Artykuł metodologiczny

Analiza układu limfatycznego i krwionośnego podczas otyłości

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61814

⸱

19 listopada 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Immunology, Washington University School of Medicine, 2Université Côte d'Azur, 3Mediterranean Center of Molecular Medicine C3M, Team 13, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) UMR1065, 4Mediterranean Center of Molecular Medicine C3M, Team 7, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) UMR1065

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Otyłość to rosnący globalny problem zdrowia publicznego. Wcześniej kojarzono go z dysfunkcją układu limfatycznego, co sugeruje istotną interakcję między tkanką tłuszczową a układem limfatycznym. W tym przypadku proponujemy przystępną metodologię pozwalającą na wyraźne znakowanie naczyń krwionośnych i limfatycznych w obrębie podskórnej tkanki tłuszczowej.

Streszczenie

Naczynia limfatyczne i węzły chłonne są nieuchronnie osadzone w tkance tłuszczowej. Fizjologiczne znaczenie tej obserwacji pozostaje nadal niewyjaśnione. Jednak otyłość charakteryzuje się upośledzoną funkcją limfy i zwiększoną przepuszczalnością naczyń. I odwrotnie, dysfunkcja limfy indukuje otyłość u myszy, co sugeruje znaczną zależność między naczyniami limfatycznymi a tkanką tłuszczową. Dlatego zrozumienie czynników prowadzących do dysfunkcji układu limfatycznego może otworzyć nowe okna terapeutyczne w celu zapobiegania otyłości i związanym z nią chorobom współistniejącym. Pierwszym krokiem w tym procesie jest precyzyjna i szczegółowa wizualizacja sieci limfatycznej w zdrowej i zapalnej tkance tłuszczowej. Tutaj opisujemy szybką, niedrogą i skuteczną metodę, która pozwala na znakowanie i analizowanie naczyń limfatycznych i krwionośnych. Podejście to wykorzystuje drenującą skórę lokalizację węzłów chłonnych ramiennych w podskórnej tkance tłuszczowej. Arboryzacja limfatyczna tej tkanki może być ujawniona przez wstrzyknięcie podskórnie lektyn sprzężonych z fluorochromem. Co więcej, podejście do znakowania in vivo umożliwia ocenę gęstości i funkcji naczyń limfatycznych. W połączeniu z barwieniem naczyń krwionośnych, adipocytów i komórek odpornościowych, protokół pozwala na mapowanie podskórnej tkanki tłuszczowej w wysokiej rozdzielczości za pomocą obrazowania 3D.

Wprowadzenie

Układ krążenia limfatycznego odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy tkanek i indukowaniu skutecznych odpowiedzi immunologicznych. Naczynia limfatyczne biegną równolegle do naczyń krwionośnych i przenoszą płyn śródmiąższowy, metabolity i komórki odpornościowe do lokalnego drenującego węzła chłonnego (LN) i ostatecznie w kierunku krążenia żylnego1. Dysfunkcyjny drenaż limfatyczny zaobserwowano podczas infekcji, stanów zapalnych i chorób metabolicznych2,3,4,5. Naczynia limfatyczne składają się z małych naczyń zwanych naczyniami włosowatymi limfatycznymi. Naczynia włosowate limfatyczne są utworzone przez pojedynczą warstwę cienkich komórek śródbłonka limfatycznego (LEC) charakteryzujących się otwartymi połączeniami ("połączeniami przypominającymi guziki") ułatwiającymi płynowi śródmiąższowemu, metabolitom i komórkom odpornościowym, głównie komórkom dendrytycznym (DC) i limfocytom T, wejście do kapilarki limfatycznej lumen5. Naczynia włosowate limfatyczne łączą się w większe naczynia zwane naczyniami zbiorczymi limfy. Kolektory limfatyczne charakteryzują się warstwą LEC otoczoną warstwą mięśniową, która zapewnia autonomiczny tonus skurczowy i utrzymuje przepływ płynów5. Ponadto naczynia zbiorcze posiadają zawory zapewniające jednokierunkowy przepływ limfy.

Leki kolektorów i naczyń włosowatych wyrażają specyficzny zestaw markerów, które odróżniają je od komórek śródbłonka krwi (BEC). Wśród tych czynników Prox1 jest czynnikiem transkrypcyjnym kierującym wytwarzaniem LEC i ulega silnej ekspresji w LEC, podczas gdy nie ma go w BEC. Krytyczny udział Prox1 w biologii LEC został zilustrowany przez wygenerowanie i analizę myszy z niedoborem Prox16. Myszy heterozygotyczne Prox1 mają wadliwy rozwój naczyń limfatycznych charakteryzujący się zmniejszoną gęstością naczyń limfatycznych i zwiększoną przepuszczalnością naczyń krwionośnych6. LEC wysoce wyrażają VEGFR3, Podoplanin i CCL215. Markery te nie znajdują się na BEC i pozwalają na oddzielną analizę sieci naczyń limfatycznych i krwionośnych. Lyve1 ulega selektywnej ekspresji w naczyniach włosowatych limfatycznych, gdy jest nieobecny w naczyniach zbiorczych5.

Trzy rodzaje tkanki tłuszczowej zostały opisane na podstawie ich zawartości mitochondrialnej i późniejszego koloru. Bogata w mitochondria termogeniczna brązowa tkanka tłuszczowa odgrywa kluczową rolę podczas ekspozycji na zimno i znajduje się w obszarze międzyłopatkowym u myszy7,8. Adipocyty białe i beżowe mają mniejszą gęstość mitochondriów i biorą udział głównie w magazynowaniu energii w postaci kropelek lipidów. Białe i beżowe adipocyty znajdują się w magazynach trzewnych i podskórnych9.

Obserwacje kliniczne wykazały związek między otyłością a dysfunkcją układu limfatycznego10. Otyłość wywołuje zmiany morfologiczne układu limfatycznego tkanki tłuszczowej i prowadzi do upośledzenia transportu limfy11. Dane uzyskane w modelach przedklinicznych wykazały, że dieta wysokotłuszczowa (HFD) indukuje przebudowę limfy, a otyłe myszy mają mniejsze węzły chłonne i mniejszą liczbę naczyń limfatycznych12. Niemniej jednak dokładne mechanizmy molekularne rządzące tym fenotypem pozostają do wyjaśnienia. Udział LEC w otyłości jest dodatkowo wspierany przez obserwacje w modelach genetycznych z upośledzonym rozwojem naczyń limfatycznych. Jak omówiono wcześniej, myszy heterozygotyczne Prox1 (Prox1+/-) mają źle funkcjonujący układ limfatyczny i przypadkowo rozwijają nadmierne nagromadzenie trzewnej tkanki tłuszczowej w porównaniu do Prox1 wystarczającej ilości zwierząt6. Co ciekawe, ten fenotyp tkanki tłuszczowej jest ratowany przez przywrócenie funkcji limfatycznej13. Łącznie wyniki te ujawniły silne wzajemne powiązania między naczyniami limfatycznymi a tkanką tłuszczową, które wymagają dalszych badań.

W kontekście stanu zapalnego, cechy charakterystycznej otyłości, zmieniona ekspresja markerów LEC i BEC utrudnia analizę tych komórek za pomocą klasycznego barwienia przeciwciałami14,15. Opracowano modele genetyczne do oznaczania specyficznie LEC i BEC, które pozwalają złagodzić ten problem16,17,18,19. Jednak wykorzystanie genetycznych linii reporterowych wymaga wielu etapów hodowli i znacznie wydłuża czas trwania i koszt projektu. Dlatego proponujemy zastosowanie zastrzyków z lektyny sprzężonej z fluorochromem do zbadania krwi i układu krążenia limfatycznego w podskórnej tkance tłuszczowej, co jest prostym i stosunkowo niedrogim podejściem. Lektyna sprzężona z różnymi fluorochromami jest dostępna w handlu i może być wstrzykiwana dożylnie w celu oznakowania naczyń krwionośnych lub podskórnie w celu oznaczenia drenujących skórę naczyń limfatycznych osadzonych w podskórnej tkance tłuszczowej. Podejście to opiera się na użyciu oddzielnych koniugatów fluorochrom-lektyna dla każdego wstrzyknięcia i pozwala na odrębne oznakowanie każdego naczynia krwionośnego. Metoda ta jest również kompatybilna z wykorzystaniem modeli genetycznych do oznaczania sieci naczyń limfatycznych lub krwionośnych. Co ważne, zapewnia wiele odczytów w celu analizy ogólnego stanu zdrowia podskórnej tkanki tłuszczowej oraz wypełniających ją naczyń krwionośnych i limfatycznych. Procedura ta może być łatwo zastosowana do analizy sieci naczyń limfatycznych i krwionośnych podczas ostrych i przewlekłych chorób skóry, w tym łuszczycy i infekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi komisjami etycznymi.

