Otyłość to rosnący globalny problem zdrowia publicznego. Wcześniej kojarzono go z dysfunkcją układu limfatycznego, co sugeruje istotną interakcję między tkanką tłuszczową a układem limfatycznym. W tym przypadku proponujemy przystępną metodologię pozwalającą na wyraźne znakowanie naczyń krwionośnych i limfatycznych w obrębie podskórnej tkanki tłuszczowej.
Artykuł metodologiczny
Analiza układu limfatycznego i krwionośnego podczas otyłości
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Naczynia limfatyczne i węzły chłonne są nieuchronnie osadzone w tkance tłuszczowej. Fizjologiczne znaczenie tej obserwacji pozostaje nadal niewyjaśnione. Jednak otyłość charakteryzuje się upośledzoną funkcją limfy i zwiększoną przepuszczalnością naczyń. I odwrotnie, dysfunkcja limfy indukuje otyłość u myszy, co sugeruje znaczną zależność między naczyniami limfatycznymi a tkanką tłuszczową. Dlatego zrozumienie czynników prowadzących do dysfunkcji układu limfatycznego może otworzyć nowe okna terapeutyczne w celu zapobiegania otyłości i związanym z nią chorobom współistniejącym. Pierwszym krokiem w tym procesie jest precyzyjna i szczegółowa wizualizacja sieci limfatycznej w zdrowej i zapalnej tkance tłuszczowej. Tutaj opisujemy szybką, niedrogą i skuteczną metodę, która pozwala na znakowanie i analizowanie naczyń limfatycznych i krwionośnych. Podejście to wykorzystuje drenującą skórę lokalizację węzłów chłonnych ramiennych w podskórnej tkance tłuszczowej. Arboryzacja limfatyczna tej tkanki może być ujawniona przez wstrzyknięcie podskórnie lektyn sprzężonych z fluorochromem. Co więcej, podejście do znakowania in vivo umożliwia ocenę gęstości i funkcji naczyń limfatycznych. W połączeniu z barwieniem naczyń krwionośnych, adipocytów i komórek odpornościowych, protokół pozwala na mapowanie podskórnej tkanki tłuszczowej w wysokiej rozdzielczości za pomocą obrazowania 3D.
Wprowadzenie
Układ krążenia limfatycznego odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy tkanek i indukowaniu skutecznych odpowiedzi immunologicznych. Naczynia limfatyczne biegną równolegle do naczyń krwionośnych i przenoszą płyn śródmiąższowy, metabolity i komórki odpornościowe do lokalnego drenującego węzła chłonnego (LN) i ostatecznie w kierunku krążenia żylnego1. Dysfunkcyjny drenaż limfatyczny zaobserwowano podczas infekcji, stanów zapalnych i chorób metabolicznych2,3,4,5. Naczynia limfatyczne składają się z małych naczyń zwan....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi komisjami etycznymi.
UWAGA: Prox1-cre-ERT2 (Prox1tm3(cre/ERT2)Gco/J, Jax #022075) i Rosa26-LSL-tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, Ai9, Jax #007914) uzyskano z The Jackson Laboratory i skrzyżowano w celu uzyskania indukowalnej limfatycznej linii myszy reporterowej Prox1-cre-ERT2::tdTomato. Myszy krzyżowano wstecznie na tle C57BL/6 przez 10 pokoleń. Sześciotygodniowe samce myszy Prox1-cre-ERT2::tdSamce myszy Tomato otrzymywały dietę tamoksyfenową przez 3 tygodnie. Dieta tamoksyfenowa od Envigo Teklad (dieta nr. TD.130857; 500 mg/kg). Eksperymen....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu przeprowadzenia analizy topologicznej sieci naczyń krwionośnych i limfatycznych w tkance tłuszczowej ramienia, wykonano podskórny wtrysk lektyny sprzężonej z Alexa Fluor 649 oraz dożylny wtrysk lektyny sprzężonej z Alexa Fluor 48. Tkankę tłuszczową ramienia ostrożnie wycięto, utrwalono, poddano protokołowi przejrzyszczania, a następnie przeanalizowano za pomocą barwienia całego preparatu (whole-mount). Schematyczna reprezentacja procedury przedstawiona jest na Rysunku 1A. Naczynia krw.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Takie podejście zapewnia skuteczne i solidne znakowanie naczyń krwionośnych i limfatycznych podskórnej tkanki tłuszczowej. Oddzielna analiza sieci śródbłonka krwi i limfy może odkryć patologiczne mechanizmy wpływające na jeden lub oba układy krążenia podczas otyłości lub innych stanów patologicznych. Protokół ten ma na celu analizę architektury układów naczyniowych, ich interakcji z komórkami zrębu i odpornościowymi oraz ich funkcjonalności w zdrowiu i chorobie.
Metodę ułatwia obecność węzła c.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych ujawnień i konfliktu interesów.
Podziękowania
SI jest wspierany przez Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) oraz Agence Nationale de la Recherche (ANR-17-CE14-0017-01 i ANR-19-ECVD-0005-01). AG jest wspierana przez rząd francuski w ramach projektów UCAJedi Investments in the Future zarządzanych przez Narodową Agencję Badawczą (ANR) o numerze referencyjnym ANR-15-IDEX-01. RSC jest wspierany przez FA-2020-01-IBD-1 z Lawrence C. Pakula, MD IBD Education & Innovation Fund".
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Lectin DyLight 649 | Vector Labs | DL-1178-1 | Opisany w protokole |
| Lectin DyLight 488 | Vector Labs | DL-1174 | Opisany w protokole |
| Paraformaldehyd | VWR Chemicals | 9713.1000 | |
| Sacharoza | Euromedex | Numer CAS 57-50-1 | |
| Anty-Podoplanina | AngioBio | 11-033 | Rozcieńczenie: 1/50 |
| Lectin DyLight 594 | Vector Labs | DL-1177 | Opisany w protokole |
| Anti-MHCII (Klon M5/114.15.2) | Biolegend | 107618 | Rozcieńczenie: 1/100 |
| Anty-CD11b (Klon M1/70) | Biolegend | 101218 | Rozcieńczenie: 1/100 |
| Anty-CD68 (Klon FA.11) | Biolegend | 137004 | Rozcieńczenie: 1/100 |
| Anty-B220 (Klon RA3-6B2) | Biolegend | 103225 | Rozcieńczenie: 1/100 |
| Anty-Perilipin (Klon PERI 112.17) | Progen | 651156 | Rozcieńczenie: 1/50 |
| Anty-CD3 (Klon 17A2) | Biolegend | 100210 | Rozcieńczenie: 1/100 |
Bibliografia
- Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. Journal of Experimental Medicine. 204 (10), 2349-2362 (2007).
- Fonseca, D. M., et al. Microbiota-Dependent Sequelae of Acu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie