Artykuł metodologiczny

Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

DOI:

10.3791/61824

⸱

10 grudnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems (ICMS), Eindhoven University of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie dynamicznej ko-hodowli ludzkich makrofagów i miofibroblastów w rurowych rusztowaniach elektroprzędzonych w celu zbadania regeneracji tkanek sterowanej materiałem, przy użyciu bioreaktora, który umożliwia oddzielenie naprężeń ścinających od cyklicznego rozciągania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie resorbowalnych biomateriałów do wywołania regeneracji bezpośrednio w organizmie jest atrakcyjną strategią z punktu widzenia translacji. Takie materiały wywołują reakcję zapalną po implantacji, która jest motorem późniejszej resorpcji materiału i regeneracji nowej tkanki. Strategia ta, znana również jako inżynieria tkankowa in situ, jest stosowana w celu uzyskania zamienników układu sercowo-naczyniowego, takich jak przeszczepy naczyniowe inżynierii tkankowej. Zarówno procesy zapalne, jak i regeneracyjne są determinowane przez lokalne sygnały biomechaniczne na rusztowaniu (tj. naprężenia rozciągające i ścinające). W tym miejscu szczegółowo opisujemy zastosowanie specjalnie opracowanego bioreaktora, który w unikalny sposób umożliwia oddzielenie naprężeń rozciągających i ścinających na rusztowaniu rurowym. Pozwala to na systematyczną i wystandaryzowaną ocenę zdolności zapalnych i regeneracyjnych rusztowań rurowych pod wpływem dobrze kontrolowanych obciążeń mechanicznych, co wykazujemy na podstawie dynamicznego eksperymentu z udziałem ludzkich makrofagów i miofibroblastów. Szczegółowo omówiono kluczowe praktyczne kroki w tym podejściu – budowę i ustawienie bioreaktora, przygotowanie rusztowań i wysiewu komórek, zastosowanie i utrzymanie przepływu rozciągającego i ścinającego oraz pobieranie próbek do analizy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria tkanek sercowo-naczyniowych (TE) jest poszukiwana jako alternatywna opcja leczenia dla obecnie stosowanych stałych protez sercowo-naczyniowych (np. przeszczepy naczyniowe, wymiana zastawek serca), które są nieoptymalne dla dużych kohort pacjentów1,2,3,4. Bardzo poszukiwane zastosowania obejmują przeszczepy naczyniowe inżynierii tkankowej (TEVG)5,6 i zastawki serca (TEHVs)7,8. Najczęściej metodologie TE układu sercowo-naczyniowego wykorzystują resorbowalne biomateriały (naturalne lub syntetyczne), które służą jako pouczające rusztowanie dla nowej tkanki, która ma zostać utworzona. Tworzenie nowej tkanki może być albo całkowicie zmodyfikowane in vitro, poprzez zasianie rusztowania komórkami i hodowla w bioreaktorze przed implantacją (in vitro TE)9,10,11, lub bezpośrednio in situ, w którym syntetyczne rusztowanie jest wszczepiane bez wstępnego hodowli w celu wywołania tworzenia nowej tkanki bezpośrednio w organizmie (in situ TE)12,13,14. Zarówno w przypadku metod TE sercowo-naczyniowych in vitro, jak i in situ, skuteczna regeneracja funkcjonalna zależy głównie zarówno od odpowiedzi immunologicznej gospodarza na wszczepiony konstrukt, jak i od odpowiedniego obciążenia biomechanicznego.

Znaczenie obciążenia biomechanicznego dla układu sercowo-naczyniowego TE jest dobrze znane15. W przypadku implantów sercowo-naczyniowych komórki zasiedlające rusztowanie są narażone na cykliczne naprężenia rozciągające i ścinające, które powstają w wyniku środowiska hemodynamicznego. Liczne badania wykazały stymulujący wpływ (cyklicznego) rozciągania na tworzenie składników matrycy, takich jak collagen16,17,18,19, glikozaminoglikany (GAG)20 i elastin21,22, według różnych typów komórek. Na przykład Huang i wsp. wykazali, że rozciągliwość dwuosiowa zwiększa odkładanie i organizację kolagenu i elastyny w TEVG in vitro przy użyciu bioreaktora naczyniowego23. Podczas gdy nacisk zwykle kładzie się na rozciąganie jako dominujące obciążenie, badania te często wykorzystują bioreaktory napędzane przepływem, w których próbka jest również narażona na przepływ ścinający. Chociaż stosunkowo niewiele wiadomo na temat izolowanego wpływu naprężeń ścinających na tworzenie tkanek i stan zapalny w 3D, dostępne są pewne dane. Na przykład Hinderer i in. oraz Eoh i wsp. wykazali, że przepływ ścinający, oprócz mikrostruktury rusztowania 3D, był ważny dla tworzenia dojrzałej elastyny przez ludzkie komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych w systemie modelowym in vitro24,25. Podsumowując, odkrycia te ilustrują znaczenie zarówno cyklicznego rozciągania, jak i naprężenia ścinającego dla układu sercowo-naczyniowego.

Innym ważnym czynnikiem decydującym o sukcesie lub porażce implantów TE jest odpowiedź immunologiczna gospodarza na wszczepiony przeszczep26. Jest to szczególnie ważne w przypadku strategii TE opartych na materiale in situ, które w rzeczywistości opierają się na ostrej odpowiedzi zapalnej na rusztowanie, aby uruchomić kolejne procesy napływu komórek oraz tworzenia i przebudowy tkanek endogennych27. Makrofag jest kluczowym inicjatorem funkcjonalnej regeneracji tkanek, co zostało wykazane w wielu badaniach28,29,30. Analogicznie do gojenia się ran, regeneracja tkanek jest regulowana przez sygnalizację parakrynną między makrofagami a komórkami wytwarzającymi tkanki, takimi jak fibroblasty i miofibroblasty31,32,33. Oprócz koordynowania depozycji nowych tkanek, makrofagi biorą udział w aktywnej resorpcji obcego materiału rusztowania34,35. W związku z tym odpowiedź makrofagów in vitro na biomateriał została zidentyfikowana jako parametr predykcyjny dla sukcesu implantów in vivo 36,37,38.

Reakcja makrofagów na wszczepione rusztowanie zależy od cech projektu rusztowania, takich jak skład materiału i mikrostruktura35,39,40. Oprócz właściwości rusztowania, na odpowiedź makrofagów na rusztowanie i ich wzajemne oddziaływanie z miofibroblastami wpływają również obciążenia hemodynamiczne. Na przykład wykazano, że cykliczne rozciąganie jest ważnym modulatorem fenotypu makrofagów41,42,43,44 i wydzielanie cytokin43,44,45,46 w rusztowaniach elektroprzędzonych 3D. Korzystając z systemu kohodowli makrofagów i komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, Battiston i in. wykazali, że obecność makrofagów prowadzi do zwiększonego poziomu elastyny i GAG oraz że umiarkowane poziomy cyklicznego rozciągania (1,07–1,10) stymulują odkładanie się kolagenu I i elastyny47. W poprzednich pracach wykazaliśmy, że naprężenie ścinające jest ważnym czynnikiem determinującym rekrutację monocytów do elektrowirowanych rusztowań 3D48,49, oraz że zarówno naprężenie ścinające, jak i cykliczne rozciąganie wpływają na sygnalizację parakrynną między ludzkimi monocytami a mezenchymalnymi komórkami zrębu50. Fahy i wsp. wykazali, że przepływ ścinający zwiększa wydzielanie cytokin prozapalnych przez ludzkie monocyty51.

Razem wzięte, powyższe dowody pokazują, że odpowiednie zrozumienie i kontrola obciążeń hemodynamicznych jest kluczowe dla sercowo-naczyniowej TE, i że ważne jest, aby wziąć pod uwagę reakcję zapalną, aby to osiągnąć. Wiele bioreaktorów zostało opisanych wcześniej dla klasy in vitro52,53,54,55,56,57,58 lub ex vivo59,60,61 hodowla tkanek sercowo-naczyniowych. Jednak wszystkie te systemy są zaprojektowane tak, aby w jak największym stopniu naśladować fizjologiczne warunki obciążenia hemodynamicznego. Chociaż jest to bardzo cenne w celu tworzenia tkanek sercowo-naczyniowych in vitro lub utrzymywania kultur ex vivo, takie systemy nie pozwalają na systematyczne badania nad indywidualnymi efektami poszczególnych sygnałów. Dzieje się tak, ponieważ zastosowanie zarówno cyklicznego rozciągania, jak i ścinania w tych bioreaktorach jest napędzane przez ten sam przepływ pod ciśnieniem, który nierozerwalnie je łączy. Podczas gdy mikrosystemy, które pozwalają na dokładną manipulację mechaniczną wieloma wskazówkami, zostały opisane dla podłoży 2D62 lub konfiguracji hydrożelowych 3D63,64, takie konfiguracje nie pozwalają na włączenie elastomerowych rusztowań z biomateriału 3D.

