Artykuł metodologiczny

Heterologiczna ekspresja i analiza funkcjonalna receptorów zapachowych Aedes aegypti do zapachów ludzkich w oocytach Xenopus

DOI:

10.3791/61813

⸱

8 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University, 2Departments of Biochemistry & Biophysics, and Cellular & Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany jest protokół, który funkcjonalnie charakteryzuje OR komarów w odpowiedzi na ludzkie zapachy za pomocą systemu ekspresji oocytów Xenopus sprzężonego z dwuelektrodowym zaciskiem napięcia, dostarczając potężną nową technikę do badania reakcji komarów OR na ekspozycję na ludzkie zapachy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komar Aedes aegypti (Linnaeus), wektor wielu ważnych chorób ludzkich, w tym żółtej febry, dengi i gorączki Zika, wykazuje silną preferencję dla ludzkich gospodarzy w stosunku do innych ciepłokrwistych zwierząt do spożywania posiłków z krwi. Sygnały węchowe odgrywają kluczową rolę dla komarów, gdy badają one swoje środowisko i szukają ludzkiego żywiciela, aby uzyskać posiłki z krwi, przenosząc w ten sposób choroby ludzkie. Wiadomo, że receptory zapachowe (OR) ulegające ekspresji w węchowych neuronach czuciowych są odpowiedzialne za interakcję wektorów komarów z ludzkimi zapachami. Aby uzyskać głębszy wgląd w fizjologię węchową Ae. aegypti i zbadać ich interakcje z ludźmi na poziomie molekularnym, zastosowaliśmy zoptymalizowany protokół heterologicznej ekspresji oocytów Xenopus do funkcjonalnej analizy receptorów zapachowych Ae. aegypti w odpowiedzi na ludzkie zapachy. Przedstawiono trzy przykładowe eksperymenty: 1) Klonowanie i synteza cRNA OR i koreceptora receptora zapachowego (Orco) od czterech do sześciu dni Ae. czułki aegypti; 2) Mikroiniekcja i ekspresja ORs i Orco w oocytach Xenopus; oraz 3) Rejestracja prądu całokomórkowego z oocytów Xenopus wykazujących ekspresję ORs/Orco komara za pomocą dwuelektrodowego zacisku napięciowego. Te zoptymalizowane procedury zapewniają naukowcom nowy sposób badania odbioru zapachów przez ludzi u komarów Aedes i ujawniają mechanizmy leżące u podstaw ich aktywności poszukiwania żywiciela na poziomie molekularnym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komar żółtej febry Ae. aegypti może przenosić wiele śmiertelnych chorób, w tym żółtą febrę, dengę i gorączkę Zika, powodując ogromne cierpienie i utratę życia. Komary wykorzystują wiele wskazówek, takich jak CO2, zapach skóry i ciepło ciała, aby zlokalizować swoich gospodarzy1. Biorąc pod uwagę, że zarówno ludzie, jak i inne zwierzęta stałocieplne wytwarzają CO2 i mają podobną temperaturę ciała, wydaje się prawdopodobne, że samice Ae. aegypti polegają głównie na zapachu skóry w celu dyskryminacji gospodarza2. Tworzy to jednak złożony obraz, a jedno z wczesnych badań wyizolowało ponad 300 związków z emanacji ludzkiej skóry3. Dalsze testy behawioralne wykazały, że wiele z tych związków wywołuje reakcje behawioralne u Ae. aegypti4,5,6,7, ale dokładny sposób, w jaki te związki są wykrywane przez komara, pozostaje w dużej mierze nieznany. Ostatnie badania przeprowadzone przez naszą grupę zidentyfikowały kilka ludzkich substancji zapachowych, które mogą być zaangażowane w aktywność Ae. aegypti polegającą na poszukiwaniu żywiciela, chociaż ich rola nie została jeszcze potwierdzona przez dalsze testy behawioralne8. Nie ustalono jeszcze, w jaki sposób te niezbędne ludzkie substancje zapachowe są dekodowane w obwodowym systemie sensorycznym Ae. aegypti.

