Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie tubuliny z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi i izotypami z ograniczonych źródeł przez cykle polimeryzacji-depolimeryzacji

DOI:

10.3791/61826

⸱

5 listopada 2020

 ,  ,  , 
1PSL Research University, CNRS UMR3348, Institut Curie, 2Université Paris-Saclay, CNRS UMR3348, Université Paris Sud

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje oczyszczanie tubuliny z małych/średnich źródeł, takich jak hodowane komórki lub pojedyncze mózgi myszy, przy użyciu cykli polimeryzacji i depolimeryzacji. Oczyszczona tubulina jest wzbogacona w określone izotypy lub ma specyficzne modyfikacje potranslacyjne i może być stosowana w testach rekonstytucji in vitro do badania dynamiki i interakcji mikrotubul.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym ważnym aspektem badań nad cytoszkieletem mikrotubul jest badanie zachowania mikrotubul w eksperymentach rekonstytucji in vitro. Umożliwiają one analizę wewnętrznych właściwości mikrotubul, takich jak dynamika, oraz ich interakcji z białkami związanymi z mikrotubulami (MAP). "Kod tubuliny" to pojawiająca się koncepcja, która wskazuje na różne izotypy tubuliny i różne modyfikacje potranslacyjne (PTM) jako regulatory właściwości i funkcji mikrotubul. Aby zbadać mechanizmy molekularne kodu tubuliny, kluczowe znaczenie ma przeprowadzenie eksperymentów rekonstytucji in vitro z użyciem oczyszczonej tubuliny o określonych izotypach i PTM.

Do tej pory było to technicznie trudne, ponieważ tubulina mózgowa, która jest szeroko stosowana w eksperymentach in vitro, zawiera wiele PTM i ma określony skład izotypowy. W związku z tym opracowaliśmy ten protokół oczyszczania tubuliny z różnych źródeł i o różnym składzie izotypowym oraz kontrolowanych PTM, przy użyciu klasycznego podejścia cykli polimeryzacji i depolimeryzacji. W porównaniu z istniejącymi metodami opartymi na oczyszczaniu z powinowactwem, podejście to daje czystą, zdolną do polimeryzacji tubulinę, ponieważ tubulina odporna na polimeryzację lub depolimeryzację jest odrzucana podczas kolejnych etapów oczyszczania.

Opisujemy oczyszczanie tubuliny z linii komórkowych, hodowanych w zawiesinie lub jako kultury przylegające, oraz z pojedynczych mózgów myszy. Metoda najpierw opisuje wytwarzanie masy komórkowej zarówno w zawiesinie, jak i w warunkach przylegania, etap lizy, a następnie kolejne etapy oczyszczania tubuliny przez cykle polimeryzacji i depolimeryzacji. Nasza metoda pozwala uzyskać tubulinę, która może być wykorzystana w eksperymentach dotyczących wpływu kodu tubuliny na wewnętrzne właściwości mikrotubul i interakcji mikrotubul z powiązanymi białkami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrotubule odgrywają kluczową rolę w wielu procesach komórkowych. Nadają komórkom ich kształt, budują wrzeciona mejotyczne i mitotyczne do segregacji chromosomów i służą jako ścieżki transportu wewnątrzkomórkowego. Aby pełnić te różnorodne funkcje, mikrotubule organizują się na różne sposoby. Jednym z intrygujących pytań w tej dziedzinie jest zrozumienie mechanizmów molekularnych, które pozwalają strukturalnie i ewolucyjnie zachowanym mikrotubulom przystosować się do tej mnogości organizacji i funkcji. Jednym z potencjalnych mechanizmów jest dywersyfikacja mikrotubul, która jest zdefiniowana przez koncepcję znaną jako "kod tubuliny"1,2,3. Kod tubuliny obejmuje dwa główne składniki: różnicową inkorporację produktów genów α- i β-tubuliny (izotypów tubuliny) do mikrotubul oraz modyfikacje potranslacyjne tubuliny (PTM).

Od lat siedemdziesiątych, eksperymenty z rekonstytucją in vitro, w połączeniu z rozwijającymi się technikami mikroskopii świetlnej, utorowały drogę do ważnych odkryć dotyczących właściwości mikrotubul: dynamicznej niestabilności4 i bieżnia5, oraz ich inne mechanizmy i funkcje6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Prawie wszystkie przeprowadzone do tej pory eksperymenty in vitro opierały się na tubulinie oczyszczonej z tkanki mózgowej za pomocą powtarzających się cykli polimeryzacji i depolimeryzacji16,17. Chociaż oczyszczanie z tkanki mózgowej ma tę zaletę, że pozwala uzyskać wysokiej jakości tubulinę w dużych ilościach (zwykle w gramach), jedną z ważnych wad jest niejednorodność, ponieważ tubulina oczyszczona z tkanki mózgowej jest mieszaniną różnych izotypów tubuliny i jest wzbogacona o wiele tubulinowych PTM. Ta niejednorodność uniemożliwia określenie roli konkretnego tubuliny PTM lub izotypu w kontroli właściwości i funkcji mikrotubul. W związku z tym wytwarzanie tubuliny kompetentnej do składania z kontrolowanymi tubulinami PTM i jednorodnym składem izotypu jest niezbędne do zajęcia się mechanizmami molekularnymi kodu tubuliny.

Ostatnio opracowano metodę oczyszczania tubuliny metodą chromatografii powinowactwa przy użyciu domeny TOG (gen z nadekspresją nowotworu) wiążącej mikrotubule drożdży Stu2p18. W tej metodzie tubulina w surowych lizatach komórek lub tkanek przepuszczana jest przez kolumnę, w której wiąże się z unieruchomioną matrycowo domeną TOG, co pozwala na analizę całej puli tubuliny w danej, nawet bardzo małej, próbce. W ostatnich latach opisano również długo oczekiwane podejście do oczyszczania rekombinowanej tubuliny. Opiera się na systemie bakulowirusowym, w którym wektor bi-cistroniczny zawierający geny α- i β-tubuliny ulega ekspresji w komórkach owadów19. Metoda ta jest jednak bardzo kłopotliwa i czasochłonna, dlatego jest najczęściej stosowana do badania wpływu mutacji tubuliny20 i izotypów tubuliny21,22,23 in vitro.

