Segmentacja wzrostu komórek śródbłonka w 6-dołkowych płytkach na wytrząsarce orbitalnej do badań mechanobiologicznych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę powlekania w celu ograniczenia wzrostu komórek śródbłonka do określonego obszaru 6-dołkowej płytki w celu przyłożenia naprężeń ścinających przy użyciu modelu wytrząsarki orbitalnej.

Streszczenie

Naprężenie ścinające wywierane na ścianę tętnicy przez przepływ krwi wpływa na morfologię i funkcję komórek śródbłonka. Postuluje się, że niskie naprężenia ścinające, oscylacyjne i wielokierunkowe stymulują fenotyp promiażdżycowy w komórkach śródbłonka, podczas gdy uważa się, że wysoka wielkość i jednokierunkowe lub jednoosiowe ścinanie sprzyjają homeostazie śródbłonka. Hipotezy te wymagają dalszych badań, ale tradycyjne techniki in vitro mają ograniczenia i są szczególnie słabe w nakładaniu wielokierunkowych naprężeń ścinających na komórki.

Jedną z metod, która zyskuje coraz większe zastosowanie, jest hodowla komórek śródbłonka na standardowych płytkach wielodołkowych na platformie wytrząsarki orbitalnej; w tej prostej, taniej, wysokoprzepustowej i przewlekłej metodzie, wirujący medium wytwarza różne wzory i wielkości ścinania, w tym wielokierunkowe ścinanie, w różnych częściach studni. Ma jednak istotne ograniczenie: komórki w jednym regionie, wystawione na jeden rodzaj przepływu, mogą uwalniać mediatory do podłoża, które wpływają na komórki w innych częściach studni, wystawione na różne przepływy, zniekształcając w ten sposób pozorną zależność między przepływem a fenotypem.

Tutaj prezentujemy łatwą i niedrogą modyfikację metody, która pozwala na wystawienie komórek tylko na określone charakterystyki naprężeń ścinających. Wysiewanie komórek jest ograniczone do określonego obszaru studzienki poprzez pokrycie obszaru zainteresowania fibronektyną, a następnie pasywację przy użyciu roztworu pasywacyjnego. Następnie płytki mogą być wirowane na wytrząsarce, co powoduje wystawienie komórek na dobrze zdefiniowane profile ścinania, takie jak ścinanie wielokierunkowe o małej wielkości lub ścinanie jednoosiowe o dużej wielkości, w zależności od ich lokalizacji. Tak jak poprzednio, zastosowanie standardowych tworzyw sztucznych do hodowli komórkowych pozwala na prostą dalszą analizę komórek. Modyfikacja pozwoliła już na zademonstrowanie rozpuszczalnych mediatorów, uwalnianych ze śródbłonka przy określonej charakterystyce naprężeń ścinających, które wpływają na komórki znajdujące się w innym miejscu studni.

Wprowadzenie

Reakcje komórek naczyniowych na ich środowisko mechaniczne są ważne dla prawidłowego funkcjonowania naczyń krwionośnych i rozwoju choroby¹. Mechanobiologia komórek śródbłonka (EC), które wyściełają wewnętrzną powierzchnię wszystkich naczyń krwionośnych, była szczególnym przedmiotem badań mechanobiologicznych, ponieważ EC bezpośrednio doświadczają naprężeń ścinających generowanych przez przepływ krwi nad nimi. Różne zmiany fenotypowe, takie jak reakcje zapalne, zmieniona sztywność i morfologia, uwalnianie substancji wazoaktywnych oraz lokalizacja i ekspresja białek połączeniowych, zależą od ekspozycji EC na naprężenie ścinające^2,3,4. Właściwości śródbłonka zależne od ścinania mogą również odpowiadać za nierównomierny rozwój chorób, takich jak miażdżyca^5,6,7.

Przydatne jest badanie wpływu ścinania na EC w hodowli, gdzie naprężenia mogą być kontrolowane, a EC mogą być izolowane od innych typów komórek. Powszechnie stosowane urządzenia in vitro do przykładania naprężeń ścinających do EC obejmują komorę przepływu z równoległą płytką i lepkościomierz stożkowo-płytkowy, ale można stosować tylko jednoosiowy przepływ stały, oscylacyjny i pulsacyjny^8,9. Chociaż opracowano zmodyfikowane komory przepływowe o stożkowej lub rozgałęzionej geometrii i chipach mikroprzepływowych, które naśladują geometrię zwężoną, ich niska przepustowość i stosunkowo krótki czas trwania hodowli, który jest możliwy, stanowią wyzwanie^{10, 11}.