Owady wykrywają substancje zapachowe za pomocą czujnika chemosensorycznego na swoich węchowych kończynach. Wewnątrz każdej z sensilli różne receptory węchowe, w tym receptory zapachowe (OR), receptory jonotropowe (IR) i receptory smakowe (GR), ulegają ekspresji na błonie węchowych neuronów czuciowych9. Te sale operacyjne są odpowiedzialne za wykrywanie wielu substancji zapachowych napotykanych przez owady, zwłaszcza zapachów związanych z żywnością, żywicielami i partnerami godowymi10,11,12,13. Poprzednie badanie skupiające się na desieroceniach funkcji OR u Anopheles gambiae przy użyciu systemu ekspresji Xenopus sprzężonego z dwuelektrodowym zaciskiem napięciowym wykazało, że OR Anopheles są specjalnie dostrojone do aromatów, które są głównymi składnikami ludzkich emanacji14. Niedawne badanie genomu zidentyfikowało do 117 genów OR u Ae. aegypti15. W związku z tym sposób na systematyczne zajęcie się funkcjami tych sal operacyjnych Aedes w odpowiedzi na biologicznie lub ekologicznie ważne substancje zapachowe, takie jak ludzkie zapachy lub bodźce składania jaj, dostarczyłby użytecznych informacji dla osób poszukujących głębszego zrozumienia ekologii chemicznej lub neuroetologii Ae. aegypti.

Technika dwuelektrodowych zacisków napięciowych (TEVC) została pierwotnie opracowana do zbadania funkcji kanałów jonowych membrany w połowie lat 90-tych16,17. Od tego czasu TEVC jest używany do badania OR wielu różnych gatunków owadów14,18,19,20,21,22,23,24,25,26, 27,28,29,30,31,32,33,34. To funkcjonalne badanie sal operacyjnych w znacznym stopniu przyczyniło się do udzielenia odpowiedzi na ważne pytania ekologiczne dotyczące owadów, w tym: 1) W jaki sposób owady lokalizują źródła pożywienia? 2) W jaki sposób przyciągają je lotne feromony płciowe uwalniane przez ich partnerów godowych? 3) Jak znaleźć idealne miejsce do składania jaj dla swojego potomstwa? oraz 4) Czy są jakieś związki, pochodzenia roślinnego lub syntetycznego, które mogą skutecznie chronić ludzi przed gryzącymi owadami? Odpowiedzi na te pytania mają kluczowe znaczenie dla zwalczania ważnych wektorów chorób, takich jak komary.

Wiele innych podejść, w tym te oparte na ludzkiej linii komórkowej 293 embrionalnej nerki (HEK293), systemie pustych neuronów Drosophila, nukleazie palca cynkowego, nukleazie efektorowej podobnej do aktywatora transkrypcji oraz systemie edycji genów CRISPR/Cas9, były również używane w badaniach funkcjonalnych OR12,20,35,36,37. Wszystkie te techniki wymagają jednak umiejętności doświadczonego biologa molekularnego i obejmują wiele potencjalnie zakłócających czynników. Ekspresja TEVC/oocytów jest w stanie bezpośrednio mierzyć prądy receptorowe wywołane zapachem i przewodnictwo jonowe, a dodatkową zaletą jest szybki czas konfiguracji wymagany do ekspresji receptorów z cRNA. W tym badaniu zastosowaliśmy TEVC do zbadania odpowiedzi jednego Ae. aegypti OR55 (AaegLUB55) na kilka substancji zapachowych o potencjalnym znaczeniu biologicznym, ujawniając, że oocyty wyrażane przez AaegLUB55•AaegOrco wykazywały zależną od dawki odpowiedź na ludzki zapach benzaldehydu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół dla tej procedury, Opieka i Wykorzystanie Zwierząt Laboratoryjnych, jest zatwierdzony i monitorowany (Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Auburn: zatwierdzony protokół # 2016-2987).

UWAGA: Niestandardowa synteza genów jest realną alternatywą dla klonowania genów komarów OR.

