Ilościowy przebieg proteomiki z wykorzystaniem wykrywania białek z ludzkiej tkanki mózgowej w oparciu o monitorowanie wielu reakcji

Podsumowanie

Protokół ma na celu wprowadzenie użycia potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego do monitorowania wielu reakcji (MRM) białek z próbek klinicznych. Zapewniliśmy systematyczny przepływ pracy, począwszy od przygotowania próbki po analizę danych dla próbek klinicznych, z zachowaniem wszystkich niezbędnych środków ostrożności, które należy podjąć.

Streszczenie

Analiza proteomiczna ludzkiej tkanki mózgowej w ciągu ostatniej dekady znacznie poszerzyła nasze zrozumienie mózgu. Jednak zaburzenia związane z mózgiem nadal są głównym czynnikiem przyczyniającym się do zgonów na całym świecie, co wymaga jeszcze lepszego zrozumienia ich patobiologii. Tradycyjne techniki oparte na przeciwciałach, takie jak western blotting lub immunohistochemia, mają niską przepustowość, a ponadto są pracochłonne i jakościowe lub półilościowe. Nawet konwencjonalne podejścia oparte na spektrometrii mas nie dostarczają rozstrzygających dowodów na poparcie pewnej hipotezy. Ukierunkowane podejścia proteomiczne są w dużej mierze oparte na hipotezach i różnią się od konwencjonalnych podejść proteomicznych, które są od dawna stosowane. Monitorowanie wielu reakcji jest jednym z takich ukierunkowanych podejść, które wymaga użycia specjalnego spektrometru masowego zwanego tandemowym kwadrupolowym spektrometrem masowym lub potrójnym kwadrupolowym spektrometrem masowym. W obecnym badaniu systematycznie podkreślaliśmy główne kroki związane z przeprowadzeniem udanego przepływu pracy proteomiki opartej na tandemowej kwadrupolowej spektrometrii mas z wykorzystaniem ludzkiej tkanki mózgowej w celu wprowadzenia tego przepływu pracy do szerszej społeczności badawczej.

Wprowadzenie

W ciągu ostatniej dekady, szybki rozwój spektrometrii mas (MS) w połączeniu z lepszym zrozumieniem technik chromatograficznych znacznie pomógł w rozwoju proteomiki opartej na MS. Techniki oparte na biologii molekularnej, takie jak western blotting i immunohistochemia, od dawna cierpią z powodu problemów z odtwarzalnością, powolnym czasem realizacji, zmiennością między obserwatorami i niezdolnością do dokładnego ilościowego określenia białek, by wymienić tylko kilka. W związku z tym wyjątkowa czułość wysokoprzepustowych podejść proteomicznych nadal oferuje biologom molekularnym alternatywne i bardziej niezawodne narzędzie w ich dążeniu do lepszego zrozumienia roli białek w komórkach. Jednak podejścia proteomiczne typu shotgun (Data Dependent Acquisition lub DDA) często nie wykrywają białek o niskiej obfitości w złożonych tkankach, poza tym, że są w dużym stopniu zależne od czułości i rozdzielczości instrumentu. W ciągu ostatnich kilku lat laboratoria na całym świecie opracowywały techniki takie jak Data Independent Acquisition (DIA), które wymagają zwiększonej mocy obliczeniowej i niezawodnego oprogramowania, które może obsłużyć te bardzo złożone zestawy danych. Jednak te techniki są nadal w toku i nie są zbyt przyjazne dla użytkownika. Ukierunkowane podejścia proteomiczne oparte na stwardnieniu rozsianym zapewniają doskonałą równowagę między wysokoprzepustowym charakterem podejść do stwardnienia rozsianego a czułością podejść biologii molekularnej, takich jak ELISA. Ukierunkowany eksperyment proteomiczny, oparty na spektrometrii mas, koncentruje się na wykrywaniu białek lub peptydów opartych na hipotezach w eksperymentach proteomicznych opartych na odkryciach lub za pośrednictwem dostępnej literatury^1,2. Monitorowanie reakcji wielokrotnych (MRM) jest jednym z takich ukierunkowanych podejść MS, które wykorzystuje tandemowy kwadrupolowy spektrometr masowy do dokładnego wykrywania i kwantyfikacji białek/peptydów ze złożonych próbek. Technika ta oferuje wyższą czułość i swoistość, mimo że wymaga użycia instrumentu o niskiej rozdzielczości.