W obecnym protokole opisujemy metodę, która wykorzystuje dobrze znane i szeroko stosowane podejście do polimeryzacji i depolimeryzacji jako plan generowania tubuliny o różnych poziomach modyfikacji, zarówno z linii komórkowych, jak i z tkanki mózgowej myszy24. W tej procedurze tubulina jest cyklicznie przenoszona między formą rozpuszczalną (dimer tubuliny w temperaturze 4 °C) a formą spolimeryzowaną (mikrotubula w temperaturze 30 °C w obecności 5'-trifosforanu guanozyny [GTP]). Każda forma jest rozdzielana w kolejnych etapach wirowania: dimery tubuliny pozostaną w supernatancie po zimnym (4 °C) wirowaniu, podczas gdy mikrotubule zostaną ogranulowane w temperaturze 30 °C. Ponadto jeden etap polimeryzacji przeprowadza się przy wysokim stężeniu piperazyno-N,N′-bis(kwas 2-etanosulfonowy) (PIPES), co pozwala na usunięcie białek związanych z mikrotubulami z mikrotubul, a tym samym z ostatecznie oczyszczonej tubuliny. Tubulina oczyszczona z komórek HeLa S3 wyhodowanych jako zawiesina lub kultury przylegające jest praktycznie wolna od jakiegokolwiek tubuliny PTM i została wykorzystana w ostatnich eksperymentach rekonstytucji in vitro25,26,27,28. Dalej dostosowaliśmy metodę oczyszczania tubuliny z pojedynczych mózgów myszy, która może być stosowana w przypadku dużej liczby modeli myszy ze zmianami w izotypach tubuliny i PTM.

W protokole najpierw opisujemy wytwarzanie materiału źródłowego (masa komórkowa lub tkanka mózgowa), jego lizę (Rysunek 1A), a następnie kolejne etapy polimeryzacji i depolimeryzacji tubuliny w celu oczyszczenia tubuliny (Rysunek 1B). Dalej opisujemy proces oceny czystości (Rysunek 2A,B) i ilość (Rysunek 3A,B) oczyszczonej tubuliny. Metodę można dostosować do produkcji tubuliny wzbogaconej o wybrany PTM poprzez nadekspresję enzymu modyfikującego w komórkach przed oczyszczaniem tubuliny (Figura 4B). Alternatywnie, enzymy modyfikujące tubulinę mogą być dodawane do tubuliny podczas procesu oczyszczania. Wreszcie, możemy oczyścić tubulinę pozbawioną określonych izotypów lub PTM z mózgów myszy z niedoborem odpowiednich enzymów modyfikujących tubulinę (Rysunek 4B) < klasa sup = "xref">29.

Metoda, którą tutaj opisujemy, ma dwie główne zalety: (i) pozwala na produkcję wystarczająco dużych ilości tubuliny w stosunkowo krótkim czasie, oraz (ii) generuje wysokiej jakości, czystą tubulinę, o specyficznym składzie izotypu tubuliny lub PTM. W filmie dołączonym do tego manuskryptu podkreślamy niektóre z kluczowych kroków związanych z tą procedurą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka nad zwierzętami i ich użytkowanie w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Wspólnoty Europejskiej (2010/63/UE). Procedury eksperymentalne zostały specjalnie zatwierdzone przez komisję etyczną Instytutu Curie CEEA-IC #118 (autoryzacja nr 04395.03 wydana przez władze krajowe) zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi.

1. Przygotowanie odczynników do oczyszczania tubuliny

UWAGA: Wszystkie używane do oczyszczania tubuliny powinny zawierać sole potasu, a NIE sole sodu30.