1. Kolekcja komarów i węchowych (anten)

  1. Utrzymuj komary Ae. aegypti (uzyskane od dr Jamesa Becnela, USDA, ARS, Mosquito and Fly Research Unit) w temperaturze 25 ± 2°C i fotoperiodzie 12: 12 (L:D) h (światła włączone 8 rano).
  2. Znieczulić ~ 800 4-6-dniowych samic komarów bez karmienia krwią za pomocą CO2. Przeciąć czułki komarów (tkanki węchowe) pod mikroskopem (40x) za pomocą nożyczek i zebrać w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml przechowywanej na suchym lodzie.
    UWAGA: Zebrane anteny można przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C lub natychmiast zużyć.

2. LUB Klonowanie z Anten Ae. aegypti

  1. Wyodrębnij całkowite RNA z anten za pomocą dostępnego na rynku zestawu całkowitego RNA zgodnie z protokołem producenta.
  2. Trawić całkowite RNA za pomocą komercyjnego zestawu bez DNA w celu usunięcia DNazy i innych jonów zgodnie z protokołem producenta.
  3. Zsyntetyzuj cDNA z 1,5 μg RNA wolnego od DNA przy użyciu systemu syntezy pierwszej nici SuperScript IV primered Oligo d(T)2013,30.
  4. Zaprojektuj startery PCR dla genów OR zgodnie z sekwencjami dostępnymi w VectorBase (https://www.vectorbase.org/) i specjalnymi wymaganiami miejsca cięcia enzymu. Dodaj sekwencję Kozaka (GCCACC), która inicjuje translację w większości organizmów eukariotycznych, między miejscem cięcia a kodonem start w każdym starterze do przodu30.
  5. Sklonuj sekwencje kodujące geny OR metodą PCR przy użyciu starterów specyficznych dla genu zawierających miejsca endonukleazy restrykcyjnej i sekwencję Kozaka zgodnie z protokołem producenta.
  6. Wykrywaj produkty PCR za pomocą 1% żelu agarozowego i oczyść je za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta.
  7. Przeprowadź budowę rekombinowanego plazmidu poprzez klonowanie produktów PCR do wektora pT7Ts po trawieniu przez enzymy restrykcyjne zgodnie z protokołem producenta.
  8. Zweryfikuj rekombinowane plazmidy za pomocą sekwencjonowania Sangera i potwierdź za pomocą bazy danych VectorBase.

3. Synteza cRNA

  1. Linearyzuj zbudowane plazmidy za pomocą specyficznych enzymów restrykcyjnych.
    UWAGA: DNA plazmidu musi być zlinearyzowane za enzymem restrykcyjnym za genem, który ma być transkrybowany.
  2. Użyj zlinearyzowanych plazmidów do syntezy cRNA za pomocą komercyjnego zestawu T7 zgodnie z poprzednim opisem13,30.
  3. Wymieszaj cRNA OR i Orco (1:1) w probówce wirówkowej i podziel zmieszane cRNA na objętość 2 μl (250 ng/μL/każda) dla każdej probówki PCR. Przed użyciem należy przechowywać podany cRNA w temperaturze -80 °C.

4. Kolekcja oocytów Xenopus

UWAGA: Procedura jest zgodna z instrukcją Schneider et al.38.