UWAGA: Prox1-cre-ERT2 (Prox1tm3(cre/ERT2)Gco/J, Jax #022075) i Rosa26-LSL-tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, Ai9, Jax #007914) uzyskano z The Jackson Laboratory i skrzyżowano w celu uzyskania indukowalnej limfatycznej linii myszy reporterowej Prox1-cre-ERT2::tdTomato. Myszy krzyżowano wstecznie na tle C57BL/6 przez 10 pokoleń. Sześciotygodniowe samce myszy Prox1-cre-ERT2::tdSamce myszy Tomato otrzymywały dietę tamoksyfenową przez 3 tygodnie. Dieta tamoksyfenowa od Envigo Teklad (dieta nr. TD.130857; 500 mg/kg). Eksperymenty przeprowadzono na 12-14-tygodniowych myszach. Protokół ten ma zastosowanie do myszy w każdym wieku, każdej płci i odmiany.

1. Przygotowanie materiału

  1. Wysterylizuj nożyczki, kleszcze i szpilki preparacyjne przy użyciu 70% etanolu.
  2. Przygotować dwie strzykawki o pojemności 1 ml z igłami o rozmiarze od 25 do 27 mm. Do wstrzykiwań podskórnych zalecamy użycie mikrostrzykawki do wstrzyknięcia 10 μl w górną część panewki.
  3. W plastikowej probówce o pojemności 1,5 ml przygotuj 200 μl lektyny sprzężonej z DyLight 488 rozcieńczonej w sterylnym PBS w końcowym stężeniu 100 μg/ml.
  4. W innej plastikowej probówce o pojemności 1,5 ml przygotuj 100 μl lektyny sprzężonej z DyLight 649 rozcieńczonej w sterylnym PBS o końcowym stężeniu 100 μg/ml.
  5. Przygotować 6-dołkową płytkę zawierającą PBS i przechowywać ją na lodzie.
  6. Przygotuj roztwór 4% paraformaldehydu i 30% sacharozy.

2. Oznaczanie podskórnej tkanki tłuszczowej, krwi i naczyń limfatycznych.

  1. Znieczulić mysz przez inhalację 5% izofluranu. Oceń głębokość znieczulenia, mocno ściskając łapę zwierzęcia, aby upewnić się, że zwierzę nie zostało skrzywdzone podczas zabiegu. Znieczulenie należy utrzymywać do końca etapów wstrzykiwania lektyny lub do czasu eutanazji.
  2. Wstrzyknąć dożylnie 100 μl lektyny sprzężonej z DyLight 488 do żyły ogonowej, aby oznaczyć układ krwionośny. Odczekaj 15 minut przed przystąpieniem do pobierania tkanek.
  3. Za pomocą innej strzykawki wstrzyknąć podskórnie 10 μl lektyny sprzężonej z DyLight 649 w górną część opuszki zwierzęcia, aby oznaczyć drenujące naczynia limfatyczne. Odczekaj 15 minut przed przystąpieniem do pobierania tkanek.
  4. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy lub narażenie na CO2 15 minut po wstrzyknięciu.

3. Pobieranie podskórnej tkanki tłuszczowej

  1. Połóż mysz na plecach na desce sekcyjnej.
  2. Wysterylizuj futro myszy za pomocą 70% etanolu.
  3. Podnieś skórę boku za pomocą kleszczy i wykonaj poprzeczne nacięcie, aby odsłonić ramienną poduszeczkę tłuszczową.
  4. Delikatnie pociągnij za skórę, aby oddzielić ją od magazynu tkanki tłuszczowej ramiennej, odsłaniając w ten sposób całą podskórną tkankę tłuszczową ramienia zawierającą węzeł chłonny i naczynie kolektora limfatycznego.
  5. Za pomocą kleszczy i nożyczek delikatnie usuń podskórne magazyny tłuszczu i przenieś je do naczynia zawierającego zimny PBS. Aby uzyskać najlepsze wyniki, zalecamy usunięcie magazynów tłuszczu jako jednego elementu.
  6. Od tego momentu chroń tkankę przed światłem.