  1. Przygotuj 1 l kompletnej pożywki: zmodyfikowanej pożywki Eagle firmy Dulbecco (DMEM), z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS, 100 ml), 200 mM L-glutaminy (10 ml 2 M bulionu) i 1x penicyliną-streptomycyną (10 ml 100x bulionu). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować 10 M wodorotlenku potasu (KOH), rozpuszczając 140 g KOH w wodzie, dostosować końcową objętość do 250 ml i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować 0,5 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), pH 8, rozpuszczając 36,5 g EDTA w wodzie, dostosować pH do 8,0 za pomocą KOH (w przeciwnym razie EDTA się nie rozpuści), a końcową objętość do 250 ml, przefiltrować-wysterylizować i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotować 5 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)-EDTA, dodając 5 ml 0,5 M EDTA do 500 ml PBS, wysterylizować pod filtrem i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotować 0,5 M K-PIPES, pH 6,8, rozpuszczając 75,5 g RUR w wodzie, dostosować do pH 6,8 za pomocą KOH (w przeciwnym razie RURY się nie rozpuszczą), a końcową objętość do 500 ml, przefiltrować-wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  6. Przygotować 1 M K-Pipes, pH 6,8, rozpuszczając 15,1 g RUR w wodzie, dostosować do pH 6,8 za pomocą KOH, a końcową objętość do 50 ml, przefiltrować-wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  7. Przygotować 0,5 M glikolu potasowo-etylenowego-bis(β-aminoetylowego eter)-N,N,N′,N′-tetraoctowego kwasu (K-EGTA, pH 7,7) rozpuszczając 47,5 g EGTA w wodzie, dostosować do pH 7,7 za pomocą KOH, a końcową objętość do 250 ml, przefiltrować-wysterylizować i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  8. Przygotować roztwór BRB80 (80 mM K-PIPES, pH 6,8; 1 mM K-EGTA; 1 mM chlorku magnezu [MgCl2]) przez zmieszanie 3,2 ml 0,5 M RUREK, 40 μL 0,5 M K-EGTA i 20 μL 1 M MgCl2 i dostosować końcową objętość do 20 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  9. Przygotować 0,1 M fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF), rozpuszczając 435 mg PMSF w izopropanolu do uzyskania końcowej objętości 25 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  10. Przygotować mieszaninę inhibitorów proteazy (200x), rozpuszczając 10 mg aprotyniny, 10 mg leupeptyny i 10 mg fluorku 4-(2-aminoetylo)-benzenesulfonylu w wodzie, aby uzyskać końcową objętość 2,5 ml, zrobić podwielokrotności 100 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  11. Przygotuj 10% Triton X-100, mieszając 5 ml Triton X-100 w 45 ml wody, przefiltruj-sterylizuj i przechowuj w temperaturze pokojowej.
  12. Przygotować bufor do lizy (BRB80 uzupełniony 1 mM 2-merkaptoetanolem, 1 mM PMSF, 1x mieszaniną inhibitorów proteazy i opcjonalnie dla komórek HEK-293 0,2% Triton X-100) w dniu oczyszczania tubuliny przez zmieszanie 20 ml BRB80 z 1,5 μl 2-merkaptoetanolu, 200 μL 0,1 M PMSF, 100 μL mieszaniny inhibitorów proteazy i, opcjonalnie do komórek HEK-293, 400 μL 10% Triton X-100.
    UWAGA: 2-merkaptoetanol jest toksyczny i powinien być stosowany w dygestorium.
  13. Przygotować 0,2 M GTP, rozpuszczając 1 g GTP w 9,5 ml wody, dostosować pH do 7,5 za pomocą KOH, przygotować porcje 20 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C. Unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
  14. Przygotować 1 M chlorowodorek tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl) rozpuszczając 60,56 g Tris w wodzie, dostosować do pH 6,8 za pomocą HCl, uzupełnić do końcowej objętości 500 ml, przefiltrować-wysterylizować i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  15. Przygotować 5 razy bufor do próbek Laemmli (450 mM ditiotreitol (DTT); 10% dodecylosiarczan sodu (SDS); 400 μM Tris-HCl, pH 6,8; 50% glicerolu; ~0,006% błękitu bromofenolowego), dodając 4 g SDS do 16 ml podgrzanego 1 M Tris-HCl o pH 6,8 i delikatnie wymieszać roztwór. Do mieszanki dodać 2,6 g DTT i 20 ml 100% glicerolu i mieszać, aż roztwór stanie się jednorodny. Dodaj żądaną ilość błękitu bromofenolowego (2,5 mg), aby osiągnąć wymaganą intensywność koloru. Przygotować 5 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować 2x roztwór roboczy buforu do próbek Laemmli, rozcieńczając 5x bulion w wodzie destylowanej.

2. Źródła amplifikacji i zbierania tubuliny

UWAGA: W tym protokole wykorzystano trzy źródła tubuliny: (i) komórki (HeLa S3 i HEK-293) hodowane jako kultury zawiesinowe; (ii) komórki hodowane jako kultury adherentne (HEK-293, HeLa i U2 OS); oraz (iii) tkanka mózgowa myszy. W protokole tym uznaje się dzień oczyszczania tubuliny za "dzień 0" i w związku z tym opisano inne etapy w odniesieniu do dnia 0.

  1. Amplifikacja komórek
    1. Komórki hodowane jako kultury zawiesinowe
      UWAGA: Aby skutecznie oczyścić tubulinę z kultur zawiesinowych, należy użyć co najmniej 2 l kultury zawiesinowej.
      1. Na 2 litry hodowli zawiesinowej należy ożywić i wyhodować preferowany typ komórek, aby uzyskać 6 × 107 komórek 10 dni przed dniem przygotowania. W dniu -10 umieść komórki na sześciu szalkach o średnicy 15 cm po 107 komórek na płytkę.
      2. W dniu -8 podgrzej wymaganą ilość kompletnej pożywki do temperatury 37 °C. Dodaj 1 l podgrzanej pożywki do każdej butelki z wirówką w sterylnych warunkach. Umieść wirówki na stole mieszadła ustawionym na 20–25 obr./min wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych, lekko rozchyl boczne nasadki przędzalnicy, aby umożliwić zrównoważenie podłoża z atmosferą inkubatora.
        UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, dokładnie wyczyść zewnętrzną powierzchnię pożywki i butelek z przędzarką przy użyciu 70% etanolu.
      3. W dniu -7 trypsynizuj i zbierz komórki wyhodowane do 80-90% konfluencji (około 1,8 × 108 komórek). Zbierz komórki z 3 szalek na raz, odwiruj (200 × g, 5 min, temperatura pokojowa) i ponownie zawieś wszystkie komórki w 10 ml DMEM.
        UWAGA: Dokładna dysocjacja komórek w tym momencie jest bardzo ważna, aby uniknąć tworzenia się większych agregatów w butelkach z przędzalnią, co wpływa na przeżycie komórek i skutkuje niską wydajnością tubuliny.
      4. Dodać 5 ml zawiesiny komórkowej do każdej butelki z przędzarką zawierającą 1 l DMEM, umieścić wirówki z powrotem na stole mieszadła w inkubatorze do hodowli komórkowych i pozwolić komórkom rosnąć przez tydzień.
    2. Komórki hodowane jako kultury adherentne
      UWAGA: Aby skutecznie oczyścić tubulinę z przylegających komórek, użyj co najmniej 10 szalek o zbiegu 80–90%.
      1. Ożywić i amplifikować pożądany typ komórek, aby uzyskać 1 × 108 komórek na trzy dni przed dniem przygotowania tubuliny.
      2. W dniu -3 ułóż te komórki na dziesięciu 15-centymetrowych szalkach po 1 × 107komórek na miskę i pozwól im rozwinąć 80-90% konfluencji.
      3. W dniu -1, jeśli to konieczne, przetransfekować komórki plazmidem w celu ekspresji enzymu modyfikującego tubulinę lub określonego izotypu tubuliny.
  2. Pobieranie komórek/tkanki mózgowej
    1. Komórki wyhodowane jako kultury zawiesinowe
      1. Przenieść zawiesinę komórek z wirówek do 1 litrowych butelek wirówkowych (tabela materiałów) i komórek peletów w temperaturze pokojowej 250 × g, 15 min. Aby natychmiast rozpocząć kolejną hodowlę komórek HeLa S3 w butelkach z przędzarką, pozostaw 100 ml zawiesiny komórek w przędzarkach i dodaj 1 l kompletnego, wstępnie podgrzanego DMEM do butelki z przędzarką.
        UWAGA: Dokładnie sprawdź, czy nie ma zanieczyszczenia bakteryjnego przed przystąpieniem do oczyszczania tubuliny.
      2. Zawiesić granulowane komórki z każdej butelki wirówkowej w 10 ml lodowatego PBS i przenieść wszystkie komórki do probówek z nakrętką o pojemności 50 ml. Podczas ponownego zawieszania należy utrzymywać komórki na lodzie. Granulować komórki w temperaturze 250 × g, 15 min, 4 °C.
        UWAGA: Postępuj zgodnie z zaleceniami dotyczącymi czyszczenia i przechowywania butelki z wirówką (patrz Tabela materiałów).
      3. Odrzucić supernatant i określić objętość osadu komórkowego. Z 2 litrów kultury zawiesinowej (dwie butelki z przędzarką) spodziewaj się granulki komórek o pojemności 5–6 ml.
        UWAGA: W opisanym poniżej protokole przyjmuje się, że objętość osadu komórkowego wynosi 10 ml. Dostosuj eksperyment do objętości granulek.
      4. Dodać 1 objętość (10 ml) buforu do lizy i ponownie zawiesić osad komórkowy.
        UWAGA: Stosunek objętości osadu komórkowego do objętości buforu do lizy jest bardzo ważny dla pomyślnego oczyszczania tubuliny. Dodanie większej ilości buforu do lizy zmniejsza stężenie tubuliny, która następnie nie osiąga krytycznego stężenia potrzebnego do polimeryzacji, co znacznie zmniejsza wydajność tubuliny.
        UWAGA: Komórki ponownie zawieszone w buforze do lizy można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez dwa miesiące.
    2. Komórki hodowane jako kultury adherentne
      UWAGA: Komórki z przylegających kultur muszą być zebrane bardzo szybko, aby skutecznie oczyścić tubulinę (około 15 minut w przypadku zebrania dziesięciu 15-centymetrowych szalek). Trzy osoby uczestniczyły w tym etapie protokołu.
      1. Usuń pożywkę z 15 cm szalek, przechylając naczynia, a następnie delikatnie umyj komórki 7 ml PBS-EDTA w temperaturze pokojowej (osoba 1). Pracuj tylko z trzema 15-centymetrowymi szalkami na raz, aby uniknąć pozostawienia komórek bez pożywki lub bufora.
      2. Dodaj 5 ml PBS-EDTA do komórek i inkubuj je przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Użyj podnośnika komórek, aby delikatnie odłączyć komórki, przesuwając je łopatą do jednej krawędzi naczynia (osoba 2) i zbierz wszystkie komórki w probówce z nakrętką o pojemności 50 ml (osoba 3). Opłucz każdą płytkę dodatkowymi 2 ml PBS-EDTA, aby zebrać pozostałe komórki z szalek. Na tym etapie należy przechowywać na lodzie zakrętkę o pojemności 50 ml zawierającą zawiesinę komórek.
      4. Osadzać komórki w temperaturze 250 × g, 10 min, 4 °C. Odrzucić supernatant i określić objętość osadu komórkowego. Spodziewaj się objętości ~1 ml z dziesięciu 15-centymetrowych szalek.
        UWAGA: W opisanym poniżej protokole przyjmuje się, że objętość osadu komórkowego wynosi 10 ml. Dostosuj eksperymenty do objętości granulek.
      5. Ponownie zawiesić komórki w 1 objętości (10 ml) buforu do lizy.
        UWAGA: Komórki zawieszone w buforze do lizy mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do dwóch miesięcy.
    3. Tkanka mózgowa
      UWAGA: Można używać myszy w każdym wieku, płci i o dowolnym pochodzeniu genetycznym. Wybór transgenicznego szczepu myszy będzie zależał od pytania naukowego, którym należy się zająć. W tym manuskrypcie pokazujemy przykład tubuliny oczyszczonej z myszy ttll1-/-, pozbawionej głównego enzymu glutamylującego mózg, białka tubuliny tyrozynopodobnej ligazy 1 (TTLL1) 31.
      1. Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy, szybko odetnij głowę i zbierz mózg do rurki z okrągłym dnem. Jeśli na mózgu znajduje się nadmiar krwi, szybko przemyj ją buforem do lizy. Zbierz mózg, gdy tylko mysz zostanie złożona w ofierze, ponieważ opóźnienie pośmiertne może wpłynąć na powodzenie oczyszczania tubuliny. Użyj probówek z okrągłym dnem, aby dostosować się do szerokości sondy używanej do homogenizacji.
        UWAGA: Pobrane mózgi myszy można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 3 lat.
      2. Dodaj 500 μl buforu do lizy do pojedynczego mózgu wyekstrahowanego od dorosłej myszy. W pozostałej części protokołu przyjmuje się, że objętość dodanego buforu do lizy wynosi 10 ml. Dostosuj do swojego eksperymentu w zależności od liczby mózgów, które mają być użyte.