  1. Znieczulenie Xenopus laevis przez 20-30 minut w 1 litrze ultra oczyszczonej wody z 1 g soli metanosulfonianu m-aminobenzoesanu etylu (Rysunek 1A). Uszczypnij jeden z palców u nogi żaby palcami; Jeśli nie ma odpowiedzi, żaba jest wystarczająco znieczulona i gotowa do operacji. Przenieś znieczuloną żabę na łóżko lodowe.
  2. Zabieg
    1. Natrzyj brzuszną okolicę żaby 10% roztworem jodu powidonu i przetrzyj roztwór czystymi wacikami. Powtórz ten krok 2 razy.
    2. Wykonaj małe nacięcie brzucha (10-15 mm, Rysunek 1B) za pomocą jednorazowego skalpela. Oddzielnie penetrować skórę, warstwę powięziowo-mięśniową. Nacięcie znajduje się w dolnej części brzucha, bocznie do linii środkowej.
      UWAGA: Nie uszkadzaj narządów wewnętrznych.
    3. Chwyć części płatów jajników kleszczami i delikatnie pociągnij na zewnątrz. Podnieś jajnik i odetnij go nożyczkami na poziomie ściany ciała. Powtórz kilka razy, aż uzyskasz wystarczającą ilość materiału jajnikowego (~200 jaj, Rysunek 1C). Przenieść materiał jajnikowy do buforu płuczącego (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MgCl2•6H2O, 5 mM sól sodowa HEPES, 10 μg/ml gentamycyny, pH 7,6).
    4. Rany pooperacyjne (zarówno mięśniowe, jak i skórne) należy zamknąć wchłanialnymi szwami, które zazwyczaj ulegają degradacji i wypadają naturalnie w ciągu 10-14 dni.
    5. Po każdym zabiegu umieść żabę w 1 litrze roztworu regeneracyjnego (zawierającego 3,4 g soli konserwowej i peklowej oraz 2 g rozpuszczalnej soli morskiej oceanicznej), aż się obudzi, a następnie zwróć ją z powrotem do placówki dla żab.
      UWAGA: Na każdej żabie można wykonać do 4 operacji. Odstęp między operacjami każdej żaby powinien wynosić więcej niż 2 miesiące.
  3. Enzymatyczne trawienie deflikukulowane i hodowla oocytów
    1. Podziel oocyty (~200 jaj, Rysunek 1C) na małe kawałki.
    2. Przenieść wszystkie oocyty do roztworu trawiącego, w tym 10 ml buforu płuczącego (sekcja 4.2.3) i 2 mg/ml kolagenazy B przez 40-60 minut w temperaturze otoczenia w celu usunięcia warstw komórek pęcherzykowych. Zbadaj próbki pod mikroskopem, aby ustalić, czy 80% oocytów zostało całkowicie zdeflikulowanych; Jeśli nie, sprawdzaj co 10 minut, aż większość oocytów będzie gotowa.
    3. Przepłukać oocyty 1x roztworem Ringera (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MgCl2·6H2O, 5 mM soli sodowej HEPES, pH 7,6), buforem płuczącym (sekcja 4.2.3), modyfikowanym roztworem soli Barth'a (78 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,33 mM Ca(NO3)2·4H2O, 0,41 mM CaCl2·2H2O, 0,82 mM MgSO4·7H2O, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM sól sodowa HEPES, 1,8 mM pirogronian sodu, 10 μg/ml gentamycyny, 10 μg/ml streptomycyny, pH 7,6) w kolejności (5 razy dla każdego buforu, za każdym razem używając 10 ml). Intensywne płukanie oocytów w celu usunięcia niedojrzałych i złej jakości oocytów.
    4. Pobrać oocyty w stadium V-VI zgodnie z klasyfikacją Dumonta. Przenieś zdrowe/dobrej jakości oocyty w stadium V-VI z wyraźnym białym/ciemnym podziałem i bez wizualnie widocznych uszkodzeń (Ryc. 1D) na szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm zawierającą zmodyfikowaną sól fizjologiczną Bartha (sekcja 4.3.3). Odrzuć oocyty złej jakości (Rysunek 1E). Utrzymuj strawione oocyty w komorach wzrostu owadów w temperaturze 18 °C przez około 24 godziny przed mikrowstrzyknięciem.