Kwadrupol składa się z 4 równoległych prętów, z których każdy jest połączony z przeciwległym prętem po przekątnej. Między prętami kwadrupolowymi powstaje zmienne pole poprzez przyłożenie zmiennych napięć RF i DC. Na trajektorię jonów wewnątrz kwadrupola wpływa obecność tych samych napięć na przeciwległych prętach. Przykładając RF do napięcia stałego, można ustabilizować trajektorię jonów. To właśnie ta właściwość kwadrupola pozwala na stosowanie go jako filtra masowego, który może selektywnie przepuszczać określone jony. W zależności od potrzeb kwadrupol może pracować zarówno w trybie statycznym, jak i skanowania. Tryb statyczny przepuszcza tylko jony o określonym m/z, co sprawia, że tryb jest wysoce selektywny i specyficzny dla jonu będącego przedmiotem zainteresowania. Z drugiej strony tryb skanowania umożliwia przechodzenie jonów w całym zakresie m/z. Tak więc tandemowe kwadrupolowe spektrometry masowe mogą działać na 4 możliwe sposoby: i) pierwszy kwadrupol pracuje w trybie statycznym, a drugi w trybie skanowania; ii) pierwszy kwadrupol pracujący w trybie skanowania, natomiast drugi pracujący w trybie statycznym; iii) obie kwadrupole pracujące w trybie skanowania; oraz iv) oba kwadrupole działające w trybie statycznym³. W typowym eksperymencie MRM obie kwadrupole działają w trybie statycznym, co pozwala na monitorowanie określonych prekursorów i powstałych przez nie produktów po rozdrobnieniu. To sprawia, że technika ta jest bardzo czuła i selektywna, co pozwala na dokładną kwantyfikację.

Dla biologów molekularnych ludzka tkanka mózgowa i jej komórki są skarbnicą. Te niezwykłe jednostki zawsze interesującego narządu ludzkiego ciała mogą dostarczyć molekularnego i komórkowego wglądu w jego funkcjonowanie. Badania proteomiczne tkanki mózgowej mogą nie tylko pomóc nam zrozumieć systemowe funkcjonowanie zdrowego mózgu, ale także szlaki komórkowe, które ulegają rozregulowaniu, gdy są spowodowane jakąś chorobą⁴. Jednak tkanka mózgowa z całą swoją niejednorodnością jest bardzo złożonym narządem do analizy i wymaga skoordynowanego podejścia w celu lepszego zrozumienia zmian na poziomie molekularnym. Poniższa praca opisuje cały proces pracy, począwszy od ekstrakcji białek z tkanki mózgowej, tworzenia i optymalizacji metod oznaczania MRM, aż po walidację celów (Rysunek 1). W tym miejscu systematycznie podkreślaliśmy główne kroki związane z udanym eksperymentem opartym na MRM z wykorzystaniem ludzkiej tkanki mózgowej w celu przedstawienia tej techniki i związanych z nią wyzwań szerszej społeczności badawczej.

Protokół

To badanie obejmuje próbki tkanki mózgowej od uczestników, sprawdzone i zatwierdzone przez TMH i IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Uczestnicy wyrazili świadomą i pisemną zgodę na udział w tym badaniu.

1 Ekstrakcja białka z tkanki mózgowej

1. Zważyć około 50 mg tkanki mózgowej i przemyć ją 300 μl 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) za pomocą mikropipety.
   UWAGA: Ten krok jest wykonywany w celu usunięcia krwi z zewnętrznej powierzchni tkanki i należy go powtórzyć w razie potrzeby. Wskazane jest usunięcie jak największej ilości krwi z tkanki, ponieważ zakłóca to ocenę i przetwarzanie białek w dalszej kolejności.
2. Po przemyciu PBS dodać 300 μl buforu do lizy (buforu A) do probówki zawierającej tkankę. Bufor A zawiera 8 M mocznika, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl₂ i koktajl inhibitorów proteazy (zgodnie z instrukcjami producenta).
   UWAGA: Wydajność białka różni się w zależności od kilku czynników, począwszy od warunków, w jakich próbki są przechowywane, ilości materiału wyjściowego i efektywności obchodzenia się z próbkami podczas przetwarzania. Proporcjonalnie zmniejszyć objętość buforu A podczas pracy z ilością tkanki mniejszą niż 50 mg.
3. Zneutralizować tkankę za pomocą sonografu sondowego, trzymając probówkę w łaźni lodowej. Użyj następujących parametrów do sonikacji: 40% amplituda, 5 sekund cyklu włączania i wyłączania przez 2:30 min.
4. Kontynuuj homogenizację tkanek za pomocą ubijaka do kulek, aby całkowicie zlizować tkankę.
   UWAGA: Ten krok należy wykonywać ze średnią prędkością przez 90 sekund, a następnie inkubować na lodzie przez 3-5 minut.
5. Odwirować zawartość probówki o stężeniu 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do świeżej probówki i jednorodnie wymieszać.
   UWAGA: Pobrać porcje próbki i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia.

2 Kwantyfikacja białka i kontrola jakości

1. Określić ilościowo próbki przed mineralizacją, korzystając ze standardowego wykresu wykonanego ze znanymi stężeniami BSA.
   UWAGA: Upewnij się, że test używany do oznaczania białka jest zgodny z buforem używanym do wytwarzania lizatu białkowego. Sprawdź jakość lizatu białkowego, uruchamiając żel SDS-PAGE.

3 Trawienie białka

1. Weź 50 μg białka do probówki mikrowirówkowej i zredukuj białka, dodając Tris 2-karboksyetylofosfinę (TCEP) tak, aby końcowe stężenie wynosiło 20 mM. Inkubować zawartość w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
2. Po inkubacji alkilować zredukowane białka poprzez dodanie jodoacetamidu (IAA) do probówki tak, aby jego końcowe stężenie wynosiło 40 mM. Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut.
   UWAGA: Przygotuj IAA na świeżo tuż przed dodaniem go do tuby.
3. Dodać bufor B do probówki zawierającej zredukowane i alkilowane białka tak, aby końcowe stężenie mocznika w probówce było mniejsze niż 1 M.
   UWAGA: Bufor B składa się z 25 mM Tris (pH 8,0) i 1 mM CaCl₂ i służy do rozcieńczania próbek. Po rozcieńczeniu upewnić się, że zawartość probówki ma pH 8 dla optymalnego trawienia białka po dodaniu trypsyny.
4. Dodać trypsynę w stosunku enzymu do białka w stosunku 1:30 i inkubować probówki przez noc w temperaturze 37 °C, ciągle wstrząsając.
5. Po roztrawieniu skoncentrować strawiony produkt w koncentratorze próżniowym. Na tym etapie peptydy mogą być albo odtworzone i odsolone, albo przechowywane w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

4 Odsalanie i kwantyfikacja peptydów

UWAGA: Odsalanie lub czyszczenie peptydów jest niezbędne przed załadowaniem próbek do LC-MS/MS. Sole i inne zanieczyszczenia w próbce mogą zatkać kolumny i spowodować uszkodzenie instrumentu. Proces ten można przeprowadzić za pomocą dostępnych na rynku końcówek lub kolumn C18.

1. Aktywuj końcówkę stopnia za pomocą 20 μl 50% acetonitrylu (ACN) w 0,1% kwasie mrówkowym (FA). Odwirować zawartość przy 1 000 x g przez 1 minutę i odrzucić przepływ.
   UWAGA: Warunki wirowania są takie same do końca procedury.
2. Dodać 20 μl 100% ACN w 0,1% FA i odwirować zawartość jak w kroku 4.1.
   UWAGA: Kroki aktywacji można powtórzyć kilka razy.
3. Po aktywacji przepuścić 20 μl odtworzonej próbki peptydu przez końcówkę sceny, a następnie odwirować zgodnie z czynnością opisaną w kroku 4.1.
   UWAGA: Nie odrzucaj przepływu na tym etapie.
4. Powtórz krok 4.3 z przepływem co najmniej 5 razy, aby zapewnić maksymalne wiązanie peptydu z końcówką etapu.
5. Przepuścić 20 μl 0,1% FA przez końcówkę sceny, a przepływ odrzucić przez.
   UWAGA: Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, aby uzyskać lepsze wyniki.
6. Eluować związane peptydy w świeżej probówce do mikrofuge, przepuszczając rosnące stężenia ACN, tj. odpowiednio 40%, 60% i 80%.
7. Wysuszyć peptydy w koncentratorze próżniowym i przystąpić do oznaczania ilościowego peptydów.
8. Rozpuść wysuszone peptydy w 0,1% FA i określ ilościowo za pomocą metody Scopes⁵.

5 Przygotowanie listy przejść dla sfinalizowanych celów

UWAGA: Przejście odnosi się do pary prekursorów (Q1) do wartości produktu (Q3) m/z w eksperymencie MRM. Peptyd może mieć od jednego do wielu przejść, z tą samą wartością Q1, ale różnymi wartościami Q3. Spektrometr masowy z potrójnym kwadrupolem wymaga informacji o przejściach peptydów i ich produktów, które mają zostać wykryte. Dlatego przed rozpoczęciem ukierunkowanego eksperymentu należy przygotować listę przejść. Można to zrobić za pomocą internetowego repozytorium SRMAtlas⁶ (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) lub oprogramowania open source o nazwie Skyline⁷ (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).