3. Liza komórek lub tkanki mózgowej

  1. Komórki wyhodowane jako kultury zawiesinowe
    1. W przypadku HEK-293 należy lizować komórki na lodzie, powtarzając pipetowanie w górę i w dół za pomocą końcówek do pipet o różnych szerokościach. Najpierw przymocuj końcówkę p1000 do pipety o pojemności 10 ml i pipetuj zawiesinę komórek w górę i w dół co 5 minut przez 10 minut (trzy cykle pipetowania). Następnie przymocuj końcówkę p200 do końcówki p1000 i pipetuj co 5 minut przez 20 minut (pięć cykli pipetowania).
    2. W przypadku HeLa S3 należy zneutralizować komórki za pomocą prasy francuskiej (ustawienia znajdują się w Tabeli materiałów).
    3. Pobrać 1/100objętości mieszaniny do lizy (L) (200 μL na 20 ml L) i dodać taką samą objętość 2x buforu Laemmli, gotować przez 5 minut i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszej analizy.
  2. Komórki hodowane jako kultury przylegające
    1. Przenieś komórki do probówki okrągłodennej o pojemności 14 ml, której wysokość została zmniejszona, aby pomieścić sondę soniczną (patrz Tabela materiałów dla ustawień). Sonikuj komórki przez ~45 impulsów i potwierdź lizę komórek, pobierając próbkę kropli mieszanki do lizy pod mikroskopem.
      UWAGA: Liczba impulsów może się różnić w zależności od typu komórki używanej do oczyszczania tubuliny. Zbyt intensywne sonikowanie komórek może spowodować wytrącanie się tubuliny i negatywnie wpłynąć na wydajność oczyszczania.
    2. Pipetować komórki w górę i w dół na lodzie co 5 minut przez 20 minut (pięć cykli pipetowania) za pomocą końcówki p200.
    3. Pobrać 1/100objętości mieszaniny do lizy (L) (200 μL na 20 ml L) i dodać taką samą objętość 2x buforu Laemmli, gotować przez 5 minut i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszej analizy.
  3. Tkanka mózgowa
    1. Zmiel tkankę mózgową za pomocą blendera do tkanek (ustawienia znajdują się w Tabeli materiałów). Alternatywnie, należy zlizować tkankę za pomocą tłuczka do mikroprobówek lub równoważnego sprzętu i pipetować w górę iw dół na lodzie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 18 G.
    2. Weź 1/100objętości mieszaniny do lizy (L) (200 μL na 20 ml L) i dodaj tę samą objętość 2x buforu Laemmli, gotuj przez 5 minut i przechowuj w temperaturze -20 °C do dalszej analizy.

4. Oczyszczanie tubuliny

  1. Klarowanie lizatu
    1. Oczyścić lizat (oddzielający osad i frakcję rozpuszczalną mieszaniny do lizy) przez odwirowanie w temperaturze 150 000 × g, w temperaturze 4 °C, 30 min. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wirników i probówek ultrawirówek. W przypadku ekstraktów komórkowych po odwirowaniu często tworzy się biała pływająca warstwa. Nie przenoś tej pływającej warstwy wraz z supernatantem, ponieważ zakłóca ona polimeryzację tubuliny. Użyć strzykawki o odpowiedniej objętości przymocowanej do długiej igły o masie 20 G lub 21 G, aby delikatnie usunąć supernatant bez naruszania warstwy unoszącej się na wodzie. Jeżeli sklarowany nad osadem jest nadal mętny, odwirować w temperaturze 5 000 × g, w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
    2. Przenieść supernatant (SN1) do probówki ultrawirówkowej i zanotować jego objętość. W przypadku 10 ml granulki komórkowej spodziewaj się objętości ~12 ml dla SN1.
    3. Pobrać 1/100objętości SN1 (120 μl na 12 ml SN1) i dodać taką samą objętość 2x buforu Laemmli, gotować przez 5 minut i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszej analizy.
    4. Ponownie zawiesić granulat (P1) w BRB80 (Tabela materiałów), używając tej samej objętości co SN1. Pobrać 1/100objętości P1 (200 μl na 20 ml P1) i dodać taką samą objętość 2x buforu Laemmli, gotować przez 5 minut i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszej analizy.
  2. Pierwsza polimeryzacja w buforze o niskiej molowości
    1. Przygotować mieszaninę polimeryzacyjną, łącząc 1 objętość SN1 (12 ml), 1/200objętości 0,2 M GTP (60 μl; stężenie końcowe 1 mM) i 0,5 objętości wstępnie podgrzanego glicerolu (6 ml) w probówce z nakrętką o odpowiedniej objętości.
      UWAGA: Glicerol jest stosowany jako środek tłumiący na etapach polimeryzacji w całym protokole i dlatego nie jest brany pod uwagę w obliczeniach stężeń innych składników.
    2. Odpipetować mieszaninę w górę i w dół, delikatnie unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza, i przenieść ją do odpowiednich probówek ultrawirówek.
      UWAGA: Podczas przenoszenia mieszanki do probówek należy wyregulować wagę probówek (parami). Dzięki temu eksperymentator może bezpośrednio przejść do sedymentacji mikrotubul po etapie polimeryzacji. Zrób to dla wszystkich etapów polimeryzacji w całym protokole.
    3. Przykryć probówki parafilmem, przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 30 °C i inkubować przez 20 minut.
    4. Odwirować probówki w temperaturze 150 000 × g, w temperaturze 30 °C przez 30 minut. Usunąć supernatant (SN2) i zachować osad spolimeryzowanych mikrotubul (P2).
      UWAGA: Granulat mikrotubuli może być zamrażany i przechowywany w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.
    5. Pobrać 1/200objętości SN2 (90 μl na 18 ml SN2) i dodać taką samą objętość 2x buforu Laemmli, gotować przez 5 minut i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszej analizy.
  3. Pierwsza depolimeryzacja
    1. Depolimeryzuj mikrotubule, dodając lodowaty BRB80 do osadu P2 i pozostaw na lodzie na 5 minut: w przypadku tubuliny z komórek dodaj 1/60(200 μl), a w przypadku tubuliny z mózgu dodaj 1/20 (600 μL) objętości SN1,
      UWAGA: Objętość lodowatego BRB80 dodawanego do osadu podczas etapów depolimeryzacji jest zawsze względna w stosunku do objętości SN1.
    2. Zawiesić delikatnie osad mikrotubuli, unikając pęcherzyków powietrza, aż roztwór będzie całkowicie jednorodny. Użyj końcówki p1000 przez kilka cykli pipetowania, a następnie końcówki p200 co 5 minut, przez 20 minut (pięć cykli pipetowania). Jest to kluczowy krok dla powodzenia oczyszczania tubuliny.
    3. Przenieść roztwór do odpowiednich probówek ultrawirówek i wirować w temperaturze 150 000 × g, 4 °C przez 20 minut. Przenieść SN3 do nowej probówki ultrawirówkowej o pojemności 1,5 ml. Osad utworzony po tym etapie wirowania (P3) zawiera wytrącone białka (białka związane z mikrotubulami lub MAP) i niezdepolimeryzowane mikrotubule. Supernatant (SN3) zawiera rozpuszczalne składniki: depolimeryzowane dimery tubuliny i MAP, które odłączyły się od zdepolimeryzowanych mikrotubul
      4. .
    4. Weź 1-4 μl SN3 i dodaj 9 objętości 2x buforu Laemmli, gotuj przez 5 minut i przechowuj w temperaturze -20 °C do dalszych analiz.
    5. Zawiesić osad P3 w BRB80 (w tej samej objętości SN3), pobrać 1–4 μl i dodać 9 objętości 2x buforu Laemmli, gotować przez 5 minut i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Druga polimeryzacja (w buforze o wysokiej molowości)
    1. Przygotować mieszaninę polimeryzacyjną, łącząc 1 objętość SN3 (200 μL), 1 objętość wstępnie podgrzanych 1 M RUR (200 μL, stężenie końcowe 0,5 M), 1/100objętości 0,2 M GTP (2 μL, stężenie końcowe 1 mM) i 1 objętość wstępnie podgrzanego glicerolu (200 μL) w probówce o odpowiedniej objętości.
    2. Pipetować mieszaninę w górę i w dół, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza, i przenieść ją do probówek ultrawirówek.
    3. Przykryć probówki parafilmem, przenieść je do łaźni wodnej o temperaturze 30 °C i inkubować przez 20 minut.
    4. Odwirować probówki w temperaturze 150 000 × g, w temperaturze 30 °C przez 30 minut. Usunąć supernatant (SN4) i zachować osad spolimeryzowanych mikrotubul (P4). Osad P4 zawiera spolimeryzowane mikrotubule, a supernatant SN4 zawiera niespolimeryzowaną tubulinę, MAP i inne rozpuszczalne białka.
      UWAGA: Osad mikrotubuli po drugim etapie polimeryzacji może być zatrzaskowo zamrożony i przechowywany w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.
    5. Pobrać 1–4 μl i dodać 9 objętości 2x buforu Laemmli, gotować przez 5 minut i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszych analiz.
  5. Druga depolimeryzacja
    1. Depolimeryzuj mikrotubule, dodając lodowaty BRB80 do osadu P4 i pozostaw na lodzie na 5 minut: w przypadku tubuliny z komórek dodaj 1/100(120 μl), a w przypadku tubuliny z mózgu dodaj 1/40(300 μl) objętości SN1.
    2. Pipetować w górę i w dół za pomocą końcówki p200 co 5 minut, przez 20 minut (pięć cykli pipetowania).
    3. Przenieść roztwór do probówki ultrawirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować w temperaturze 150 000 g × g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Przenieść SN5 do nowej probówki ultrawirówkowej o pojemności 1,5 ml. Osad powstały po tym etapie wirowania (P5) zawiera niezdepolimeryzowane mikrotubule. Supernatant (SN5) zawiera rozpuszczalną tubulinę.
    4. Pobrać 1–4 μl i dodać 9 objętości 2x buforu Laemmli, gotować przez 5 minut i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszych analiz.
    5. Zawiesić osad P5 w BRB80 (ta sama objętość SN5), pobrać 1–4 μl i dodać 9 objętości 2x buforu Laemmli, gotować przez 5 minut i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszych analiz.
  6. Trzecia polimeryzacja (w buforze o niskiej molowości)
    1. Przygotować mieszaninę polimeryzacyjną: 1 objętość SN5 (120 μL), 1/200objętości 0,2 M GTP (0,6 μL, stężenie końcowe wynosi 1 mM) i 0,5 objętości podgrzanego glicerolu (60 μL) w probówce o odpowiedniej objętości.
    2. Odpipetować mieszaninę w górę i w dół, delikatnie unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza, i przenieść ją do odpowiednich probówek ultrawirówek.
    3. Przykryć probówki parafilmem, przenieść je do łaźni wodnej o temperaturze 30 °C i inkubować przez 20 minut.
    4. Odwirować probówki w temperaturze 150 000 × g, w temperaturze 30 °C przez 30 minut. Osad (P6) zawiera spolimeryzowane mikrotubule, a supernatant SN6 zawiera niewielkie ilości niespolimeryzowanej tubuliny.
      UWAGA: Granulki mikrotubul mogą być zamrażane zatrzaskowo i przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.
    5. Pobrać 1–4 μl i dodać 9 objętości 2x buforu Laemmli, gotować przez 5 minut i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszych analiz.
  7. Trzecia depolimeryzacja
    1. Depolimeryzuj mikrotubule, dodając lodowaty BRB80 do osadu P6 i pozostaw na lodzie na 5 minut: w przypadku tubuliny z komórek dodaj 1/100(120 μl), a w przypadku tubuliny z mózgu dodaj 1/40(300 μL) objętości SN1.
    2. Pipetować w górę i w dół za pomocą końcówki p200 co 5 minut, przez 20 minut (pięć cykli pipetowania).
    3. Przenieść roztwór do odpowiednich probówek ultrawirówek i wirować w temperaturze 150 000 × g, 4 °C przez 20 minut. Przenieść SN7 do nowej probówki ultrawirówkowej o pojemności 1,5 ml. Osad (P7) zawiera niewielkie ilości niezdepolimeryzowanych mikrotubul. Supernatant (SN7) zawiera wyłącznie zdepolimeryzowane mikrotubule (rozpuszczalna tubulina).
    4. Pobrać 1–4 μl i dodać 9 objętości 2x buforu Laemmli, gotować przez 5 minut i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszych analiz.
    5. Zawiesić osad P7 w BRB80 (ta sama objętość SN7), pobrać 1–4 μl i dodać 9 objętości 2x buforu Laemmli, gotować przez 5 minut i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszych analiz.
    6. Oznaczyć ilościowo ilość tubuliny (patrz wyniki reprezentatywne) i podwielokrotność SN7 na małe objętości, zamrozić błyskawicznie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym celem tej metody jest wyprodukowanie wysokiej jakości, kompetentnej do montażu tubuliny w ilościach wystarczających do przeprowadzenia wielokrotnych eksperymentów in vitro z oczyszczonymi składnikami. Mikrotubule złożone z tej tubuliny mogą być używane w testach rekonstytucji opartych na technice mikroskopii całkowitej fluorescencji wewnętrznej odbicia (TIRF) z dynamicznymi lub stabilnymi mikrotubulami, w eksperymentach testujących dynamikę mikrotubul, interakcje z MAP lub silnikami molekularnymi oraz generowanie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda zapewnia platformę do szybkiego generowania wysokiej jakości, kompetentnej do składania tubuliny w średnich i dużych ilościach z linii komórkowych i pojedynczych mózgów myszy. Opiera się na złotym standardzie oczyszczania tubuliny z mózgów bydlęcych, stosowanym w tej dziedzinie od wielu lat 16,17. Szczególną zaletą tego podejścia jest wykorzystanie kultur zawiesinowych komórek HeLa S3, które po ustaleniu dają duże ilości komórek, a jednocześn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez ANR-10-IDEX-0001-02, LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 oraz Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ jest wspierany przez Instytut Curie, Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR) przyznaje nagrody ANR-12-BSV2-0007 i ANR-17-CE13-0021, grant Institut National du Cancer (INCA) 2014-PL BIO-11-ICR-1 oraz grant Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) DEQ20170336756. MMM jest wspierany przez Fondation Vaincre Alzheimer grant FR-16055p oraz przez France Alzheimer Grant AAP SM 2019 n°2023. JAS był wspierany przez program Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o udzielenie dotacji nr 675737 w ramach działania "Maria Skłodowska-Curie" oraz grant w ramach FRM FDT201904008210. SB otrzymał wsparcie z grantu FRM FDT201805005465.

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Janke, w szczególności J. Souphronowi, a także G. Lakisicowi (Institut MICALIS, AgroParisTech) i A. Gautreau (Ecole Polytechnique) za pomoc podczas tworzenia protokołu. Chcielibyśmy podziękować zwierzętom Instytutu Curie za pomoc w hodowli i opiece nad myszami.

Przeciwciało 12G10, opracowane przez J. Frankela i M. Nelsona, zostało uzyskane z Developmental Studies Hybridoma Bank, opracowanego pod auspicjami NICHD i utrzymywanego przez University of Iowa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1  M MgCl2 Sigma#M1028
1-L naczynia do hodowli komórkowychTechne F7610 Używany do kultur przędzarki. Nigdy nie mieszaj pustych butelek po przędzarce. Gdy butelki z przędzarką znajdują się w inkubatorze do hodowli komórkowych, należy zawsze trzymać boczne zawory butelek z przędzarką lekko otwarte, aby ułatwić zrównoważenie pożywki z inkubatorem" s atmosfera. Po użyciu należy natychmiast napełnić butelki z przędzarką wodą z kranu, aby uniknąć wysuszenia pozostałych komórek na ściankach butelki. Umyj butelki wodą dejonizowaną, dodaj około 200 ml wody dejonizowanej i przeprowadź autoklaw. Pod sterylnym kapturem do hodowli komórkowych usuń wodę i pozostaw butelki do całkowitego wyschnięcia, nadal pod kapturem, przez kilka godzin. Nigdy nie używaj detergentów do czyszczenia butelek z przędzarką, ponieważ wszelkie śladowe ilości detergentu mogą być szkodliwe dla komórek.
Probówki 1,5 i 2 ml Probówki
okrągłodenne 14 ml Sterylne
szalki
15 cm Probówki z nakrętką 15 ml
 Sigma #M31482-merkaptoetanol jest toksyczny i powinien być stosowany pod maską.
Fluorek 4-(2-aminoetylo)-benzenosulfonylu Sigma 
40% akrylamid Bio-Rad #161-0140
Strzykawki 5-, 10-20-ml Sterylne
pipety 5-, 10-ml, 25-ml Probówki
nakrętką 50 ml Nadsiarczan
amonu (APS)Sigma#A3678
Przeciwciało anty-alfa-tubulinowe, 12G10 Opracowany przez J. Frankela i M. Nelsona, uzyskany z Developmental Studies Hybridoma Bank, opracowany pod auspicjami NICHD i utrzymywany przez University of IowaRozcieńczenie: 1/500
Przeciwciało przeciwko glutamylowanej tubulinie, GT335 AdipoGen #AG-20B-0020rozcieńczenie: 1/20 000
Aprotynina Sigma 
Balance (0,1 – 10 g)
Butelki polipropylenowe Beckman 1 l Do zbierania kultur przędzarkowych
Wirówka Beckman Avanti J-26 XP Dozbierania kultur przędzarki
Mieszadło biologiczne Techne MCS-104L Zainstalowany w inkubatorze do hodowli komórkowych (do hodowli spinnerowych), 25 obr./min dla komórek Hela S3 i HEK 293
Bis N,N'-Metyleno-Bis-Akrylamid Bio-Rad #161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®  Do lizy tkanki mózgowej należy użyć sondy 5 mm, z maszyną ustawioną na moc 6 lub 7. Zmiksuj tkankę mózgową 2-3 razy przez 15 s na lodzie.
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma 
Błękit bromofenolowy Sigma #1.08122
Karboksypeptydaza A (CPA)Sigma#C9268Stężenie: 1.7  U/&mikro; l
do hodowli
komórkowych Inkubator do hodowli komórkowych ustawiony na 37° C, 5% CO2
Dimetylosulfotlenek (DMSO)  Sigma #D8418DMSO może zwiększyć przepuszczalność komórek i skóry dla innych związków. Unikać kontaktu i stosować ochronę skóry i oczu.
DMEM średnie Technologie życiowe #41965062
naziemna telewizja cyfrowa, DL-Dithiothreitol Sigma 
EDTAEuromedex#EU0007-C
EGTASigma 
Absolutny etanol Fisher Chemical #E/0650DF/15
Surowica bydlęca płodu (FBS)Sigma 
Francuska prasa ciśnieniowa Thermo electron corporation #FA-078Az ogniwem #FA-032; do lizy dużych ilości komórek. Ustawione na średni stosunek, a ciśnienie manometryczne wynosi 1,000 psi (odpowiada 3,000 psi wewnątrz komory rozrywającej).
Glicerol  Chemikalia VWR #24388.295
GlicynaSigma#G8898
GTP Sigma 
Blok grzewczy Stuart 
Komórki Hela ATCC® CCL-2 i handel;
Ogniwa Hela S3 ATCCATCC® CCL-2.2 i handel;
Kwas solny (HCl)VWR#20252.290
Mikroskop odwrócony Z fluorescencją, jeśli ma być zweryfikowana transfekcja komórek
Izopropanol Firma VWR #20842.298
jetPEIPolyplus #101
Wirnik JLA-8.1000 Do zbierania kultur przędzalniczych
KOH Sigma #P1767KOH jest i powoduje oparzenia; należy stosować ochronę oczu i skóry.
L-glutamina Technologie życiowe #25030123
Wirówka laboratoryjna do probówek 50 mlSigma4-16 K 
Leupeptin Sigma#L2884
Ciekły azot 
Mikropipety p2.5, p10, p20, p100, p200 i p1000 oraz odpowiadające im końcówki
MikrotłuczkiEppendorf#0030 120.973
Tkanka mózgowa myszy Opieka nad zwierzętami i ich użytkowanie w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Wspólnoty Europejskiej (2010/63/UE). Procedury eksperymentalne zostały specjalnie zatwierdzone przez komisję etyczną Instytutu Curie CEEA-IC #118 (autoryzacja nr 04395.03 wydana przez władze krajowe) zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi.
Igły 18G x 1 i frac12; ” (1,2 x 38 mmTerumo#18G
Igły 20G x 1 i frac12; ” (0,9 x 38 mmTerumo#20G
Igły 21G x 4 i frac34; ” (0,8 x 120 mmB.Braun#466 5643
Parafilm
PBS Technologie życiowe #14190169
Penicylina-Streptomycyna Technologie życiowe #15140130
pH-metr
Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)Sigma #P7626proszku PMSF jest niebezpieczny. Podczas przygotowywania roztworów PMSF należy stosować ochronę skóry i oczu.
RURY Sigma 
Rotory do pipet
Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; i TLA 55
SDS-PAGE sprzęt do elektroforezy Bio-Rad 
SDS, Dodecylosiarczan sodu Firma VWR #442444HDo przygotowania bufora Laemmeli 
SDS, Dodecylosiarczan sodu Sigma #L5750Do przygotowania żeli "TUB" SDS-PAGE
Sonicator Branson#101-148-070Służy do lizy komórek hodowanych jako kultury przylegające. Użyj sondy o średnicy 6.5 mm, ustaw sonikator na " Sterowanie wyjściem" 1, " Cykl pracy" 10% i czas w zależności od użytego typu ogniwa.
Wirówka stołowa do probówek 1,5 mlEppendorf5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetrametyloetylenodiamina Sigma#9281
Trichostatyna A (TSA)Sigma#T8552
Triton X-100 Sigma 
Podstawa Trizma (Tris)Sigma 
Trypsyna Life Technologies#15090046
Wirniki ultrawirówek Wirniki TLA-55, TLA-100.3 i 70.1 TiUstawione na 4& C lub 30° C w oparciu o potrzeby eksperymentu 
Probówki do ultrawirówek Beckman#357448 do stosowania z wirnikiem TLA-55
Probówki do ultrawirówek Beckman#349622z wirnikiem TLA-100.3
 Beckman#355631 do stosowania z wirnikiem 70.1 Ti
UltrawirówkiBeckmanOptima L80-XP (lub odpowiednik) i Optima MAX-XP (lub odpowiednik)Ustawione na 4° C lub 30° C w oparciu o potrzeby eksperymentu 
Mieszacz
Łaźnia wodna wyposażona w pływaki lub uchwytyZestaw na 30° C 
hodowlane o średnicy 2-merkaptoetanol#A8456 z #A1153#A7906Kaptur #D9779#E3889#F7524#G8877#SBH130D#P6757#1658001FC#T9284#T1503 do stosowania z probówkami ultrawirówkowymi Vortex na rurki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  3. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  4. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  5. Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
  6. Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
  7. Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
  8. Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
  9. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  10. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  11. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  12. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  13. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  14. Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
  15. Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
  16. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  17. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  18. Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  19. Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
  20. Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
  21. Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
  22. Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
  23. Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
  24. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
  25. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  26. Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
  27. Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
  28. Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18(2020).
  29. Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705(2019).
  30. Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
  31. Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440(2018).
  32. Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
  33. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  34. Magiera, M. M., Janke, C. Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. Correia, J. J., Wilson, L. , Academic Press. 247-267 (2013).
  35. Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
  37. Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
  38. Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
  39. Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
  40. Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
  41. Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie tubulinyizotypy tubulinyhodowle linii kom rkowychlizy m zgu myszyanaliza SDS PAGEanaliza immunoblotbia ka zwi zane z mikrotubulamirekonstrukcja in vitro

Powiązane artykuły