5. Mikroiniekcja cRNA i ekspresja receptorów zapachowych (OR) i koreceptorów OR (Orco) w oocytach Xenopus

  1. Umieścić metalową matrycę na szalce Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm, dodając zmodyfikowaną sól fizjologiczną Bartha (sekcja 4.3.3), aż matryca zostanie zanurzona. Przenieś oocyty na macierz i odrzuć oocyty, które nie spełniają rozmiaru. Ułóż oocyty tak, aby bieguny roślinne znajdowały się na górnej stronie (Ryc. 1F).
  2. Wyciągnąć świeżą szklaną kapilarnę (1,0 mm średnicy zewnętrznej x 0,5 mm średnicy, długość = 100 mm) dla każdej próbki za pomocą ściągacza do mikrorurek (ciepło = 525, ciągnięcie = 50, prędkość = 50, czas = 250) i naostrzyć ukosownikiem do mikropipet pod kątem 25°. Zamontuj rurkę kapilarną na wtryskiwaczu nanolitrowym.
  3. Przed wstrzyknięciem należy wyjąć z zamrażarki jedną tubkę wstępnie zmieszanych cRNA OR i Orco (sekcja 3.3) i umieścić ją na lodzie aż do całkowitego rozpuszczenia. Napełnij rurkę kapilarną mieszaniną OR/Orco, naciskając przycisk Napełnianie wtryskiwacza nanolitrowego.
  4. Wstrzyknij 10 ng (5ng OR + 5ng Orco; ~20 nL) wstępnie zmieszanego cRNA dla każdego oocytu za pomocą nanolitrowego wstrzykiwacza w stacji wolnej od RNAse. (Rysunek 1F).
    UWAGA: Przed wstrzyknięciem naciskamy przycisk EMPTY, aby usunąć niewielką ilość mieszaniny, aby upewnić się, że rurka kapilarna nie jest zablokowana. Odczekanie około 5 sekund, aby cRNA całkowicie weszło do oocytu.
  5. Po wstrzyknięciu przechowuj oocyty na sterylnej 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej ze zmodyfikowaną solą fizjologiczną Bartha w temperaturze 18°C przez 3-7 dni przed zapisem całych komórek.

