Ulepszony protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy pod względem czasu i pracy

Summary

Pierwotne hepatocyty są cennym narzędziem do badania reakcji wątroby i metabolizmu in vitro. Wykorzystując dostępne na rynku odczynniki, opracowano ulepszony, efektywny czasowo i pracochłonnie protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy.

Abstract

Pierwotne hepatocyty są szeroko stosowane w badaniach nad wątrobą in vitro, zwłaszcza w badaniach metabolizmu glukozy. Podstawowa technika została dostosowana w oparciu o różne potrzeby, takie jak czas, praca, koszty i użycie pierwotnych hepatocytów, co zaowocowało różnymi protokołami izolacji pierwotnych hepatocytów. Jednak liczne etapy i czasochłonne przygotowanie odczynników w pierwotnej izolacji hepatocytów są głównymi wadami dla wydajności. Po porównaniu różnych protokołów pod kątem ich zalet i wad, połączono zalety każdego z nich i sformułowano szybki i skuteczny protokół pierwotnej izolacji hepatocytów. W ciągu zaledwie ~35 minut ten protokół może dać tyle samo, jeśli nie więcej, zdrowych hepatocytów pierwotnych, co inne protokoły. Co więcej, eksperymenty metabolizmu glukozy przeprowadzone przy użyciu izolowanych hepatocytów pierwotnych potwierdziły przydatność tego protokołu w badaniach metabolizmu wątrobowego in vitro. Dokonaliśmy również szczegółowego przeglądu i analizy znaczenia i celu każdego kroku w tym badaniu, aby przyszli badacze mogli dalej optymalizować ten protokół w zależności od potrzeb.

Introduction

Wątroba służy jako jeden z najważniejszych organów w ciele kręgowców ze względu na istotną rolę, jaką odgrywa w wielu funkcjach podtrzymujących życie, takich jak trawienie pokarmu, krążenie krwi i detoksykacja. Wykorzystanie pierwotnych hepatocytów myszy w hodowli in vitro jest coraz bardziej popularne w badaniach nad metabolizmem węglowodanów i rakiem wątroby. Dlatego ważne jest, aby opracować wygodną metodę izolacji pierwotnych hepatocytów myszy przy zachowaniu ich wrodzonej funkcji fizjologicznej. Ze względu na swoją funkcję jako centrum metabolizmu glukozy, wątroba ma również kluczowe znaczenie dla produkcji i magazynowania glukozy¹

Protocol

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. W tym badaniu wykorzystano samice myszy C57BL/6 (w wieku 8 tygodni).

1. Przygotowanie:

1. Wymieszaj William's E Medium (suplement GlutaMAX) z 10% FBS i 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym, aby uzyskać pożywkę hodowlaną.
2. Przefiltruj 25 ml pożywki z dypazą kolagenazy (np. Pożywki do trawienia wątroby) przez filtr strzykawkowy 0,45 μm, aby usunąć resztki cząstek.
3. Ogrzać 50 ml podwójnie destylowanego_H2O(ddH₂O), 35 ml pożywki perfuzyjnej (np. pożywki do perfuzji wątroby) (lub 50 ....

Results

W celu przetestowania skuteczności, obecny podstawowy protokół izolacji hepatocytów został przeprowadzony na 8-tygodniowych samicach myszy C57BL/6. Badano przyłączenie i czystość wyizolowanych hepatocytów pierwotnych. Pierwotna izolacja hepatocytów jest stosowana w szerokiej gamie eksperymentów dotyczących fizjologii wątroby, takich jak działanie leków na wątrobę i metabolizm glukozy, aktywność biomarkerów farmaceutycznych², wrażliwość na insulinę i produkcja glukozy. W związku z tym aktywność pie.......

Discussion

Opracowano różne protokoły pierwotnej izolacji hepatocytów. Są one również optymalizowane i dostosowywane w oparciu o różne potrzeby (tabela 1). Protokoły izolacji składają się zazwyczaj z dwóch części: perfuzji (w tym trawienia enzymatycznego) i oczyszczania.

Perfuzję można przeprowadzić z całą wątrobą in vivo 2,20,21,22,23 lub z wypreparowanymi płatami wątroby

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
12-dołkowa płytka	FALCON	353043	Powłoka nie jest wymagana
Płytka 6-dołkowa	FALCON	353046	Powłoka nie jest wymagana
Anty-AKT	Sygnalizacja komórkowa	2920S
Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy (100x), stabilizowany	Sigma-Aldrich	A5955
anty-FOXO1	Sygnalizacja komórkowa	97635S
anty-GAPDH	Sygnalizacja komórkowa	2118S
anty-p-AKT (S473)	Sygnalizacja komórkowa	9271L
anty-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anty-p-FOXO1 (S256)	Sygnalizacja komórkowa	84192S
Sitko komórkowe, 70 &mikro;	m CELLTREAT	229483
Zamknięty cewnik dożylny, 24 Gauge 0,75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM, bez glukozy, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom Zestaw do oznaczania glukozy Systemy	testów biologicznych	EBGL-100
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Hyklon	SH30071.03
Forskolina	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glukagon	Sigma-Aldrich	G2044
Koza Przeciwciało wtórne przeciw myszym IgG	LI-COR	926-68070
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG Przeciwciało wtórne	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	Oprogramowanie GraphPad	NA
Hepatocyty do mycia Medium	Gibco	17704-024
Sygnalizacja komórkowa	IBMX	13630S
Insulina	Lilly	NDC 0002-8215-01
Ketamina HCL (100 mg / ml)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-glutamina	Gibco	25030081
Trawienie wątroby Medium	Gibco	17703-034	Podwielokrotność w kapturze do hodowli tkankowej po 25 ml każdy w probówce o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 ° C zamrażarka
Medium do perfuzji wątroby	Gibco	17701-038
Pióro Strep	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Pompa perystaltyczna	Gilson	Minipuls 2	Zdolna do pompowania z prędkością 4 ml / min
Szalka Petriego	Fisherbrand	08-757-12
Wirówka	z chłodzeniemSorvall	Legend RT	Możliwość odwirowania probówki o pojemności 50 ml w temperaturze 4 stopni; C
L-mleczan sodu	Sigma-Aldrich	L7022
Pirogronian sodu	Gibco	11360070
Filtr strzykawkowy, PVDF 0,45 i mikro;	229745		CELLTREAT
Becton Dickinson	329461		0,5 ml
, 60 ml	Becton Dickinson	309653
, 0,4%	15250061		Gibco
, 15 ml		Corning 430052
, 50 ml	Corning	430290
Zbiornik do kąpieli	Corning	CLS6783	Lub dowolny zbiornik do kąpieli wodnej zdolny do podgrzania do 45 stopni C
William' s E Medium (suplement GlutaMAX)	Gibco	32551020
Xylozyna (100 mg / mL)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10