Metoda wytrząsarki orbitalnej (lub studni wirowej) do badania mechanotransdukcji śródbłonka, w której komórki są hodowane w standardowym plastikowym naczyniu do hodowli komórkowych umieszczonym na platformie wytrząsarki orbitalnej, zyskuje coraz większą uwagę, ponieważ jest zdolna do chronicznego narzucania złożonych, przestrzennie zmiennych wzorców naprężeń ścinających na EC o wysokiej przepustowości (zobacz recenzję Warboys et al.¹²). Symulacje obliczeniowej dynamiki płynów (CFD) zostały wykorzystane do scharakteryzowania przestrzennej i czasowej zmienności naprężeń ścinających w wirującej studni. Wirowy ruch pożywki hodowlanej spowodowany ruchem orbitalnym platformy wytrząsającej, na której umieszczona jest płytka, prowadzi do przepływu wielokierunkowego o niskiej wielkości (LMMF lub przypuszczalnie przepływu promiażdżycowego) w centrum i przepływu jednoosiowego o wysokiej wielkości (HMUF lub przypuszczalnie przepływu miażdżycowego) na krawędzi studzienek płytki 6-dołkowej. Na przykład uśrednione w czasie naprężenie ścinające ścianki (TAWSS) wynosi około 0,3 Pa w środku i 0,7 Pa na krawędzi 6-dołkowej płytki zawirowanej z prędkością 150 obr./min o promieniu orbity 5 mm¹³. Metoda wymaga wyłącznie dostępnych na rynku wyrobów z tworzyw sztucznych i samej wytrząsarki orbitalnej.

Istnieje jednak wada tej metody (i innych metod narzucania przepływów in vitro): EC uwalniają rozpuszczalne mediatory i mikrocząstki w sposób zależny od ścinania^14,15,16 i ten sekretom może wpływać na EC w regionach studni innych niż ten, w którym zostały uwolnione, z powodu mieszania się w wirującym medium. Może to maskować rzeczywisty wpływ naprężeń ścinających na fenotyp EC. Na przykład, Ghim i in. spekulowali, że wyjaśnia to pozornie identyczny wpływ różnych profili ścinania na transkomórkowy transport dużych cząstek¹⁷.

Tutaj opisujemy metodę promowania adhezji ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) w określonych obszarach płytki 6-dołkowej za pomocą powłoki fibronektynowej przy użyciu Pluronic F-127 do pasywacji powierzchni i zapobiegania wzrostowi w innych miejscach. Metoda rozwiązuje opisane powyżej ograniczenie, ponieważ, poprzez segmentację wzrostu komórek, EC doświadczają tylko jednego rodzaju profilu ścinania i nie mają na nie wpływu sekretomy z EC wystawione na działanie innych profili w innym miejscu studni.

Protokół

1. Produkcja urządzeń i przygotowanie odczynników

1. Wykonanie modułu ze stali nierdzewnej
   1. Wykonaj moduł ze stali nierdzewnej ze stali nierdzewnej klasy 316 za pomocą frezarki CNC zgodnie z dostarczonym rysunkiem technicznym (Rysunek 1).
2. Druk 3D formy z polidimetylosiloksanu (PDMS)
   1. Przygotuj model 3D do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) formy PDMS za pomocą SolidWorks zgodnie z dostarczonym rysunkiem technicznym (Rysunek 2).
   2. Wyeksportuj model CAD do pliku STL i zaimportuj plik STL do Cura 2.6.2.
   3. Pokrój model na warstwy z prędkością druku 50 mm/s i gęstością wypełnienia 60%.
   4. Wyeksportuj plik jako G-code i prześlij go do drukarki 3D Ultimaker² w celu wydrukowania. Użyj kwasu polimlekowego (PLA) jako materiału do drukowania.
3. Odlewanie pierścienia PDMS
   1. Wymieszaj bazę PDMS i utwardzacz (oba z zestawu elastomerów silikonowych) w proporcji 90,9% bazy i 9,1% utwardzacza.
   2. Wlej około 2,6 ml dobrze wymieszanego roztworu do formy wydrukowanej w 3D.
   3. Usuń pęcherzyki w próżniowej komorze odgazowywania.
   4. Utwardzać przez 1 godzinę w piecu o temperaturze 80 °C.
   5. Poczekaj, aż pierścień PDMS ostygnie do temperatury pokojowej, a następnie ostrożnie wyjmij utwardzony pierścień PDMS z formy. Rysunek techniczny pierścienia PDMS jest pokazany na Rysunek 3.
4. Przygotowanie 1% pluronicznego F-127
   1. Odważyć 5 g Pluronic F-127, przelać do szklanej butelki, a następnie dodać 100 ml sterylnej wody do szklanej butelki. Daje to 5% roztwór Pluronic F-127.
   2. Upewnij się, że cały proszek Pluronic F-127 jest zanurzony w wodzie, zamknij nakrętkę i autoklawuj ją w autoklawie za pomocą programu cyklu sterylizacji płynów.
   3. Po autoklawie pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej przed użyciem.
   4. Dodaj 10 ml 5% roztworu Pluronic F-127 do 40 ml autoklawowanej sterylnej wody, aby uzyskać 1% roztwór Pluronic F-127. Rozcieńczenie należy przeprowadzić w okapie komory bezpieczeństwa biologicznego (BSC).
   5. Przechowuj zarówno 1%, jak i 5% Pluronic F-127 w temperaturze pokojowej.
5. Przygotowanie 4% paraformaldehydu (PFA)
   1. Dodać 800 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do szklanej zlewki i podgrzać do temperatury 60 °C, mieszając (mieszać od kroku 1.5.1 do 1.5.5).
   2. Odważyć 40 g proszku PFA i dodać go do ciepłego roztworu PBS.
      UWAGA: PFA jest niebezpieczny, wykonaj kroki od 1.5.2 do 1.5.6 w dygestorium.
   3. Powoli dodawać 1 M wodorotlenek sodu (NaOH) do roztworu PFA, aż roztwory staną się klarowne.
   4. Doprowadzić pH roztworu PFA do około 7,4 za pomocą 1 M kwasu solnego (HCl).
   5. Uzupełnić roztwór do 1 litra za pomocą 1X PBS. Daje to 1 L 4% PFA.
   6. Przefiltrować roztwór PFA za pomocą filtrów 0,2 μm, aby usunąć wszelkie cząstki stałe, podwielokrotność i zamrozić w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
6. Preparat 0,1% Triton-X
   1. Dodaj 50 μl czystego Triton-X do 50 ml PBS, aby uzyskać 0,1% roztwór Triton-X.
7. Przygotowanie 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)
   1. Odważyć 0,5 g BSA, wlać do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, a następnie dodać do niej 50 ml PBS.
   2. Pozostaw na wałku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej do rozpuszczenia.
   3. Przechowywać 1% BSA w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.

2. Powłoka płytki 6-dołkowej

1. Autoklaw modułu ze stali nierdzewnej, pierścienia PDMS i pęsety przed użyciem. Wszystkie kolejne procedury należy wykonać w okapie BSC i przestrzegać technik aseptycznych, aby zapewnić sterylność.
2. Umieść pierścień PDMS w 6-dołku za pomocą pęsety. Użyj zewnętrznej krawędzi pierścienia PDMS, aby wyrównać pierścień PDMS koncentrycznie ze studnią.
   UWAGA: Należy używać wyłącznie płytek studzienkowych niepoddanych hodowli tkankowej.
3. Umieść moduł ze stali nierdzewnej na pierścieniu PDMS za pomocą pęsety.
4. Włóż końcówki szczypiec do wewnętrznego pierścienia ustalającego w otwory uchwytu pierścienia ustalającego, ściśnij uchwyt, aby zmniejszyć średnicę pierścienia ustalającego. Włóż go do 6-dołka, mocno dociśnij go do modułu ze stali nierdzewnej i zwolnij szczypce, aby zabezpieczyć pierścień PDMS w studzience.
5. Dodaj 1 ml fibronektyny o stężeniu 5 μg/ml do środka lub krawędzi studzienki (w zależności od obszaru zainteresowania) przez otwór pierścienia PDMS i modułu ze stali nierdzewnej.
6. Zakręć płytką, aby upewnić się, że roztwór fibronektyny pokrywa cały obszar zainteresowania.
7. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze w 95% powietrza/5% CO₂ .
8. Usuń roztwór fibronektyny ze studzienki i przemyj dwukrotnie PBS. Całkowicie usuń PBS ze studni.
9. Zdejmij pierścień ustalający, moduł ze stali nierdzewnej i pierścień PDMS ze studni.
10. Dodać 1,5 ml 1% Pluronic F-127 do środka lub krawędzi studzienki (powierzchnia niepowlekana) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu pasywacji niepowlekanej powierzchni.
11. Usunąć roztwór Pluronic F-127 ze studzienki i przemyć trzykrotnie PBS.
12. Powleczoną studzienkę należy natychmiast zużyć lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni z warstwą PBS w powlekanej studzience.

