Pierwotne hepatocyty są cennym narzędziem do badania reakcji wątroby i metabolizmu in vitro. Wykorzystując dostępne na rynku odczynniki, opracowano ulepszony, efektywny czasowo i pracochłonnie protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ulepszony protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy pod względem czasu i pracy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pierwotne hepatocyty są szeroko stosowane w badaniach nad wątrobą in vitro, zwłaszcza w badaniach metabolizmu glukozy. Podstawowa technika została dostosowana w oparciu o różne potrzeby, takie jak czas, praca, koszty i użycie pierwotnych hepatocytów, co zaowocowało różnymi protokołami izolacji pierwotnych hepatocytów. Jednak liczne etapy i czasochłonne przygotowanie odczynników w pierwotnej izolacji hepatocytów są głównymi wadami dla wydajności. Po porównaniu różnych protokołów pod kątem ich zalet i wad, połączono zalety każdego z nich i sformułowano szybki i skuteczny protokół pierwotnej izolacji hepatocytów. W ciągu zaledwie ~35 minut ten protokół może dać tyle samo, jeśli nie więcej, zdrowych hepatocytów pierwotnych, co inne protokoły. Co więcej, eksperymenty metabolizmu glukozy przeprowadzone przy użyciu izolowanych hepatocytów pierwotnych potwierdziły przydatność tego protokołu w badaniach metabolizmu wątrobowego in vitro. Dokonaliśmy również szczegółowego przeglądu i analizy znaczenia i celu każdego kroku w tym badaniu, aby przyszli badacze mogli dalej optymalizować ten protokół w zależności od potrzeb.
Wprowadzenie
Wątroba służy jako jeden z najważniejszych organów w ciele kręgowców ze względu na istotną rolę, jaką odgrywa w wielu funkcjach podtrzymujących życie, takich jak trawienie pokarmu, krążenie krwi i detoksykacja. Wykorzystanie pierwotnych hepatocytów myszy w hodowli in vitro jest coraz bardziej popularne w badaniach nad metabolizmem węglowodanów i rakiem wątroby. Dlatego ważne jest, aby opracować wygodną metodę izolacji pierwotnych hepatocytów myszy przy zachowaniu ich wrodzonej funkcji fizjologicznej. Ze względu na swoją funkcję jako centrum metabolizmu glukozy, wątroba ma również kluczowe znaczenie dla produkcji i magazynowania glukozy1. Eksperymenty z pierwotnymi hepatocytami in vitro są koniecznością w większości badań nad metabolizmem glukozy. Dlatego od lat różne grupy badawcze opracowują protokoły izolacji pierwotnych hepatocytów myszy.
Ogólna procedura izolacji hepatocytów myszy polega najpierw na wypłukaniu krwi z wątroby za pomocą izosmotycznego płynu, takiego jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) lub Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS), a następnie użycie roztworu zawierającego kolagenazę do dysocjacji hepatocytów. Protokoły te mają wspólną ogólną procedurę, ale różnią się odczynnikami i krokami w zależności od różnych potrzeb. Jednak przygotowanie wymaganych odczynników i wykonanie etapów izolacji wymaga czasu. Opracowując niniejszy protokół, za priorytet uznano wydajność, przy czym wszystkie odczynniki są gotowe do użycia i dostępne na rynku, a także jak najmniejszą liczbę kroków. Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie szybkiej i pracochłonnej metody izolowania pierwotnych hepatocytów od myszy, bez narażania na szwank czystości i żywotności izolowanych pierwotnych hepatocytów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. W tym badaniu wykorzystano samice myszy C57BL/6 (w wieku 8 tygodni).
1. Przygotowanie:
- Wymieszaj William's E Medium (suplement GlutaMAX) z 10% FBS i 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym, aby uzyskać pożywkę hodowlaną.
- Przefiltruj 25 ml pożywki z dypazą kolagenazy (np. Pożywki do trawienia wątroby) przez filtr strzykawkowy 0,45 μm, aby usunąć resztki cząstek.
- Ogrzać 50 ml podwójnie destylowanegoH2O(ddH2O), 35 ml pożywki perfuzyjnej (np. pożywki do perfuzji wątroby) (lub 50 ml przy pierwszym użyciu tego protokołu) i 25 ml przefiltrowanej pożywki z dypazą kolagenazy w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C przez 30 minut.