4. Utrwalenie tkanek

  1. Pobraną tkankę zanurzyć w roztworze zawierającym 4% paraformaldehydu i 30% sacharozy.
  2. Inkubuj tkankę w tym roztworze co najmniej przez noc przed przygotowaniem jej do obrazowania.

5. Barwienie i obrazowanie

  1. Aby uzyskać optymalne wyniki, wykonaj oczyszczanie tkanek i konfokalną akwizycję 3D zgodnie z opisem Gillerona i współpracowników20. Zalecamy użycie mikroskopu arkuszowego światła do analizy dużych tkanek. Podczas procesu oczyszczania można wykonać dodatkowe barwienie.
  2. Aby uzyskać najlepsze mapowanie tkanek, należy zastosować następujące przeciwciała:
    Dla adipocytów: Perilipin
    Dla makrofagów: barwienie CD68 i CD11b.
    Dla komórek dendrytycznych: MHC II i CD11b.
    Dla komórek B: barwienie B220 (CD45R).
    Dla limfocytów T: barwienie CD3.
    UWAGA: Ta metoda jest zgodna z wykorzystaniem modeli genetycznych do znakowania komórek odpornościowych.
  3. W celu analizy naczynia kolektora limfatycznego za pomocą przyżyciowej mikroskopii 2-fotonowej należy wstrzyknąć lektynę podskórnie w dolną opuszkę stopy i uwidocznić naczynie zbiorcze limfatyczne podkolanowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby przeprowadzić analizę topologiczną sieci naczyń krwionośnych i limfatycznych w tkance tłuszczowej ramienia, podaliśmy podskórnie lektynę sprzężoną z Alexa Fluor 649 oraz dożylnie lektynę sprzężoną z Alexa Fluor 488. Tkankę tłuszczową ramienia starannie wycięto, utrwalono, poddano protokołowi klarowania, a następnie przeanalizowano metodą barwienia całego preparatu (whole-mount). Schematyczna reprezentacja procedury przedstawiona jest na Rysunku 1A. Naczynia krwionośne są zaznaczone na zi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Takie podejście zapewnia skuteczne i solidne znakowanie naczyń krwionośnych i limfatycznych podskórnej tkanki tłuszczowej. Oddzielna analiza sieci śródbłonka krwi i limfy może odkryć patologiczne mechanizmy wpływające na jeden lub oba układy krążenia podczas otyłości lub innych stanów patologicznych. Protokół ten ma na celu analizę architektury układów naczyniowych, ich interakcji z komórkami zrębu i odpornościowymi oraz ich funkcjonalności w zdrowiu i chorobie.

Metodę ułatwia obecność węzła c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych ujawnień i konfliktu interesów.

Podziękowania

SI jest wspierany przez Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) oraz Agence Nationale de la Recherche (ANR-17-CE14-0017-01 i ANR-19-ECVD-0005-01). AG jest wspierana przez rząd francuski w ramach projektów UCAJedi Investments in the Future zarządzanych przez Narodową Agencję Badawczą (ANR) o numerze referencyjnym ANR-15-IDEX-01. RSC jest wspierany przez FA-2020-01-IBD-1 z Lawrence C. Pakula, MD IBD Education & Innovation Fund".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lectin DyLight 649Vector LabsDL-1178-1Opisany w protokole
Lectin DyLight 488Vector LabsDL-1174Opisany w protokole
ParaformaldehydVWR Chemicals9713.1000
SacharozaEuromedexNumer CAS 57-50-1
Anty-PodoplaninaAngioBio11-033Rozcieńczenie: 1/50
Lectin DyLight 594Vector LabsDL-1177Opisany w protokole
Anti-MHCII (Klon M5/114.15.2)Biolegend107618Rozcieńczenie: 1/100
Anty-CD11b (Klon M1/70)Biolegend101218Rozcieńczenie: 1/100
Anty-CD68 (Klon FA.11)Biolegend137004Rozcieńczenie: 1/100
Anty-B220 (Klon RA3-6B2)Biolegend103225Rozcieńczenie: 1/100
Anty-Perilipin (Klon PERI 112.17)Progen651156Rozcieńczenie: 1/50
Anty-CD3 (Klon 17A2)Biolegend100210Rozcieńczenie: 1/100

Bibliografia

  1. Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. Journal of Experimental Medicine. 204 (10), 2349-2362 (2007).
  2. Fonseca, D. M., et al. Microbiota-Dependent Sequelae of Acute Infection Compromise Tissue-Specific Immunity. Cell. 163 (2), 354-366 (2015).
  3. Thomas, S. N., et al. Impaired humoral immunity and tolerance in K14-VEGFR-3-Ig mice that lack dermal lymphatic drainage. The Journal of Immunology. 189 (5), 2181-2190 (2012).
  4. Kuan, E. L., et al. Collecting lymphatic vessel permeability facilitates adipose tissue inflammation and distribution of antigen to lymph node-homing adipose tissue dendritic cells. The Journal of Immunology. 194 (11), 5200-5210 (2015).
  5. Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2017).
  6. Harvey, N. L., et al. Lymphatic vascular defects promoted by Prox1 haploinsufficiency cause adult-onset obesity. Nature Genetics. 37 (10), 1072-1081 (2005).
  7. Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and Beige Fat: Physiological Roles beyond Heat Generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
  8. Wu, J., Cohen, P., Spiegelman, B. M. Adaptive thermogenesis in adipocytes: is beige the new brown. Genes and Development. 27 (3), 234-250 (2013).
  9. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes & Essential Fatty Acids. 73 (1), 9-15 (2005).
  10. Kataru, R. P., et al. Regulation of Lymphatic Function in Obesity. Frontiers in Physiology. 11, 459(2020).
  11. Escobedo, N., Oliver, G. The Lymphatic Vasculature: Its Role in Adipose Metabolism and Obesity. Cell Metabolism. 26 (4), 598-609 (2017).
  12. Weitman, E. S., et al. Obesity impairs lymphatic fluid transport and dendritic cell migration to lymph nodes. PLoS One. 8 (8), 70703(2013).
  13. Escobedo, N., et al. Restoration of lymphatic function rescues obesity in Prox1-haploinsufficient mice. JCI Insight. 1 (2), (2016).
  14. Commerford, C. D., et al. Mechanisms of Tumor-Induced Lymphovascular Niche Formation in Draining Lymph Nodes. Cell Reports. 25 (13), 3554-3563 (2018).
  15. Gregory, J. L., et al. Infection Programs Sustained Lymphoid Stromal Cell Responses and Shapes Lymph Node Remodeling upon Secondary Challenge. Cell Reports. 18 (2), 406-418 (2017).
  16. Ivanov, S., et al. CCR7 and IRF4-dependent dendritic cells regulate lymphatic collecting vessel permeability. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1581-1591 (2016).
  17. Zhong, W., et al. Prox1-GFP/Flt1-DsRed transgenic mice: an animal model for simultaneous live imaging of angiogenesis and lymphangiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 581-598 (2017).
  18. Choi, I., et al. Visualization of lymphatic vessels by Prox1-promoter directed GFP reporter in a bacterial artificial chromosome-based transgenic mouse. Blood. 117 (1), 362-365 (2011).
  19. Pham, T. H., et al. Lymphatic endothelial cell sphingosine kinase activity is required for lymphocyte egress and lymphatic patterning. Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 17-27 (2010).
  20. Gilleron, J., et al. Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).
  21. Ivanov, S., Merlin, J., Lee, M. K. S., Murphy, A. J., Guinamard, R. R. Biology and function of adipose tissue macrophages, dendritic cells and B cells. Atherosclerosis. 271, 102-110 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

naczynia limfatycznenaczynia krwiono netkanka t uszczowapodsk rna tkanka t uszczowalokalizacja w z w ch onnychlektyny sprz one z fluorochromemobrazowanie 3Danaliza g sto ci naczymodel oty o cifunkcja limfatyczna
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły