Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61824

⸱

10 grudnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems (ICMS), Eindhoven University of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie dynamicznej ko-hodowli ludzkich makrofagów i miofibroblastów w rurowych rusztowaniach elektroprzędzonych w celu zbadania regeneracji tkanek sterowanej materiałem, przy użyciu bioreaktora, który umożliwia oddzielenie naprężeń ścinających od cyklicznego rozciągania.

Streszczenie

Wykorzystanie resorbowalnych biomateriałów do wywołania regeneracji bezpośrednio w organizmie jest atrakcyjną strategią z punktu widzenia translacji. Takie materiały wywołują reakcję zapalną po implantacji, która jest motorem późniejszej resorpcji materiału i regeneracji nowej tkanki. Strategia ta, znana również jako inżynieria tkankowa in situ, jest stosowana w celu uzyskania zamienników układu sercowo-naczyniowego, takich jak przeszczepy naczyniowe inżynierii tkankowej. Zarówno procesy zapalne, jak i regeneracyjne są determinowane przez lokalne sygnały biomechaniczne na rusztowaniu (tj. naprężenia rozciągające i ścinające). W tym miejscu szczegółowo opisujemy zastosowanie specjalnie opracowanego bioreaktora, który w unikalny sposób umożliwia oddzielenie naprężeń rozciągających i ścinających na rusztowaniu rurowym. Pozwala to na systematyczną i wystandaryzowaną ocenę zdolności zapalnych i regeneracyjnych rusztowań rurowych pod wpływem dobrze kontrolowanych obciążeń mechanicznych, co wykazujemy na podstawie dynamicznego eksperymentu z udziałem ludzkich makrofagów i miofibroblastów. Szczegółowo omówiono kluczowe praktyczne kroki w tym podejściu – budowę i ustawienie bioreaktora, przygotowanie rusztowań i wysiewu komórek, zastosowanie i utrzymanie przepływu rozciągającego i ścinającego oraz pobieranie próbek do analizy.

Wprowadzenie

Inżynieria tkanek sercowo-naczyniowych (TE) jest poszukiwana jako alternatywna opcja leczenia dla obecnie stosowanych stałych protez sercowo-naczyniowych (np. przeszczepy naczyniowe, wymiana zastawek serca), które są nieoptymalne dla dużych kohort pacjentów1,2,3,4. Bardzo poszukiwane zastosowania obejmują przeszczepy naczyniowe inżynierii tkankowej (TEVG)5,6 i zastawki serca (TEHVs)7,8. Najczęściej metodologie TE układu sercowo-naczyniowego wykorzystują resorbowalne biomateriały (naturalne lub syntetyczne), które służą jako pouczające rusztowanie dla nowej tkanki, która ma zostać utworzona. Tworzenie nowej tkanki może być albo całkowicie zmodyfikowane in vitro, poprzez zasianie rusztowania komórkami i hodowla w bioreaktorze przed implantacją (in vitro TE)9,10,11, lub bezpośrednio in situ, w którym syntetyczne rusztowanie jest wszczepiane bez wstępnego hodowli w celu wywołania tworzenia nowej tkanki bezpośrednio w organizmie (in situ TE)12,13,14. Zarówno w przypadku metod TE sercowo-naczyniowych in vitro, jak i in situ, skuteczna regeneracja funkcjonalna zależy głównie zarówno od odpowiedzi immunologicznej gospodarza na wszczepiony konstrukt, jak i od odpowiedniego obciążenia biomechanicznego.

Znaczenie obciążenia biomechanicznego dla układu sercowo-naczyniowego TE jest dobrze znane15. W przypadku implantów sercowo-naczyniowych komórki zasiedlające rusztowanie są narażone na cykliczne naprężenia rozciągające i ścinające, które powstają w wyniku środowiska hemodynamicznego. Liczne badania wykazały stymulujący wpływ (cyklicznego) rozciągania na tworzenie składników matrycy, takich jak collagen16,17,18,19, glikozaminoglikany (GAG)20 i elastin21,22, według różnych typów komórek. Na przykład Huang i wsp. wykazali, że rozciągliwość dwuosiowa zwiększa odkładanie i organizację kolagenu i elastyny w TEVG in vitro przy użyciu bioreaktora naczyniowego23. Podczas gdy nacisk zwykle kładzie się na rozciąganie jako dominujące obciążenie, badania te często wykorzystują bioreaktory napędzane przepływem, w których próbka jest również narażona na przepływ ścinający. Chociaż stosunkowo niewiele wiadomo na temat izolowanego wpływu naprężeń ścinających na tworzenie tkanek i stan zapalny w 3D, dostępne są pewne dane. Na przykład Hinderer i in. oraz Eoh i wsp. wykazali, że przepływ ścinający, oprócz mikrostruktury rusztowania 3D, był ważny dla tworzenia dojrzałej elastyny przez ludzkie komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych w systemie modelowym in vitro24,25. Podsumowując, odkrycia te ilustrują znaczenie zarówno cyklicznego rozciągania, jak i naprężenia ścinającego dla układu sercowo-naczyniowego.

Innym ważnym czynnikiem decydującym o sukcesie lub porażce implantów TE jest odpowiedź immunologiczna gospodarza na wszczepiony przeszczep26. Jest to szczególnie ważne w przypadku strategii TE opartych na materiale in situ, które w rzeczywistości opierają się na ostrej odpowiedzi zapalnej na rusztowanie, aby uruchomić kolejne procesy napływu komórek oraz tworzenia i przebudowy tkanek endogennych27. Makrofag jest kluczowym inicjatorem funkcjonalnej regeneracji tkanek, co zostało wykazane w wielu badaniach28,29,30. Analogicznie do gojenia się ran, regeneracja tkanek jest regulowana przez sygnalizację parakrynną między makrofagami a komórkami wytwarzającymi tkanki, takimi jak fibroblasty i miofibroblasty31,32,33. Oprócz koordynowania depozycji nowych tkanek, makrofagi biorą udział w aktywnej resorpcji obcego materiału rusztowania34,35. W związku z tym odpowiedź makrofagów in vitro na biomateriał została zidentyfikowana jako parametr predykcyjny dla sukcesu implantów in vivo 36,37,38.

Reakcja makrofagów na wszczepione rusztowanie zależy od cech projektu rusztowania, takich jak skład materiału i mikrostruktura35,39,40. Oprócz właściwości rusztowania, na odpowiedź makrofagów na rusztowanie i ich wzajemne oddziaływanie z miofibroblastami wpływają również obciążenia hemodynamiczne. Na przykład wykazano, że cykliczne rozciąganie jest ważnym modulatorem fenotypu makrofagów41,42,43,44 i wydzielanie cytokin43,44,45,46 w rusztowaniach elektroprzędzonych 3D. Korzystając z systemu kohodowli makrofagów i komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, Battiston i in. wykazali, że obecność makrofagów prowadzi do zwiększonego poziomu elastyny i GAG oraz że umiarkowane poziomy cyklicznego rozciągania (1,07–1,10) stymulują odkładanie się kolagenu I i elastyny47. W poprzednich pracach wykazaliśmy, że naprężenie ścinające jest ważnym czynnikiem determinującym rekrutację monocytów do elektrowirowanych rusztowań 3D48,49, oraz że zarówno naprężenie ścinające, jak i cykliczne rozciąganie wpływają na sygnalizację parakrynną między ludzkimi monocytami a mezenchymalnymi komórkami zrębu50. Fahy i wsp. wykazali, że przepływ ścinający zwiększa wydzielanie cytokin prozapalnych przez ludzkie monocyty51.

Razem wzięte, powyższe dowody pokazują, że odpowiednie zrozumienie i kontrola obciążeń hemodynamicznych jest kluczowe dla sercowo-naczyniowej TE, i że ważne jest, aby wziąć pod uwagę reakcję zapalną, aby to osiągnąć. Wiele bioreaktorów zostało opisanych wcześniej dla klasy in vitro52,53,54,55,56,57,58 lub ex vivo59,60,61 hodowla tkanek sercowo-naczyniowych. Jednak wszystkie te systemy są zaprojektowane tak, aby w jak największym stopniu naśladować fizjologiczne warunki obciążenia hemodynamicznego. Chociaż jest to bardzo cenne w celu tworzenia tkanek sercowo-naczyniowych in vitro lub utrzymywania kultur ex vivo, takie systemy nie pozwalają na systematyczne badania nad indywidualnymi efektami poszczególnych sygnałów. Dzieje się tak, ponieważ zastosowanie zarówno cyklicznego rozciągania, jak i ścinania w tych bioreaktorach jest napędzane przez ten sam przepływ pod ciśnieniem, który nierozerwalnie je łączy. Podczas gdy mikrosystemy, które pozwalają na dokładną manipulację mechaniczną wieloma wskazówkami, zostały opisane dla podłoży 2D62 lub konfiguracji hydrożelowych 3D63,64, takie konfiguracje nie pozwalają na włączenie elastomerowych rusztowań z biomateriału 3D.

Tutaj prezentujemy zastosowanie systemu bioreaktora rurowego, który w unikalny sposób umożliwia rozdzielenie naprężeń ścinających i cyklicznego rozciągania oraz pomaga mechanicznie badać ich indywidualne i łączne efekty. System ten pozwala na testowanie szerokiej gamy przeszczepów naczyniowych wytwarzanych metodą inżynierii tkankowej (np. pochodzenia syntetycznego lub naturalnego, różnej mikroarchitektury, różnej porowatości). Aby skutecznie oddzielić zastosowanie naprężeń ścinających od rozciągania, kluczowymi koncepcjami wykorzystywanymi w bioreaktorze są (1) oddzielenie kontroli naprężeń ścinających i rozciągania za pomocą odrębnych systemów pomp oraz (2) stymulacja rusztowań w sposób "od wewnątrz na zewnątrz" z wymiarami sterowanymi obliczeniowo. Przepływ jest doprowadzany do zewnętrznej powierzchni rusztowania rurowego za pomocą pompy przepływowej, natomiast rozciąganie obwodowe rusztowania jest indukowane przez rozciągnięcie silikonowej rurki, na której montuje się rusztowanie za pomocą oddzielnej pompy naprężającej. Wymiary rurki silikonowej i rurki szklanej, w której znajduje się konstrukcja, są starannie dobierane i weryfikowane za pomocą symulacji obliczeniowej dynamiki płynów, aby zapewnić, że naprężenie ścinające na rusztowaniu (spowodowane przepływem) i rozciągnięcie obwodowe (spowodowane rozszerzaniem się rury) nie wpływają na siebie znacząco. Ten projekt od wewnątrz na lewą stronę ma kilka praktycznych przesłanek. Jeśli rozciąganie jest wywierane przez ciśnienie płynu świetlnego (podobne do obciążenia fizjologicznego), z natury wymaga to, aby projekt próbki był szczelny. Ponadto ciśnienie wymagane do rozciągnięcia próbki byłoby całkowicie określone przez sztywność próbki, która może się zmieniać w zależności od próbki i w obrębie próbki w czasie, co utrudnia kontrolowanie rozciągania. Ten bioreaktor montuje przeszczep inżynierii tkankowej wokół silikonowej rurki i umożliwia przyłożenie naprężeń ścinających ścianę (WSS) na zewnętrzną ścianę przeszczepu i zwiększa ciśnienie w przeszczepie od wewnątrz. W ten sposób można zapewnić równe warunki obciążenia między próbkami i w próbkach w czasie, a ponadto próbki mogą być nieszczelne, jak to zwykle bywa w przypadku porowatych rusztowań naczyniowych19. Ten bioreaktor typu inside-out jest specjalnie przeznaczony do systematycznych badań nad skutkami ścinania i/lub rozciągania, a nie do inżynierii natywnego naczynia krwionośnego in vitro, do którego bardziej odpowiednie są tradycyjne konfiguracje bioreaktorów naczyniowych. Zobacz Rysunek 1A–B dla rysunków projektowych bioreaktora, a odpowiadająca mu Tabela 1 dla opisu funkcjonalnego i uzasadnienia głównych komponentów bioreaktora.

Użycie bioreaktora zostało zademonstrowane na podstawie serii ostatnich badań przeprowadzonych przez naszą grupę, w których badaliśmy indywidualne i połączone wpływy naprężeń ścinających i cyklicznego rozciągania na stan zapalny i tworzenie tkanek w resorbowalnych rusztowaniach elektroprzędzonych dla tkanki sercowo-naczyniowej in situ19,43,44. W tym celu wykorzystaliśmy ludzkie makrofagi i miofibroblasty w monokulturze lub w kohodowli, aby symulować różne fazy kaskady regeneracyjnej in situ. Wykazaliśmy, że na wydzielanie cytokin przez ludzkie makrofagi wyraźnie wpływa zarówno cykliczne rozciąganie, jak i naprężenie ścinające, wpływając na odkładanie i organizację macierzy przez ludzkie miofibroblasty w tych rusztowaniach, zarówno poprzez sygnalizację parakrynną, jak i bezpośredni kontakt19,43,44. Warto zauważyć, że badania te wykazały, że w przypadku połączonego zastosowania naprężeń ścinających i rozciągania, wpływ na tworzenie tkanek i stan zapalny jest albo zdominowany przez jedno z dwóch obciążeń, albo występują synergiczne efekty obu obciążeń. Wyniki te ilustrują znaczenie oddzielenia obu obciążeń w celu lepszego zrozumienia wpływu środowiska mechanicznego na procesy TE. Wiedza ta może być wykorzystana do systematycznej optymalizacji parametrów konstrukcyjnych rusztowania w odpowiednich reżimach obciążenia hemodynamicznego. Ponadto dane mechanistyczne z takich dobrze kontrolowanych środowisk mogą służyć jako dane wejściowe dla modeli numerycznych, które są opracowywane w celu przewidywania przebiegu przebudowy tkanek in situ, jak ostatnio zgłoszono dla TEVGs65 lub TEHVs66, w celu dalszej poprawy zdolności predykcyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W badaniach opisanych w niniejszym protokole wykorzystano pierwotne ludzkie makrofagi wyizolowane z warstwy leukocytarnej (buffy coat) krwi obwodowej oraz ludzkie miofibroblasty wyizolowane z żyły odbytowej po operacji pomostowania wieńcowego44. Warstwy leukocytarne pozyskano od zdrowych, zanonimizowanych ochotników, którzy wyrazili pisemną zgodę, zatwierdzoną przez Instytucjonalny Komitet Etyki Medycznej Sanquin Research. Wykorzystanie komórek ludzkiej żyły odbytowej (HVSCs) odbywało się zgodnie z „Kodeksem właściwego wtórnego wykorzystania tkanek ludzkich” opracowanym przez Federację Towarzystw Medycznych (FMWV) w Holandii.

1. Ogólne przygotowania i niezbędne czynności przed uruchomieniem bioreaktora

UWAGA: Szczegółowe informacje na temat odpowiednich protokołów izolacji i hodowli znajdują się w poprzednich pracach19,43,44. Wszystkie obliczenia w protokole podano jako przykłady dla eksperymentu z kokulturą monocytów i myofibroblastów, wysianych w 8 rusztowaniach obciążonych hemodynamicznie oraz 2 statycznych kontrolach (n=10).

  1. Rozpocząć izolację komórek i hodowlę komórkową. Gęstości wysiewu dla próbek kokultury monocytów i miofibroblastów (przy stosunku wysiewu 2:1) wynoszą odpowiednio 30 × 106 monocytów/cm3 oraz 15 × 106 miofibroblastów/cm3.
    UWAGA: Materiał elektroprzędziony charakteryzuje się wysoką porowatością (>90%). Aby oszacować wymaganą liczbę komórek na przeszczep, objętość rusztowania oblicza się za pomocą wzoru na objętość pustego w środku cylindra: π*(grubość)2*długość ≈ 0,04 cm3. Całkowita liczba komórek na przeszczep wynosi 1,2 × 106 monocytów i 0,6 × 106 miofibroblastów. Dla 10 próbek wymagane jest co najmniej 12 × 106 monocytów i 6 × 106 miofibroblastów; należy przygotować o ok. 10–15% więcej komórek, aby uwzględnić możliwe błędy pipetowania.
  2. Odgazować pożywkę do hodowli komórkowej, która będzie używana w eksperymentach z wykorzystaniem bioreaktora.
    1. Przygotować pożywkę do kokultur, składającą się z RPMI-1640:aDMEM (1:1), uzupełnioną o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny i 0,5% L-glutaminy.
    2. Umieścić pożywkę na noc (O/N) w inkubatorze w kolbie do hodowli komórkowej z nakrętką z filtrem w celu odgazowania.
    3. Zastąpić nakrętkę z filtrem nakrętką szczelną i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Bezpośrednio przed użyciem dodać do pożywki 0,25 mg/mL L-kwasu askorbinowego 2-fosforanu (witaminy C).
      UWAGA: Do obliczeń przyjmuje się, że ilość pożywki wymagana na jedną komorę hodowli przepływowej wynosi 50 mL. Odświeżać pożywkę trzy razy w tygodniu; 25 mL starej pożywki zastępuje się 25 mL świeżej pożywki. Dla 10 próbek, po wysiewie, wymagane jest łącznie 500 mL świeżej pożywki, a przy każdej kolejnej wymianie pożywki zużywa się łącznie 250 mL świeżej pożywki. Pożywkę należy zawsze przygotowywać na świeżo; w szczególności witaminę C należy dodać bezpośrednio przed wymianą pożywki.
  3. Przygotować izotropowe rusztowania elektroprzędzione (średnica wewnętrzna 3 mm, grubość ścianki 200 µm) zgodnie z opisem Van Haaften i wsp.19 (Rysunek 1G–I). W skrócie, rurkowe rusztowania z biseuреи polikaprolaktonu (PCL-BU) są wytwarzane metodą elektroprzędzenia z 15% (w/w) roztworów polimeru w chloroformie. Roztwory polimeru są elektroprzędzione w temperaturze pokojowej i przy 30% wilgotności względnej, przy szybkości przepływu 40 µL/min, w odległości 16 cm od obracającego się cylindrycznego celu (Ø 3 mm, 500 rpm), przy przyłożonym napięciu 16 kV na dyszy elektroprzędzenia i -1 kV na celu.
    UWAGA: Chociaż w tych eksperymentach zastosowano przeszczepy PCL-BU, w tym bioreaktorze można zamontować szeroką gamę elastomerowych przeszczepów inżynierii tkankowej (np. różnego pochodzenia syntetycznego lub naturalnego, o różnej mikroarchitekturze, różnej porowatości).
    1. Zdjąć rusztowania elektroprzędzione z trzpienia.
      1. Wyonać mały otwór w nakrętce probówki 15 mL, aby „utrzymać” trzpień w centrum i zapobiec jego dotykaniu ścianki probówki.
      2. Umieścić trzpień z rusztowaniem elektroprzędzionym w probówce typu Falcon i wypełnić ją wodą dejonizowaną.
      3. Zamrozić probówki na noc (O/N) w temperaturze -20 °C.
      4. Pozostawić probówki w temperaturze pokojowej (RT) i wyciągnąć trzpienie po kilku minutach, pozostawiając elektroprzędzione przeszczepy w lodzie.
      5. Pozwolić lodowi całkowicie stopnieć, wyjąć elektroprzędzioną rurkę z odtopionej wody i „powiesić” do wyschnięcia w pozycji pionowej przez kilka godzin. Należy upewnić się, że rusztowania nie „zapadają się” pod własnym ciężarem.
    2. Suszyć rusztowania w próżni na noc (O/N).
    3. Wyonać obrazowanie małej próbki przeszczepów elektroprzędzionych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), aby ocenić ich mikrostrukturę (np. morfologię włókien, średnicę włókien). Przeszczepy w badaniach przykładniczych mają izotropową orientację włókien i średnicę włókien 5 µm (Rysunek 1H–I).
  4. Na dzień przed rozpoczęciem eksperymentu umieścić w inkubatorze zbiornik hydrauliczny wypełniony wodą dejonizowaną. Zamknąć wszystkie osiem połączeń komór hodowli przepływowej białymi zatyczkami Luer. Podłączyć do systemu sprężonego powietrza i wstawić czujnik ciśnienia. Uruchomić pompę naprężeniową (patrz krok 5.6) na noc (O/N), aby umożliwić niewielką ekspansję teflonowego miecha.
    UWAGA: Upewnić się, że wszystkie niezbędne materiały i sprzęt są oczyszczone i/lub autoklawowane (patrz Tabela materiałów, kolumna Uwagi/Opis w celu sprawdzenia, które materiały mogą być autoklawowane), zgodnie z protokołem producenta lub zgodnie z opisem w krokach 7.3–7.6.
  5. Zapewnić sterylne warunki pracy przez resztę protokołu.
    1. Wykonaj kroki 2–5.3 (konfiguracja systemu), krok 6.3 (wymiana pożywki) oraz kroki 7.1–7.2 (pozyskiwanie konstruktów naczyniowych) w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    2. Materiały, które nie są bezpośrednio potrzebne do kolejnych kroków, umieścić w zamkniętych szalkach Petriego, aby zachować maksymalną czystość.
    3. Regularnie oczyszczać lub osuszać powierzchnie materiałów, nasączając ręcznik papierowy 70% etanolem, i przecierać powierzchnie komponentów bioreaktora oraz komory z laminarnym przepływem powietrza.

2. Przygotowanie bioreaktora

UWAGA: Krok 2 należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Przytnąć rusztowania elektroprzędzione do formy rurek o długości około 25 mm i udokumentować je przed użyciem (np. wykonać zdjęcie w celu pomiaru długości, zważyć na wadze w celu ustalenia masy początkowej).
  2. Zdekontaminować rusztowania elektroprzędzione.
    1. Umieścić rusztowania elektroprzędzione pod kątem w płytce wielodołkowej lub czreplacedce Petriego, tak aby jeden otwór był skierowany w stronę źródła światła ultrafioletowego (UV), umożliwiając naświetlenie wnętrza rusztowań światłem UV (253,7 nm).
    2. Naświetlać rusztowania elektroprzędzione światłem UV przez 5 min.
    3. Obrócić wszystkie rusztowania i powtórzyć naświetlanie UV dla drugiego otworu.
      UWAGA: Po tym kroku dotykać rusztowania elektroprzędzionego tylko w razie potrzeby. Zawsze używać czystej pęsety lub czystych rękawiczek.
    4. Wyjąć szklane rurki komór hodowli przepływowej przechowywane w 70% etanolu, przemyć je wodą ultrapure, osuszyć i umieścić w dużej, zamkniętej czreplacedce Petriego.
      UWAGA: Następne kroki, zwłaszcza kroki 2.3–2.5, powinny być idealnie wykonywane przez dwóch eksperymentatorów.
  3. Zamontować rusztowania elektroprzędzione na rurkach silikonowych.
    1. Przymocować szew z prolenu 5-0 do jednego końca rurki silikonowej, przeprowadzając nitkę przez jedną stronę rurki i wyprowadzając ją z drugiej, tak aby dwa przeciwległe, napięte szwy rozpościerały się w poprzek przekroju rurki. Zawiązać mały węzeł po obu stronach rurki, ściskając rurkę w miejscu węzłów, i pozostawić około 10 cm nitki przy obu węzłach. Zawiązać trzeci węzeł na końcu dwóch pozostawionych 10-centymetrowych odcinków nitki.
      1. Odciąć igłę chirurgiczną oraz wszystkie wolne nitki, które mogłyby wystawać i uszkodzić wnętrze rusztowania elektroprzędzionego. Przyciąć krawędzie rurki silikonowej w kształt trójkąta, aby ułatwić przeciąganie rurki silikonowej przez rusztowanie elektroprzędzione.
    2. Zanurzyć rusztowanie elektroprzędzione w 30% etanolu (służy to jako dodatkowy etap dekontaminacji i ułatwia nasunięcie rusztowania elektroprzędzionego na rurkę silikonową) i umieścić rusztowanie na wolnym 10-centymetrowym odcinku nitki. Eksperymentator A rozciąga rurkę silikonową, delikatnie ciągnąc za rurkę oraz węzeł z 10-centymetrowej nitki, podczas gdy eksperymentator B delikatnie nasuwa rusztowanie elektroprzędzione na rurkę silikonową za pomocą pęsety z gładkim końcem, aby zapobiec uszkodzeniu rusztowań.
    3. Powoli zredukować rozciąganie rurki silikonowej, jednocześnie wygładzając rusztowanie elektroprzędzione pęsetą. Zanurzyć rusztowanie elektroprzędzione na rurce silikonowej w wodzie ultrapure dwa razy.
      UWAGA: Może dojść do zmarszczenia rusztowania elektroprzędzionego. Zmarszczenie to zniknie podczas wstępnego rozciągania przed zamocowaniem rusztowań do przewodów ciśnieniowych w kroku 2.5.3.
    4. Powtórzyć kroki 2.3.2 i 2.3.3 dla pozostałych rusztowań elektroprzędzionych. W zależności od długości rurki silikonowej, na jednej rurce można zamontować wiele rusztowań elektroprzędzionych.
    5. Gdy wszystkie rusztowania elektroprzędzione zostaną zamontowane na rurkach silikonowych, przyciąć rurki silikonowe wokół rusztowań do tej samej długości (5,5 cm); po jednej stronie blisko końca rusztowania elektroprzędzionego, po drugiej stronie pozostawiając ~2–3 cm wolnej rurki silikonowej.
  4. Zbudować dolną komorę komory hodowli przepływowej (Rysunek 1A–B).
    1. Wziąć górną część dolnej komory zawierającą wylot przepływu i zamknąć wylot za pomocą męskiego korka Luer.
    2. Przeciągnąć przewód ciśnieniowy z otworami przez dolną komorę i nałożyć silikonowy pierścień O-ring wokół dolnego końca przewodu ciśnieniowego, aby zapobiec wyciekom. Przykręcić dolną część dolnej komory do górnej części dolnej komory, aby zabezpieczyć przewód ciśnieniowy. Upewnić się, że dolny wyżłobiony rowek przewodu ciśnieniowego znajduje się około 3–5 mm powyżej krawędzi tulei adapterowej dolnej komory; będzie on później „trzymać” ciasny węzeł nitki, mocując rusztowanie elektroprzędzione na rurce silikonowej.
      UWAGA: Jeśli przewód ciśnieniowy można łatwo przesuwać w górę i w dół, oznacza to, że dolna komora nie jest dobrze zabezpieczona. Powtórzyć krok 2.4.2, aby zapobiec wyciekom w późniejszych etapach (Rysunek 2D).
  5. Zamocować rurkę silikonową z rusztowaniem elektroprzędzonym do przewodu ciśnieniowego.
    1. Nasunąć rurkę silikonową z rusztowaniem elektroprzędzonym na przewód ciśnieniowy.
    2. Zawiązać węzeł z nitki na dolnym końcu rusztowania elektroprzędzionego w miejscu wyżłobionego rowka na przewodzie ciśnieniowym. Zawiązać drugi węzeł po przeciwnej stronie, aby ściśle zamocować rurkę silikonową z graftem elektroprzędzonym.
      OSTRZEŻENIE: Jest to krytyczny etap. Należy upewnić się, że węzeł dokładnie „wpada” w wyżłobiony rowek przewodu ciśnieniowego, aby zapobiec wyciekowi wody z rezerwuaru hydraulicznego do komór hodowli przepływowej. W razie wątpliwości należy spróbować zaciągnąć nitkę w kilku pozycjach, powyżej lub poniżej przewidywanego miejsca rowka, aby upewnić się, że końcowe węzły znajdują się dokładnie w wyżłobionym rowku (Rysunek 2A).
    3. Założyć zacisk nożycowy na górnym końcu rurki silikonowej i rozciągnąć rurkę silikonową w górę (pozwoli to bezpośrednio przetestować pierwszy węzeł – jeśli rurka silikonowa z rusztowaniem elektroprzędzonym może przesuwać się po przewodzie ciśnieniowym, oznacza to, że nie została wystarczająco zaciśnięta). Siła ciągnienia powoduje wstępne rozciągnięcie rurki silikonowej. Aby zapewnić powtarzalność rozciągnięcia rurek silikonowych między różnymi próbkami, do zacisku nożycowego należy przymocować linijkę. Ciągnąć zacisk nożycowy w górę, aż dolny koniec linijki osiągnie wysokość dolnego końca rusztowania.
      UWAGA: Ważne jest, aby wstępne rozciągnięcie w każdej próbce było mniej więcej takie samo (~5%) z dwóch powodów: (1) jeśli rurka silikonowa zostanie wstępnie rozciągnięta, doprowadzi to do bardziej jednorodnej ekspansji wzdłuż długości próbki po poddaniu ciśnieniu; (2) wstępne rozciągnięcie wpłynie na właściwości mechaniczne silikonu, dlatego powinno być identyczne we wszystkich próbkach, aby zapewnić równe warunki rozciągania między próbkami.
    4. Usunąć zmarszczki w rusztowaniu elektroprzędzionym, delikatnie za nie pociągając. Ponownie zawiązać dwa węzły po obu stronach nitką na górnym końcu rusztowania w miejscu górnego wyżłobionego rowka na przewodzie ciśnieniowym.
    5. Zwolnić zacisk nożycowy i odciąć nadmiar rurki silikonowej nożem, pozostawiając 20–30% gwintu przykrytego rurką silikonową, aby zapobiec wyciekom po zamontowaniu stożka na gwincie.
      UWAGA: Powtórzyć kroki 2.4 i 2.5 dla wszystkich próbek dynamicznych.
    6. W przypadku próbek kontrolnych statycznych zamocować rusztowanie elektroprzędzione na rurce silikonowej na przewodach ciśnieniowych bez otworów. Przewody te można przechowywać oddzielnie w probówce 15 mL aż do zasiewania (krok 4) i nie muszą być one montowane w komorach hodowli przepływowej.
  6. Zdekontaminować częściowo zbudowane komory hodowli przepływowej z rusztowaniem elektroprzędzonym, naświetlając je światłem UV przez 10 min. Obrócić komory hodowli przepływowej z rusztowaniami na drugą stronę i powtórzyć naświetlanie UV przez 10 min.
  7. Wkręcić stożki na gwinty przewodów ciśnieniowych z otworami dla próbek dynamicznych.
    1. Upewnić się, że górny koniec rurki silikonowej pasuje do stożka, aby zapobiec wyciekom w późniejszych etapach. Jeśli rurki silikonowej jest za dużo, odciąć jej nadmiar nożem.
    2. Umieścić częściowo zbudowane komory hodowli przepływowej w dużej czreplacedce Petriego i skierować stożek w stronę źródła światła UV. Naświetlać światłem UV przez 5 min.
  8. Dopełnić konstrukcję komory hodowli przepływowej za pomocą szklanej rurki i górnej komory komory hodowli przepływowej (Rysunek 1A–B).
    1. Wstępnie zwilżyć rusztowania elektroprzędzione, zanurzając przewód ciśnieniowy z rurką silikonową i rusztowaniem elektroprzędzonym w 30% etanolu, a następnie dwa razy zanurzając w wodzie ultrapure.
    2. Nałożyć szklaną rurkę na przewód ciśnieniowy, delikatnie wcisnąć w dolną komorę i ostrożnie zabezpieczyć.
    3. Wziąć górną komorę zawierającą wlot przepływu, umieścić silikonowy pierścień O-ring, prostownicę przepływu oraz tuleję adapterową w odpowiedniej kolejności (Rysunek 1A–B), nałożyć na otwarty koniec szklanej rurki i delikatnie zabezpieczyć.
    4. Wkręcić białą nasadkę Luer w wlot przepływu górnej komory.
    5. Zdjąć męski korek Luer z wylotu przepływu dolnej komory i oczyścić powierzchnię wokół niego ręcznikiem papierowym nasączonym etanolem.
    6. Wprowadzić strzykawkę z 10 mL wody ultrapure do wylotu przepływu, otworzyć białą nasadkę Luer w górnej komorze i napełnić komorę wodą ultrapure. Ponownie zamknąć białą nasadkę Luer, wyjąć strzykawkę, ponownie oczyścić etanolem i zamknąć wylot przepływu męskim korkiem Luer.
      UWAGA: Powtórzyć kroki 2.6–2.8 dla wszystkich komór hodowli przepływowej.
    7. W przypadku kontroli statycznych dodać 10 mL wody ultrapure do probówek 15 mL zawierających próbki zamontowane na przewodach ciśnieniowych bez otworów.
  9. Umieścić wszystkie komory hodowli przepływowej w inkubatorze. Zastąpić wodę ultrapure pożywką hodowlaną na jeden dzień przed zasiewaniem komórek w ten sam sposób, jak opisano w krokach 2.8.5 i 2.8.6 (należy pamiętać o zebraniu „starej” wody ultrapure za pomocą ręcznika papierowego nasączonego etanolem umieszczonego bezpośrednio na wylocie przepływu).

[W tym miejscu można przerwać protokół]

3. Przygotowania do konfiguracji pompy przepływowej

UWAGA: Krok 3 należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Zgromadzić wszystkie materiały do konfiguracji pompy i przygotować je do użycia.
    UWAGA: W celu uzyskania szczegółowego opisu konfiguracji pompy, jednostek płynowych oraz prowadzenia rurek z medium przez zawory jednostki płynowej, należy zapoznać się z protokołem producenta.
    1. Ustawić pompę na wydajność 200 mbar.
    2. Przykręcić uchwyty zbiorników o pojemności 60 mL do jednostek płynowych.
    3. Oczyścić wielorazowe gumowe filtry powietrza za pomocą chusteczki nasączonej etanolem, dbając o to, aby filtr powietrza pozostał suchy.
  2. Umieścić zbiorniki 60 mL w uchwytach oraz przeprowadzić standardowe rurki z medium przez zawory jednostki płynowej. Połączyć rurki z medium o większej średnicy wewnętrznej w zamkniętą pętlę za pomocą żeńskich złączy Luer lock.
  3. Zaciśnąć rurkę z medium opaską zaciskową bezpośrednio poniżej zbiorników.
  4. Napełnić każdy zbiornik 60 mL ilością 25 mL pożywki hodowlanej. Poluzować opaskę zaciskową i pozwolić pożywce wpłynąć do rurek.
  5. Zamknąć zbiorniki z pożywką gumowymi filtrami powietrza i umieścić konfigurację pompy przepływowej w inkubatorze do momentu wykonania kroku 4.

4. Wysiew komórek z wykorzystaniem fibryny jako nośnika komórek

UWAGA: Krok 4 należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Przygotować żel fibrynowy do etapu wysiewania komórek. Szczegóły znajdują się w pracy Mol et al.67 W przypadku żelu fibrynowego końcowe stężenie roztworu fibrinogenu powinno wynosić 10 mg/mL (uwzględniając czystość roztworu białka), a końcowe stężenie roztworu trombiny powinno wynosić 10 U/mL.
    1. Rozmrozić fibrinogen w temperaturze pokojowej (RT), a następnie odważyć ok. 50 mg (ilość wystarczająca na 10 próbek) do plastikowego pojemnika z czerwoną zakrętką.
    2. Dodać pożywkę hodowlaną, aby przygotować roztwór fibrinogenu (o stężeniu 10 mg/mL, uwzględniając czystość roztworu białka). Dobrze wymieszać i przefiltrować roztwór fibrinogenu w celu sterylizacji za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 µm do sterylnej probówki 15 mL. Przefiltrowany roztwór fibrinogenu przechowywać w lodzie.
      UWAGA: Należy unikać przygotowywania roztworu fibrinogenu z dużym wyprzedzeniem, w przeciwnym razie fibrinogen może ulec samoistnemu skrzepnięciu.
    3. Rozmrozić trombinę i przygotować roztwór trombiny (o stężeniu 10 U/mL) w pożywce hodowlanej, a następnie umieścić w lodzie. Przygotować 20 µL roztworu trombiny z komórkami na każdą próbkę. Dla n=10 próbek wymagane jest 200 µL; dlatego należy przygotować 250 µL roztworu trombiny, aby uwzględnić możliwe błędy pipetowania.
  2. Zebrać i policzyć komórki z kolb hodowlanych. Wymieszać komórki w żądanym stosunku i ilości (1,2 × 106 monocytów i 0,6 × 106 myofibroblastów na rusztowanie). Upewnić się, że dostępna jest wystarczająca liczba komórek dla n+1 próbek, aby skorygować błędy pipetowania. Wirować przy 350 × g przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT). Usunąć supernatant.
  3. Przygotować mieszaninę zawiesiny komórkowej i trombiny.
    1. Dla każdej próbki użyć 20 µL roztworu trombiny. Dla n=10 próbek dodać 200 µL trombiny do osadu komórkowego i wymieszać. Zmierzyć objętość zawiesiny komórkowej (komórki + trombina) i obliczyć, jak podzielić ją równomiernie na wszystkie 10 rusztowań (np. jeśli zawiesina trombiny z komórkami ma objętość 260 µL, każda próbka elektroprzędzana otrzyma 260 µL/10 próbek = 26 µL zawiesiny trombiny z komórkami).
    2. Ponieważ wysiewanie na rusztowania odbywa się w dwóch etapach, przygotować dwie probówki mikrowirówkowe 1,5 mL, z których każda będzie zawierać połowę zawiesiny komórkowej dla każdego rusztowania (w obliczeniach przykładu z poprzedniego kroku: przygotować dwie probówki z 13 µL zawiesiny trombiny z komórkami). Umieścić w lodzie.
      UWAGA: Następne kroki, zwłaszcza krok 4.4, powinny być idealnie wykonywane przez dwóch eksperymentatorów.
  4. Osuszyć uprzednio namoczone rusztowania elektroprzędzone za pomocą próżni w celu przygotowania do wysiewania komórek.
    1. Podłączyć szklaną pipetę Pasteura do systemu próżniowego komory laminarnej i umieścić ją w pustej probówce 50 mL do sterylnego tymczasowego przechowywania.
    2. Wyjąć komory do hodowli przepływowej z inkubatora, usunąć męski korek Luer z wylotu przepływu i usunąć pożywkę po otwarciu białej nasadki Luer i umieszczeniu nasączonej etanolem chusteczki papierowej przed wylotem przepływu.
    3. Zdjąć górną sekcję oraz szklaną rurkę i umieścić je w sterylnej szalce Petriego do tymczasowego przechowywania.
    4. Przystawić próżniową pipetę Pasteura do rusztowania elektroprzędzanego i usunąć jak najwięcej pożywki.
      OSTROŻNIE: Osuszać rusztowanie elektroprzędzane próżniowo bardzo delikatnie. Zamiast wykonywać ruchy liniowe w przód i w tył nad rusztowaniem, należy przykładać pipetę próżniową w wielu różnych miejscach. Aby uzyskać lepszą kontrolę, zacisnąć rurkę próżniową na górze pipety Pasteura między palcami.
    5. Wymieszać roztwór fibrinogenu w stosunku 1:1 z zawiesiną trombiny i komórek (np. zmieszać 13 µL fibrinogenu z 13 µL zawiesiny trombiny z komórkami). Aby upewnić się, że fibryna spolimeryzuje w rusztowaniu, a nie w probówce mikrowirówkowej, nabrać fibrinogen, ustawić pokrętło pipety na „dodatkową objętość” zawiesiny trombiny z komórkami, a następnie raz zassać i wypuścić ciecz w probówce z zawiesiną komórkową, aby wymieszać składniki.
    6. Bezpośrednio i jednorodnie nanosić roztwór kroplami na całej długości rusztowania elektroprzędzanego. Zaleca się, aby Eksperymentator A nanosił mieszaninę fibryny, podczas gdy Eksperymentator B trzyma dolną sekcję z zamontowanym do przewodu ciśnieniowego rusztowaniem elektroprzędzanym.
    7. Po naniesieniu fibryny z komórkami na rusztowanie elektroprzędzane, Eksperymentator B powoli przesuwa rusztowanie z lewej do prawej oraz w górę i w dół, aby dodatkowo równomiernie rozdzielić komórki na rusztowaniu.
    8. Powtórzyć kroki 4.4.5–4.4.7 po drugiej stronie rusztowania elektroprzędzanego.
    9. Ponownie zamontować komorę do hodowli przepływowej, ostrożnie umieszczając szklaną rurkę (zapobiegając przywieraniu i skrzepnięciu fibryny do wewnętrznej strony szklanej rurki), a następnie nasunąć górną sekcję komory. Umieścić wysianą konstrukcję bezpośrednio w komorze do hodowli przepływowej w inkubatorze, bez dodawania pożywki ani soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).
    10. Powtórzyć kroki 4.4.1–4.4.9 dla wszystkich próbek dynamicznych. W przypadku próbek statycznych zamontowanych do przewodów ciśnieniowych bez otworów, wysiewać zgodnie z krokami 4.4.1–4.4.8, a następnie umieścić w probówce 15 mL.
    11. Pozostawić fibrynę do polimeryzacji na 60 min w inkubatorze.