Tutaj prezentujemy zastosowanie systemu bioreaktora rurowego, który w unikalny sposób umożliwia rozdzielenie naprężeń ścinających i cyklicznego rozciągania oraz pomaga mechanicznie badać ich indywidualne i łączne efekty. System ten pozwala na testowanie szerokiej gamy przeszczepów naczyniowych wytwarzanych metodą inżynierii tkankowej (np. pochodzenia syntetycznego lub naturalnego, różnej mikroarchitektury, różnej porowatości). Aby skutecznie oddzielić zastosowanie naprężeń ścinających od rozciągania, kluczowymi koncepcjami wykorzystywanymi w bioreaktorze są (1) oddzielenie kontroli naprężeń ścinających i rozciągania za pomocą odrębnych systemów pomp oraz (2) stymulacja rusztowań w sposób "od wewnątrz na zewnątrz" z wymiarami sterowanymi obliczeniowo. Przepływ jest doprowadzany do zewnętrznej powierzchni rusztowania rurowego za pomocą pompy przepływowej, natomiast rozciąganie obwodowe rusztowania jest indukowane przez rozciągnięcie silikonowej rurki, na której montuje się rusztowanie za pomocą oddzielnej pompy naprężającej. Wymiary rurki silikonowej i rurki szklanej, w której znajduje się konstrukcja, są starannie dobierane i weryfikowane za pomocą symulacji obliczeniowej dynamiki płynów, aby zapewnić, że naprężenie ścinające na rusztowaniu (spowodowane przepływem) i rozciągnięcie obwodowe (spowodowane rozszerzaniem się rury) nie wpływają na siebie znacząco. Ten projekt od wewnątrz na lewą stronę ma kilka praktycznych przesłanek. Jeśli rozciąganie jest wywierane przez ciśnienie płynu świetlnego (podobne do obciążenia fizjologicznego), z natury wymaga to, aby projekt próbki był szczelny. Ponadto ciśnienie wymagane do rozciągnięcia próbki byłoby całkowicie określone przez sztywność próbki, która może się zmieniać w zależności od próbki i w obrębie próbki w czasie, co utrudnia kontrolowanie rozciągania. Ten bioreaktor montuje przeszczep inżynierii tkankowej wokół silikonowej rurki i umożliwia przyłożenie naprężeń ścinających ścianę (WSS) na zewnętrzną ścianę przeszczepu i zwiększa ciśnienie w przeszczepie od wewnątrz. W ten sposób można zapewnić równe warunki obciążenia między próbkami i w próbkach w czasie, a ponadto próbki mogą być nieszczelne, jak to zwykle bywa w przypadku porowatych rusztowań naczyniowych19. Ten bioreaktor typu inside-out jest specjalnie przeznaczony do systematycznych badań nad skutkami ścinania i/lub rozciągania, a nie do inżynierii natywnego naczynia krwionośnego in vitro, do którego bardziej odpowiednie są tradycyjne konfiguracje bioreaktorów naczyniowych. Zobacz Rysunek 1A–B dla rysunków projektowych bioreaktora, a odpowiadająca mu Tabela 1 dla opisu funkcjonalnego i uzasadnienia głównych komponentów bioreaktora.

Użycie bioreaktora zostało zademonstrowane na podstawie serii ostatnich badań przeprowadzonych przez naszą grupę, w których badaliśmy indywidualne i połączone wpływy naprężeń ścinających i cyklicznego rozciągania na stan zapalny i tworzenie tkanek w resorbowalnych rusztowaniach elektroprzędzonych dla tkanki sercowo-naczyniowej in situ19,43,44. W tym celu wykorzystaliśmy ludzkie makrofagi i miofibroblasty w monokulturze lub w kohodowli, aby symulować różne fazy kaskady regeneracyjnej in situ. Wykazaliśmy, że na wydzielanie cytokin przez ludzkie makrofagi wyraźnie wpływa zarówno cykliczne rozciąganie, jak i naprężenie ścinające, wpływając na odkładanie i organizację macierzy przez ludzkie miofibroblasty w tych rusztowaniach, zarówno poprzez sygnalizację parakrynną, jak i bezpośredni kontakt19,43,44. Warto zauważyć, że badania te wykazały, że w przypadku połączonego zastosowania naprężeń ścinających i rozciągania, wpływ na tworzenie tkanek i stan zapalny jest albo zdominowany przez jedno z dwóch obciążeń, albo występują synergiczne efekty obu obciążeń. Wyniki te ilustrują znaczenie oddzielenia obu obciążeń w celu lepszego zrozumienia wpływu środowiska mechanicznego na procesy TE. Wiedza ta może być wykorzystana do systematycznej optymalizacji parametrów konstrukcyjnych rusztowania w odpowiednich reżimach obciążenia hemodynamicznego. Ponadto dane mechanistyczne z takich dobrze kontrolowanych środowisk mogą służyć jako dane wejściowe dla modeli numerycznych, które są opracowywane w celu przewidywania przebiegu przebudowy tkanek in situ, jak ostatnio zgłoszono dla TEVGs65 lub TEHVs66, w celu dalszej poprawy zdolności predykcyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W badaniach opisanych w tym protokole, użyto pierwotnych ludzkich makrofagów wyizolowanych z kożuchów krwi obwodowej oraz ludzkich miofibroblastów wyizolowanych z żyły odpiszczelowej po operacji pomostowania naczyń wieńcowych44. Płaszcze buffy zostały uzyskane od zdrowych, anonimowych ochotników, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę, która została zatwierdzona przez Sanquin Research Institutional Medical Ethical Committee. Wykorzystanie komórek sapheny żyły ludzkiej (HVSC) było zgodne z "Kodeksem Właściwego Wtórnego Użycia Tkanki Ludzkiej" opracowanym przez Federację Towarzystw Medycznych (FMWV) w Holandii.

1. Ogólne przygotowania i wymagane działania przed ustawieniem bioreaktora

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat odpowiednich protokołów izolacji i hodowli, zapoznaj się z wcześniejszymi pracami19,43,44. Wszystkie obliczenia w protokole są podane jako przykłady dla eksperymentu z kokulturą z monocytami i miofibroblastami, wysianymi w 8 hemodynamicznie obciążonych rusztowaniach i 2 statycznych kontrolach (n = 10).

  1. Rozpocznij izolację komórek i hodowlę komórkową. Gęstości wysiewu dla wspólnie hodowanych próbek monocytów i miofibroblastów (o stosunku wysiewu 2:1) wynoszą odpowiednio 30 × 106 monocytów/cm3 i 15 × 10,6 miofibroblastów/cm3.
    UWAGA: Materiał przędzony elektrolitycznie ma wysoką porowatość (>90%). Aby oszacować wymaganą liczbę komórek na przeszczep, objętość rusztowania oblicza się według wzoru na objętość pustego cylindra: π*(grubość)2*długość ≈ 0,04 cm3. Całkowita ilość komórek w przeszczepie wynosi 1,2 × 106 monocytów i 0,6 × 106 miofibroblastów. W przypadku 10 próbek wymagane jest co najmniej 12 × 106 monocytów i 6 × 106 miofibroblastów; Zacznij od ~10–15% więcej komórek, aby uwzględnić możliwe błędy pipetowania.
  2. Odgazować pożywkę do hodowli komórkowych, która zostanie wykorzystana do eksperymentów z udziałem bioreaktora.
    1. Przygotuj pożywkę dla kokultur, która składa się z RPMI-1640:aDMEM (1:1), uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną-streptomycyną i 0,5% L-glutaminą.
    2. Umieścić pożywkę na noc (O/N) w inkubatorze w kolbie do hodowli komórkowych z nasadką filtrującą do odgazowania.
    3. Załóż nasadkę filtra na hermetyczną nasadkę i przechowuj w temperaturze 4 °C.
    4. Tuż przed użyciem dodać 0,25 mg/ml 2-fosforanu L-askorbinowego (witaminy C) do podłoża.
      UWAGA: Do obliczeń ilość pożywki wymagana na komorę hodowli przepływowej wynosi 50 ml. Odświeżaj podłoże trzy razy w tygodniu; 25 ml starej pożywki zastępuje się 25 ml świeżej pożywki. Na 10 próbek; po wysianiu wymagane jest łącznie 500 ml świeżej pożywki, a do każdej kolejnej zmiany pożywki używa się łącznie 250 ml świeżej pożywki. Pożywkę należy zawsze przygotowywać na świeżo, szczególnie witaminę C należy dodać tuż przed zmianą podłoża.
  3. Przygotuj izotropowe rusztowania elektroprzędzone (średnica światła 3 mm, grubość ścianki 200 μm) zgodnie z opisem Van Haaftena i wsp.19 (Rysunek 1G–I). Krótko mówiąc, rusztowania rurowe z polikaprolaktonu bisurea (PCL-BU) są wytwarzane przez elektroprzędzenie z 15% (w/w) roztworów chloroform-polimer. Roztwory polimerowe są elektroprzędzone w temperaturze pokojowej i wilgotności względnej 30%, przy natężeniu przepływu 40 μl/min, w odległości 16 cm od obracającego się cylindrycznego celu (Ø 3 mm, 500 obr./min) i przy przyłożonym napięciu 16 kV na dyszy elektroprzędzalniczej i -1 kV na tarczy.
    UWAGA: Chociaż w tych eksperymentach użyto przeszczepów PCL-BU, w tym bioreaktorze można zamontować szeroką gamę przeszczepów elastomerowych (np. o różnym pochodzeniu syntetycznym lub naturalnym, różnej mikroarchitekturze, różnej porowatości)
    1. Usuń rusztowania elektroprzędzone z trzpienia.
      1. Zrób mały otwór w nasadce probówki o pojemności 15 ml, aby "przytrzymać" trzpień w środku i zapobiec dotykaniu przez niego ścianki probówki.
      2. Umieść trzpień z rusztowaniem elektrowirowanym w rurze sokoła i napełnij go wodą dejonizowaną.
      3. Zamrozić probówki O/N w temperaturze -20 °C.
      4. Umieść probówki w temperaturze pokojowej (RT) i po kilku minutach wyciągnij trzpienie, pozostawiając elektroprzędzone przeszczepy w lodzie.
      5. Poczekaj, aż lód całkowicie się rozmrozi, wyjmij rurkę elektroprzędzoną z rozmrożonej wody i "zawieś" do wyschnięcia w pionie przez kilka godzin. Upewnij się, że rusztowania nie "zapadają się" pod własnym ciężarem.
    2. Suche rusztowania pod próżnią O/N.
    3. Wyobraź sobie małą próbkę elektroprzędzonych przeszczepów za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) w celu oceny ich mikrostruktury (np. morfologii włókien, średnicy włókien). Przeszczepy w przykładowych badaniach mają izotropową orientację włókien i średnicę włókna 5 μm (Rysunek 1H–I).
  4. Na dzień przed rozpoczęciem eksperymentu umieść w inkubatorze zbiornik hydrauliczny wypełniony wodą dejonizowaną. Zamknij wszystkie osiem połączeń komór hodowlanych przepływowych białymi nasadkami Luer. Podłączyć do układu sprężonego powietrza i włożyć czujnik ciśnienia. Uruchomić pompę napinającą (patrz krok 5.6) O/N, aby umożliwić niewielkie rozszerzanie się miecha teflonowego.
    UWAGA: Upewnij się, że wszystkie niezbędne materiały i sprzęt są oczyszczone i/lub autoklawowane (patrz Tabela materiałów, kolumna Uwagi/Opis, dla których materiałów można sterylizować w autoklawie), zgodnie z protokołem producenta lub zgodnie z opisem w krokach 7.3–7.6.
  5. Zapewnić sterylne warunki pracy przez pozostałą część protokołu.
    1. Wykonaj kroki 2–5.3 (konfiguracja systemu), krok 6.3 (zmiana podłoża) i kroki 7.1–7.2 (pobieranie konstruktów naczyniowych) w sterylnej komorze laminarnej.
    2. Materiały, które nie są bezpośrednio potrzebne do kolejnych kroków, umieść na zamkniętych szalkach Petriego, aby wszystko było jak najbardziej czyste.
    3. Regularnie czyść lub susz powierzchnie materiałów, nasączając chusteczkę papierową 70% etanolem i wycieraj powierzchnie elementów bioreaktora i komory laminarnej.

2. Konfiguracja bioreaktora

UWAGA: Wykonaj krok 2 w komorze z przepływem laminarnym.

  1. Pociąć rusztowania elektroprzędzone na rury o długości około 25 mm i udokumentować je przed użyciem (np. sfotografować długość, zważyć wagą masę początkową).
  2. Odkaż rusztowania elektroprzędzone.
    1. Rusztowania elektroprzędzone należy umieścić przechylone w płytce studzienkowej lub na szalce Petriego, z jednym otworem skierowanym w stronę źródła światła ultrafioletowego (UV), aby światło UV (253,7 nm) oświetlało wnętrze rusztowań.
    2. Rusztowania elektroprzędzone należy wystawić na działanie promieniowania UV przez 5 minut.
    3. Obrócić wszystkie rusztowania i powtórzyć oświetlenie UV dla drugiego otworu.
      UWAGA: Po tym kroku dotykaj rusztowania elektroprzędzonego tylko wtedy, gdy jest to konieczne. Zawsze używaj czystej pęsety lub czystych rękawiczek.
    4. Weź szklane probówki z komór do hodowli przepływowych, które są przechowywane w 70%, umyj szklane probówki w ultraczystej wodzie, wysusz i umieść na dużej, zamkniętej szalce Petriego.
      UWAGA: Poniższe kroki, zwłaszcza kroki 2.3–2.5, są idealnie wykonane przez dwóch eksperymentatorów.
  3. Zamontuj rusztowania elektroprzędzone na silikonowej rurce.
    1. Przymocuj szew prolenowy 5-0 do jednego końca silikonowej rurki, przejmując szew z jednej strony rurki i z drugiej, pozostawiając dwa przeciwległe napięte szwy rozciągające się na przekroju rurki. Zrób mały węzeł po obu stronach rurki, ściskając rurkę w miejscu węzłów i pozostaw około 10 cm drutu na obu węzłach. Zrób trzeci węzeł na końcu dwóch pozostałych 10 cm drutów.
      1. Odetnij igłę do szycia i wszystkie wolne nitki, które mogą wystawać i uszkodzić wnętrze rusztowania elektroprzędzonego. Odetnij krawędzie silikonowej rurki w trójkątny kształt, aby pomóc w przeciąganiu silikonowej rurki przez rusztowanie elektroprzędzone.
    2. Zanurz rusztowanie elektroprzędzone w 30% etanolu (służy to jako dodatkowy etap odkażania i pomaga w przesuwaniu rusztowania elektroprzędzonego po rurkach silikonowych) i umieść rusztowanie elektroprzędzone na wolnym drucie o długości 10 cm. Eksperymentator A rozciąga silikonową rurkę, delikatnie pociągając zarówno silikonową rurkę, jak i węzeł 10-centymetrowego drutu do szycia, podczas gdy eksperymentator B delikatnie przesuwa elektroprzędzone rusztowanie po silikonowej rurce za pomocą pęsety z gładką końcówką wewnętrzną, aby zapobiec uszkodzeniu rusztowań.
    3. Powoli zwolnij odcinek na silikonowej rurce, jednocześnie wygładzając rusztowanie elektroprzędzone pęsetą. Zanurz rusztowanie elektroprzędzone na silikonowej rurce dwa razy w ultraczystej wodzie.
      UWAGA: Możliwe jest, że wystąpi pewne marszczenie rusztowania elektroprzędzonego. To marszczenie zniknie podczas zastosowanego rozciągania wstępnego, tuż przed przymocowaniem rusztowań do przewodów ciśnieniowych w kroku 2.5.3.
    4. Powtórzyć kroki 2.3.2 i 2.3.3 dla pozostałych rusztowań elektrowirowanych. W zależności od długości rurki silikonowej, na tej samej rurce silikonowej można zamontować wiele rusztowań elektroprzędzonych.
    5. Gdy wszystkie rusztowania elektroprzędzone są zamontowane na rurkach silikonowych, należy przyciąć rurki silikonowe wokół rusztowań, wszystkie na tę samą długość (5,5 cm); z jednej strony, blisko końca rusztowania elektroprzędzonego, z drugiej strony, pozostawiając ~2–3 cm wolnej rurki silikonowej.
  4. Zbuduj dolną komorę komory hodowli przepływowej (Rysunek 1A–B).
    1. Weź górną część dolnej komory zawierającej wylot przepływu i zamknij wylot przepływu męską wtyczką Luer.
    2. Przepchnij przewód ciśnieniowy z otworami przez dolną komorę i umieść silikonowy O-ring wokół dolnego końca przewodu ciśnieniowego, aby zapobiec wyciekom. Przykręć dolną część dolnej komory do górnej części dolnej komory, aby zabezpieczyć przewód ciśnieniowy. Upewnij się, że dolny wygrawerowany rowek przewodu ciśnieniowego znajduje się około 3–5 mm powyżej krawędzi tulei adaptera dolnej komory; To później "przytrzyma" ciasny węzeł drutu do szycia, mocując rusztowanie elektroprzędzone na silikonowej rurce.
      UWAGA: Jeśli przewodem ciśnieniowym można łatwo manewrować w górę iw dół, oznacza to, że dolna komora nie jest dobrze zabezpieczona. Powtórz krok 2.4.2, aby zapobiec wyciekom w późniejszych etapach (Rysunek 2D).
  5. Przymocuj rurkę silikonową z rusztowaniem elektroprzędzonym do przewodu ciśnieniowego.
    1. Przeciągnij silikonową rurkę z rusztowaniem elektroprzędzonym przez przewód ciśnieniowy.
    2. Wykonaj węzeł z drutem do szycia na dolnym końcu rusztowania elektroprzędzonego w miejscu wygrawerowanego rowka na przewodzie ciśnieniowym. Wykonaj drugi węzeł po przeciwnej stronie, aby szczelnie zabezpieczyć silikonową rurkę za pomocą elektroprzędzonego przeszczepu.
      UWAGA: Jest to krytyczny krok. Upewnij się, że węzeł dokładnie "wpada" w wygrawerowany rowek przewodu ciśnieniowego, aby zapobiec wyciekowi wody ze zbiornika hydraulicznego do komór kultur przepływowych. Jeśli nie masz pewności, spróbuj zacisnąć drut do szycia w kilku pozycjach, powyżej lub poniżej oczekiwanego miejsca rowka, aby upewnić się, że końcowe węzły znajdują się dokładnie w wygrawerowanym rowku (Rysunek 2A).
    3. Umieść zacisk nożycowy na górnym końcu rurki silikonowej i rozciągnij rurkę silikonową do góry (spowoduje to bezpośrednie przetestowanie pierwszego węzła, jeśli możliwe jest przesunięcie rurki silikonowej z rusztowaniem elektroprzędzonym nad przewodem ciśnieniowym, nie został on wystarczająco dobrze dokręcony). Dzięki sile ciągnącej silikonowa rurka jest wstępnie naciągana. Aby upewnić się, że silikonowa rurka jest spójna między różnymi próbkami, przymocuj linijkę do zacisku nożycowego. Pociągnij nożyce clamp do góry, aż dolny koniec linijki osiągnie wysokość dolnego końca rusztowania.
      UWAGA: Ważne jest, aby utrzymać wstępne rozciąganie w każdej próbce mniej więcej takie samo (~ 5%) z dwóch powodów: (1) jeśli rurki silikonowe są wstępnie rozciągnięte, spowoduje to bardziej jednorodne rozszerzanie się na całej długości próbki pod ciśnieniem; (2) Wstępne rozciąganie będzie miało wpływ na właściwości mechaniczne silikonu, dlatego powinno być takie samo we wszystkich próbkach, aby zapewnić równe warunki rozciągania między próbkami.
    4. Usuń zmarszczki na rusztowaniu elektroprzędzonym, delikatnie pociągając za rusztowanie elektroprzędzone. Ponownie wykonaj dwa węzły po obu stronach za pomocą drutu do szycia na górnym końcu rusztowania w miejscu górnego wygrawerowanego rowka na przewodzie ciśnieniowym.
    5. Zwolnij zacisk nożycowy i odetnij nadmiar rurki silikonowej nożem, pozostawiając 20–30% gwintu pokrytego silikonową rurką, aby zapobiec wyciekom, gdy stożek nosowy jest zamontowany na gwincie.
      UWAGA: Powtórz kroki 2.4 i 2.5 dla wszystkich próbek dynamicznych.
    6. W przypadku statycznych próbek kontrolnych należy zabezpieczyć rusztowanie elektroprzędzone zamontowane na rurkach silikonowych na przewodach ciśnieniowych bez otworów. Przewody te mogą być przechowywane oddzielnie w probówce o pojemności 15 ml do momentu wysiewu (krok 4) i nie muszą być montowane w komorach komory hodowli przepływowej.
  6. Częściowo zbudowane komory do hodowli przepływowych należy odkazić rusztowaniem elektroprzędzonym, wystawiając je na działanie światła UV przez 10 minut. Obrócić komory do hodowli przepływowych z rusztowaniami elektroprzędzonymi na drugą stronę i powtarzać ekspozycję na światło UV przez 10 minut.
  7. Przykręcić stożki nosowe do gwintu śrubowego przewodów ciśnieniowych z otworami na próbki dynamiczne.
    1. Upewnij się, że górny koniec silikonowej rurki pasuje do stożka nosowego, aby zapobiec wyciekom w późniejszych etapach. Jeśli rurki silikonowej jest za dużo, odetnij nadmiar rurki nożem.
    2. Umieść częściowo zbudowane komory do hodowli przepływowych na dużej szalce Petriego i skieruj stożek nosowy w stronę źródła światła UV. Zastosuj oświetlenie UV przez 5 minut.
  8. Kompletna konstrukcja komory hodowli przepływowej ze szklaną rurką i górną komorą komory hodowli przepływowej (Rysunek 1A–B).
    1. Rusztowania elektroprzędzone należy wstępnie zwilżyć, zanurzając przewód ciśnieniowy w silikonowej rurce i rusztowaniu elektroprzędzonym w 30% etanolu, a następnie dwukrotnie zanurzając je w ultraczystej wodzie.
    2. Umieść szklaną rurkę na przewodzie ciśnieniowym, delikatnie wepchnij dolną komorę i delikatnie ją zabezpiecz.
    3. Weź górną komorę zawierającą wlot przepływu, umieść silikonowy O-ring, prostownik przepływu i tuleję adaptera we właściwej kolejności (Rysunek 1A–B) i umieść na otwartym końcu szklanej rurki i delikatnie ją zabezpiecz.
    4. Przykręć białą nasadkę Luer na wlocie przepływu górnej komory.
    5. Wyjmij męską wtyczkę Luer z wylotu przepływu dolnej komory i oczyść powierzchnię wokół niej chusteczką papierową nasączoną etanolem.
    6. Umieść strzykawkę z 10 ml ultraczystej wody w wylocie przepływu, otwórz białą nasadkę Luer w górnej komorze i napełnij komorę ultraczystą wodą. Ponownie zamknij białą nasadkę Luer, wyjmij strzykawkę, ponownie wyczyść etanolem i zamknij wylot przepływu męską wtyczką Luer.
      UWAGA: Powtórz kroki 2.6–2.8 dla wszystkich komór do hodowli przepływowych.
    7. W przypadku kontroli statycznej dodać 10 ml ultraczystej wody do 15 ml probówek zawierających próbki zamontowane na przewodach ciśnieniowych bez otworów.
  9. Umieść wszystkie komory hodowli przepływowych w inkubatorze. Zastąp ultraczystą wodę pożywką hodowlaną na dzień przed wysiewem komórek w taki sam sposób, jak opisano w krokach 2.8.5 i 2.8.6 (upewnij się, że zebrałeś "starą" ultraczystą wodę za pomocą papierowej chusteczki papierowej nasączonej etanolem umieszczonej bezpośrednio na wylocie przepływu).

[Protokół może być tutaj wstrzymany]

3. Przygotowania do konfiguracji pompy przepływowej

UWAGA: Wykonaj krok 3 w komorze z przepływem laminarnym.

  1. Zbierz wszystkie materiały dotyczące konfiguracji pompy i przygotuj się do użycia.
    UWAGA: Eksperymentatorzy są odsyłani do protokołu producenta w celu uzyskania szczegółowego opisu konfiguracji pompy, jednostek płynowych i przewodów medium przez zawory jednostki fluidycznej.
    1. Ustaw pompę na wydajność 200 mbar.
    2. Przykręć uchwyty zbiorników 60 ml do jednostek fluidycznych.
    3. Wyczyść gumowe filtry powietrza wielokrotnego użytku papierową chusteczką nasączoną etanolem, upewnij się, że filtr powietrza pozostaje suchy.
  2. Umieść zbiorniki o pojemności 60 ml w uchwytach zbiorników i umieść standardowy przewód medium przez zawory jednostki fluidycznej. Połącz średni przewód o większej średnicy wewnętrznej z żeńskimi złączkami Luer lock w zamkniętej pętli.
  3. Zacisnąć średni przewód za pomocą opaski zaciskowej, bezpośrednio pod zbiornikami.
  4. Napełnij zbiorniki 25 ml pożywki hodowlanej na 60 ml zbiornika. Zwolnij zacisk węża i pozwól, aby medium dostało się do rurki.
  5. Zamknij zbiorniki pożywki gumowymi filtrami powietrza i umieść zestaw pompy przepływowej w inkubatorze do kroku 4.

4. Sadzenie komórek z wykorzystaniem fibryny jako nośnika komórkowego

UWAGA: Wykonaj krok 4 w komorze z przepływem laminarnym.

  1. Przygotuj żel fibrynowy do etapu wysiewu komórek. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz Mol et al.67 W przypadku żelu fibrynowego roztwór fibrynogenu powinien mieć końcowe stężenie 10 mg/ml (prawidłowe dla czystości białka), a roztwór trombiny powinien mieć końcowe stężenie 10 U/ml.
    1. Rozmrozić fibrynogen do RT, a następnie zważyć ~50 mg (wystarcza na 10 próbek) w plastikowym pojemniku z czerwoną pokrywką.
    2. Dodać pożywkę do hodowli komórkowych, aby przygotować roztwór fibrynogenu (o stężeniu 10 mg/ml, skorygowanym dla czystości białka). Dobrze wymieszać i przefiltrować, aby wysterylizować roztwór fibrynogenu za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Przefiltrowany roztwór fibrynogenu należy przechowywać na lodzie.
      UWAGA: Unikaj przygotowywania roztworu fibrynogenu zbyt wcześnie wcześniej, w przeciwnym razie fibrynogen może samoistnie krzepnąć.
    3. Rozmrozić trombinę i przygotować roztwór trombiny (o stężeniu 10 j./ml) w pożywce do hodowli komórkowych i umieścić na lodzie. Przygotować 20 μl roztworu trombiny + komórek na próbkę. Dla n=10 próbek potrzeba 200 μl; W związku z tym należy przygotować 250 μl roztworu trombiny, aby uwzględnić możliwe błędy w pipetowaniu.
  2. Zebrać i policzyć komórki z kolb hodowlanych. Wymieszaj komórki w pożądanym stosunku i ilości (1,2 × 106 monocytów i 0,6 × 106 miofibroblastów na rusztowanie). Upewnij się, że jest wystarczająco dużo komórek dla n+1 próbek, aby skorygować błędy pipetowania. Odwirować przy 350 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant.
  3. Zrób mieszaninę zawieszonych komórek i trombiny.
    1. Do każdej próbki należy użyć 20 μl roztworu trombiny. W przypadku n=10 próbek dodać 200 μl trombiny do osadu komórkowego i wymieszać. Zmierz objętość zawiesiny komórek (komórki + trombina) i oblicz, jak równomiernie podzielić się na wszystkie 10 rusztowań (np. jeśli zawiesina trombiny + komórek ma objętość 260 μl, każda elektroprzędzona próbka otrzyma 260 μl/10 próbek = 26 μl trombiny + zawiesina komórek).
    2. Ponieważ wysiew rusztowań odbywa się w dwóch etapach, należy przygotować dwie probówki do mikrofug o pojemności 1,5 ml, które pomieszczą połowę zawiesiny komórek dla każdego rusztowania (w przykładowym obliczeniu z poprzedniego kroku: przygotuj dwie probówki z 13 μl trombiny + zawiesiny komórek). Miejsce na lodzie.
      UWAGA: Poniższe kroki, zwłaszcza krok 4.4, są idealnie wykonane przez dwóch eksperymentatorów.
  4. Wysuszyć wstępnie zwilżone rusztowania elektroprzędzone za pomocą próżni, aby przygotować się do wysiewu komórek.
    1. Podłącz szklaną pipetę Pasteura do systemu próżniowego komory z przepływem laminarnym i umieść w pustej probówce o pojemności 50 ml w celu sterylnego tymczasowego przechowywania.
    2. Wyjmij komory hodowli przepływowych z inkubatora, wyjmij męską zatyczkę Luer z wylotu przepływu i usuń pożywkę po otwarciu białej nasadki Luer i umieszczeniu papierowej chusteczki nasączonej etanolem przed wylotem przepływu.
    3. Zdjąć górną komorę i szklaną rurkę i umieścić na sterylnej szalce Petriego do tymczasowego przechowywania.
    4. Umieść próżniową pipetę Pasteura na rusztowaniu elektroprzędzonym i usuń jak najwięcej medium.
      UWAGA: Rusztowanie elektrowirowane należy bardzo delikatnie wysuszyć próżniowo. Zamiast ruchu liniowego w przód iw tył nad rusztowaniem, pipetę próżniową należy umieścić w wielu miejscach. Zacisnąć rurkę próżniową na górze pipety Pasteura między palcami, aby uzyskać lepszą kontrolę.
    5. Roztwór fibrynogenu wymieszać w stosunku 1:1 z zawiesiną trombiny + komórek (np. zmieszać 13 μl fibrynogenu z 13 μl trombiny + zawiesiny komórek). Aby upewnić się, że fibryna polimeryzuje w rusztowaniu, a nie w probówce do mikrofuge, odpipetuj fibrynogen, obróć koło pipetowania, aby uzyskać "dodatkową objętość" zawiesiny trombiny + komórek, a następnie pipetuj raz w górę iw dół w probówce z zawiesiną komórek do wymieszania.
    6. Bezpośrednio jednorodnie wlać roztwór na całej długości rusztowania elektroprzędzonego. Zaleca się, aby eksperymentator A wkraplał mieszaninę fibryny, podczas gdy eksperymentator B trzymał dolną komorę z rusztowaniem elektroprzędzonym zamontowanym do przewodu ciśnieniowego.
    7. Po tym, jak fibryna z komórkami zostanie przelana przez rusztowanie elektroprzędzone, Eksperymentator B powoli przesuwa rusztowanie, od lewej do prawej oraz w górę i w dół, aby dalej równomiernie podzielić komórki na rusztowaniu.
    8. Powtórzyć kroki 4.4.5 - 4.4.7 po drugiej stronie rusztowania elektroprzędzonego.
    9. Ponownie zamontuj komorę hodowli przepływowej, ostrożnie umieszczając szklaną rurkę (zapobiegaj przywieraniu fibryny i krzepnięciu do wewnętrznej strony szklanej rurki) i odepchnij górną komorę komory hodowli przepływowej. Bezpośrednio umieścić wysiany konstrukt bez pożywki lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w komorze hodowli przepływowej w inkubatorze.
    10. Powtórzyć kroki 4.4.1–4.4.9 dla wszystkich próbek dynamicznych. W przypadku próbek statycznych zamontowanych na przewodach ciśnieniowych bez otworów, należy wysiać nasiona zgodnie z krokami 4.4.1–4.4.8, a następnie umieścić w probówce o pojemności 15 ml.
    11. Pozwól fibrynie polimeryzować przez 60 minut w inkubatorze.