6. Rejestracja prądu w całym ogniwie za pomocą dwuelektrodowego systemu zacisków napięcia (Rysunek 2)

  1. Przed zapisem napięcia za pomocą dwuelektrodowych cęgów należy rozpuścić poszczególne związki nawaniające w dimetylosulfotlenku (DMSO), aby otrzymać szereg roztworów podstawowych (100 μg/μL). Rozcieńczyć te roztwory podstawowe 1x buforem ND96 (91 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2·2H2O, 2 mM MgCl2·6H2O, 5 mM soli sodowej HEPES, pH 7,6) 1000-krotnie, aby otrzymać zestaw roztworów roboczych (0,1 μg/μL).
  2. Upewnij się, że wszystko na stole wibroizolacyjnym TMC, w tym metalowa osłona, mikroskop, źródło światła i pompa odpadowa, jest starannie uziemione, aby zmniejszyć wpływ zewnętrznego szumu elektrycznego na zapis sygnału całego ogniwa.
  3. Przygotuj mikroelektrody, pociągając szklaną kapilarnę (1,20 mm średnicy zewnętrznej x 0,94 mm średnicy, długość = 750 mm) za pomocą ściągacza do mikrorurek (ciepło = 525, ciągnięcie = 50, prędkość = 50, czas = 250). Napełnij naczynia włosowate 3 M KCl. Chloruj druty Ag/AgCl przez 2-5 minut w 10% wybielaczu chlorowym, aż zmienią kolor na ciemnoszary (jasnoszare druty Ag/AgCl należy chlorować).
  4. Włącz maszynę, włączając zacisk oocytów i digitizer Digidata (Rysunek 3A). Otwórz oprogramowanie (np. Clampex 10.3) i kliknij przycisk Nagraj. Włączyć przełącznik bufora 1x ND96 (rozdział 6.1) i pompę bufora odpływowego.
  5. Przeprowadź test wstępny, wkładając mikroelektrody do przepływającego bufora, a następnie naciskając przycisk testu elektrody Vm i przycisk testu elektrody Ve, aby sprawdzić rezystancję mikroelektrod. Vm powinno wynosić < 40 mV, a Ve powinno wynosić < 40 μA. Po wykonaniu testu wstępnego wyłączyć przepływ 1x bufora ND96 (sekcja 6.1) i pompę ściekową.
  6. Umieść każdy oocyt w komorze perfuzyjnej (Rysunek 2) wypełnionej 1x buforem ND96 (sekcja 6.1) i delikatnie ustaw oocyty z biegunami roślinnymi skierowanymi do góry przez szklaną gąsienicę. Powoli wprowadzaj elektrody do oocytu (Rysunek 3B). Dostosuj parametr Vm do 0, a następnie parametr Ve do 0. Zmień przycisk Clamp z OFF na FAST. Ustaw przycisk Gain na ~ -80 mV.
  7. Sprawdź wartość Ve, która powinna być stała. Jeśli nie, oznacza to, że co najmniej jedna z dwóch mikroelektrod jest nieszczelna. Jeśli tak się stanie, wymień wadliwe elementy na nowe kapilary.
  8. Rejestruj prądy całokomórkowe z wstrzykniętych oocytów za pomocą klamry oocytów o potencjale utrzymywania ~−80 mV (Rysunek 2).
  9. Wykonywanie akwizycji i analizy danych.
    1. Wznów przepływ bufora 1x ND96 (rozdział 6.1) i włącz pompę odpływową.
    2. Podanie roztworu nawaniacza za pomocą systemu perfuzyjnego: wyłączyć 1x bufor ND96 (sekcja 6.1) i przepływać roztwór nawaniacza przez 10 sekund. Następnie zapisz wartość szczytową. Aby uzyskać odpowiedź sali operacyjnej na badany nawaniacz, należy odjąć wartość wyjściową od wartości szczytowej.
    3. Zatrzymaj przepływ roztworu nawaniacza i przełącz się na 1x bufor ND96 (rozdział 6.1). Przemyj oocyt za pomocą buforu, aż bieżący ślad odzyska się po poprzedniej stymulacji zapachowej. Oocyt jest wtedy gotowy do stymulacji przez inny roztwór zapachowy. Ogólnie rzecz biorąc, jeden oocyt może być użyty do wykrycia 20-30 stymulacji chemicznych.
      UWAGA: Podczas badania reakcji zależnej od stężenia, przed przejściem do wyższych stężeń należy zawsze najpierw zastosować najniższe stężenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z techniki pojedynczego zapisu sensillum (SSR), niedawno zidentyfikowaliśmy ludzkie substancje zapachowe, które uważa się za ważne dla Ae. aegypti zachowanie w poszukiwaniu gospodarza8. Jednak mechanizm molekularny kierujący procesem wyczuwania ludzkich substancji zapachowych w obwodowym układzie czuciowym Ae. aegypti pozostaje nieznany. Sale operacyjne odgrywają ważną rolę w wykrywaniu ligandów zapachowych u większości owadów10,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TEVC to klasyczna technika, która jest szeroko stosowana do badania funkcji receptorów błonowych. Chociaż opublikowano już szczegółowy protokół43 , który wykazuje znaczne podobieństwo do przedstawionej tu procedury, proponowana metoda wprowadza kilka istotnych modyfikacji. Na przykład w tym przypadku cRNA zarówno OR, jak i Orco są wstępnie mieszane i porcjowane na próbki o małej objętości natychmiast po syntezie i przechowywane w temperaturze -80 °C do momentu użycia, a nie mieszane oddzielnie na ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt został wsparty nagrodą od Alabama Agricultural Experiment Station (AAES) Multistate/Hatch Grants ALA08-045, ALA015-1-10026 i ALA015-1-16009 dla N.L.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowejCytoOneCC7682-7524Używana do hodowli oocytów
Afrykańska żaba szponiastaNascoLM00535Używana do zbierania oocytów Xenopus
Elektroda drutowa Ag/AgClWarner Instruments64-1282Używana do mikroelektrod
Clampex 10.3AxonN.A.Służy do nagrywania sygnału
Clampfit 10.3Axon Instruments Inc.NieSłuży do analizy danych
Kolagenaza BSigma 11088815001Służy do trawienia oocytów
Digidata DigitizerAxon CNSDigidata 1440ASłuży do akwizycji
danych E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini kitOmegaD6942-01Służy do przygotowania plazmidu
Sól metanosulfonianu etylu M-aminobenzoesanuSigma886-86-2Służy do znieczulania żab
Szkło kapilaraFHC30-30-1Służy do mikroiniekcji
Kapilara szklanaWarner Instruments64-0801Służy do przygotowania mikroelektrod
Mieszalnik nutacyjny GyroMiniLabnetS0500Służy do trawienia oocytów
Komory wzrostu owadówCaron Productsmodel 6025Używany do inkubacji oocytów
Mikroskop LeicaLeicaS6 DSłuży do cięcia anten komarów
Źródło światłaSchottA20500Zapewnienie źródeł światła do obserwacji
Stojak magnetycznyNarishigeGJ-1Służy do przytrzymywania elektrody referencyjnej
MikromanipulatorLeica115378Służy do niewielkiego ruchu elektrody
Ściągacz do mikrorurSuttermodel P-97Służy do wyciągania naczyń włosowatych
Ukosowarka do mikropipetSuttermodel BV-10Służy do ostrzenia naczyń włosowatych
Zestaw mMESSAGE mMACHINE T7InvitrogenAM1344Używany do syntezy cRNA
Nanoject II Auto-NanolitrInjector Drummond3-000-204Używany do mikroiniekcji
Oligo d(T)20-primed SuperScript IV First-Strand Synthesis SystemInvitrogen18091050Używany do syntetyzujący cDNA
Mikroskop OlympusOlympusSZ61Używany do mikroiniekcji
One Shot TOP10 Chemicznie kompetentne komórki E. coliInvitrogenC404003Używany do transformacji
Wzmacniacz cęgowy oocytówWarner Instrumentsmodel OC-725CUżywany do nagrywania TEVC
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquickQiagen28704Używany do żelu oczyszczanie
Stół do izolacji drgań TMC63-500Służy do izolowania wibracji od sprzętu
Zestaw TURBO bez DNAInvitrogenAM1907Służy do usuwania DNazy i innych jonów w RNA
dotyczy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cardé, R. T. Multi-cue integration: how female mosquitoes locate a human host. Current Biology. 25 (18), 793-795 (2015).
  2. McBride, C. S., et al. Evolution of mosquito preference for humans linked to an odorant receptor. Nature. 515 (7526), 222-227 (2014).
  3. Bernier, U. R., Kline, D. L., Barnard, D. R., Schreck, C. E., Yost, R. A. Analysis of human skin emanations by gas chromatography/mass spectrometry. 2. Identification of volatile compounds that are candidate attractants for the yellow fever mosquito (Aedes aegypti). Analytical Chemistry. 72 (4), 747-756 (2000).
  4. Bernier, U. R., Kline, D. L., Schreck, C. E., Yost, R. A., Barnard, D. R. Chemical analysis of human skin emanations: comparison of volatiles from humans that differ in attraction of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of the American Mosquito Control Association. 18 (3), 186-195 (2002).
  5. Bernier, U. R., et al. Synergistic attraction of Aedes aegypti (L.) to binary blends of L-lactic acid and acetone, dichloromethane, or dimethyl disulfide. Journal of Medical Entomology. 40 (5), 653-656 (2003).
  6. Bernier, U. R., Kline, D. L., Allan, S. A., Barnard, D. R. Laboratory studies of Aedes aegypti attraction to ketones, sulfides, and primary chloroalkanes tested alone and in combination with L-lactic acid. Journal of the American Mosquito Control Association. 31 (1), 63-70 (2015).
  7. Okumu, F. O., et al. Development and field evaluation of a synthetic mosquito lure that is more attractive than humans. PloS one. 5 (1), 8951(2010).
  8. Chen, Z., Liu, F., Liu, N. Human odour coding in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 9 (1), 1-12 (2019).
  9. Hansson, B. S., Stensmyr, M. C. Evolution of insect olfaction. Neuron. 72 (5), 698-711 (2011).
  10. Nakagawa, T., Sakurai, T., Nishioka, T., Touhara, K. Insect sex-pheromone signals mediated by specific combinations of olfactory receptors. Science. 307 (5715), 1638-1642 (2005).
  11. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  12. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7285), 66-71 (2010).
  13. Liu, F., Xiong, C., Liu, N. Chemoreception to aggregation pheromones in the common bed bug, Cimex lectularius. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 82, 62-73 (2017).
  14. Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4418-4423 (2010).
  15. Matthews, B. J., et al. Improved reference genome of Aedes aegypti informs arbovirus vector control. Nature. 563 (7732), 501-507 (2018).