- W sterylnym kapturze do hodowli tkanek wymieszaj 2 ml 10x HBSS i 18 ml Percollu w probówce o pojemności 50 ml, aby uzyskać 20 ml 1x Percoll-HBSS i przechowywać na lodzie lub 4 °C.
UWAGA: 1x Percoll-HBSS można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 miesięcy. - W sterylnym kapturze do hodowli tkanek wlej 30 ml pożywki myjącej (np. pożywki do płukania hepatocytów) do czystej szalki Petriego i trzymaj na lodzie.
- Zanurzyć rurkę pompującą w wodzie łaźni wodnej o temperaturze 45 °C. Wyniki są najbardziej wiarygodne, jeśli temperatura w pomieszczeniu wynosi 25 °C.
- Przygotuj 2 ml 1x środków znieczulających, mieszając 225 μl ketaminy HCL, 93,75 μl ksylazyny i 1681 μl 1x PBS.
- Znieczulij jedną mysz zatwierdzoną metodą. Tutaj mysz została wstrzyknięta dootrzewnowo 150 μl 1x środków znieczulających. Wykonaj testy pod kątem utraty odruchów, takich jak reakcja na szczypanie palców u stóp, aby zapewnić pełne znieczulenie.
- Przymocuj mysz na plecach do podkładki preparacyjnej za pomocą czterech kończyn, przypinając lub używając wodoodpornej taśmy lub innych metod zatwierdzonych przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (lub ich odpowiedniki).
- Przygotuj wysterylizowane kleszcze i nożyczki do sekcji. Aby uniknąć możliwego zanieczyszczenia, wszystkie czynności należy wykonywać w sterylnym kapturze.
2. Procedura:
- Za pomocą pompy perystaltycznej rozpocząć pompowanie rozgrzanego ddH2O z prędkością 4 ml/min przez 5 minut. Zmienić rurkę pompującą z wody na podgrzane medium perfuzyjne.
- Zdezynfekuj brzuch znieczulonej myszy 70% EtOH i rozetnij nożyczkami, aby odsłonić wątrobę, żyłę wrotną i żyłę główną dolną (IVC).
- Zatrzymaj pompę perystaltyczną. Wprowadzić cewnik 24 G (np. zamknięty cewnik dożylny, 24 G, 0.75 IN) do IVC. Rozpocznij pompowanie i otwórz żyłę wrotną.
- Kontynuuj pompowanie, aż wypłukany płyn będzie klarowny (około 3-5 minut). Naciskaj żyłę wrotną co minutę, aby płyn dotarł do każdego zakątka wątroby. Uważaj, aby pęcherzyki powietrza nie dostały się do IVC.
UWAGA: Ten krok polega na wypłukaniu jak największej ilości krwi z wątroby. - Zmienić rurkę pompującą z pożywki perfuzyjnej na pożywkę z dypazą kolagenazową. Kontynuuj pompowanie, aż wyczerpie się całe 25 ml pożywki z kolagenazą-dypazą, wykonując krok 2.6.
- Naciskaj żyłę wrotną co minutę, aby płyn dotarł do każdego zakątka wątroby.
UWAGA: Na tym etapie całkowita utrata krwi jest śmiertelna dla myszy. Śmierć myszy może być potwierdzona przez brak bicia serca po eksperymencie. Tuszę należy utylizować zgodnie z zasadami obowiązującymi w obiekcie. - Wyizolować całą wątrobę bez pęcherzyka żółciowego do 30 ml roztworu do płukania na szalce Petriego na lodzie.
- Rozerwij go na kawałki kleszczami, aby uwolnić pierwotne hepatocyty do roztworu. Ten krok zamieniłby pożywkę płuczącą w mętny roztwór pełen uwolnionych pierwotnych hepatocytów i małych kawałków wątroby.
- Przefiltrować mętny roztwór w kroku 2.8 przez sitko do komórek 70 μm do 20 ml 1x Percoll-HBSS w probówce 50 ml na lodzie. Wymieszaj, odwracając rurkę 20 razy.
- Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- W kapturze do hodowli tkankowej odessać supernatant. Przemyć granulkę zimnym 30 ml środka myjącego.
- Wirować przy 50 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 25 ml pożywki hodowlanej (lub odpowiednich innych objętościach) w kapturze do hodowli tkankowych.
- Policz liczbę komórek i umieść komórki na żądanych płytkach hodowlanych zgodnie z projektem eksperymentalnym.