[Protokół można tutaj przerwać na 30–60 min.]

  1. Po polimeryzacji wypełnić komory do hodowli przepływowej (próbki dynamiczne) lub probówki 15 mL (próbki statyczne) pożywką.

5. Połączenie systemów bioreaktora i pompy przepływowej przed rozpoczęciem eksperymentu

UWAGA: Kroki 5.1–5.3 należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Przenieś tace z komorami do hodowli przepływowej oraz jednostkami płynowymi z wypełnionymi zbiornikami z medium i podłączonymi przewodami do medium do wnętrza komory z laminarnym przepływem powietrza.
  2. Ustaw komory do hodowli przepływowej na podstawie bioreaktora dla grup eksperymentalnych poddanych cyklicznemu rozciąganiu oraz połączonym obciążeniom hemodynamicznym (Rycina 1E).
    1. Odwróć komorę do hodowli przepływowej dnem do góry i napełnij kanał ciśnieniowy od dołu wodą ultrapurystyczną za pomocą strzykawki z cienkim przewodem (może to być dowolny typ przewodu, o ile jest elastyczny i cienki; w tym doświadczeniu do igły przymocowano drut o długości 10 cm i średnicy wewnętrznej 0,15 mm).
    2. Wprowadź cienki przewód do wnętrza kanału ciśnieniowego i podczas napełniania kanału wodą ultrapurystyczną poprzez stopniowe wypychanie jej ze strzykawki, jednocześnie wyciągaj drut z kanału ciśnieniowego, aby upewnić się, że wewnątrz nie pozostały pęcherzyki powietrza.
    3. Umieść komorę do hodowli przepływowej na jednym z ośmiu gwintów w podstawie bioreaktora. Umieść silikonowy o-ring między podstawą bioreaktora a białym złączem Luer, aby zapobiec ewentualnym wyciekom, a następnie dokręć białe złącze Luer z dolnej komory.
    4. Powtórz kroki 5.2.2 i 5.2.3 dla wszystkich próbek poddawanych cyklicznemu rozciąganiu.
  3. Podłącz komory do hodowli przepływowej dla wszystkich grup eksperymentalnych, z wyjątkiem kontroli statycznej, do systemu pomp przepływowych.
    1. Załóż zacisk na przewód z medium. Zdejmij białą nasadkę Luer zakrywającą wlot przepływu w górnej komorze komory do hodowli przepływowej. Zdejmij żeński łącznik Luer z przewodu z medium i połącz jedną stronę przewodu z wlotem przepływu w górnej komorze, a drugą stronę przewodu z wylotem przepływu w dolnej komorze.
    2. Powtórz krok 5.3.1 dla wszystkich komór do hodowli przepływowej. Na tym etapie bioreaktor i komory do hodowli przepływowej są wypełnione medium i podłączone do systemów przepływowych.
    3. W przypadku próbek kontroli statycznej umieść próbki pionowo w kolbie do hodowli komórkowej z nakrętką z filtrem, używając zacisku kleszczykowego. Napełnij kolbę do hodowli komórkowej medium i umieść ją w inkubatorze.
  4. Przenieś cały zestaw z komory z laminarnym przepływem powietrza do inkubatora, a następnie podłącz jednostki płynowe do przewodów ciśnienia powietrza i kabla elektrycznego.
  5. Uruchom oprogramowanie i zainicjuj pompy przepływowe. Uruchamiaj przepływ medium dla próbek jedna po drugiej.
    1. Sprawdź, czy zawory jednostki płynowej klikają.
    2. Zdejmij zacisk z przewodu z medium.
    3. Uruchom pompę przepływową z ustawieniem 100 mbar i czasem przełączania 10 s.
    4. Uważnie sprawdź kierunek przepływu pod kątem ewentualnych wycieków lub pęcherzyków powietrza. Wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza można usunąć, odwracając komorę do hodowli przepływowej do góry nogami.
      UWAGA: Upewnij się, że poziomy medium w zbiornikach są zrównoważone, aby zapobiec zasysaniu powietrza do systemu i powstawaniu pęcherzyków powietrza w komorach do hodowli przepływowej, oraz aby zbiorniki nie wyschły (Rycina 2C).
    5. Powtórz krok 5.5 dla wszystkich jednostek płynowych jedna po drugiej.
  6. Zainicjuj pompę do wywierania odkształceń.
    1. Podłącz pompę z napędem pneumatycznym poprzez wlot powietrza w cylindrze pneumatycznym do sprężonego powietrza. Podłącz dolny wylot powietrza do niebieskiego przewodu odprowadzającego powietrze (Rycina 1F).
    2. Otwórz oprogramowanie LabVIEW, uruchom skrypt LabVIEW i system aplikacji ciśnienia sprężonego powietrza, zgodnie z opisem Van Kelle i wsp.68, wprowadź przemieszczenie i częstotliwość (zacznij od niskiej częstotliwości 0,2 Hz). Wstrzymaj pompę, gdy miech teflonowy znajdzie się na najniższym poziomie.
    3. Umieść czujnik ciśnienia we wlocie czujnika ciśnienia w zbiorniku hydraulicznym.
  7. Zmień ustawienia pompy na pożądane (dla 1,5 Pa użyj 150 mbar, czas przełączania 10 s).
  8. Uruchom pompę do wywierania odkształceń i zastosuj preferowane ustawienie (np. 0,5 Hz, rozciąganie 1,05).

6. Prowadzenie eksperymentu przez wiele dni; monitorowanie ścinania i rozciągania podczas hodowli i wymiany medium

  1. Oblicz WSS na ścianie rusztowania.
    1. Rejestruj wartość przepływu co drugi dzień (szczegóły znajdują się w instrukcji producenta pompy przepływowej). W skrócie: obserwuj zmianę poziomu cieczy (w mL) w zbiornikach z medium podczas 10 s przełączania zbiornika jednostki płynowej. Przeprowadź co najmniej pięć pomiarów, oblicz wartość średnią i pomnóż ją przez 6, aby uzyskać natężenie przepływu Q w mL/min.
    2. Przepływ jest opisany jako przepływ Poiseuille'a przez kanał pierścieniowy. Przyjmując, że medium hodowlane jest cieczą newtonowską, oblicz WSS na ścianie rusztowania, r1, zgodnie z równaniem 1.
      Formuła dynamiki płynów τw=1/4(-∂p/∂z)[1/(r1ln(r2/r1))][(r2²-r1²)-2r1], obliczanie naprężenia ścinającego. (1)
      gdzie WSS τw na ścianie rusztowania (r1; tutaj r1 = 1,7 mm), wynikające ze stanu ustalonego przepływu, jest określone przez przyłożone ciśnienie p oraz promień wewnętrzny szklanej rurki r2 (tutaj r2 = 2,3 mm). Przyjmuje się, że gradient ciśnienia w kierunku osiowym jest jednorodny pomiędzy wlotem a wylotem przepływu i jest dany równaniem 2 (Rysunek 1J).
      Formuła dynamiki płynów; równanie Hagena-Poiseuille'a dla przepływu przez rurkę cylindryczną; mechanika płynów. (2)
      gdzie µ to lepkość dynamiczna (tutaj przyjęto stałą lepkość medium, µ = 0,7 × 10-3 Pa∙s w 37 °C), a Q to przyłożone natężenie przepływu.
  2. Monitoruj rozciąganie przyłożone do rusztowań co drugi dzień.
    1. Umieść ciemne tło za komorą hodowli przepływowej, aby zwiększyć kontrast między rusztowaniem a tłem. Ustaw lampy LED, kierując je w stronę rusztowania, aby ułatwić jego wizualizację.
    2. Wykonaj zdjęcia poklatkowe rusztowania z częstotliwością 30 Hz przez 6 s (tj. 3 cykle rozciągania) za pomocą kamery wysokiej rozdzielczości.
      UWAGA: Niższa częstotliwość rejestracji może być wystarczająca, jeśli kamera na to pozwala. Minimalna wymagana częstotliwość nie została jednak określona.
    3. Ręcznie wyznacz minimalną i maksymalną średnicę rusztowania na podstawie obrazów.
    4. Oblicz minimalną i maksymalną średnicę zewnętrzną rusztowania elektroprzędzionego, aby obliczyć maksymalne rozciągnięcia zgodnie z równaniem 3.
      Równanie równowagi statycznej λθ=d₁/d₀, formuła symboliczna dla analizy inżynieryjnej. (3)
      gdzie rozciągnięcie obwodowe (λθ) jest dane stosunkiem średnicy zewnętrznej rusztowania, d1, do jego średnicy początkowej, d0.
  3. Koryguj odparowanie medium i odświeżaj medium trzy razy w tygodniu.
    1. Zatrzymaj i odłącz kable systemów przepływowych oraz pompy do rozciągania.
    2. Załóż zaciski do węży na rurki z medium.
    3. Określ ilość odparowanego medium na podstawie oznaczeń poziomu objętości na zbiornikach z medium.
    4. Przenieś tackę z bioreaktorem i jednostkami płynowymi do komory z laminarnym przepływem powietrza.
    5. Zdejmij gumowe filtry powietrza ze zbiorników z medium; dodaj autoklawowaną wodę ultrapure, aby zrekompensować odparowaną objętość medium. Zamknij ponownie zbiorniki z medium i podłącz je ponownie do pompy, aby wymieszać medium z wodą ultrapure.
    6. Powtórz kroki 6.3.1–6.3.5. Ponownie zdejmij gumowe filtry powietrza, pobierz 25 mL medium hodowlanego i odwiruj przy 300 × g przez 5 min w RT.
      1. Zbierz 1,5 mL supernatantu i przechowuj w -30 °C do analizy profili sekrecyjnych (do analizy za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA)).
      2. Zbierz żądaną objętość supernatantu do badań nad sygnalizacją parakrynną, wykorzystując supernatant jako medium warunkowane43.
    7. Dodaj 25 mL świeżego medium do zbiorników z medium.
    8. Załóż gumowe filtry powietrza z powrotem na zbiorniki z medium.
    9. Umieść cały zestaw z powrotem w inkubatorze; podłącz wszystkie kable i rurki powietrzne do pompy i pompy do rozciągania. Zwolnij zaciski do węży i powtórz kroki 5.4–5.8.
  4. Sprawdź, czy kuleczki żelu krzemionkowego w butelkach suszących podłączonych do pompy są wilgotne (biały kolor) i w razie potrzeby wymień je na suche kuleczki krzemionkowe (pomarańczowy kolor).

7. Zakończenie eksperymentu, pobieranie próbek, czyszczenie i przechowywanie sprzętu

  1. W ostatnim dniu eksperymentu należy skorygować parowanie pożywki zgodnie z opisem w krokach 6.3.1–6.3.5, a następnie kolejno zebrać próbki.
    1. Aby pobierać próbki jedna po drugiej, należy kilkukrotnie zatrzymać pompę przepływową oraz pompę szczepu. Na przewodzie z pożywką należy umieścić zacisk do węży. Tymczasowo zatrzymać pompę przepływową i pompę szczepu. Odłączyć jedną komorę hodowli przepływowej od podstawy bioreaktora; w miejscu przyłączenia na podstawie bioreaktora założyć białą zaślepkę Luer. Komorę hodowli przepływowej wraz z jednostką fluidyczną przenieść do komory z laminarnym przepływem powietrza. Ponownie uruchomić pompę przepływową i pompę szczepu, aby utrzymać obciążenie hemodynamiczne pozostałych próbek aż do momentu ich pobrania.
    2. Pobrać medium z rezerwuarów pożywki w celu analizy produkcji cytokin parakrynnych metodą ELISA.
  2. Odłącz jednostki przepływowe i pobierz konstrukt rurkowy. Wykonaj sekcję zgodnie z przyjętym schematem cięcia. Części konstruktu można przechowywać w 4 °C (po 15-minutowej fiksacji w 3,7% formaldehydzie i trzykrotnym 5-minutowym płukaniu w PBS) lub -30 °C (po szybkim zamrażaniu w ciekłym azocie) do czasu dalszej analizy.
  3. Wyczyść bioreaktor oraz elementy pompy. Dodatkowo w [tekście/sekcji] wskazano zalecaną metodę czyszczenia dla poszczególnych elementów. Tabela materiałów.
    1. Oczyścić gumowe filtry powietrza 70% etanolem. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie namoczyć filtra wewnętrznego!
    2. Zebrać wszystkie oddzielne elementy: przewody do pożywki, zbiorniki na pożywkę, szklane rurki, korki Luer (male) i złączki Luer (female), białe nakrętki Luer, przewody ciśnieniowe, stożki nosowe, silikonowe pierścienie O-ring, tuleje adapterowe, prostownice przepływu (z wyłączeniem pomp, jednostek płynowych, gumowych filtrów powietrza oraz podstawy bioreaktora) i opłukać pod bieżącą wodą z kranu.
    3. Inkubować przez noc w 0,1% dodcylowanym siarczanie sodu w wodzie dejonizowanej.
      UWAGA: Nie należy używać wody ultrapure, ponieważ części mogą ulec korozji.
    4. Opłukać wodą z kranu i detergentem do mycia naczyń.
    5. Zanurzyć w wodzie dejonizowanej, następnie dwukrotnie w 70% etanolu, a na koniec w wodzie dejonizowanej.
    6. Umieść wszystkie materiały osobno na ręcznikach papierowych i pozostaw do wyschnięcia. Do osuszenia rurek użyj sprężonego powietrza.
    7. Wszystkie materiały niepodlegające autoklawowaniu należy oczyścić za pomocą ręcznika papierowego nasączonego 70% etanolem. Dotyczy to gumowego filtra powietrza (należy pamiętać, aby filtr powietrza pozostał suchy) oraz podstawy bioreaktora (miech teflonowy i cylinder pneumatyczny).
    8. Autoklawować elementy komory płynowej (w tym silikonowy pierścień O-ring), przewody do medium, zbiorniki na medium (bez gumowego filtra powietrznego), męskie korki Luer i żeńskie łączniki Luer, białe nakrętki Luer, opaski zaciskowe oraz wyposażenie standardowe (np. pęsetę, nożyczki zaciskowe).
    9. W celu ułatwienia pracy podczas kolejnych eksperymentów, należy umieścić oddzielne komponenty jednego kompletnego zestawu komory płynowej w autoklawowalnym pudełku.
  4. Usunąć wodę z zbiornika hydraulicznego. Oczyścić 70% etanolem, a następnie wodą dejonizowaną. Pozostawić do wyschnięcia. Ponownie napełnić wodą dejonizowaną z dodatkiem kilku kropli środka dezynfekującego do kąpieli wodnych.
  5. Przechowywać szklane probówki do komory hodowli przepływowej w 70% etanolu.
  6. Umieścić wilgotne kuleczki osuszające z krzemionki (o białym kolorze) w piekarniku na noc (O/N) w temperaturze 120 °C pozostawić do wyschnięcia (do uzyskania pomarańczowego koloru), a następnie przechowywać w szczelnym słoju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ten bioreaktor został opracowany w celu badania indywidualnego i połączonego wpływu naprężeń ścinających oraz cyklicznego rozciągania na wzrost i przebudowę tkanki naczyniowej w trójwymiarowych rusztowaniach z biomateriałów. Konstrukcja bioreaktora umożliwia hodowlę do ośmiu konstruktów naczyniowych w różnych warunkach obciążenia (Rysunek 1A). Konstrukty naczyniowe są umieszczone w komorze hodowli przepływowej (Rysunek 1B), w której zarówno rozciąganie obwodowe,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany w niniejszym dokumencie bioreaktor pozwala na systematyczną ocenę wpływu poszczególnych i łącznych skutków naprężeń ścinających i cyklicznego rozciągania na stan zapalny i regenerację tkanek w rurowych rusztowaniach resorbowalnych. Podejście to umożliwia również wykonywanie wielu różnych analiz na konstruktach naczyniowych, czego przykładem jest sekcja dotycząca wyników reprezentatywnych. Wyniki te pokazują charakterystyczny wpływ różnych reżimów obciążenia hemodynamicznego (tj. różnych kombinacji ścinania i rozc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie jest wspierane finansowo przez ZonMw w ramach programu LSH 2Treat (436001003) oraz Holenderską Fundację Nerek (14a2d507). N.A.K. dziękuje za wsparcie Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (851960). Z wdzięcznością dziękujemy za Program Grawitacyjny "Materials Driven Regeneration", finansowany przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (024.003.013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
zaawansowany Dulbecco' s zmodyfikowana pożywka do hodowli komórkowych EagleMedium (aDMEM)Gibco12491-015hodowli fibroblastów
Aqua StabilJulabo8940012zapobiega rozwojowi mikroorganizmów w bioreaktorze-zbiorniku hydraulicznym
Fibrynogen bydlęcySigmaF8630do przygotowania żelu fibrynonowego do wysiewu komórek na rusztowaniu elektroprzędzonym
Trombin bydlęcySigmaT4648do przygotowania żelu fibrynogenowego do wysiewu komórek na rusztowaniu elektroprzędzonym
WirówkaEppendorf5804do odwirowania komórek i kondycjonowanego podłoża
Nożyczki zaciskowe - "kleszcze Kelly'ego"AlmedicP-422zaciśnij rurkę silikonową i nałóż wstępne rozciągnięcie na rusztowanie, aby rusztowanie można było wszyć w wygrawerowany rowek (autoklaw w kroku 1, kroku 7)
Inkubatory do hodowli komórkowych CO2SanyoMCO-170AIC-PEdo hodowli komórek
Zbiornik sprężonego powietrzaFestoCRVZS-5wygładza wahania ciśnienia powietrza i tworzy opóźnienia czasowe dla wzrostu ciśnienia
Niestandardowy skrypt Matlab do obliczania maksymalnych rozciągnięćMatlabR2017. Mathworks, Natick, MAoblicza minimalną i maksymalną średnicę zewnętrzną rusztowania elektroprzędzonego
Tablica akwizycji danychNational InstrumentsBNC-2090przetwarzanie danych między systemem wzmacniacza a komputerem
EtanolVWRVWRK4096-9005w celu utrzymania sterylnych warunków pracy
Surowica cielęca bydła płodowego (FBS)Greiner758087suplement pożywki do hodowli komórkowych; surowica-suplement
Komory do hodowli przepływowej, składające się z przewodu ciśnieniowego z wygrawerowanymi rowkami i małymi otworami do wywierania nacisku na rurki silikonowe, gwintem śrubowym, stożkiem nosowym, górną komorą z wlotem przepływu i wylotem przepływu komory dolnej, tuleją adapteraWykonane na zamówienie, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Uniwersytet Techniczny w Eindhovenn.a.komorykomory hodowli przepływowej (autoklaw w kroku 1, krok 7)
Szklany asystent pipety PasteuraHE40567002zastosować próżnię na rusztowaniu elektroprzędzonym (autoklaw w kroku 1)
Szklane rurki komory kulturowej przepływowejwykonane przez Custon, sprzęt i Centrum Prototypów, Uniwersytet Techniczny w Eindhovenbrak częścikomory do hodowli przepływowej (czyste i przechowywane w 70% etanolu, na etapie 1 i 7)
GlutaMaxGibco35050061pożywka do hodowli komórkowych suplement aminokwasowy, minimalizuje gromadzenie się amoniaku Kamera
szybkoobrotowaMotionScopeM-5monitorować rozciąganie podczas hodowli; Zdjęcia poklatkowe rusztowań są wykonywane z częstotliwością 30 Hz przez 6 sekund (tj. 3 cykle rozciągania)
Obiektyw szybkiego aparatu - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - obiektywNikonJAA616ABdo monitorowania rozciągania podczas hodowli; Zdjęcia poklatkowe rusztowań są wykonywane z częstotliwością 30 Hz przez 6 sekund (tj. 3 cykle rozciągania)
Opaskaibidi GmbH10821blok przepływu medium (autoklaw w kroku 1, Krok 7)
Zbiornik hydrauliczny z 8 gwintami śrubowymi dla 8 przepływowych komór hodowlanychWykonane na zamówienie, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Uniwersytet Techniczny w Eindhovenn.a.w celu wywarcia nacisku na konstrukcje zamontowane w silikonie (wyczyść na zewnątrz chusteczką papierową z 70% etanolem, przepłucz zbiornik 70% etanolem, a następnie wodą demineralizowaną, w kroku 1 i 7)
System pomp Ibidi (8x), w tym pompa ibidi, oprogramowanie PumpControl, jednostka fluidyczna, zestaw perfuzyjny (rurka średnia), rurka ciśnieniowa powietrza, butelki suszące z pomarańczowymi kulkami krzemionkiKonfiguracja ibidi GmbH10902służy do sterowania przepływem w komorach kulturowych. Uwaga 1: pompy ibidi zostały zmodyfikowane przez producenta, aby umożliwić wydajność 200 mbar. Uwaga 2: może być zastąpiony przez system pompowy innego producenta, o ile można zastosować te same reżimy przepływu.
Noże (nr 10 sterylnych ostrzy, indywidualne opakowanie foliowe) i rękojeść skalpela (stal nierdzewna, pakowane pojedynczo)Swann Morton0301; 0933do cięcia rurki silikonowej w rozmiarze odpowiednim dla rusztowania i do cięcia materiału do szycia
Oprogramowanie LabVIEWNational Instrumentswersja 2018do kontrolowania rozciągania zastosowanego na rusztowaniach
Szafa bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym ze światłem UVLabconco302310001w celu zapewnienia sterylnych warunków pracy. Promieniowanie UV służy do odkażania wszystkiego, czego nie można zautoklawować lub dotknąć po autoklawowaniu
Duże i małe szalki PetriegoGreiner664-160do sterylnych warunków pracy
Kwas L-askorbinowy 2-fosforan (witamina C)SigmaA8960pożywki do hodowli komórkowych, ważny dla produkcji kolagenu
Źródło światła LED KL2500ZeissSchott AGaby pomóc w wizualizacji upływu czasu rusztowań podczas monitorowania rozciągania
Zamki i łączniki Luer (żeńskie i męskie), białe nasadki Lueribidi GmbHróżne, patrz (https://ibidi.com/26-flow-accessories)aby zamknąć lub połączyć części bioreaktora i pompy ibidi (autoklaw w kroku 1, kroku 7)
Wzmacniacz pomiarowy (PICAS)PEEKEL instruments B.V.n.d.wcelu wzmocnienia sygnału z czujnika ciśnienia i sprzężenia zwrotnego do LabView
Zbiornik Medium (duże strzykawki 60 ml) i uchwyty zbiornikówibidi GmbH10974zbiornik medium (autoklaw w kroku 1, kroku 7)
Medium rurka o średnicy zewnętrznej 4,25 mm i średnicy wewnętrznej 1 mmGuma BV1805Aby umożliwić większe natężenie przepływu, zastosowano rurkę ibidi Medium o większej średnicy. Uwaga: część rurki medium prowadzona przez zawory jednostki fluidycznej jest taka sama jak domyślna rurka medium ibidi
Oprogramowanie Motion StudioIdtvision2.15.00do tworzenia obrazów poklatkowych z dużą prędkością do monitorowania rozciągania
Igła (19G)BD Microlance301700wraz z cienką elastyczną rurką służącą do napełniania zbiornika hydraulicznego ultraczystą wodą bez dodawania pęcherzyków powietrza
SterownikigłowyAdson2429218do przenoszenia igły nylonowego szwu przez silikonową rurkę (autoklaw w kroku 1, kroku 7)
Chusteczki papieroweKleenex38044001do czyszczenia sprzętu 70% etanolem
ParafilmSigma P7793-1EAszybka naprawa w przypadku wystąpienia wycieku
Penicylina/streptomycyna (P/S)LonzaDE17-602Esuplement pożywki do hodowli komórkowych; zapobiegać bakteriom Zanieczyszczenie
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaP4417-100TABdo etapów przechowywania i mycia (autoklaw na etapie 1)
Pojemniki plastikowe (60 ml) z czerwonymi nakrętkamiGreiner206202do przygotowania roztworu fibrynogenu
Siłownik pneumatycznyFestoAEVC-20-10-I-Pdo uruchamiania miecha teflonowego (wyczyść chusteczką papierową z 70% etanolem w kroku 1 i 7)
Rusztowania rurowe z polikaprolaktonu bisurea (PCL-BU) (średnica wewnętrzna 3 mm, 200 &mikro; m grubość ścianki, długość 20 mm)SyMO-Chem, Eindhoven, Holandian.d.a.produkowane metodą elektroprzędzenia z 15% (w/w) roztworów polimerów chloroformu (Sigma; 372978). Więcej informacji można znaleźć w Van Haaften i in. Inżynieria tkankowa część C (2018)
Przewód ciśnieniowy bez otworów (do kontroli statycznej)Wykonany na zamówienie, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Uniwersytet Techniczny w Eindhovenn.a.do montażu rurek elektroprzędzonych na rurkach silikonowych (autoklaw w kroku 1, kroku 7)
Czujnik ciśnienia i przetwornikBDTC-XX i P 10 EZCiśnienie powietrza docierającego do pompy uruchamianej pneumatycznie jest podnoszone, aż osiągnie ustawione ciśnienie
Proporcjonalny zawór regulacji ciśnienia powietrza i czujnik ciśnieniaFestoMPPES-3-1/8-2-010, 159596dostarcza sprężone powietrze do pompy uruchamianej pneumatycznie
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)GibcoA1049101pożywka do hodowli komórkowych monocytów/makrofagów
Bezpieczny zamek Probówki Eppendorfa (1,5 ml)Eppendorf30120086wielu zastosowań (autoklaw w kroku 1)
Roztwór dodecylosiarczanu sodu 20%Sigma5030Służy do czyszczenia materiałów, w stężeniu 0,1%.   
Silikonowe O-ringiTechnirub1250Szapobiegające wyciekom (autoklaw w kroku 1, kroku 7)
Rurka silikonowa (średnica zewnętrzna 2,8 mm, grubość ścianki 400 um)Guma BV1805do montażu rurek elektroprzędzonych na przewodach ciśnieniowych (autoklaw w kroku 1)
Sterylna rurka (15 ml)Falcon352095wielu zastosowań
Szew, 5-0 prolen z wstępnie przymocowaną igłąstożkowąEthicon, Johnson & Drutdo szycia Johnson EH7404H Prolene 5-0 (długość 75 cm, igła stożkowa TF, 1/2 koła, długość igły 13 mm)
Strzykawka (24 ml)B. Braun Melsungen AG2057932do dodawania ultraczystej wody lub pożywki do zbiornika hydraulicznego lub komory hodowli przepływowej
Filtr strzykawkowy (0,2 &mikro; m)Satorius17597-Kdo filtrowania roztworu fibrynogenu
Kolba do hodowli komórkowych T150 z nasadką filtrującąNunc178983do odgazowania pożywki hodowlanej
T75 Kolba do hodowli komórkowych z nasadką filtrującąNunc156499do hodowli próbek kontroli statycznej
Mieszek teflonowyWykonane na zamówienie, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Uniwersytet Techniczny w Eindhovenn.a.do załadowania zbiornika hydraulicznego (wyczyść na zewnątrz chusteczką papierową z 70% etanolem w kroku 1 i 7)
Taca (stal nierdzewna)PolarWare15-248do łatwego transportu komór do hodowli fluidalnej i bioreaktora z inkubatora do komory laminarnej i z powrotem (wyczyść chusteczką papierową z 70% etanolem przed i po użyciu)
PęsetaWironit4910sterylne obchodzenie się z poszczególnymi częściami (autoklaw na etapie 1 i 7)
Woda ultraczystaStakpureOmniapure UV 18200002do korekcji parowania średniego, zmieszana z mieszanką aqua stabil i stosowana jako płyn hydrauliczny. (Woda ultraczysta w autoklawie w kroku 1)
Lampa UVPhilipsTUV 30W/G30 T8do odkażania szczepów i części bioreaktora przed siewem
do zaciskowa suplement

Bibliografia

  1. Chlupác, J., Filová, E., Bacáková, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiological Research. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
  2. Huygens, S. A., et al. Bioprosthetic aortic valve replacement in elderly patients: Meta-analysis and microsimulation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 157 (6), 2189-2197 (2019).
  3. Huygens, S. A., et al. Contemporary outcomes after surgical aortic valve replacement with bioprostheses and allografts: a systematic review and meta-analysis. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (4), 605-616 (2016).
  4. Loh, S. A., et al. Mid- and long-term results of the treatment of infrainguinal arterial occlusive disease with precuffed expanded polytetrafluoroethylene grafts compared with vein grafts. Annals of Vascular Surgery. 27 (2), 208-217 (2013).
  5. Tara, S., et al. Vessel bioengineering. Circulation Journal. 78 (1), 12-19 (2014).
  6. Huang, A. H., Niklason, L. E. Engineering of arteries in vitro. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (11), 2103-2118 (2014).
  7. Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M., Baaijens, F. P. T. Can we grow valves inside the heart? Perspective on material-based in situ heart valve tissue engineering. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 54(2018).
  8. Fioretta, E. S., et al. Next-generation tissue-engineered heart valves with repair, remodelling and regeneration capacity. Nature Reviews Cardiology. , (2020).
  9. Kirkton, R. D., et al. Bioengineered human acellular vessels recellularize and evolve into living blood vessels after human implantation. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  10. Gutowski, P., et al. Arterial reconstruction with human bioengineered acellular blood vessels in patients with peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. , (2020).
  11. Syedain, Z., et al. Tissue engineering of acellular vascular grafts capable of somatic growth in young lambs. Nature Communications. 7 (12951), 12951(2016).
  12. Sugiura, T., et al. Tissue-engineered vascular grafts in children with congenital heart disease: intermediate term follow-up. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery. 30 (2), 175-179 (2018).
  13. Kluin, J., et al. In situ heart valve tissue engineering using a bioresorbable elastomeric implant - material design to 12 months follow-up in sheep. Biomaterials. 125, 101-117 (2017).
  14. Fioretta, E. S., et al. Differential leaflet remodeling of bone marrow cell pre-seeded versus nonseeded bioresorbable transcatheter pulmonary valve replacements. JACC. Basic to Translational Science. 5 (1), 15-31 (2020).
  15. Van Haaften, E. E., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A. Vascular mechanobiology: towards control of. Cells. , 1-24 (2017).
  16. De Jonge, N., et al. Matrix production and organization by endothelial colony forming cells in mechanically strained engineered tissue constructs. PLoS ONE. 8 (9), 73161(2013).
  17. Schmidt, J. B., Chen, K., Tranquillo, R. T. Effects of intermittent and incremental cyclic stretch on ERK signaling and collagen production in engineered tissue. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (1), 55-64 (2016).
  18. Luo, J., et al. Tissue-engineered vascular grafts with advanced mechanical strength from human iPSCs. Cell Stem Cell. 26 (2), 251-261 (2020).
  19. Van Haaften, E. E., et al. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
  20. Gupta, V., Tseng, H., Lawrence, B. D., Jane Grande-Allen, K. Effect of cyclic mechanical strain on glycosaminoglycan and proteoglycan synthesis by heart valve cells. Acta Biomaterialia. 5 (2), 531-540 (2009).
  21. Lin, S., Mequanint, K. Bioreactor-induced mesenchymal progenitor cell differentiation and elastic fiber assembly in engineered vascular tissues. Acta Biomaterialia. 59, 200-209 (2017).
  22. Venkataraman, L., Bashur, C. A., Ramamurthi, A. Impact of cyclic stretch on induced elastogenesis within collagenous conduits. Tissue Engineering. Part A. 20 (9-10), 1403-1415 (2014).
  23. Huang, A. H., et al. Biaxial stretch improves elastic fiber maturation, collagen arrangement, and mechanical properties in engineered arteries. Tissue Engineering Part C Methods. 22 (6), 524-533 (2016).
  24. Hinderer, S., et al. In vitro elastogenesis: instructing human vascular smooth muscle cells to generate an elastic fiber-containing extracellular matrix scaffold. Biomedical Materials. 10 (3), 034102(2015).
  25. Eoh, J. H., et al. Enhanced elastin synthesis and maturation in human vascular smooth muscle tissue derived from induced-pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 52, 49-59 (2017).
  26. Smits, A. I. P. M., Bouten, C. V. C. Tissue engineering meets immunoengineering: Prospective on personalized in situ tissue engineering strategies. Current Opinion in Biomedical Engineering. 6, 17-26 (2018).
  27. Wissing, T. B., Bonito, V., Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M. Biomaterial-driven in situ cardiovascular tissue engineering-a multi-disciplinary perspective. npj Regenerative Medicine. 2 (1), 18(2017).
  28. Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25 (12), 4253-4263 (2011).
  29. Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. Macrophages are required for adult salamander limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).
  30. Godwin, J. W., Debuque, R., Salimova, E., Rosenthal, N. A. Heart regeneration in the salamander relies on macrophage-mediated control of fibroblast activation and the extracellular landscape. npj Regenerative Medicine. 2 (1), 22(2017).
  31. McBane, J. E., Cai, K., Labow, R. S., Santerre, J. P. Co-culturing monocytes with smooth muscle cells improves cell distribution within a degradable polyurethane scaffold and reduces inflammatory cytokines. Acta Biomaterialia. 8 (2), 488-501 (2012).
  32. Battiston, K. G., Ouyang, B., Labow, R. S., Simmons, C. A., Santerre, J. P. Monocyte/macrophage cytokine activity regulates vascular smooth muscle cell function within a degradable polyurethane scaffold. Acta Biomaterialia. 10 (3), 1146-1155 (2014).
  33. Ploeger, D. T., et al. Cell plasticity in wound healing: paracrine factors of M1/ M2 polarized macrophages influence the phenotypical state of dermal fibroblasts. Cell Communication and Signaling. 11 (1), 29(2013).
  34. McBane, J. E., Santerre, J. P., Labow, R. S. The interaction between hydrolytic and oxidative pathways in macrophage-mediated polyurethane degradation. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 82 (4), 984-994 (2007).
  35. Wissing, T. B., et al. Macrophage-driven biomaterial degradation depends on scaffold microarchitecture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 87(2019).
  36. Wolf, M. T., Vodovotz, Y., Tottey, S., Brown, B. N., Badylak, S. F. Predicting in vivo responses to biomaterials via combined in vitro and in silico analysis. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (2), 148-159 (2015).
  37. Grotenhuis, N., Bayon, Y., Lange, J. F., Van Osch, G. J. V. M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M. A culture model to analyze the acute biomaterial-dependent reaction of human primary macrophages. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 115-120 (2013).
  38. Jannasch, M., et al. A comparative multi-parametric in vitro model identifies the power of test conditions to predict the fibrotic tendency of a biomaterial. Scientific Reports. 7 (1), 1689(2017).
  39. Wang, Z., et al. The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(ε-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration. Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).
  40. McWhorter, F. Y., Davis, C. T., Liu, W. F. Physical and mechanical regulation of macrophage phenotype and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (7), 1303-1316 (2014).
  41. Ballotta, V., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Strain-dependent modulation of macrophage polarization within scaffolds. Biomaterials. 35 (18), 4919-4928 (2014).
  42. Dziki, J. L., et al. The effect of mechanical loading upon extracellular matrix bioscaffold-mediated skeletal muscle remodeling. Tissue Engineering. Part A. 24 (1-2), 34-46 (2018).
  43. Wissing, T. B., et al. Hemodynamic loads distinctively impact the secretory profile of biomaterial-activated macrophages - implications for in situ vascular tissue engineering. Biomaterials Science. 8 (1), 132-147 (2020).
  44. Van Haaften, E. E., Wissing, T. B., Kurniawan, N. A., Smits, A. I. P. M., Bouten, C. V. C. Human in vitro model mimicking material-driven vascular regeneration reveals how cyclic stretch and shear stress differentially modulate inflammation and matrix deposition. Advanced Biosystems. 4 (6), 1900249(2020).
  45. Ballotta, V., Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Synergistic protein secretion by mesenchymal stromal cells seeded in 3D scaffolds and circulating leukocytes in physiological flow. Biomaterials. 35 (33), 9100-9113 (2014).
  46. Bonito, V., de Kort, B. J., Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M. Cyclic strain affects macrophage cytokine secretion and extracellular matrix turnover in electrospun scaffolds. Tissue Engineering Part A. 25 (17-18), 1310-1325 (2019).
  47. Battiston, K. G., Labow, R. S., Simmons, C. A., Santerre, J. P. Immunomodulatory polymeric scaffold enhances extracellular matrix production in cell co-cultures under dynamic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 24, 74-86 (2015).
  48. Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. A mesofluidics-based test platform for systematic development of scaffolds for in situ cardiovascular tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (6), 475-485 (2012).
  49. Smits, A. I. P. M., Ballotta, V., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. T. Shear flow affects selective monocyte recruitment into MCP-1-loaded scaffolds. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2176-2188 (2014).
  50. Ballotta, V., Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Synergistic protein secretion by mesenchymal stromal cells seeded in 3D scaffolds and circulating leukocytes in physiological flow. Biomaterials. 35 (33), 9100-9113 (2014).
  51. Fahy, N., Menzel, U., Alini, M., Stoddart, M. J. Shear and dynamic compression modulates the inflammatory phenotype of human monocytes in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 383(2019).
  52. Pennings, I., et al. Layer-specific cell differentiation in bi-layered vascular grafts under flow perfusion. Biofabrication. 12 (1), 015009(2019).
  53. Wang, J., et al. Ex vivo blood vessel bioreactor for analysis of the biodegradation of magnesium stent models with and without vessel wall integration. Acta Biomater. 50, 546-555 (2017).
  54. Huang, A. H., et al. Design and use of a novel bioreactor for regeneration of biaxially stretched tissue-engineered vessels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (8), 841-851 (2015).
  55. Huang, A. H., Niklason, L. E. Engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (52), e2646(2011).
  56. Bono, N., et al. A Dual-mode bioreactor system for tissue engineered vascular models. Annals of Biomedical Engineering. 45 (6), 1496-1510 (2017).
  57. Wolf, F., et al. VascuTrainer: a mobile and disposable bioreactor system for the conditioning of tissue-engineered vascular grafts. Annals of Biomedical Engineering. 46 (4), 616-626 (2018).
  58. Ramaswamy, S., et al. A novel bioreactor for mechanobiological studies of engineered heart valve tissue formation under pulmonary arterial physiological flow conditions. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (12), 121009(2014).
  59. Piola, M., et al. A compact and automated ex vivo vessel culture system for the pulsatile pressure conditioning of human saphenous veins. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (3), 204-215 (2016).
  60. Vanerio, N., Stijnen, M., de Mol, B. A. J. M., Kock, L. M. An innovative ex vivo vascular bioreactor as comprehensive tool to study the behavior of native blood vessels under physiologically relevant conditions. Journal of Engineering and Science in Medical Diagnostics and Therapy. 2 (4), (2019).
  61. Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplantation. 27 (9), 1375-1389 (2018).
  62. Sinha, R., et al. A medium throughput device to study the effects of combinations of surface strains and fluid-flow shear stresses on cells. Lab on a Chip. 15 (2), 429-439 (2015).
  63. Beca, B. M., Sun, Y., Wong, E., Moraes, C., Simmons, C. A. Dynamic bioreactors with integrated microfabricated devices for mechanobiological screening. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 581-592 (2019).
  64. Liu, H., Usprech, J., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform with hydrogel arrays for 3D mechanical stimulation of cells. Acta Biomaterialia. 34, 113-124 (2016).
  65. Szafron, J. M., Ramachandra, A. B., Breuer, C. K., Marsden, A. L., Humphrey, J. D. Optimization of tissue-engineered vascular graft design using computational modeling. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 561-570 (2019).
  66. Emmert, M. Y., et al. Computational modeling guides tissue-engineered heart valve design for long-term in vivo performance in a translational sheep model. Science Translational Medicine. 10 (440), (2018).
  67. Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26 (16), 3113-3121 (2005).
  68. van Kelle, M. A. J., et al. A Bioreactor to identify the driving mechanical stimuli of tissue growth and remodeling. Tissue Engineering Part C: Methods. 23 (6), (2017).
  69. van den Broek, C. N., et al. Medium with blood-analog mechanical properties for cardiovascular tissue culturing. Biorheology. 45 (6), 651-661 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

naprężenie ścinającerozciąganie cyklicznetkankowo inżynieryjne przeszczepy naczynioweludzkie makrofagimiofibroblastykomora do hodowli przepływowejdepozycja kolagenu typu 1profil sekrecji cytokinalfa-aktyna mięśni gładkich
Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.