3. Wysiewanie HUVEC

1. W eksperymencie użyj HUVEC poniżej przejścia 5.
2. Usuń całą pożywkę hodowlaną i przemyj komórki raz PBS.
3. Dodać 3 ml 0,05% trypsyny i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze w 95% powietrzu/5% CO₂ . Delikatnie postukać w kolbę, aby usunąć komórki.
   UWAGA: Ten protokół został przetestowany przy użyciu HUVEC, a stężenie trypsyny i czas jej inkubacji mogą być różne dla innych typów EC.
4. Przenieść roztwór do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i zneutralizować trypsynę za pomocą 6 ml pożywki hodowlanej (np. Lonza EGM-2) podgrzanej do temperatury 37 °C.
5. Wirować przy 200 x g przez 5 minut. Usunąć zobojętniony roztwór trypsyny i ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.
6. Policz komórki za pomocą hemocytometru i wysiew 180 tys. komórek na powlekanej 6-dołkowej płytce w 1,5 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.
7. Potrząśnij płytką studzienki na boki, aby upewnić się, że komórki równomiernie rozprowadzają się w studzience.
8. Pozostaw na noc w inkubatorze z wilgotnością 37 °C w 95% powietrza/5% CO_{2 .}
9. Usuń nieprzyłączone komórki i pożywkę hodowlaną i zastąp ją 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.
   UWAGA: spodziewanych jest wiele nieprzyłączonych komórek unoszących się na podłożu.

4. Zastosowanie naprężenia ścinającego za pomocą wytrząsarki orbitalnej

1. HUVEC powinny osiągnąć konfluencję po 3 dniach wzrostu. Zastąp pożywkę 1,9 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej (aby osiągnąć wysokość 2 mm).
2. Umieść płytkę na platformie wytrząsarki orbitalnej w nawilżanym inkubatorze pod 95% powietrzem/5% CO₂ i obracaj ją z prędkością 150 obr./min przez 3 dni.
   UWAGA: Wytrzyj zewnętrzną powierzchnię wytrząsarki orbitalnej przy użyciu 70% etanolu przed umieszczeniem jej w inkubatorze.
3. (Opcjonalnie) Po 2 dniach ścinania cytokiny można dodać do pożywki hodowlanej w celu zbadania wzajemnych oddziaływań między cytokinami a stresem ścinającym. Po zabiegu ścinaj komórki przez kolejny dzień. W tym badaniu do aktywacji komórek wykorzystano TNF-α.
4. Analizy należy wykonać po 3 dniach od przyłożenia naprężeń ścinających.

5. Barwienie i obrazowanie komórek

1. Po 3 dniach ścinania wyjąć płytkę z inkubatora i dwukrotnie przemyć komórki PBS.
2. Utrwal komórki, dodając 1,5 ml 4% PFA do studzienki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
3. Usuń 4% PFA ze studzienki i umyj dwukrotnie PBS.
4. Przepuszczalność komórek poprzez dodanie 0,1% Triton-X do studzienki i inkubację przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Usunąć 0,1% roztwór Triton-X ze studzienki i dodać 1,5 ml 1% BSA do studzienki w celu zablokowania. Inkubować komórki z 1% BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Rozcieńczyć królicze przeciwciało anty-ludzkie ZO-1 w rozcieńczeniu 1:200 w 1% BSA. Dodać 1,5 ml rozcieńczonego przeciwciała do studzienki i inkubować je z komórkami przez noc w temperaturze 4 °C.
7. Po całonocnej inkubacji usunąć rozcieńczone przeciwciało i trzykrotnie przemyć komórki PBS.
8. Rozcieńczyć kozie przeciwciało anty-królicze IgG znakowane kozią powłoką Fluor 488 w rozcieńczeniu 1:300 w PBS. Dodać 1,5 ml rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do studzienki i inkubować je z komórkami przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
9. Usunąć rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe i dwukrotnie przemyć komórki PBS.
10. Rozcieńczyć DRAQ5 w rozcieńczeniu 1:1000 w PBS. Dodać 1,5 ml rozcieńczonego DRAQ5 do studzienki i inkubować z komórkami przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu zabarwienia jąder komórkowych.
11. Usunąć rozcieńczony DRAQ5 i przemyć trzykrotnie PBS.
12. Wykonaj skan płytek od krawędzi do środka studni za pomocą mikroskopu konfokalnego.