UWAGA: Hepatocyty pierwotne prawidłowo wyizolowane od jednej 8-tygodniowej myszy są zwykle wystarczające do posiewu na czterech płytkach 6-dołkowych lub czterech płytkach 12-dołkowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu przetestowania wydajności, niniejszy protokół izolacji pierwotnych hepatocytów przeprowadzono na 8-tygodniowych samicach myszy C57BL/6. Przebadano przyleganie oraz czystość izolowanych pierwotnych hepatocytów. Izolacja pierwotnych hepatocytów jest wykorzystywana w szerokim zakresie doświadczeń dotyczących fizjologii wątroby, takich jak wpływ leków na wątrobę i metabolizm glukozy, aktywność biomarkerów farmaceutycznych2, wrażliwość na insulinę oraz produkcja glukozy. W związku z tym, aktywno...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowano różne protokoły pierwotnej izolacji hepatocytów. Są one również optymalizowane i dostosowywane w oparciu o różne potrzeby (tabela 1). Protokoły izolacji składają się zazwyczaj z dwóch części: perfuzji (w tym trawienia enzymatycznego) i oczyszczania.
Perfuzję można przeprowadzić z całą wątrobą in vivo 2,20,21,22,23 lub z wypreparowanymi płatami wątroby
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (Grant 5R01HD095512-02 dla S.W.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-dołkowa płytka | FALCON | 353043 | Powłoka nie jest wymagana |
| Płytka 6-dołkowa | FALCON | 353046 | Powłoka nie jest wymagana |
| Anty-AKT | Sygnalizacja komórkowa | 2920S | |
| Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy (100x), stabilizowany | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anty-FOXO1 | Sygnalizacja komórkowa | 97635S | |
| anty-GAPDH | Sygnalizacja komórkowa | 2118S | |
| anty-p-AKT (S473) | Sygnalizacja komórkowa | 9271L | |
| anty-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anty-p-FOXO1 (S256) | Sygnalizacja komórkowa | 84192S | |
| Sitko komórkowe, 70 &mikro; | m CELLTREAT | 229483 | |
| Zamknięty cewnik dożylny, 24 Gauge 0,75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, bez glukozy, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Zestaw do oznaczania glukozy Systemy | testów biologicznych | EBGL-100 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Hyklon | SH30071.03 | |
| Forskolina | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glukagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Koza Przeciwciało wtórne przeciw myszym IgG | LI-COR | 926-68070 | |
| Kozie przeciwciało anty-królicze IgG Przeciwciało wtórne | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | Oprogramowanie GraphPad | NA | |
| Hepatocyty do mycia Medium | Gibco | 17704-024 | |
| Sygnalizacja komórkowa | IBMX | 13630S | |
| Insulina | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamina HCL (100 mg / ml) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-glutamina | Gibco | 25030081 | |
| Trawienie wątroby Medium | Gibco | 17703-034 | Podwielokrotność w kapturze do hodowli tkankowej po 25 ml każdy w probówce o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 ° C zamrażarka |
| Medium do perfuzji wątroby | Gibco | 17701-038 | |
| Pióro Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Pompa perystaltyczna | Gilson | Minipuls 2 | Zdolna do pompowania z prędkością 4 ml / min |
| Szalka Petriego | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Wirówka | z chłodzeniemSorvall | Legend RT | Możliwość odwirowania probówki o pojemności 50 ml w temperaturze 4 stopni; C |
| L-mleczan sodu | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Pirogronian sodu | Gibco | 11360070 | |
| Filtr strzykawkowy, PVDF 0,45 i mikro; | 229745 | CELLTREAT | |
| Becton Dickinson | 329461 | 0,5 ml | |
| , 60 ml | Becton Dickinson | 309653 | |
| , 0,4% | 15250061 | Gibco | |
| , 15 ml | Corning 430052 | ||
| , 50 ml | Corning | 430290 | |
| Zbiornik do kąpieli | Corning | CLS6783 | Lub dowolny zbiornik do kąpieli wodnej zdolny do podgrzania do 45 stopni C |
| William' s E Medium (suplement GlutaMAX) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozyna (100 mg / mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
Bibliografia
- Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214(2015).
- Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111(2018).
- Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
- Crispe, I. N. Hepatocytes as immunological agents. Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).
- Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
- Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817(2019).
- Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
- Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
- Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
- Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
- Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
- Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
- Shih, S. C., et al. Molecular profiling of angiogenesis markers. American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).
- Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
- Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799(2017).
- Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169(2007).
- Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
- Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
- Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
- Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48(2017).
- Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
- Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
- Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
- Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
- Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