[Protokół może być tutaj wstrzymany na 30–60 minut.]

  1. Po polimeryzacji napełnić komory hodowli przepływowej (próbki dynamiczne) lub probówki o pojemności 15 ml (próbki statyczne) pożywką.

5. Sprzężenie systemów bioreaktora i pomp przepływowych przed rozpoczęciem eksperymentu

UWAGA: Wykonaj kroki 5.1–5.3 w komorze laminarnej.

  1. Weź tacę z komorami kultur przepływowych i jednostkami fluidycznymi z napełnionymi zbiornikami pożywki i podłączonymi rurkami pożywki wewnątrz komór z przepływem laminarnym.
  2. Umieść komory hodowli przepływowych na podstawie bioreaktora dla grup eksperymentalnych obciążonych cyklicznym rozciąganiem i połączonymi obciążeniami hemodynamicznymi (Rysunek 1E).
    1. Przechyl komorę hodowli przepływowej do góry nogami i napełnij przewód ciśnieniowy od dołu ultraczystą wodą za pomocą strzykawki z cienkim rurką (może to być dowolny rodzaj, o ile jest elastyczny i cienki, w tym eksperymencie do igły przymocowano drut o długości 10 cm i średnicy wewnętrznej 0,15 mm).
    2. Umieść cienką rurkę wewnątrz przewodu ciśnieniowego, a gdy przewód ciśnieniowy jest napełniany ultraczystą wodą, stopniowo wypychając wodę ze strzykawki, jednocześnie wyciągnij przewód z przewodu ciśnieniowego, aby upewnić się, że wewnątrz przewodu ciśnieniowego nie ma pęcherzyków powietrza.
    3. Umieść przepływową komorę hodowlaną na jednym z ośmiu gwintów śrubowych na podstawie bioreaktora. Umieść silikonowy O-ring między podstawą bioreaktora a białym złączem Luer, aby zapobiec ewentualnemu wyciekowi, i dokręć białe złącze Luer od dolnej komory.
    4. Powtórzyć kroki 5.2.2 i 5.2.3 dla wszystkich cyklicznie rozciąganych próbek.
  3. Podłączyć komory do hodowli przepływowych dla wszystkich grup doświadczalnych, z wyjątkiem kontroli statycznej, do systemu pomp przepływowych.
    1. Umieść opaskę zaciskową na średniej rurce. Zdejmij białą nasadkę Luer zakrywającą wlot przepływu z górnej komory komory kultur przepływowych. Zdejmij żeński łącznik Luer z rurki medium i połącz rurkę medium z jednej strony z wlotem przepływu w górnej komorze, a z drugiej strony rurki medium z wylotem przepływu w dolnej komorze.
    2. Powtórzyć krok 5.3.1 dla wszystkich komór do hodowli przepływowych. W tym momencie bioreaktor i komory hodowli przepływowej są napełniane medium i podłączane do systemów przepływowych.
    3. W przypadku statycznych próbek kontrolnych należy umieścić próbki pionowo w kolbie do hodowli komórkowych z nasadką filtra, używając zacisku nożycowego. Napełnij kolbę do hodowli komórkowych pożywką i umieść w inkubatorze.
  4. Przenieś kompletną konfigurację z komory przepływu laminarnego do inkubatora i podłącz jednostki hydrauliczne do przewodu ciśnieniowego powietrza i elektrycznego.
  5. Uruchom oprogramowanie i zainicjuj pompy przepływowe. Uruchom przepływ pożywki dla próbek jedna po drugiej.
    1. Sprawdź, czy zawory jednostki fluidycznej klikają.
    2. Zdejmij wąż clamp z pośredniej rurki.
    3. Uruchom pompę przepływową z czasem przełączania 100 mbar i 10 s.
    4. Dokładnie sprawdź kierunek przepływu pod kątem ewentualnych wycieków lub pęcherzyków powietrza. Wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza można usunąć, odwracając komorę hodowli przepływowej do góry nogami.
      UWAGA: Upewnij się, że poziomy medium w zbiornikach pożywki są zrównoważone, aby zapobiec zasysaniu powietrza do systemu i pęcherzykom powietrza w przepływowych komorach hodowlanych oraz aby nie dopuścić do wyschnięcia zbiorników (Rysunek 2C).
    5. Powtórz krok 5.5 dla wszystkich jednostek fluidycznych jedna po drugiej.
  6. Zainicjuj pompę naprężeniową.
    1. Podłączyć pompę uruchamianą pneumatycznie przez wlot powietrza na siłowniku pneumatycznym do sprężonego powietrza. Połącz dolny wylot powietrza z niebieskim wężem do wylotu powietrza (Rysunek 1F).
    2. Otwórz oprogramowanie LabVIEW, uruchom skrypt LabVIEW i system aplikacji ciśnienia sprężonego powietrza, zgodnie z opisem Van Kelle i wsp.68, wprowadź przemieszczenie i częstotliwość (zacznij od niskiej częstotliwości 0,2 Hz). Wstrzymaj pompę, gdy mieszek teflonowy znajdzie się na najniższym poziomie.
    3. Umieść czujnik ciśnienia na wlocie czujnika ciśnienia na zbiorniku hydraulicznym.
  7. Zmień ustawienia pompy na żądane ustawienia (dla 1,5 Pa użyj 150 mbar, czas przełączania 10 s).
  8. Uruchom pompę naprężeniową i zastosuj preferowane ustawienie (np. 0.5 Hz, 1.05 rozciągnięcia).

6. Przeprowadzanie eksperymentu przez wiele dni; Monitorowanie ścinania i rozciągania podczas hodowli i wymiany pożywki

  1. Oblicz WSS na ścianie rusztowania.
    1. Rejestruj wielkość przepływu co drugi dzień (szczegółowe informacje można znaleźć w instrukcji producenta pompy przepływowej). Krótko mówiąc, obserwuj zmianę poziomu cieczy (w ml) w zbiornikach pożywki pomiędzy przełączaniem zbiornika jednostki płynowej przez 10 sekund. Wykonaj co najmniej pięć pomiarów, oblicz średnią wartość i pomnóż przez 6, aby uzyskać natężenie przepływu Q w ml/min.
    2. Przepływ jest opisany przez przepływ Poiseuille'a przez kanał pierścieniowy. Przyjmując, że pożywka hodowlana jest płynem newtonowskim, oblicz WSS na ścianie rusztowania, r1, za pomocą równania 1.
      figure-protocol-1 (1)
      gdzie WSS τw na ścianie rusztowania (r1; tutaj r1 = 1,7 mm), wynikająca z przepływu w stanie ustalonym, jest określona przez przyłożone ciśnienie p i promień wewnętrzny rurki szklanej r2 (tutaj r2 = 2,3 mm). Przyjmuje się, że gradient ciśnienia w kierunku osiowym jest równomierny między wlotem i wylotem przepływu i jest określony równaniem 2 (Rysunek 1J).
      figure-protocol-2 (2)
      przy μ lepkości dynamicznej (tutaj przyjęto stałą lepkość średnią, μ = 0,7 × 10-3 Pa∙s w temperaturze 37 °C), a Q zastosowane natężenie przepływu.
  2. Monitoruj rozciąganie zastosowane na rusztowaniach co drugi dzień.
    1. Umieść ciemne tło za komorą hodowli przepływowej, aby zwiększyć kontrast między rusztowaniem a tłem. Ustaw lampy świetlne LED, skierowane w stronę rusztowania, aby ułatwić wizualizację rusztowania.
    2. Rób zdjęcia poklatkowe rusztowania z częstotliwością 30 Hz przez 6 s (tj. 3 cykle rozciągania) za pomocą szybkiej kamery.
      UWAGA: Niższa częstotliwość nagrywania może wystarczyć, jeśli kamera na to pozwala. Nie określono jednak minimalnej wymaganej częstotliwości.
    3. Ręcznie określ minimalną i maksymalną średnicę rusztowania na podstawie obrazów.
    4. Obliczyć minimalną i maksymalną średnicę zewnętrzną rusztowania elektroprzędzonego, aby obliczyć maksymalne rozciągnięcia zgodnie z równaniem 3.
      figure-protocol-3 (3)
      gdzie rozciągnięcie obwodowe (λθ) jest określone jako stosunek średnicy zewnętrznej rusztowania d1 do jego średnicy początkowej d0.
  3. Popraw parowanie podłoża i odświeżaj podłoże trzy razy w tygodniu.
    1. Zatrzymać i odłączyć do systemów przepływowych i pompy napinającej.
    2. Umieść opaski zaciskowe na średniej rurce.
    3. Określ, ile medium odparowało na podstawie oznaczeń wskaźnika objętości na zbiornikach pożywki.
    4. Przenieś tacę z bioreaktorem i jednostkami fluidycznymi do komory z przepływem laminarnym.
    5. Zdemontować gumowe filtry powietrza ze zbiorników pożywki; dodać autoklawowaną ultraczystą wodę, aby skompensować odparowaną objętość medium. Ponownie zamknij zbiorniki medium i ponownie podłącz do pompy, aby wymieszać medium z ultraczystą wodą.
    6. Powtórz kroki 6.3.1–6.3.5. Ponownie wyjmij gumowe filtry powietrza, wyjmij 25 ml pożywki hodowlanej i odwiruj z prędkością 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      1. Zebrać 1,5 ml supernatantu i przechowywać w temperaturze -30 °C w celu analizy profili wydzielniczych (do analizy za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA)).
      2. Zbierz żądaną objętość supernatantu do badań sygnalizacji parakrynnej, używając supernatantu jako kondycjonowanego podłoża43.
    7. Dodaj 25 ml świeżej pożywki do zbiorników pożywki.
    8. Umieść gumowe filtry powietrza z powrotem na zbiornikach pożywki.
    9. Umieść kompletny zestaw z powrotem w inkubatorze; podłącz wszystkie i rurę przewodzącą powietrze do pompy i pompy odcinkowej. Zwolnij opaski zaciskowe i powtórz kroki 5.4–5.8.
  4. Sprawdź, czy kulki do suszenia krzemionki w butelkach do suszenia podłączonych do pompy są wilgotne (biały wygląd) i w razie potrzeby zastąp suchymi kulkami krzemionki (wygląd pomarańczowy).

