Hydrofobowa metoda oczyszczania tkanki mózgowej szczura

Summary

Tutaj prezentujemy hydrofobową metodę oczyszczania tkanek, która pozwala na oglądanie docelowych cząsteczek jako części nienaruszonych struktur mózgu. Technika ta została teraz zwalidowana dla kontroli F344/N i transgenicznych szczurów HIV-1 obu płci.

Abstract

Hydrofobowe metody oczyszczania tkanek to łatwe do dostosowania, szybkie i tanie procedury, które pozwalają na badanie interesującej cząsteczki w niezmienionych próbkach tkanek. Tradycyjne procedury znakowania immunologicznego wymagają pocięcia próbki na cienkie sekcje, co ogranicza możliwość znakowania i badania nienaruszonych struktur. Jeśli jednak tkanka mózgowa może pozostać nienaruszona podczas przetwarzania, struktury i obwody mogą pozostać nienaruszone do analizy. Wcześniej ustalone metody oczyszczania zajmują dużo czasu, aby całkowicie oczyścić tkankę, a ostre chemikalia często mogą uszkodzić wrażliwe przeciwciała. Metoda iDISCO szybko i całkowicie oczyszcza tkankę, jest kompatybilna z wieloma przeciwciałami i nie wymaga specjalnego sprzętu laboratoryjnego. Technika ta została początkowo zwalidowana do stosowania w tkankach myszy, ale obecny protokół dostosowuje tę metodę do obrazowania półkul kontrolnych i transgenicznych mózgów szczurów. Oprócz tego obecny protokół wprowadza również kilka poprawek do istniejącego wcześniej protokołu, aby zapewnić wyraźniejsze obrazy z mniejszą ilością plam tła. Przeciwciała przeciwko Iba-1 i hydroksylazie tyrozynowej zwalidowano u transgenicznego szczura HIV-1 i u szczurów kontrolnych F344/N przy użyciu obecnej metody hydrofobowego oczyszczania tkanek. Mózg jest splecioną siecią, w której struktury częściej współpracują ze sobą niż oddzielnie od siebie. Analiza mózgu jako całego systemu, w przeciwieństwie do kombinacji pojedynczych części, jest największą korzyścią płynącą z tej całej metody oczyszczania mózgu.

Introduction

Kilka technik oczyszczania tkanek zostało zatwierdzonych do użytku w mózgu: hydrożelowe, hydrofilowe i hydrofobowe. Techniki te mają na celu przekształcenie tkanki w przezroczystą poprzez delipidację, odbarwianie i odwapnianie poprzez podawanie rozpuszczalników. Gdy współczynnik załamania światła próbki tkanki dopasuje się do współczynnika załamania światła wybranego ośrodka obrazowania, można uzyskać wyraźny obraz próbki. Techniki oparte na hydrożelu, takie jak CLARITY, zabezpieczają biomolekuły w tkance poprzez powiązanie ich z hydrożelami na bazie akrylu, co zapobiega uszkodzeniom strukturalnym i utracie białek¹. Jednak techniki hydrożelowe wykorzystują ostre chemikalia, które mogą uszkodzić bardziej delikatne tkanki, a gęstsze próbki tkanek mogą nie być kompatybilne z protokołem hydrożelowym. Niektóre techniki hydrożelowe mogą wymagać drogiego sprzętu lub prowadzić do rozszerzania się tkanek. Techniki hydrofilowe, takie jak CUBIC, zachowują strukturę 3D poprzez tworzenie wiązań wodorowych w obrębie tkanki². Rozszerzanie tkanek może również wystąpić w niektórych protokołach hydrofilowych. Zdolność oczyszczania technik hydrofilowych często nie odpowiada zdolności, jaką mają techniki hydrofobowe, co jest ważne dla gęstszych i grubszych tkanek³.

Techniki hydrofobowe są zazwyczaj szybkie, nie wymagają specjalnego sprzętu i wytwarzają próbkę, która jest łatwa do obsługi i przechowywania. iDISCO to technika hydrofobowa, która eliminuje skurcz, który może wystąpić w innych protokołach hydrofobowych. Pierwotnie, technika oczyszczania tkanek iDISCO została opisana przez Renier et al.⁴ dla zarodków i gęstych, dorosłych narządów myszy. Technika ta usuwa wodę z tkanki na początkowym etapie odwodnienia, zmniejszając w ten sposób rozproszenie światła. Tkanka jest przepuszczalna podczas wstępnego leczenia, aby umożliwić głęboką penetrację przeciwciał. Barwniki fluorowe Alexa w widmie dalekiej czerwieni są używane do znakowania immunologicznego, aby uniknąć autofluorescencji tkanki na niższych długościach fal⁵. Tkanki, które przeszły hydrofobowe protokoły oczyszczania, mogą być łatwo obsługiwane i mogą być obrazowane kilka razy ze względu na długowieczność barwników Alexa Fluor. Prawidłowo przechowywane tkanki mogą dostarczać obrazy przez miesiące do roku po wstępnym przetworzeniu.

W obecnym protokole, przeciwciało przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH), przeciwciało Iba1 i podjednostka B toksyny (CTB) były stosowane zarówno na męskich, jak i żeńskich mózgach szczurów transgenicznych (Tg) i transgenicznych HIV-1. Szczur HIV-1 Tg posiada siedem z dziewięciu genów, które składają się na genom wirusa HIV-1, co prowadzi do niezakaźnego modelu długotrwałej ekspozycji na białko HIV-1^6,7,8. Zmiany dopaminergiczne zostały wcześniej wykazane u szczura HIV-1 Tg, a sam HIV-1 jest chorobą zapalną, więc wybór przeciwciał był istotny dla projektu eksperymentalnego^9,10,11,12. CTB jest znacznikiem, który przyłącza się do neuronów poprzez wiązanie gangliozydowe i może być używany do śledzenia projekcji aferentnych w mózgu. CTB był wcześniej używany do badania projekcji od jądra półleżącego do obszaru istoty czarnej, dwóch obszarów mózgu silnie zaangażowanych w szlaki dopaminergiczne^13,14,15.

W tym protokole, TH będzie służył jako marker do produkcji dopaminy, a Iba1 będzie oznaczał aktywowany mikroglej. Stosowane selektywnie przeciwciało TH znakuje pojedyncze prążki o stężeniu około 62 kDa, które odpowiada hydroksylazie tyrozyny. Przeciwciało Iba1 odpowiada sekwencji karboksylowo-końcowej Iba1. Oba przeciwciała wyhodowano u królików i były poliklonalne. CTB będzie używany do wstecznego śledzenia neuronów od obszaru jądra półleżącego do obszaru istoty czarnej. Obecny protokół zawiera również wytyczne dotyczące dostosowania oryginalnego protokołu iDISCO na dwa różne sposoby: 1) ogólna redukcja barwienia tła poprzez zmianę odczynników surowicy w etapach blokowania oraz 2) skalowanie czasu inkubacji, aby był odpowiedni dla większych próbek tkanek. Ogólnie rzecz biorąc, niniejszy protokół dostarcza ciągłych dowodów na to, że hydrofobowe techniki oczyszczania są wykonalne w tkankach mózgowych szczura, nie mają dostrzegalnych szkodliwych interakcji z białkami wirusa HIV-1 i są kompatybilne z przeciwciałami TH, przeciwciałami Iba1 i CTB.

Protocol

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Południowej Karoliny.

1. Przygotowanie roztworu podstawowego

1. Roztwór 1 (1 l): Do 900 ml dejonizowanego_H2Ododać 100 ml 10x buforowanej soli fizjologicznej (PBS) i 2 ml Triton X-100.
2. Roztwór 2 (1 l): Do 900 ml dejonizowanego H₂O dodać 100 ml 10 x PBS, 2 ml Tween-20 i 1 ml 10 mg / ml roztworu podstawowego heparyny.
3. Roztwór 3 (500 ml): Do 400 ml roztworu 1 dodać 11,5 g glicyny i 100 ml dimetylosulfotlenku (DMSO).
4. Roztwór 4 (50 ml): Do 42 ml roztworu 1 dodać 3 ml odpowiedniej surowicy i 5 ml DMSO.
5. Pierwszorzędowy roztwór przeciwciał (50 ml): Do 46 ml roztworu 2 dodać 2,5 ml DMSO i 1,5 ml odpowiedniej surowicy.
6. Roztwór przeciwciał drugorzędowych (50 ml): Do 48,5 ml roztworu 2 dodać 1,5 ml odpowiedniej surowicy.
   UWAGA: W przypadku roztworu 4, roztworu pierwszorzędowego i roztworu drugorzędowego należy użyć surowicy odpowiadającej przeciwciału drugorzędowemu (np. kozie, koniowi, bydłu).

2. Przygotowanie próbki

UWAGA: Wykonaj kroki od 2.1 do 2.7 w dygestoriach, aby ograniczyć narażenie na PFA.

1. Głęboko znieczulić młodego (3-6 tygodniowego) szczura za pomocą sewofluranu; przejść do 2,2, gdy szczur nie reaguje i nie reaguje na szczypanie palców u nóg i ogona.
2. Połóż szczura w pozycji leżącej na plecach i wykonaj nacięcie przez ścianę brzucha za pomocą nożyczek do tęczówki.
3. Przetnij dolną część klatki piersiowej do obojczyka po obu stronach klatki piersiowej za pomocą nożyczek Mayo.
4. Przymocuj mostek i żebra z dala od serca i płuc za pomocą hemostatu.
5. Przekłuć lewą komorę igłą 23 G dołączoną do pompy perfuzyjnej i przeciąć prawy przedsionek nożyczkami do tęczówki.
6. Wykonać perfuzję przezsercową z około 75 ml 100 mM (1x) PBS.
7. Kontynuować perfuzję przezsercową z około 100 ml 4% paraformaldehydu (PFA) buforowanego w 1x PBS.
8. Usuń mózg z czaszki za pomocą kleszczy.
9. Umieść mózg w pozycji strzałkowej i pokrój na 4 równe części (około 3 mm szerokości) za pomocą żyletki i matrycy mózgu szczura.
10. Utrwal każdą sekcję w 4% PFA w 1x PBS w szczelnie zamkniętej, 5 ml plastikowej tubie przez noc w temperaturze 4 °C na shakerze.
11. Kontynuuj utrwalanie w 4% PFA w 1x PBS w temperaturze pokojowej (RT) na wytrząsarce przez 1 godzinę.
12. Umyj każdą sekcję 1x PBS w temperaturze RT przez 30 minut, 3 razy.

3. Odwodnienie i depigmentacja

1. Próbkę inkubować w roztworze wody o stężeniu 20% metanolu/80% dejonizowanego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
2. Próbkę inkubować w 40% metanolu/60% roztworze wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Próbkę inkubować w 60% metanolu/40% roztworze wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Próbkę inkubować w roztworze wodnym zawierającym 80% metanol/20% roztwór wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Inkubować próbkę w 100% metanolu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórzyć z większą ilością 100% metanolu, inkubując przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Schładzać próbkę w 100% metanolu w temperaturze 4 °C przez około 10 minut.
7. Przygotować 66% roztwór dichlorometanu (DCM)/33% metanolu.
8. Próbkę inkubować przez noc w roztworze DCM/metanolu w temperaturze pokojowej, wstrząsając.
9. Myć metanolem w temperaturze pokojowej przez 30 minut, 2 razy.
10. Schładzać próbkę w 100% metanolu w temperaturze 4 °C przez około 10 minut.
11. Wybielać w schłodzonym, świeżo przygotowanym 5% nadtlenku wodoru w metanolu przez noc w temperaturze 4°C.
12. Próbkę inkubować w roztworze wodnym zawierającym 80% metanol/20% roztwór wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
13. Próbkę inkubować w 60% metanolu/40% roztworze wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
14. Próbkę inkubować w 40% metanolu/60% roztworze wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
15. Próbkę inkubować w roztworze wody o stężeniu 20% metanolu/80% dejonizowanego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
16. Inkubować próbkę w 1 PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
17. Myć w roztworze 1 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, 2 razy.

4. Etykietowanie podjednostki B toksyny

1. Wprowadzić końcówkę igły strzykawki o pojemności 1 ml w miejsce jądra półleżącego.
2. Powoli wstrzykiwać 2,5 μl 1% biotyny-CTB przez 20 sekund.
3. Pozostaw końcówkę igły na miejscu na 1 minutę i powoli usuwaj przez 10 sekund, aby zapobiec wyciekowi.

5. Aplikacja przeciwciał

1. Inkubować próbkę w roztworze 3 przez 2 dni w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
2. Inkubować próbkę w roztworze 4 przez 2 dni w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
3. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 7 dni w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
4. Myć w roztworze 2 przez 5 razy, inkubując 1 godzinę na pranie. Przechowywać w roztworze 2 w RT przez noc.
5. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przez 7 dni w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
6. Myć w roztworze 2 5 razy, inkubując 1 godzinę na pranie; przechowywać w roztworze 2 w temperaturze RT przez noc.
   UWAGA: Wszystkie kroki od 5.6 wzwyż, w tym końcowe przechowywanie, powinny odbywać się przy słabym oświetleniu. Probówki na próbki mogą być osłonięte folią aluminiową. Stężenia użyte dla przeciwciał w tym protokole wynosiły: TH na 1:100, Iba1 na 1:200 i przeciwciało drugorzędowe na 1:100. Dodaj dodatkowe rozwiązanie 2 do kroków 5.1-5.6, aby upewnić się, że probówki są całkowicie wypełnione.

6. Oczyszczanie tkanek

1. Próbkę inkubować w roztworze wody o stężeniu 20% metanolu/80% dejonizowanego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
2. Próbkę inkubować w 40% metanolu/60% roztworze wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Próbkę inkubować w 60% metanolu/40% roztworze wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Próbkę inkubować w roztworze wodnym zawierającym 80% metanol/20% roztwór wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Inkubować próbkę w 100% metanolu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Inkubować w świeżym 100% metanolu przez noc w temperaturze pokojowej.
7. Inkubować w 66% DCM/33% metanolu przez 3 godziny, wytrząsając, w temperaturze pokojowej.
8. Inkubować w eterze dibenzylowym (DBE) bez wstrząsania. Pozostawić próbkę w DBE do momentu jej oczyszczenia i przechowywać w DBE do czasu obrazowania.

7. Montaż

1. Zdobądź wydrukowaną w 3D komorę wykonaną z żywicy Visijet M3 Crystal (szablony dostępne na stronie idisco.info).
2. Przymocuj komorę do szkiełka mikroskopowego za pomocą żywicy epoksydowej.
3. Umieścić próbkę w kwadratowym miejscu na środku komory.
4. Całkowicie napełnij komorę DBE.
5. Umieść szkiełko nakrywkowe o grubości 0,17 mm na komorze i dociśnij, aż szkiełko nakrywkowe będzie w pełni stykało się ze ściankami komory.
6. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego do komory za pomocą żywicy epoksydowej.
7. Obróć komorę, aby pęcherzyki powietrza mogły wydostać się z wlotu napełniania.
8. Napełnij komorę dodatkowym DBE.
9. Uszczelnij wlot wypełnienia żywicą epoksydową i pozostaw do utwardzenia.
   UWAGA: Nadmiar DBE wyleje się podczas montażu.

8. Obrazowanie

1. Użyj systemu mikroskopu konfokalnego, aby wykonać skan z przy 4-krotnym powiększeniu (patrz załączony film 3D).
2. Osiągnąć wzbudzenie fluorescencyjne próbki za pomocą zestawu laserowego do emisji o długości fali podobnej do długości fali określonej przez przeciwciało wtórne. Wzbudzenie TH osiągnięto przy użyciu zestawu laserowego HeNe, który emitował światło o długości fali 632 nm.
3. Ustaw detektor na długość fali zbliżoną do emisji lasera. Dla niniejszego protokołu detektor dla TH został ustawiony na 650 nm.
4. Zwiększ wzmocnienie detektora, aż pojawi się widoczny sygnał. Wzmocnienie 650 LP dla obrazów zostało ustawione na 7,50 B.
5. Korzystając z opcji Skanuj w oprogramowaniu do obrazowania konfokalnego, przesuwaj stolik mikroskopu, aż próbka zostanie ustawiona na ostrości.
6. Poruszaj się po tkance na wszystkich płaszczyznach i uzyskuj pojedyncze obrazy lub obrazy z stosu za pomocą oprogramowania do obrazowania konfokalnego.
7. Po zakończeniu obrazowania wyjmij próbkę z komory. Umieść go z powrotem w tubie całkowicie wypełnionej DBE i przechowuj w RT w ciemnym miejscu, najlepiej przykrytym folią aluminiową.
   UWAGA: Próbki można ponownie montować i obrazować, o ile sygnał fluorescencji jest nadal silny.

Results

Pełne oczyszczenie dużych fragmentów tkanki mózgowej zarówno F344/N, jak i HIV-1 zostało osiągnięte przy użyciu tego zmodyfikowanego protokołu oczyszczania tkanek hydrofobowych. Rysunek 1 przedstawia typowy obraz konfokalny dla TH w obszarze istoty czarnej. Rysunek 1A przedstawia gęste, dodatnie barwienie. Gęste obszary, takie jak te, można przeanalizować, skupiając się na płaszczyźnie "Z", aby potwierdzić pozytywne barwienie i prawidłową morfologię komórki.

Discussion

Oczyszczanie tkanek stanowi rozwiązanie dla ograniczeń tradycyjnego protokołu IHC. Próbka, która jest przezroczysta, minimalizuje rozpraszanie i absorpcję światła, co zapewnia optyczny dostęp na poziomie komórkowym do nienaruszonych tkanek^18,19. Techniki oczyszczania tkanek sprawiają, że tkanka staje się przezroczysta poprzez delipidację, odbarwianie i odwapnianie za pomocą rozpuszczalników. Gdy współczynnik załamania światła próbki tkanki dopasuje się do współcz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Podjednostka B toksyny (rekombinowana), Alexa Fluor 488	Invitrogen	C34775
DBE	Sigma-Aldrich	108014-1KG
DCM	Sigma-Aldrich	270997-100mL
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-1L
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
Kozia anty-królik Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32733
Kozia surowica	Sigma Life Science	G9023-10mL
Heparyna	Acros Organics	41121-0010
Przeciwciało pierwszorzędowe Iba1	FUJIFILM Wako	019-19741
Kwik-sil epoksyd	VWR	70730-062
Metanol	Sigma-Aldrich	34860-1l-R
PBS	Fisher Bioreagents	BP2944-100
Maszyna do perfuzji	VWR	70730-062	mini pompa o zmiennym przepływie
PFA	Sigma-Aldrich	158127-3KG
TH przeciwciało pierwotne	Millipore Sigma	AB152
TritonX-100	Odczynniki Fisher	BP151-500
Tween-20	Bioresole	FisherZobacz materiał BP337-500