6. Kwantyfikacja indeksu kształtu i liczby komórek

1. Przetwarzanie końcowe obrazów za pomocą MATLAB R2016a.
2. Odczytaj plik LIF z mikroskopu konfokalnego do MATLAB i przekonwertuj scalony skan kafelka na obraz binarny, a następnie proguj obraz według obszaru i intensywności, aby odróżnić jądra od tła.
3. Podziel skan kafelka binarnego na segmenty promieniowe o średnicy 1 mm.
4. Dopasuj elipsę do każdego pojedynczego jądra.
5. Policz liczbę elipsy w każdym segmencie promieniowym, aby uzyskać numer komórki.
6. Zdefiniuj indeks kształtu = jako SI = 4π x Powierzchnia / Obwód². Oblicz indeks kształtu dla każdej klasy elipsa18.

Wyniki

Adhezja HUVECs do obszarów płytki do hodowli niepokrytych fibronektyną została zniesiona dzięki pasywacji Pluronic F-127; wzrost komórek ograniczał się do obszaru pokrytego fibronektyną nawet po 72 h hodowli, zarówno przy zastosowaniu, jak i bez zastosowania naprężenia ścinającego (Rycina 4A, Rycina 4C). Bez pasywacji Pluronic F-127 komórki HUVECs przytwierdziły się do powierzchni pozbawionej fibronektyny i uległy dalszej prolife...

Dyskusja

Metoda studni wirowej jest w stanie wygenerować złożone profile przepływu w jednym odwiercie - przepływ wielokierunkowy o niskiej wielkości (LMMF) w centrum i przepływ jednoosiowy o dużej wielkości (HMUF) na krawędzi studni. Jednak wydzieliny rozpuszczalnego mediatora za pośrednictwem naprężeń ścinających zostaną zmieszane z wirującym podłożem i wpłyną na komórki w całej studzience, potencjalnie maskując prawdziwy wpływ określonego profilu naprężenia ścinającego na komórki.

Zademonstrowana tut...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cell and Media
Endothelial Growth Medium (EGM-2)	Lonza	cc-3162
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej	NA		NA Izolowane z pępowiny uzyskanej od dawców z nieskomplikowanym porodem w Hammersmith Hospital
Odczynniki i materiały
Alexa Fuor 488-znakowana koza anty-królicza IgG	Thermofisher Scientific	A11008
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A9418-50G
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Nie leczony	Zaopatrzenie laboratoriów naukowych Sp. z o.o.
Fibronektyna z osocza bydlęcego	Sigma-Aldrich	F1141-5MG
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127-500G
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma-Aldrich	D8537-6X500ML
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Rekombinowany ludzki TNF-A	Peprotech	300-01A
RS Pro 2,85 mm filament do drukarki 3D PLA, 1 kg	RS	832-0264
Stal nierdzewna 316	Metal Supermarket	NA
Sylgard184 Zestaw elastomerów silikonowych	Farnell	101697
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Roztwór trypsyny-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
Przeciwciało Zonula Occludens-1 (ZO-1)	Technologia sygnalizacji komórkowej	13663
DRAQ5 (5mM)	Bio Status	DR50200
Equipments
Grant Wytrząsarka orbitalna PSU-10i	Scientific Laboratory Supplies Ltd
Mikroskop konfokalny Leica TCS SP5		Leica
ustalające	Misumi	RTWP32-58
Pierścienie ustalające/Wewnętrzne/C-Type	Misumi	RTWS35
Ultimaker 2+Drukarka 3D	Ultimaker	NA
strong>Softwares
Cura 2.6.2	Ultimaker	NA
MATLAB	MathWorks	NA
Solidworks 2016	Dassault Systemes	NA

351146SHA7930 Szczypce do pierścieni ustalających NA Pierścienie <