7. Zakończenie eksperymentu, pobieranie próbek oraz czyszczenie i przechowywanie sprzętu

  1. W ostatnim dniu doświadczenia należy skorygować parowanie pożywki zgodnie z opisem w krokach 6.3.1–6.3.5 i zbierać próbki pojedynczo.
    1. Aby zbierać próbki pojedynczo, należy kilkakrotnie wstrzymać pompę przepływową i pompę odprężającą. Umieść opaskę zaciskową na średniej rurce. Tymczasowo zatrzymać pompę przepływową i pompę napinającą. Odłączyć jedną komorę hodowli przepływowej od podstawy bioreaktora; zastąpić białą nasadką Luer na podstawie bioreaktora. Przenieś komorę do hodowli przepływowej i jednostkę fluidyczną do komory z przepływem laminarnym. Uruchom pompę przepływową i ponownie odcedź pompę, aby przyłożyć obciążenie hemodynamiczne do innych próbek aż do zbioru.
    2. Pobrać pożywkę ze zbiorników pożywki do analizy produkcji cytokin parakrynnych za pomocą testu ELISA.
  2. Odłącz jednostki przepływowe i konstrukcję rurową do zbioru. Przekrój zgodnie z żądanym schematem cięcia. Części konstruktu można przechowywać w temperaturze 4 °C (po 15 minutowym utrwaleniu w 3,7% formaldehydzie i 3 x 5 minutowym praniu w PBS) lub -30 °C (po szybkim zamrożeniu w ciekłym azocie) do czasu dalszej analizy.
  3. Wyczyść elementy bioreaktora i pompy. Dodatkowo zalecana metoda czyszczenia dla każdego elementu jest wymieniona w Tabeli Materiałów.
    1. Wyczyść gumowe filtry powietrza 70% etanolem. Uważaj, aby nie zwilżyć filtra wewnętrznego!
    2. Zbierz wszystkie oddzielne elementy: rurki średnie, zbiorniki medium, szklane rurki, męskie zaślepki Luer i żeńskie zamki Luer, białe nasadki Luer, przewody ciśnieniowe, stożki nosowe, silikonowe O-ringi, tuleję adaptera, prostowniki przepływu (z wyłączeniem pomp, jednostek fluidycznych, gumowych filtrów powietrza, podstawy bioreaktora) i spłucz pod bieżącą wodą z kranu.
    3. Umieść O/N w 0,1% dodecylosiarczanie sodu w wodzie dejonizowanej.
      UWAGA: Nie używaj ultraczystej wody, ponieważ części mogą rdzewieć.
    4. Spłucz wodą z kranu i płynem do mycia naczyń.
    5. Zanurz w wodzie dejonizowanej, a następnie dwukrotnie w 70% etanolu, a następnie w wodzie dejonizowanej.
    6. Umieść wszystkie materiały osobno na chusteczkach papierowych i pozostaw do wyschnięcia. Do suszenia przewodów używaj sprężonego powietrza.
    7. Wyczyść wszystkie materiały, które nie nadają się do sterylizacji w autoklawie, chusteczką papierową nasączoną 70% etanolem. Obejmuje to gumowy filtr powietrza (należy pamiętać, że filtr powietrza powinien pozostać suchy) i podstawę bioreaktora (mieszek teflonowy i cylinder pneumatyczny).
    8. Autoklaw elementów komory fluidalnej (w tym silikonowy O-ring), rurki medium, zbiorniki medium (bez gumowego filtra powietrza), męskie wtyki Luer i żeńskie złączki Luer, białe nasadki Luer, opaski zaciskowe do węży i standardowe wyposażenie (np. pęseta, nożyczki zaciskowe)
    9. Dla wygody użytkowania podczas kolejnych eksperymentów, połącz oddzielne składniki w jedną kompletną komorę fluidyczną w autoklawowalnym pudełku.
  4. Usuń wodę ze zbiornika hydraulicznego. Oczyść 70% etanolem, a następnie wodą dejonizowaną. Pozostaw do wyschnięcia. Uzupełnij wodą dejonizowaną i kilkoma kroplami środka dezynfekującego do kąpieli wodnej.
  5. Szklane probówki do komory hodowli przepływowej należy przechowywać w 70% etanolu.
  6. Umieścić wilgotne kulki do suszenia krzemionki (o białym wyglądzie) w suszarce o temperaturze 120 °C, aby mogły wyschnąć (wygląd pomarańczowy) i przechowywać w hermetycznej kolbie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten bioreaktor został opracowany do badania indywidualnego i połączonego wpływu naprężeń ścinających i cyklicznego rozciągania na wzrost i przebudowę tkanki naczyniowej w rusztowaniach 3D z biomateriałów. Konstrukcja bioreaktora pozwala na hodowlę do ośmiu konstruktów naczyniowych w różnych warunkach obciążenia (Rysunek 1A). Konstrukcje naczyniowe są umieszczone w komorze hodowli przepływowej (Rysunek 1B), w której zarówno rozciągliwość obwodowa, jak i WSS mogą być niezależnie kont...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany w niniejszym dokumencie bioreaktor pozwala na systematyczną ocenę wpływu poszczególnych i łącznych skutków naprężeń ścinających i cyklicznego rozciągania na stan zapalny i regenerację tkanek w rurowych rusztowaniach resorbowalnych. Podejście to umożliwia również wykonywanie wielu różnych analiz na konstruktach naczyniowych, czego przykładem jest sekcja dotycząca wyników reprezentatywnych. Wyniki te pokazują charakterystyczny wpływ różnych reżimów obciążenia hemodynamicznego (tj. różnych kombinacji ścinania i rozc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie jest wspierane finansowo przez ZonMw w ramach programu LSH 2Treat (436001003) oraz Holenderską Fundację Nerek (14a2d507). N.A.K. dziękuje za wsparcie Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (851960). Z wdzięcznością dziękujemy za Program Grawitacyjny "Materials Driven Regeneration", finansowany przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (024.003.013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
zaawansowany Dulbecco' s zmodyfikowana pożywka do hodowli komórkowych EagleMedium (aDMEM)Gibco12491-015hodowli fibroblastów
Aqua StabilJulabo8940012zapobiega rozwojowi mikroorganizmów w bioreaktorze-zbiorniku hydraulicznym
Fibrynogen bydlęcySigmaF8630do przygotowania żelu fibrynonowego do wysiewu komórek na rusztowaniu elektroprzędzonym
Trombin bydlęcySigmaT4648do przygotowania żelu fibrynogenowego do wysiewu komórek na rusztowaniu elektroprzędzonym
WirówkaEppendorf5804do odwirowania komórek i kondycjonowanego podłoża
Nożyczki zaciskowe - "kleszcze Kelly'ego"AlmedicP-422zaciśnij rurkę silikonową i nałóż wstępne rozciągnięcie na rusztowanie, aby rusztowanie można było wszyć w wygrawerowany rowek (autoklaw w kroku 1, kroku 7)
Inkubatory do hodowli komórkowych CO2SanyoMCO-170AIC-PEdo hodowli komórek
Zbiornik sprężonego powietrzaFestoCRVZS-5wygładza wahania ciśnienia powietrza i tworzy opóźnienia czasowe dla wzrostu ciśnienia
Niestandardowy skrypt Matlab do obliczania maksymalnych rozciągnięćMatlabR2017. Mathworks, Natick, MAoblicza minimalną i maksymalną średnicę zewnętrzną rusztowania elektroprzędzonego
Tablica akwizycji danychNational InstrumentsBNC-2090przetwarzanie danych między systemem wzmacniacza a komputerem
EtanolVWRVWRK4096-9005w celu utrzymania sterylnych warunków pracy
Surowica cielęca bydła płodowego (FBS)Greiner758087suplement pożywki do hodowli komórkowych; surowica-suplement
Komory do hodowli przepływowej, składające się z przewodu ciśnieniowego z wygrawerowanymi rowkami i małymi otworami do wywierania nacisku na rurki silikonowe, gwintem śrubowym, stożkiem nosowym, górną komorą z wlotem przepływu i wylotem przepływu komory dolnej, tuleją adapteraWykonane na zamówienie, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Uniwersytet Techniczny w Eindhovenn.a.komorykomory hodowli przepływowej (autoklaw w kroku 1, krok 7)
Szklany asystent pipety PasteuraHE40567002zastosować próżnię na rusztowaniu elektroprzędzonym (autoklaw w kroku 1)
Szklane rurki komory kulturowej przepływowejwykonane przez Custon, sprzęt i Centrum Prototypów, Uniwersytet Techniczny w Eindhovenbrak częścikomory do hodowli przepływowej (czyste i przechowywane w 70% etanolu, na etapie 1 i 7)
GlutaMaxGibco35050061pożywka do hodowli komórkowych suplement aminokwasowy, minimalizuje gromadzenie się amoniaku Kamera
szybkoobrotowaMotionScopeM-5monitorować rozciąganie podczas hodowli; Zdjęcia poklatkowe rusztowań są wykonywane z częstotliwością 30 Hz przez 6 sekund (tj. 3 cykle rozciągania)
Obiektyw szybkiego aparatu - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - obiektywNikonJAA616ABdo monitorowania rozciągania podczas hodowli; Zdjęcia poklatkowe rusztowań są wykonywane z częstotliwością 30 Hz przez 6 sekund (tj. 3 cykle rozciągania)
Opaskaibidi GmbH10821blok przepływu medium (autoklaw w kroku 1, Krok 7)
Zbiornik hydrauliczny z 8 gwintami śrubowymi dla 8 przepływowych komór hodowlanychWykonane na zamówienie, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Uniwersytet Techniczny w Eindhovenn.a.w celu wywarcia nacisku na konstrukcje zamontowane w silikonie (wyczyść na zewnątrz chusteczką papierową z 70% etanolem, przepłucz zbiornik 70% etanolem, a następnie wodą demineralizowaną, w kroku 1 i 7)
System pomp Ibidi (8x), w tym pompa ibidi, oprogramowanie PumpControl, jednostka fluidyczna, zestaw perfuzyjny (rurka średnia), rurka ciśnieniowa powietrza, butelki suszące z pomarańczowymi kulkami krzemionkiKonfiguracja ibidi GmbH10902służy do sterowania przepływem w komorach kulturowych. Uwaga 1: pompy ibidi zostały zmodyfikowane przez producenta, aby umożliwić wydajność 200 mbar. Uwaga 2: może być zastąpiony przez system pompowy innego producenta, o ile można zastosować te same reżimy przepływu.
Noże (nr 10 sterylnych ostrzy, indywidualne opakowanie foliowe) i rękojeść skalpela (stal nierdzewna, pakowane pojedynczo)Swann Morton0301; 0933do cięcia rurki silikonowej w rozmiarze odpowiednim dla rusztowania i do cięcia materiału do szycia
Oprogramowanie LabVIEWNational Instrumentswersja 2018do kontrolowania rozciągania zastosowanego na rusztowaniach
Szafa bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym ze światłem UVLabconco302310001w celu zapewnienia sterylnych warunków pracy. Promieniowanie UV służy do odkażania wszystkiego, czego nie można zautoklawować lub dotknąć po autoklawowaniu
Duże i małe szalki PetriegoGreiner664-160do sterylnych warunków pracy
Kwas L-askorbinowy 2-fosforan (witamina C)SigmaA8960pożywki do hodowli komórkowych, ważny dla produkcji kolagenu
Źródło światła LED KL2500ZeissSchott AGaby pomóc w wizualizacji upływu czasu rusztowań podczas monitorowania rozciągania
Zamki i łączniki Luer (żeńskie i męskie), białe nasadki Lueribidi GmbHróżne, patrz (https://ibidi.com/26-flow-accessories)aby zamknąć lub połączyć części bioreaktora i pompy ibidi (autoklaw w kroku 1, kroku 7)
Wzmacniacz pomiarowy (PICAS)PEEKEL instruments B.V.n.d.wcelu wzmocnienia sygnału z czujnika ciśnienia i sprzężenia zwrotnego do LabView
Zbiornik Medium (duże strzykawki 60 ml) i uchwyty zbiornikówibidi GmbH10974zbiornik medium (autoklaw w kroku 1, kroku 7)
Medium rurka o średnicy zewnętrznej 4,25 mm i średnicy wewnętrznej 1 mmGuma BV1805Aby umożliwić większe natężenie przepływu, zastosowano rurkę ibidi Medium o większej średnicy. Uwaga: część rurki medium prowadzona przez zawory jednostki fluidycznej jest taka sama jak domyślna rurka medium ibidi
Oprogramowanie Motion StudioIdtvision2.15.00do tworzenia obrazów poklatkowych z dużą prędkością do monitorowania rozciągania
Igła (19G)BD Microlance301700wraz z cienką elastyczną rurką służącą do napełniania zbiornika hydraulicznego ultraczystą wodą bez dodawania pęcherzyków powietrza
SterownikigłowyAdson2429218do przenoszenia igły nylonowego szwu przez silikonową rurkę (autoklaw w kroku 1, kroku 7)
Chusteczki papieroweKleenex38044001do czyszczenia sprzętu 70% etanolem
ParafilmSigma P7793-1EAszybka naprawa w przypadku wystąpienia wycieku
Penicylina/streptomycyna (P/S)LonzaDE17-602Esuplement pożywki do hodowli komórkowych; zapobiegać bakteriom Zanieczyszczenie
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaP4417-100TABdo etapów przechowywania i mycia (autoklaw na etapie 1)
Pojemniki plastikowe (60 ml) z czerwonymi nakrętkamiGreiner206202do przygotowania roztworu fibrynogenu
Siłownik pneumatycznyFestoAEVC-20-10-I-Pdo uruchamiania miecha teflonowego (wyczyść chusteczką papierową z 70% etanolem w kroku 1 i 7)
Rusztowania rurowe z polikaprolaktonu bisurea (PCL-BU) (średnica wewnętrzna 3 mm, 200 &mikro; m grubość ścianki, długość 20 mm)SyMO-Chem, Eindhoven, Holandian.d.a.produkowane metodą elektroprzędzenia z 15% (w/w) roztworów polimerów chloroformu (Sigma; 372978). Więcej informacji można znaleźć w Van Haaften i in. Inżynieria tkankowa część C (2018)
Przewód ciśnieniowy bez otworów (do kontroli statycznej)Wykonany na zamówienie, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Uniwersytet Techniczny w Eindhovenn.a.do montażu rurek elektroprzędzonych na rurkach silikonowych (autoklaw w kroku 1, kroku 7)
Czujnik ciśnienia i przetwornikBDTC-XX i P 10 EZCiśnienie powietrza docierającego do pompy uruchamianej pneumatycznie jest podnoszone, aż osiągnie ustawione ciśnienie
Proporcjonalny zawór regulacji ciśnienia powietrza i czujnik ciśnieniaFestoMPPES-3-1/8-2-010, 159596dostarcza sprężone powietrze do pompy uruchamianej pneumatycznie
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)GibcoA1049101pożywka do hodowli komórkowych monocytów/makrofagów
Bezpieczny zamek Probówki Eppendorfa (1,5 ml)Eppendorf30120086wielu zastosowań (autoklaw w kroku 1)
Roztwór dodecylosiarczanu sodu 20%Sigma5030Służy do czyszczenia materiałów, w stężeniu 0,1%.   
Silikonowe O-ringiTechnirub1250Szapobiegające wyciekom (autoklaw w kroku 1, kroku 7)
Rurka silikonowa (średnica zewnętrzna 2,8 mm, grubość ścianki 400 um)Guma BV1805do montażu rurek elektroprzędzonych na przewodach ciśnieniowych (autoklaw w kroku 1)
Sterylna rurka (15 ml)Falcon352095wielu zastosowań
Szew, 5-0 prolen z wstępnie przymocowaną igłąstożkowąEthicon, Johnson & Drutdo szycia Johnson EH7404H Prolene 5-0 (długość 75 cm, igła stożkowa TF, 1/2 koła, długość igły 13 mm)
Strzykawka (24 ml)B. Braun Melsungen AG2057932do dodawania ultraczystej wody lub pożywki do zbiornika hydraulicznego lub komory hodowli przepływowej
Filtr strzykawkowy (0,2 &mikro; m)Satorius17597-Kdo filtrowania roztworu fibrynogenu
Kolba do hodowli komórkowych T150 z nasadką filtrującąNunc178983do odgazowania pożywki hodowlanej
T75 Kolba do hodowli komórkowych z nasadką filtrującąNunc156499do hodowli próbek kontroli statycznej
Mieszek teflonowyWykonane na zamówienie, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Uniwersytet Techniczny w Eindhovenn.a.do załadowania zbiornika hydraulicznego (wyczyść na zewnątrz chusteczką papierową z 70% etanolem w kroku 1 i 7)
Taca (stal nierdzewna)PolarWare15-248do łatwego transportu komór do hodowli fluidalnej i bioreaktora z inkubatora do komory laminarnej i z powrotem (wyczyść chusteczką papierową z 70% etanolem przed i po użyciu)
PęsetaWironit4910sterylne obchodzenie się z poszczególnymi częściami (autoklaw na etapie 1 i 7)
Woda ultraczystaStakpureOmniapure UV 18200002do korekcji parowania średniego, zmieszana z mieszanką aqua stabil i stosowana jako płyn hydrauliczny. (Woda ultraczysta w autoklawie w kroku 1)
Lampa UVPhilipsTUV 30W/G30 T8do odkażania szczepów i części bioreaktora przed siewem
do zaciskowa suplement

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chlupác, J., Filová, E., Bacáková, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiological Research. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
  2. Huygens, S. A., et al. Bioprosthetic aortic valve replacement in elderly patients: Meta-analysis and microsimulation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 157 (6), 2189-2197 (2019).
  3. Huygens, S. A., et al. Contemporary outcomes after surgical aortic valve replacement with bioprostheses and allografts: a systematic review and meta-analysis. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (4), 605-616 (2016).
  4. Loh, S. A., et al. Mid- and long-term results of the treatment of infrainguinal arterial occlusive disease with precuffed expanded polytetrafluoroethylene grafts compared with vein grafts. Annals of Vascular Surgery. 27 (2), 208-217 (2013).
  5. Tara, S., et al. Vessel bioengineering. Circulation Journal. 78 (1), 12-19 (2014).
  6. Huang, A. H., Niklason, L. E. Engineering of arteries in vitro. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (11), 2103-2118 (2014).
  7. Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M., Baaijens, F. P. T. Can we grow valves inside the heart? Perspective on material-based in situ heart valve tissue engineering. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 54(2018).
  8. Fioretta, E. S., et al. Next-generation tissue-engineered heart valves with repair, remodelling and regeneration capacity. Nature Reviews Cardiology. , (2020).
  9. Kirkton, R. D., et al. Bioengineered human acellular vessels recellularize and evolve into living blood vessels after human implantation. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  10. Gutowski, P., et al. Arterial reconstruction with human bioengineered acellular blood vessels in patients with peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. , (2020).
  11. Syedain, Z., et al. Tissue engineering of acellular vascular grafts capable of somatic growth in young lambs. Nature Communications. 7 (12951), 12951(2016).
  12. Sugiura, T., et al. Tissue-engineered vascular grafts in children with congenital heart disease: intermediate term follow-up. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery. 30 (2), 175-179 (2018).
  13. Kluin, J., et al. In situ heart valve tissue engineering using a bioresorbable elastomeric implant - material design to 12 months follow-up in sheep. Biomaterials. 125, 101-117 (2017).
  14. Fioretta, E. S., et al. Differential leaflet remodeling of bone marrow cell pre-seeded versus nonseeded bioresorbable transcatheter pulmonary valve replacements. JACC. Basic to Translational Science. 5 (1), 15-31 (2020).
  15. Van Haaften, E. E., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A. Vascular mechanobiology: towards control of. Cells. , 1-24 (2017).
  16. De Jonge, N., et al. Matrix production and organization by endothelial colony forming cells in mechanically strained engineered tissue constructs. PLoS ONE. 8 (9), 73161(2013).
  17. Schmidt, J. B., Chen, K., Tranquillo, R. T. Effects of intermittent and incremental cyclic stretch on ERK signaling and collagen production in engineered tissue. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (1), 55-64 (2016).
  18. Luo, J., et al. Tissue-engineered vascular grafts with advanced mechanical strength from human iPSCs. Cell Stem Cell. 26 (2), 251-261 (2020).
  19. Van Haaften, E. E., et al. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
  20. Gupta, V., Tseng, H., Lawrence, B. D., Jane Grande-Allen, K. Effect of cyclic mechanical strain on glycosaminoglycan and proteoglycan synthesis by heart valve cells. Acta Biomaterialia. 5 (2), 531-540 (2009).
  21. Lin, S., Mequanint, K. Bioreactor-induced mesenchymal progenitor cell differentiation and elastic fiber assembly in engineered vascular tissues. Acta Biomaterialia. 59, 200-209 (2017).
  22. Venkataraman, L., Bashur, C. A., Ramamurthi, A. Impact of cyclic stretch on induced elastogenesis within collagenous conduits. Tissue Engineering. Part A. 20 (9-10), 1403-1415 (2014).
  23. Huang, A. H., et al. Biaxial stretch improves elastic fiber maturation, collagen arrangement, and mechanical properties in engineered arteries. Tissue Engineering Part C Methods. 22 (6), 524-533 (2016).
  24. Hinderer, S., et al. In vitro elastogenesis: instructing human vascular smooth muscle cells to generate an elastic fiber-containing extracellular matrix scaffold. Biomedical Materials. 10 (3), 034102(2015).
  25. Eoh, J. H., et al. Enhanced elastin synthesis and maturation in human vascular smooth muscle tissue derived from induced-pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 52, 49-59 (2017).
  26. Smits, A. I. P. M., Bouten, C. V. C. Tissue engineering meets immunoengineering: Prospective on personalized in situ tissue engineering strategies. Current Opinion in Biomedical Engineering. 6, 17-26 (2018).
  27. Wissing, T. B., Bonito, V., Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M. Biomaterial-driven in situ cardiovascular tissue engineering-a multi-disciplinary perspective. npj Regenerative Medicine. 2 (1), 18(2017).
  28. Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25 (12), 4253-4263 (2011).
  29. Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. Macrophages are required for adult salamander limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).
  30. Godwin, J. W., Debuque, R., Salimova, E., Rosenthal, N. A. Heart regeneration in the salamander relies on macrophage-mediated control of fibroblast activation and the extracellular landscape. npj Regenerative Medicine. 2 (1), 22(2017).
  31. McBane, J. E., Cai, K., Labow, R. S., Santerre, J. P. Co-culturing monocytes with smooth muscle cells improves cell distribution within a degradable polyurethane scaffold and reduces inflammatory cytokines. Acta Biomaterialia. 8 (2), 488-501 (2012).
  32. Battiston, K. G., Ouyang, B., Labow, R. S., Simmons, C. A., Santerre, J. P. Monocyte/macrophage cytokine activity regulates vascular smooth muscle cell function within a degradable polyurethane scaffold. Acta Biomaterialia. 10 (3), 1146-1155 (2014).
  33. Ploeger, D. T., et al. Cell plasticity in wound healing: paracrine factors of M1/ M2 polarized macrophages influence the phenotypical state of dermal fibroblasts. Cell Communication and Signaling. 11 (1), 29(2013).
  34. McBane, J. E., Santerre, J. P., Labow, R. S. The interaction between hydrolytic and oxidative pathways in macrophage-mediated polyurethane degradation. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 82 (4), 984-994 (2007).
  35. Wissing, T. B., et al. Macrophage-driven biomaterial degradation depends on scaffold microarchitecture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 87(2019).
  36. Wolf, M. T., Vodovotz, Y., Tottey, S., Brown, B. N., Badylak, S. F. Predicting in vivo responses to biomaterials via combined in vitro and in silico analysis. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (2), 148-159 (2015).
  37. Grotenhuis, N., Bayon, Y., Lange, J. F., Van Osch, G. J. V. M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M. A culture model to analyze the acute biomaterial-dependent reaction of human primary macrophages. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 115-120 (2013).
  38. Jannasch, M., et al. A comparative multi-parametric in vitro model identifies the power of test conditions to predict the fibrotic tendency of a biomaterial. Scientific Reports. 7 (1), 1689(2017).
  39. Wang, Z., et al. The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(ε-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration. Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).
  40. McWhorter, F. Y., Davis, C. T., Liu, W. F. Physical and mechanical regulation of macrophage phenotype and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (7), 1303-1316 (2014).
  41. Ballotta, V., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Strain-dependent modulation of macrophage polarization within scaffolds. Biomaterials. 35 (18), 4919-4928 (2014).
  42. Dziki, J. L., et al. The effect of mechanical loading upon extracellular matrix bioscaffold-mediated skeletal muscle remodeling. Tissue Engineering. Part A. 24 (1-2), 34-46 (2018).
  43. Wissing, T. B., et al. Hemodynamic loads distinctively impact the secretory profile of biomaterial-activated macrophages - implications for in situ vascular tissue engineering. Biomaterials Science. 8 (1), 132-147 (2020).
  44. Van Haaften, E. E., Wissing, T. B., Kurniawan, N. A., Smits, A. I. P. M., Bouten, C. V. C. Human in vitro model mimicking material-driven vascular regeneration reveals how cyclic stretch and shear stress differentially modulate inflammation and matrix deposition. Advanced Biosystems. 4 (6), 1900249(2020).
  45. Ballotta, V., Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Synergistic protein secretion by mesenchymal stromal cells seeded in 3D scaffolds and circulating leukocytes in physiological flow. Biomaterials. 35 (33), 9100-9113 (2014).
  46. Bonito, V., de Kort, B. J., Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M. Cyclic strain affects macrophage cytokine secretion and extracellular matrix turnover in electrospun scaffolds. Tissue Engineering Part A. 25 (17-18), 1310-1325 (2019).
  47. Battiston, K. G., Labow, R. S., Simmons, C. A., Santerre, J. P. Immunomodulatory polymeric scaffold enhances extracellular matrix production in cell co-cultures under dynamic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 24, 74-86 (2015).
  48. Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. A mesofluidics-based test platform for systematic development of scaffolds for in situ cardiovascular tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (6), 475-485 (2012).
  49. Smits, A. I. P. M., Ballotta, V., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. T. Shear flow affects selective monocyte recruitment into MCP-1-loaded scaffolds. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2176-2188 (2014).
  50. Ballotta, V., Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Synergistic protein secretion by mesenchymal stromal cells seeded in 3D scaffolds and circulating leukocytes in physiological flow. Biomaterials. 35 (33), 9100-9113 (2014).
  51. Fahy, N., Menzel, U., Alini, M., Stoddart, M. J. Shear and dynamic compression modulates the inflammatory phenotype of human monocytes in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 383(2019).
  52. Pennings, I., et al. Layer-specific cell differentiation in bi-layered vascular grafts under flow perfusion. Biofabrication. 12 (1), 015009(2019).
  53. Wang, J., et al. Ex vivo blood vessel bioreactor for analysis of the biodegradation of magnesium stent models with and without vessel wall integration. Acta Biomater. 50, 546-555 (2017).
  54. Huang, A. H., et al. Design and use of a novel bioreactor for regeneration of biaxially stretched tissue-engineered vessels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (8), 841-851 (2015).
  55. Huang, A. H., Niklason, L. E. Engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (52), e2646(2011).
  56. Bono, N., et al. A Dual-mode bioreactor system for tissue engineered vascular models. Annals of Biomedical Engineering. 45 (6), 1496-1510 (2017).
  57. Wolf, F., et al. VascuTrainer: a mobile and disposable bioreactor system for the conditioning of tissue-engineered vascular grafts. Annals of Biomedical Engineering. 46 (4), 616-626 (2018).
  58. Ramaswamy, S., et al. A novel bioreactor for mechanobiological studies of engineered heart valve tissue formation under pulmonary arterial physiological flow conditions. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (12), 121009(2014).
  59. Piola, M., et al. A compact and automated ex vivo vessel culture system for the pulsatile pressure conditioning of human saphenous veins. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (3), 204-215 (2016).
  60. Vanerio, N., Stijnen, M., de Mol, B. A. J. M., Kock, L. M. An innovative ex vivo vascular bioreactor as comprehensive tool to study the behavior of native blood vessels under physiologically relevant conditions. Journal of Engineering and Science in Medical Diagnostics and Therapy. 2 (4), (2019).
  61. Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplantation. 27 (9), 1375-1389 (2018).
  62. Sinha, R., et al. A medium throughput device to study the effects of combinations of surface strains and fluid-flow shear stresses on cells. Lab on a Chip. 15 (2), 429-439 (2015).
  63. Beca, B. M., Sun, Y., Wong, E., Moraes, C., Simmons, C. A. Dynamic bioreactors with integrated microfabricated devices for mechanobiological screening. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 581-592 (2019).
  64. Liu, H., Usprech, J., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform with hydrogel arrays for 3D mechanical stimulation of cells. Acta Biomaterialia. 34, 113-124 (2016).
  65. Szafron, J. M., Ramachandra, A. B., Breuer, C. K., Marsden, A. L., Humphrey, J. D. Optimization of tissue-engineered vascular graft design using computational modeling. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 561-570 (2019).
  66. Emmert, M. Y., et al. Computational modeling guides tissue-engineered heart valve design for long-term in vivo performance in a translational sheep model. Science Translational Medicine. 10 (440), (2018).
  67. Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26 (16), 3113-3121 (2005).
  68. van Kelle, M. A. J., et al. A Bioreactor to identify the driving mechanical stimuli of tissue growth and remodeling. Tissue Engineering Part C: Methods. 23 (6), (2017).
  69. van den Broek, C. N., et al. Medium with blood-analog mechanical properties for cardiovascular tissue culturing. Biorheology. 45 (6), 651-661 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

napr enie cinaj cerozci ganie cyklicznetkankowo in ynieryjne przeszczepy naczynioweludzkie makrofagimiofibroblastykomora do hodowli przep ywowejdepozycja kolagenu typu 1profil sekrecji cytokinalfa aktyna mi ni g adkich

Powiązane artykuły