu(NH4)2SO4Sinopharm Odczynnik chemiczny10002917do przygotowania bulionu
Zestaw odczynników PrimeScriptRRT z gumką gDNA TaKaRaRR047qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qRT-PCR
T4 DNA LigazaNEBM0202Ligacja
TRIzol Invitrogen15596018Izolacja RNA
TryptonOxoidLP0042do przygotowania bulionu
Ekstrakt drożdżowyOxoidLP0021do przygotowania bulionu
wirówkaEppendorf5418wirówka
Aparatura do elektroforezyBio-Rad164-5050Elektroforeza
  System elektroporacjiBio-Rad165-2100do transformacji bakteryjnej
SpektrofotometrBioTekEpochDetekcja absorbancji
System Real-Time PCRSystem Applied Biosystems7500qRT-PCR
do rekombinacji czerwonej Odczynnik chemiczny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504(2020).
  2. Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
  3. Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
  4. Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
  5. Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
  6. Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
  7. Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
  8. Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33(2017).
  9. Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
  10. Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
  11. Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
  12. Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
  13. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  14. Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
  15. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  16. Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
  17. Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736(1999).
  18. Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
  19. De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
  20. Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
  21. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477(2009).
  22. Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120(2011).
  23. Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
  24. Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
  25. Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
  26. Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
  27. Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
  28. Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
  29. Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
  30. Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
  31. Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
  32. Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

MicC RNAGene DeletionLambda Red RecombinationOuter Membrane ProteinsqRT PCR AnalysisLD50 AssaySalmonella EnteritidisChloramphenicol CassetteElectroporation TransformationVirulence Enhancement

Powiązane artykuły