1. Pobierz najnowszy plik FASTA ludzkiego proteomu z UniProt (https://www.uniprot.org/) i utwórz plik proteomu w tle, wstawiając go do Skyline. W ustawieniach peptydów przejdź do listy rozwijanej Proteom w tle i kliknij Dodaj. Podaj plik sekwencji FASTA ludzkiego proteomu. Upewnij się, że ta baza danych jest wybrana, a dozwolona wartość pominiętego rozszczepienia jest ustawiona na 0 przed przejściem do następnego kroku.
2. Teraz w zakładce Filtr w Ustawieniach peptydów ogranicz długość akceptowanych peptydów od 8 do 25 aminokwasów.
3. W Ustawieniach przejścia, na karcie Filtr, ustaw Ładunki prekursora na 2,3, ustaw Ładunki jonowe na 1 i ustaw Typy jonów na y. Jony produktu można wybrać w zależności od wyboru użytkownika. Wybierz N-terminal do proliny dla jonów specjalnych i pozostaw wszystkie inne parametry jako domyślne.
   UWAGA: Ustawienia peptydu i przejścia mogą się różnić w zależności od eksperymentu.
4. Wstaw interesujące Cię peptydy lub białka, klikając Edytuj i przechodząc do Wstaw. Aby wstawić białka, skopiuj ich identyfikatory dostępu, a aby wstawić określone peptydy, skopiuj sekwencje peptydowe. Oprogramowanie mapuje identyfikatory dostępu do proteomu tła, a lista przejść jest tworzona na podstawie ustawień peptydu i przejścia.
5. Wyeksportuj listę przejść. Upewnij się, że z listy rozwijanej Typ instrumentu wybrano odpowiedni instrument. W przypadku eksperymentów optymalizacyjnych można podzielić listy przejść na mniejsze liczby, ustawiając żądaną liczbę przejść na plik w Skyline. Zapewni to, że instrument nie zostanie przeciążony przez przesiewanie zbyt wielu przejść w jednym przebiegu. Liczba przejść musi być dodatkowo zoptymalizowana, aby uzyskać pojedynczą metodę - wspominamy o tym w dalszej części sekcji dotyczącej udoskonalania metody.

6 parametrów LC

1. Stosować dwuskładnikowy system rozpuszczalników z rozpuszczalnikiem wodnym zawierającym 0,1% FA (rozpuszczalnik A) i rozpuszczalnikiem organicznym zawierającym 80% ACN (rozpuszczalnik B).
2. Ustaw temperaturę kolumny na 45 °C.
3. Ustawić gradient LC 10 min przy natężeniu przepływu 450 μl/min (jak pokazano w tabeli S1).

7 parametrów MS

UWAGA: Opisany test został opracowany i zoptymalizowany dla spektrometru masowego TSQ Altis Triple Quadrupol

.

1. Optymalizuj parametry przebiegów, takie jak rozdzielczość Q1 i Q3, czas przebywania i czas cyklu - jeden parametr na raz. Uważamy, że rozdzielczość 0,7 dla Q1 i Q3 działa najlepiej. Czas cyklu lub czas przebywania może wymagać dostosowania w zależności od liczby przejść i średniej szerokości pików monitorowanych peptydów.
2. Użyj parametrów MS w tabeli S2 i tabeli S3. Całkowity czas trwania metody wynosi 10 min.
   UWAGA: Parametry pozostają takie same dla wszystkich przebiegów w trakcie i po uściśleniu metody, chyba że zaznaczono inaczej. W przypadku nowego eksperymentu może zaistnieć potrzeba zmiany niektórych parametrów w zależności od rodzaju próbki i etapów przetwarzania próbki.

8 Uruchom sekwencję i kontrolę jakości instrumentu

1. Przygotuj mieszaninę wody: metanol: izopropanol: acetonitryl w stosunku 1:1:1:1. Użyj tej mieszaniny jako pustego miejsca.
2. Przygotuj peptydy dla dowolnej próbki wzorcowej, które można wykorzystać do konsekwentnego monitorowania wydajności urządzenia. Zostanie to wykorzystane jako standard kontroli jakości. Wykrywamy peptydy z trawienek BSA, które zostały zoptymalizowane i dają dobrą i spójną odpowiedź przez kilka dni (Rysunek 2).
3. Aby uruchomić próbki, sekwencja powinna zaczynać się od kilku ślepych prób, a następnie standardu kontroli jakości i próbek klinicznych. Zawsze upewnij się, że między dwiema kolejnymi próbkami znajduje się jedna ślepa próba.
4. Aby ułatwić porównanie, należy upewnić się, że za każdym razem wstrzykiwane są równe ilości i objętości każdej próbki.

9 Udoskonalenie metody

1. Przeanalizuj wstępne dane uzyskane z połączonych próbek za pomocą Skyline. Poszukaj odpowiedniego szczytu, przejść i parametrów, takich jak kształt i intensywność szczytu, aby wybrać najlepsze wyniki. Zapisz plik jako nowy projekt Skyline.
2. Użyj biblioteki, aby znaleźć najlepiej pasujący szczyt, a co za tym idzie, zalecana jest najlepsza możliwa lista przejść. Biblioteka to zestaw pików MS/MS dostępnych w literaturze lub eksperymentach wewnętrznych.
3. Wyeksportuj nową listę przejść z nowo zapisanego projektu Skyline i użyj tej listy przejść, aby utworzyć nową metodę. Pozyskaj dane z nowo utworzonej metody i powtórz proces udoskonalania przejść za pomocą Skyline.
4. Gdy lista peptydów i przejść zostanie sfinalizowana po analizie danych za pomocą Skyline, dostosuj metodę, wypróbowując różne permutacje czasu cyklu i czasu przebywania.
   UWAGA: Zastosowanie ciężkich, znakowanych syntetycznych peptydów i peptydów o indeksowanym czasie retencji (iRT) ułatwia udoskonalanie metody^{8, 9}. Dlatego zaleca się, aby precyzyjne dostrojenie metody było wykonywane przy użyciu tych peptydów.
5. Korzystając z informacji o czasie przechowywania z eksperymentów uściślania, utwórz ostateczną metodę, która jest zaplanowana (ze zdefiniowanym oknem pozyskiwania).
6. Przygotuj próbki dla poszczególnych tematów. Dane dla tych próbek zostaną pozyskane przy użyciu ostatecznej zaplanowanej metody.
7. Po uzyskaniu danych można przeprowadzić dalszą analizę i porównanie grupowe, importując surowe pliki do Skyline.

Wyniki

Przeprowadziliśmy względną kwantyfikację 3 białek z 10 próbek, po 5 próbek z każdej grupy pacjentów z nieprawidłowościami w mózgu. Białka te obejmowały apolipoproteinę A-I (APOA-I), wimentynę (VIM) i fosforybozylotransferazę nikotynamidu (NAMPT), o których wiadomo, że pełnią różne role w komórkach mózgowych. Analiza danych po uruchomieniu została przeprowadzona przy użyciu Skyline-daily (wer. 20.2.1.286). Monitorowano łącznie 10 peptydów odpowiadających 3 białkom. Obejmowały one 3 peptydy dla APOA-I, 4 peptydy dla VIM i ...

Dyskusja

Techniki takie jak immunohistochemia i Western blotting przez wiele lat były uważane za złote standardy walidacji docelowych białek. Metody te znajdują zastosowanie nawet dzisiaj, z niewielkimi modyfikacjami protokołu i niewielką zależnością od technologii, co czyni je bardzo kłopotliwymi i żmudnymi. Poza tym wiążą się one również z zastosowaniem drogich przeciwciał, które nie zawsze wykazują taką samą swoistość we wszystkich partiach i wymagają dużej wiedzy specjalistycznej. Ponadto tylko niewielka część białek zidentyf...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
Acetonitryl (klasa MS)	Fisher Scientific	A/0620/21
Albumina surowicy bydlęcej	HiMedia	TC194-25G
Chlorek wapnia	Fischer Sicific	BP510-500
Kwas mrówkowy (klasa MS)	Fisher Scientific	147930250
Jodoacetamid	Sigma	1149-25G
Izopropanol (klasa MS)	Fisher Scientific	Q13827
Chlorek magnezu	Fischer Scienific	BP214-500
Metanol (klasa MS)	Fisher Scientific	A456-4
Woda klasy MS	Pierce	51140
Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna	HiMedia	TL1006-500ML
Koktajl inhibitorów proteazy	Roche Diagnostics	11873580001
Chlorek sodu	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsyna (klasa MS)	Pierce	90058
Mocznik	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 kolumna	Thermo	25002-102130
Mikropipety	Gilson	F167380
Stage	MilliPore	ZTC18M008
Kulki cyrkonowe/krzemionkowe	Produkty BioSpec	11079110z
Equipment
Bead bijak (homogenizator)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Czytnik mikropłytek (spektrofotometr)	Termo	MultiSkan Go
pH-metr	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Wytrząsający Drybath	Thermo	88880028
Spektrometr masowy TSQ Altis	Thermo	TSQ02-10002
uHPLC - Vanquish	Thermo	VQF01-20001
Koncentrator próżni	Thermo	Savant ISS 110