  16. Costa, A. C., Patrick, J. W., Dani, J. A. Improved technique for studying ion channels expressed in Xenopus oocytes, including fast superfusion. Biophysical Journal. 67 (1), 395-401 (1994).
  17. Schreibmayer, W., Lester, H. A., Dascal, N. Voltage clamping of Xenopus laevis oocytes utilizing agarose-cushion electrodes. Pflügers Archiv. 426 (5), 453-458 (1994).
  18. Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17 (18), 1533-1544 (2007).
  19. Ditzen, M., Pellegrino, M., Vosshall, L. B. Insect odorant receptors are molecular targets of the insect repellent DEET. Science. 319 (5871), 1838-1842 (2008).
  20. Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
  21. Xia, Y., et al. The molecular and cellular basis of olfactory-driven behavior in Anopheles gambiae larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (17), 6433-6438 (2008).
  22. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Characterization of an enantioselective odorant receptor in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS One. 4 (9), 7032(2009).
  23. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Insect repellents: modulators of mosquito odorant receptor activity. PLoS One. 5 (8), 12138(2010).
  24. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Odorant receptor modulation: ternary paradigm for mode of action of insect repellents. Neuropharmacology. 62 (5-6), 2086-2095 (2012).
  25. Hughes, D. T., Pelletier, J., Luetje, C. W., Leal, W. S. Odorant receptor from the southern house mosquito narrowly tuned to the oviposition attractant skatole. Journal of Chemical Ecology. 36 (8), 797-800 (2010).
  26. Pelletier, J., Hughes, D. T., Luetje, C. W., Leal, W. S. An odorant receptor from the southern house mosquito Culex pipiens quinquefasciatus sensitive to oviposition attractants. PloS one. 5 (4), 10090(2010).
  27. Bohbot, J. D., et al. Multiple activities of insect repellents on odorant receptors in mosquitoes. Medical and Veterinary Entomology. 25 (4), 436-444 (2011).
  28. Bohbot, J. D., et al. Conservation of indole responsive odorant receptors in mosquitoes reveals an ancient olfactory trait. Chemical Senses. 36 (2), 149-160 (2011).
  29. Leal, W. S., Choo, Y. M., Xu, P., da Silva, C. S., Ueira-Vieira, C. Differential expression of olfactory genes in the southern house mosquito and insights into unique odorant receptor gene isoforms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (46), 18704-18709 (2013).
  30. Liu, F., Chen, Z., Liu, N. Molecular basis of olfactory chemoreception in the common bed bug, Cimex lectularius. Scientific Reports. 7, 45531(2017).
  31. Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
  32. Ruel, D. M., Yakir, E., Bohbot, J. D. Supersensitive odorant receptor underscores pleiotropic roles of indoles in mosquito ecology. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 533(2019).
  33. Xu, P., Choo, Y. M., De La Rosa, A., Leal, W. S. Mosquito odorant receptor for DEET and methyl jasmonate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16592-16597 (2014).
  34. Xu, P., et al. Odorant inhibition in mosquito olfaction. iScience. 19, 25-38 (2019).
  35. Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
  36. DeGennaro, M., et al. orco mutant mosquitoes lose strong preference for humans and are not repelled by volatile DEET. Nature. 498 (7455), 487-491 (2013).
  37. Koutroumpa, F. A., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6, 29620(2016).
  38. Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method. Journal of Visualized Experiments. (45), e1864(2010).
  39. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  40. Jones, P. L., Pask, G. M., Rinker, D. C., Zwiebel, L. J. Functional agonism of insect odorant receptor ion channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (21), 8821-8825 (2011).
  41. Butterwick, J. A., et al. Cryo-EM structure of the insect olfactory receptor Orco. Nature. 560 (7719), 447-452 (2018).
  42. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  43. Nakagawa, T., Touhara, K. Functional assays for insect olfactory receptors in Xenopus oocytes. Pheromone signaling. , Humana Press. Totowa, NJ. 107-119 (2013).
  44. Dobritsa, A. A., Van Naters, W., Warr, C. G., Steinbrecht, R. A., Carlson, J. R. Integrating the molecular and cellular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 37 (5), 827-841 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspresja w oocytach Xenopusdwuelektrodowa metoda clampowania napi ciarejestracja pr d w ca okom rkowychsynteza cRNAtechnika mikroiniekcjikoreceptor Orcoludzka odpowied zapachowaposzukiwanie ywiciela przez komary
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły