Artykuł metodologiczny

Karmienie i ilościowe oznaczanie krwi pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków u komarów Aedes aegypti

10.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61835

⸱

22 października 2020

 ,  ,  , 
1Laboratory of Neurogenetics and Behavior, The Rockefeller University, 2Department of Biological Sciences, Columbia University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest dostarczanie komarom Aedes aegypti pokarmów pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków z krwi za pomocą sztucznego karmnika membranowego i precyzyjne określenie ilościowe ilości spożytego posiłku.

Streszczenie

Samice niektórych gatunków komarów mogą przenosić choroby podczas gryzienia kręgowców, aby uzyskać bogate w białko posiłki z krwi, niezbędne do rozwoju jaj. W laboratorium naukowcy mogą dostarczać komarom sztuczne posiłki z krwi pochodzenia zwierzęcego za pomocą karmników membranowych, które pozwalają na manipulowanie składem posiłków. W tym miejscu przedstawiamy metody podawania komarom Aedes aegypti krwi krwi i sztucznych posiłków z krwi oraz ilościowego określania objętości spożywanej przez poszczególne samice.

Ukierunkowane karmienie i kwantyfikacja posiłków sztucznych/krwistych mają szerokie zastosowanie, w tym testowanie wpływu składników posiłku na zachowanie i fizjologię komarów, dostarczanie związków farmakologicznych bez wstrzykiwań i infekowanie komarów określonymi patogenami. Dodanie barwnika fluoresceinowego do posiłku przed karmieniem pozwala na późniejsze określenie ilościowe wielkości posiłku. Objętość posiłku spożywanego przez komary może być mierzona albo na podstawie masy, jeśli samice mają być później wykorzystane do eksperymentów behawioralnych, albo poprzez homogenizację pojedynczych samic na 96-dołkowych płytkach i pomiar poziomu fluorescencji za pomocą czytnika płytek jako testu końcowego. Kwantyfikacja wielkości posiłku może być wykorzystana do określenia, czy zmiana składników posiłku zmienia objętość spożywanego posiłku, czy też spożycie posiłku różni się w zależności od szczepu komarów. Precyzyjna kwantyfikacja wielkości posiłku ma również kluczowe znaczenie dla dalszych testów, takich jak te, które mierzą wpływ na przyciąganie lub płodność żywiciela. Przedstawione tutaj metody mogą być dalej dostosowywane do śledzenia trawienia posiłków w ciągu dni lub do włączenia wielu rozróżnialnych markerów dodawanych do różnych posiłków (takich jak nektar i krew) w celu ilościowego określenia spożycia każdego posiłku przez jednego komara.

Te metody pozwalają badaczom samodzielnie przeprowadzać pomiary o wysokiej przepustowości w celu porównania objętości posiłku spożywanego przez setki pojedynczych komarów. Narzędzia te będą zatem szeroko przydatne dla społeczności badaczy komarów w celu uzyskania odpowiedzi na różne pytania biologiczne.

Wprowadzenie

Przedstawiamy protokół podawania komarom Aedes aegypti zmodyfikowanych posiłków z krwi za pomocą karmnika z sztuczną membraną i precyzyjnego pomiaru objętości posiłku spożywanego przez każdego komara. Protokół ten może być elastycznie dostosowywany w celu zmiany zawartości posiłku lub porównania objętości posiłku spożywanego przez różne eksperymentalne grupy komarów.

Komar Ae. aegypti zagraża globalnemu zdrowiu, rozprzestrzeniając patogeny wywołujące choroby, w tym żółtą febrę, dengę, chikungunyę i Zika1,2,3,4,5. Samice Ae. aegypti są obowiązkowymi żywicielami krwi; Muszą spożywać krew kręgowców, aby uzyskać białko niezbędne do rozwoju jaj, a każde lęg jaj wymaga pełnego posiłku z krwi od co najmniej jednego gospodarza6,7,8. Samica komara najpierw gryzie swojego żywiciela, przebijając skórę swoim styletem i wstrzykując ślinę, która zawiera związki wywołujące odpowiedź immunologiczną gospodarza9. Następnie karmi się, pompując krew przez stylik do jelita środkowego. Podczas spożywania posiłku z krwi zakażonego żywiciela może ona połknąć patogeny przenoszone przez krew6,8, które następnie migrują z jelita środkowego komara do jego gruczołów ślinowych10. Samice komarów zarażone w ten sposób mogą rozprzestrzeniać chorobę poprzez wstrzykiwanie patogenów wraz ze śliną podczas gryzienia kolejnych gospodarzy11,12. Zrozumienie i ilościowe określenie mechanizmów zachowań związanych z odżywianiem się krwią jest kluczowym krokiem w kontrolowaniu przenoszenia chorób przenoszonych przez komary.

Wiele protokołów laboratoryjnych dotyczących hodowli komarów i eksperymentów wykorzystuje żywe zwierzęta, w tym myszy, świnki morskie lub ludzi, jako źródło krwi13,14,15,16. Wykorzystywanie żywych zwierząt wiąże się z problemami etycznymi, a także złożonymi wymaganiami dotyczącymi szkolenia personelu, trzymania i opieki nad zwierzętami oraz zgodności z polityką Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania (IACUC). Ogranicza również rodzaje związków, które mogą być dostarczane komarom, co ogranicza badania, które można przeprowadzić17.

Sztuczne urządzenia do podawania krwi, które zazwyczaj używają systemu membranowego do symulacji skóry gospodarza, są użytecznymi narzędziami do badania zachowań związanych z karmieniem krwią, które omijają potrzebę utrzymywania żywych gospodarzy. Krew pełną można kupić u wielu sprzedawców i karmić komary za pomocą podgrzewanych, sztucznych karmników membranowych z płaszczem wodnym lub podobnych urządzeń18,19. W tym protokole demonstrujemy użycie małych, jednorazowych podajników membranowych zwanych "glirurkami". Ten podajnik membranowy, wcześniej opublikowany przez Costa-da-Silva et al. (2013)20, można łatwo zmontować ze standardowego sprzętu laboratoryjnego, dzięki czemu idealnie nadaje się do dostarczania posiłków z krwi umiarkowanej liczbie komarów i można go łatwo skalować w celu testowania większych grup lub wielu preparatów posiłków. Glytube jest niedrogą i wydajną alternatywą dla innych komercyjnych sztucznych karmników, które mogą wymagać większych objętości posiłków i są bardziej odpowiednie do grupowego karmienia dużych grup komarów na jednym posiłku formulation21.

Ten protokół zawiera dwie sekcje: przygotowywanie/dostarczanie sztucznych posiłków i ilościowe określanie konsumpcji. W pierwszej sekcji glirurki są używane jako skuteczny środek do dostarczania zmanipulowanej diety. Krew pełna może być zastąpiona całkowicie sztucznym posiłkiem w celu porównania skutków substytutów krwi zamiast mączki z krwi. Przepis zaczerpnięty z Kogan (1990)22 jest tutaj przedstawiony, chociaż opracowano wiele receptur sztucznych posiłków23,24. Ponadto karmienie jest mniej inwazyjną i mniej pracochłonną metodą wprowadzania związków farmakologicznych niż iniekcja. Ze względu na niewielką całkowitą objętość wymaganą do każdego posiłku (1–2 ml), protokół ten stanowi atrakcyjną metodę dostarczania w celu zmniejszenia ilości drogich odczynników. Samice Ae. aegypti chętnie spożywają bezbiałkowe posiłki z roztworem soli fizjologicznej z adenozyno-5′-trifosforanem (ATP)25,26, co stanowi punkt odniesienia do pomiaru wpływu pojedynczych składników posiłku. Na przykład receptor podobny do neuropeptydu Y 7 (NPYLR7) w Ae. aegypti jest znany z tego, że pośredniczy w supresji poszukiwania gospodarza po bogatym w białko posiłku z krwi, a gdy agoniści NPYLR7 są dodawani do bezbiałkowego posiłku solnego, samice komarów wykazują supresję poszukiwania żywiciela podobną do tych, które spożywały krew pełną7.

W drugiej sekcji przedstawiono kroki do ilościowego określania objętości każdego posiłku spożywanego przez pojedynczą samicę komara. Test ten jest oparty na fluorescencji i rejestruje stan karmienia w wyższej rozdzielczości niż metody, w których samice są klasyfikowane jako "karmione" lub "niekarmione" na podstawie samej wizualnej oceny wzdęcia brzucha. Dodając fluoresceinę do posiłku przed karmieniem, objętości posiłków spożywanych przez osobniki można określić ilościowo poprzez homogenizację każdego komara na 96-dołkowej płytce i pomiar intensywności fluorescencji jako odczyt. Test ten może mierzyć różnice w wigorze karmienia w odpowiedzi na zmienne, takie jak skład posiłku lub tło genetyczne komarów. Precyzyjna kwantyfikacja ma kluczowe znaczenie dla posiłków o średniej wielkości, na przykład, gdy samicom podaje się nieoptymalne posiłki zawierające środki odstraszające od karmienia lub gdy spożywają posiłki z sacharozy o różnych rozmiarach27. Jeśli karmione komary są wymagane do kolejnych testów behawioralnych po ilościowym określeniu wielkości posiłku, wielkość posiłku można zamiast tego obliczyć, ważąc znieczulone samice w grupach i szacując średnią zwiększoną masę na osobnika. Chociaż znakowanie fluoresceiną jest mniej precyzyjne niż oznaczanie fluoresceiną, ważenie nadal zapewnia zagregowane oszacowanie objętości posiłku i umożliwia zbadanie wpływu posiłku na dalsze procesy, takie jak płodność lub późniejsze przyciąganie gospodarza. Chociaż wielkość mączki z krwi jest zmienna i może na nią wpływać niezliczona ilość czynników11,28,29, spożywane posiłki mierzone za pomocą opisanych tutaj metod są zgodne z poprzednimi ocenami ilościowymi7,30,31.

Protokół

Procedury karmienia krwią nie były wykonywane przy użyciu żywych zwierząt lub ludzkich gospodarzy i były zgodne z wytycznymi ustalonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Rockefellera (IACUC) oraz Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB).

1. Przygotowanie posiłku

  1. Przygotowanie fagostymulantu, 5′-trifosforanu adenozyny
    1. Przygotować 25 mM roztwór wodnego roztworuNaHCO3 (masa cząsteczkowa, MW = 84,006 g/mol). Na 100 ml 25 mM NaHCO3 dodać 210 mg NaHCO3 do kolby miarowej i napełnić wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) do całkowitej objętości 100 ml. Za pomocą mieszadła magnetycznego dokładnie wymieszaj roztwór, aż cały NaHCO3 się rozpuści.
    2. Rozpuść ATP sól disodową hydrat (MW = 551,14 g/mol) w roztworze wodnym 25 mMNaHCO3 do końcowego stężenia 200 mM ATP. Aby uzyskać całkowitą objętość 10 ml 200 mM ATP w 25 mM buforze NaHCO3, dodać 1,1 g hydratu soli disodowej ATP do kolby miarowej i napełnić 25 mM buforem NaHCO3 do całkowitej objętości 10 ml. Za pomocą mieszadła magnetycznego dokładnie wymieszaj roztwór, aż całe ATP się rozpuści.
      UWAGA: Aby zminimalizować hydrolizę ATP, musi on być buforowany roztworem soli, takim jak NaHCO3.
    3. Porcjować roztwór ATP i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Ten podstawowy roztwór ATP jest zwykle przygotowywany na świeżo co sześć miesięcy i jest stosowany do wszystkich posiłków opisanych poniżej. Aby zapobiec degradacji, podwielokrotności ATP nie powinny być poddawane wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania ani podgrzewane wraz z innymi składnikami mączki.
  2. Przygotowanie fluorescencyjnego roztworu znacznikowego, fluoresceiny
    1. Przygotować 2% (w/v) roztwór podstawowy wodnego roztworu fluoresceiny. Aby uzyskać całkowitą objętość roztworu podstawowego wynoszącą 10 ml, zmieszać 0,2 g soli disodowej fluoresceiny z 10 ml ddH2O w stożkowej probówce o pojemności 15 ml owiniętej folią aluminiową w temperaturze pokojowej. Ten podstawowy roztwór fluoresceiny może być stosowany do rozcieńczania we wszystkich posiłkach opisanych poniżej.
      UWAGA: Ponieważ fluoresceina jest wrażliwa na światło, unikaj ekspozycji na światło, owijając pojemniki folią aluminiową.
  3. Przygotowanie mączek z krwi pochodzenia zwierzęcego
    1. Oblicz liczbę posiłków potrzebnych do nakarmienia wszystkich komarów; każda glituba zawiera 2 ml posiłku i karmi około 25 komarów. Przygotuj jeden dodatkowy posiłek, aby skalibrować krzywą wzorcową dla odczytów fluorescencji. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie kroki w tej sekcji opisują ilości odczynników wymagane do przygotowania jednego posiłku o końcowej objętości 2 ml.
    2. W przypadku posiłków z krwi pochodzenia zwierzęcego przenieś 1,98–2 ml zdefibrynowanej krwi owczej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml (patrz krok 3.3, aby uzyskać żądaną objętość krwi).
      UWAGA: Można używać komercyjnie zdefibrynowanych źródeł krwi kręgowców, w tym od owiec, świnek morskich i ludzi13. Przed użyciem należy upewnić się, że zakupiona krew nie przekroczyła terminu ważności i dobrze ją wymieszać, odwracając butelkę, zwłaszcza jeśli widoczne jest oddzielenie składników krwi.
    3. Aby zapewnić optymalne karmienie, należy dodać ATP do końcowego stężenia 1–2 mM po podgrzaniu krwi owcy do 45 °C w łaźni wodnej. Aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM ATP, dodaj 10 μl 200 mM roztworu podstawowego ATP do 1,99 ml wstępnie podgrzanej krwi i wymieszaj. Aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM ATP, dodaj 20 μl 200 mM zapasu ATP do 1,98 ml wstępnie podgrzanej krwi i wymieszaj. Jeśli nie ma być dodawany ATP, należy ogrzać 2 ml zdefibrynowanej krwi owczej.
    4. Jeśli następnie ma być przeprowadzone ilościowe oznaczanie wielkości posiłku na podstawie fluorescencji, należy dodać roztwór fluoresceiny do końcowego stężenia 0,002% (2 μl 2% bulionu fluoresceiny w 2 ml całkowitej objętości posiłku). Zmniejszyć objętość krwi o taką samą ilość, jaką dodaje fluoresceina. Zachować 1 ml preparatu końcowego posiłku zawierającego 0,002% fluoresceiny, aby wygenerować referencyjną krzywą wzorcową. Zatrzymaną objętość należy traktować identycznie jak mączkę dostarczaną komarom; Wystaw się na te same warunki świetlne i temperaturowe przez cały czas trwania eksperymentu, a następnie zamroź to wraz z dostarczonym posiłkiem.
  4. Przygotowanie sztucznych posiłków z krwi
    1. Oblicz liczbę posiłków potrzebnych do nakarmienia wszystkich komarów; każda glituba zawiera 2 ml posiłku i karmi około 25 komarów. Przygotuj jeden dodatkowy posiłek, aby skalibrować krzywą wzorcową dla odczytów fluorescencji. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie kroki w tej sekcji opisują ilości odczynników wymagane do przygotowania jednego posiłku o pojemności 2 ml.
    2. Aby przygotować sztuczną krew (zaadaptowaną z Kogan (1990)22), jak w Tabeli 1, najpierw przygotuj roztwór podstawowy 400 mM NaHCO3. Dla całkowitej objętości 10 ml 400 mMNaHCO3 (MW = 84,006 g/mol), dodać 336 mgNaHCO3 do kolby miarowej i napełnić wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) do całkowitej objętości 10 ml. Za pomocą mieszadła magnetycznego dokładnie wymieszaj roztwór, aż cały NaHCO3 się rozpuści.
    3. Dla składników białkowych sztucznej krwi należy przygotować roztwory podstawowe 50 mg/ml γ-globulin w 400 mM NaHCO3, 35 mg/ml hemoglobiny w ddH2O i 300 mg/ml albuminy w ddH2O. Roztwory podstawowe białek można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy. Końcowe stężenie wszystkich białek ludzkich w sztucznej krwi wynosi 125 mg/ml. Obejmuje to końcowe stężenia 15 mg/ml γ-globulin, 8 mg/ml hemoglobiny i 102 mg/ml albuminy.
    4. Na każde 2 ml posiłku połącz 600 μl γ-globulin, 460 μl hemoglobiny, 680 μl albuminy i 250 μl ddH2O z roztworów podstawowych wymienionych w tabeli 1. Odczekać z dodaniem 10 μl 200 mM roztworu podstawowego ATP do momentu ogrzania posiłku do temperatury 45 °C, bezpośrednio przed podaniem posiłku.
    5. Jeśli następnie ma być przeprowadzone ilościowe oznaczanie wielkości posiłku na podstawie fluorescencji, należy dodać roztwór fluoresceiny do końcowego stężenia 0,002% (2 μl 2% bulionu fluoresceiny w 2 ml całkowitej objętości posiłku). Zmniejszyć objętość ddH2O w kroku 4.4 o taką samą ilość, jaką dodaje fluoresceina. Zachować co najmniej 1 ml końcowej formuły posiłku zawierającej 0,002% fluoresceiny w celu wygenerowania wzorcowej krzywej odniesienia. Zatrzymaną objętość należy traktować identycznie jak mączkę dostarczaną komarom; Wystaw się na te same warunki świetlne i temperaturowe przez cały czas trwania eksperymentu, a następnie zamroź to wraz z dostarczonym posiłkiem.
  5. Przygotowanie przykładowych bezbiałkowych posiłków solankowych (na podstawie Duvall et al. (2019)7)
    UWAGA: Bezbiałkowe posiłki solankowe można przygotowywać na wiele sposobów7,27,32. Prezentowany tutaj posiłek solankowy jest bezbiałkową wersją opisanej powyżej receptury sztucznej krwi.
    1. Oblicz liczbę posiłków potrzebnych do nakarmienia wszystkich komarów; każda rurka glikulki zawiera 2 ml posiłku i karmi około 25 komarów Przygotuj jeden dodatkowy posiłek, aby skalibrować krzywą wzorcową do pomiarów fluorescencji. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie kroki w tej sekcji opisują ilości odczynników wymagane do przygotowania jednego posiłku o pojemności 2 ml.
    2. Aby przygotować mączkę z soli fizjologicznej, przygotuj roztwór podstawowy 400 mM NaHCO3. Dla całkowitej objętości 10 ml 400 mM NaHCO3 (MW = 84,006 g/mol), dodać 336 mg NaHCO3 do kolby miarowej i napełnić ddH2O do całkowitej objętości 10 ml. Za pomocą mieszadła magnetycznego dokładnie wymieszaj roztwór, aż cały NaHCO3 się rozpuści.
    3. Na każde 2 ml posiłku połączyć w stożkowej probówce o pojemności 15 ml 600 μl 400 mMNaHCO3 z 1,39 ml ddH2O. Poczekaj z dodaniem 10 μl 200 mM roztworu podstawowego ATP, aż posiłek zostanie ogrzany do 45 °C w łaźni wodnej.
    4. Jeżeli następnie ma być przeprowadzone ilościowe oznaczanie wielkości posiłku na podstawie fluorescencji, należy dodać roztwór fluoresceiny do końcowego stężenia 0,002% (2 μl 2% bulionu fluoresceiny na 2 ml całkowitej objętości posiłku). Zmniejszyć objętośćddH2O w kroku 5.3 o taką samą ilość, jaką dodaje fluoresceina. Zachować co najmniej 1 ml końcowej formuły posiłku zawierającej 0,002% fluoresceiny w celu wygenerowania wzorcowej krzywej odniesienia. Zatrzymaną objętość należy traktować identycznie jak mączkę dostarczaną komarom; Wystaw się na te same warunki świetlne i temperaturowe przez cały czas trwania eksperymentu, a następnie zamroź to wraz z dostarczonym posiłkiem.

2. Dostarczanie posiłków do komarów

  1. Ustawianie pojemników na komary do karmienia
    UWAGA: Komary mogą być karmione w różnych pojemnikach, o ile spełnione są następujące kryteria. Upewnij się, że pojemnik jest wystarczająco duży, aby komary mogły w nim latać, ale nie na tyle duży, aby komary miały trudności ze zlokalizowaniem powierzchni siatki i rozpoczęciem żerowania. Siatka użyta do przykrycia pojemnika może różnić się materiałem i rozmiarem otworu. Otwory muszą być wystarczająco duże, aby przebił się przez nie sztyft samicy komara, ale nie na tyle duże, aby komar mógł uciec. Mocno zabezpiecz siatkę, aby była napięta, a rurka glikulkowa mogła stabilnie spoczywać na swojej powierzchni przez cały okres karmienia.
    1. Przykładowy pojemnik (Rysunek 1) to zmodyfikowane wiadro z tworzywa sztucznego o pojemności 946 ml (32 uncje) z polietylenu wysokiej gęstości (HDPE). Aby odtworzyć tę konfigurację, użyj żyletki, aby wyciąć centralny otwór o średnicy ~10 cm w pokrywie wiadra. Aby zmontować pojemnik do użytku przez komary, przymocuj kawałek białej moskitiery poliestrowej o grubości ~400 cmi 2 cm na wierzchu wiadra, bezpiecznie dociskając perforowaną pokrywę w dół, aby mocno zatrzasnęła.
    2. Zbierz samice komarów, które są co najmniej 3 dni po wyklucie, aby upewnić się, że są wystarczająco dojrzałe, aby nakarmić się krwią. Optymalne dawki karmienia obserwuje się po 7 dniach33.
    3. Umieść samice komarów w pojemniku i przykryj siatką. Jeśli pojemnik jest gęsto zaludniony komarami, zwiększ liczbę używanych glirurek. Optymalne odżywianie osiąga się przy użyciu ~25 komarów/Glytube. Zmniejsza to konkurencję o dostęp do błony zasilającej.
    4. Odłóż na bok grupę kontrolną niekarmionych komarów, którym nie zostanie zaoferowany posiłek. W protokole pomiaru masy ciała zważ osobno grupę niekarmioną i użyj tej masy do oszacowania przyrostu masy ciała w grupie eksperymentalnej, która żywiła się posiłkiem. W protokole kwantyfikacji opartej na fluorescencji dodać niekarmioną grupę komarów do studzienek w celu obliczenia krzywej standardowej i kontroli ujemnej. Aby dopasować wyjściową autofluorescencję tkanek komara w grupie eksperymentalnej, upewnij się, że krzywa standardowa i studzienki kontroli ujemnej zawierają niekarmionego komara.
  2. Konstruowanie i konfigurowanie Glytube (na podstawie Costa-da-Silva et al. (2013)20)
    1. Jak pokazano w Rysunek 1, aby wytworzyć źródło ciepła, napełnij stożkową rurkę o pojemności 50 ml 40 ml 100% glicerolu. Uszczelnij otwartą stożkową rurkę kawałkiem parafilmu o długości 5 cm × 5 cm i powtórz z dodatkowym kawałkiem parafilmu o średnicy 5 cm × 5 cm, aby zminimalizować ryzyko wycieku. Opcjonalnie parafilm może być przytrzymywany na miejscu za pomocą gumek recepturkach. Odwróć rurkę, aby upewnić się, że nie ma ani szczelin.
    2. Aby stworzyć urządzenie do dostarczania posiłków, wytnij wyśrodkowany otwór o średnicy 2,5 cm w nakrętki stożkowej rurki za pomocą ostrej żyletki lub, dla lepszej konsystencji, tokarki. Rozciągnij równomiernie kawałek parafilmu o długości 5 cm × 5 cm, tak aby z grubsza podwoił swoją objętość. Parafilm powinien być na tyle cienki, aby komary mogły go łatwo przebić, ale nie powinno być żadnych przecieków. Uszczelnij zewnętrzną powierzchnię nakrętki, aby całkowicie zakryć otwór i odłóż nasadkę na bok.
      UWAGA: Aby zwiększyć atrakcyjność dla Glytube, przed rozciągnięciem parafilmu, perfumuj go ludzkim zapachem, delikatnie wcierając go w fragment ludzkiej skóry bez stosowania kosmetyków, uważając, aby nie powstały żadne. Jest to zalecane, jeśli eksperyment nie ma na celu zbadania sygnałów sensorycznych wymaganych do zbliżenia się komarów do posiłku.
    3. Podgrzewać zarówno szczelnie zamkniętą probówkę z glicerolem, jak i mączkę (ze wszystkimi składnikami z wyjątkiem ATP) w łaźni wodnej o temperaturze 42–45 °C przez co najmniej 15 minut. Nie podgrzewaj ATP; Dodaj go bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu.
    4. Dodaj ATP do podgrzanego posiłku i dokładnie wymieszaj. Odpipetować pipetą 2 ml podgrzanego posiłku do wewnętrznej komory zakrętki i delikatnie umieścić w niej odwróconą, podgrzaną, wypełnioną glicerolem stożkową probówkę o pojemności 50 ml. Częściowo przykręć nakrętkę z posiłkiem do probówki wypełnionej glicerolem - tylko tyle, aby zapobiec wyciekowi posiłku lub glicerolu.
      UWAGA: Objętość użytego posiłku może wynosić od 1 ml do 2,5 ml. Mniejsze objętości mogą być szczególnie przydatne, gdy posiłki są wykorzystywane do dostarczania związków, które są rzadkie lub drogie. Na tym etapie ważne jest, aby pracować szybko, aby posiłek nie ostygł do temperatury otoczenia i zmniejszył prawdopodobieństwo maksymalnego karmienia. Szybkość chłodzenia będzie zależeć od temperatury otoczenia w pomieszczeniu, w którym przeprowadzane są te etapy, ale zazwyczaj należy je zakończyć w ciągu 5 minut w temperaturze 25 °C.
    5. Umieść zmontowaną rurkę Glytube na pojemniku na komary i pozwól komarom na dostęp do pożywienia przez co najmniej 15 minut, aby osiągnąć maksymalne dawki karmienia.
    6. Aby zapewnić optymalne karmienie, umieść pojemniki na komary w komorze wyposażonej w wkładkę CO2 i pozwól na co najmniej 15 minut aklimatyzacji w temperaturze 25–28 °C i wilgotności 70–80% przed podaniem posiłku. Użyta tutaj komora testowa jest prostą i tanią modyfikacją wcześniej opublikowanego setup16. Wykorzystuje półprzezroczyste polipropylenowe pudełko do przechowywania o wymiarach 36 cm dł. × 31 cm szer. × 32 cm wys. ze zdejmowaną pokrywą. Otwór o średnicy 1,5 cm wykonany w ściance komory umożliwia dostarczanie CO2 przez silikonowe rurki. Podkładka dyfuzyjna CO2 jest przymocowana do wewnętrznej środkowej części pokrywy w celu dostarczania oczyszczonego powietrza i CO2 w celu kondycjonowania atmosfery w komorze podczas próby.
      UWAGA: Upewnij się, że sygnały gospodarza (ciepło i CO2, z opcjonalnym zapachem hosta16) są obecne, aby komary zostały przyciągnięte do podajnika membranowego. Jeśli komary nie tłoczą się pod rurką Glytube, sprawdź, czy CO2 jest prawidłowo dostarczany i czy posiłek i rurka Glytube są wystarczająco ciepłe. Jeśli zewnętrzne źródło CO2 nie jest dostępne, CO2 może być dostarczane poprzez zaciągnięcia się wydychanym ludzkim oddechem.
    7. Po karmieniu nasadkę Glytube można wyrzucić jako odpad stanowiący zagrożenie biologiczne lub ponownie użyć po namoczeniu w niskoprocentowym roztworze wybielacza i dokładnym spłukaniu w wodzie.

3. Kwantyfikacja spożywanych posiłków

  1. Ważenie komarów do wykorzystania w dalszych eksperymentach
    UWAGA: Ważenie komarów w celu ilościowego określenia wielkości posiłku pozwala na wykorzystanie ich do dalszych eksperymentów na żywo, ale ta metoda wymaga wykonania pomiarów masy ciała od grupy 5 komarów. Ponieważ masa ciała poszczególnych komarów jest trudna do precyzyjnego zmierzenia przy użyciu większości wag laboratoryjnych, zmienność wielkości poszczególnych posiłków nie może być łatwo określona ilościowo za pomocą pomiaru wagi. Ważenie jest zalecane tylko w sytuacjach, w których samice widocznie nabrzmiewają po posiłku.
    1. Znieczulenie komarów na zimno należy przenieść, przenosząc ich pojemnik do chłodni o temperaturze 4 °C lub umieszczając go na lodzie.
    2. Zważ grupy 5 samic z niekarmionej kohorty (tj. komarów, którym nigdy nie zaoferowano posiłku) i oblicz ich średnią wagę jako szacunkową wagę "przed karmieniem". Średnia waga niekarmionego komara zależy od genotypu, płci i warunków chowu. Niekarmione samice komarów Ae. aegypti, hodowane z dostępem ad libitum do sacharozy, zazwyczaj ważą około 2 mg każdy.
    3. Z kohorty eksperymentalnej (tj. komarów, którym zaoferowano posiłek), podziel samice na stosy "karmione" i "niekarmione" na podstawie wzdęcia brzucha obserwowanego przez eye7. Podziel odpowiednio każdy z "nakarmionych" i "nienakarmionych" stosów na grupy po 5 komarów do zważenia. Komary w każdej grupie 5 osób powinny pochodzić z tej samej kohorty eksperymentalnej w celu wykonania pomiarów masy ciała grupy. Oblicz średnią wagę na samicę z każdego ze stosów "karmionych" i "niekarmionych" w grupie eksperymentalnej.
  2. Pomiar fluorescencji do analizy punktu końcowego7,27,34
    UWAGA: Aby uzyskać dokładne pomiary wielkości posiłków od poszczególnych komarów, które nie są już potrzebne do dalszych eksperymentów na żywo, należy przechowywać komary i pozostały 1 ml mączki zawierającej 0,002% fluoresceiny w temperaturze -20 °C natychmiast po karmieniu. W tym miejscu eksperyment można wstrzymać. Ta metoda jest opisana w Rysunek 2.
    1. Aby wygenerować wzorcową krzywą odniesienia, należy przygotować seryjne rozcieńczenie tego samego posiłku zawierającego 0,002% fluoresceiny, który zaoferowano grupie eksperymentalnej komarów. W sumie dostępnych będzie 8 rozwiązań krzywych standardowych. W każdym z tych roztworów końcowa objętość mączki zawierającej 0,002% fluoresceiny wyniesie 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125, 0,15625, 0,078125 lub 0 μL, a każda z nich będzie w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o łącznej objętości 100 μL (np. 5 μL mączki zawierającej 0,002% fluoresceiny w 95 μL 1x PBS).
    2. Aby przygotować pierwszy roztwór krzywej wzorcowej, dodaj 50 μL mączki zawierającej 0,002% fluoresceiny do 950 μL 1x PBS i dokładnie wymieszaj (końcowa objętość: 5 μL mączki zawierającej 0,002% fluoresceiny w 95 μL 1x PBS). Aby przygotować resztę roztworów krzywej wzorcowej, wykonaj 2-krotne rozcieńczenie dla każdego etapu, pobierając 500 μl z poprzedniej probówki i dodając ją do nowej probówki zawierającej 500 μL 1x PBS. Dobrze wymieszać przed przygotowaniem następnego 2-krotnego rozcieńczenia.
    3. Aby przygotować studzienki, które mają być użyte do wygenerowania wzorcowej krzywej odniesienia, należy pobrać pipetę po 100 μl każdego z roztworów krzywej wzorcowej do każdej z 8 studzienek w pierwszej kolumnie 96-dołkowej płytki PCR. Dodaj 1 niekarmionego komara kontrolnego do każdej z tych samych 8 studzienek w pierwszej kolumnie płytki. Powtórzyć czynności w drugiej kolumnie płytki dla powtórzenia pomiaru.
      UWAGA: Jeżeli grupom eksperymentalnym oferuje się różne rodzaje posiłków, dla każdego rodzaju posiłku należy przygotować oddzielną krzywą wzorca odniesienia.
    4. Dodaj 100 μl 1x PBS do każdej pozostałej studzienki dla niekarmionych grup kontrolnych i eksperymentalnych. Jeśli tkanka ma zostać rozerwana w kolejnych etapach za pomocą homogenizatora lub wiru młyna perełkowego, dodaj jeden 3 mm koralik z litego szkła borokrzemianowego do każdej studzienki.
    5. Jako kontrolę ujemną dodaj 1 niekarmionego komara do każdej studzienki w następnych 2 kolumnach płytki. Fluorescencja mierzona w tej grupie ustala linię wyjściową odcięcia w celu uwzględnienia autofluorescencji tkanek i zostanie wykorzystana do określenia, czy komar w grupie eksperymentalnej żywił się posiłkiem.
    6. Dodaj 1 komara, na dołek, do pozostałych studzienek z grup eksperymentalnych, którym zaoferowano posiłek.
    7. Ostrożnie uszczelnij płytkę i rozbij tkankę poprzez ręczne szlifowanie. Brzuch powinien być dokładnie homogenizowany, aby uwolnić posiłek. Metody rozbijania tkanek obejmują użycie homogenizatora z młynkiem perełkowym z 3 mm kulkami ze szkła borokrzemianowego (30 Hz przez 30 sekund), mieszalnika wirowego z kulkami z litego szkła borokrzemianowego o średnicy 3 mm lub młynka do tłuczka bez kulek.
    8. Odwirować płytkę z prędkością 2000 obr./min przez 1–2 minuty, aby zebrać lizat.
    9. Przygotuj czarną 96-dołkową płytkę ze 180 μl 1x PBS w każdym dołku.
    10. Przenieś 20 μl lizatu do każdej studzienki ze 180 μl 1x PBS i wymieszaj. Jeśli to możliwe, użyj pipety wielokanałowej, aby zwiększyć prędkość i uzyskać lepszą konsystencję.
    11. Zmierz intensywność fluorescencji każdej studzienki za pomocą czytnika płytek na kanale wzbudzenia/emisji 485/520. Proszę wygenerować wzorcową krzywą odniesienia, wykreślając znaną objętość mączki w stosunku do odpowiedniego pomiaru intensywności fluorescencji.
    12. Korzystając z wygenerowanej referencyjnej krzywej wzorcowej, ekstrapolować objętość posiłku spożytego przez każdy z komarów z grupy doświadczalnej. Odejmij średni odczyt intensywności fluorescencji ujemnej grupy kontrolnej niekarmionych komarów od odczytu intensywności fluorescencji każdej grupy eksperymentalnej, aby skorygować wyjściową autofluorescencję tkanek.

Wyniki

Rycina 1 przedstawia schemat montażu Glytube, natomiast Rycina 2 pokazuje ogólny zarys projektu eksperymentalnego służącego do pomiaru wielkości posiłku przy użyciu opisanego tutaj testu opartego na fluorescencji. Rycina 3 prezentuje reprezentatywne pomiary wielkości posiłku z fluoresceiną z eksperymentu z pobieraniem krwi. Rycina 4, Rycina 5 oraz Rycina 6 ilustrują przykłady pytań biologicznych, na które można odpowiedzieć, stosując niniejszy protokół. Zastosowania tego protokołu są szerokie i obejmują m.in. zmianę składu posiłku z krwi, podawanie związków farmakologicznych, precyzyjne ilościowe określanie suboptymalnych posiłków z krwi lub mniejszych posiłków z nektaru, a także porównywanie zachowań żerownych różnych genotypów komarów.

W celu wygenerowania krzywej wzorcowej do obliczeń objętości pokarmu, wartości fluorescencji nanosi się na wykres z wyznaczonych doń dołków referencyjnych, z których każdy zawiera niekarmionego komara oraz znaną objętość pokarmu z 0,002% fluoresceiny (Rysunek 3A). Odczyty fluorescencji z pozostałych dołków, zawierających komary z grupy kontrolnej ujemnej (niekarmione) lub z grupy eksperymentalnej (którym zaoferowano pokarm), porównuje się z tą krzywą wzorcową, aby określić objętość pokarmu (µL) spożytego przez każdego komara (Rysunek 3B). Aby zwalidować odczyty bazowe w tym teście, należy potwierdzić, że komarom z niekarmionej grupy kontrolnej ujemnej nie przypisano dodatniej wartości spożytego pokarmu w µL (Rysunek 3B, lewo). Mimo że wszystkim samicom w grupie eksperymentalnej zaoferowano posiłek z krwi, niektóre komary go spożyły (Rysunek 3B, środek), a niektóre nie (Rysunek 3B, prawo). Wynik ten pokazuje, że za pomocą tego protokołu można uzyskać dwa rodzaje danych: 1) procent całkowitej liczby samic, które żerują na danym pokarmie, oraz 2) objętość spożytą przez samice, które żerują na danym pokarmie.

Niniejszy protokół można wykorzystać do podawania i ilościowego oznaczania posiłków o różnych składach białkowych. Rycina 4A,B przedstawia dane zebrane przy użyciu posiłków z dodatkiem fluoresceiny. Na podstawie odczytów fluorescencji obliczono odpowiednio odsetek komarów, które żerowały, oraz objętość spożytego posiłku. Odczyty te są bardzo czułe i pozwalają na precyzyjne ilościowe oznaczenie w µL, jednak mają ograniczenie polegające na tym, że komary nie mogą być wykorzystane w przyszłych eksperymentach in vivo. Rycina 4C,D przedstawia dane zebrane w niezależnym eksperymencie z komarami, które po zaoferowaniu posiłków bez fluoresceiny oceniono wizualnie jako żerujące lub nieżerujące. Wielkość posiłku obliczono jako średnią masę na samicę dla grup 5 komarów. Chociaż pomiary masy są mniej czułe niż pomiary fluorescencji, pozwalają one na odzyskanie samic i ich wykorzystanie w dalszych eksperymentach in vivo. Odsetek komarów żerujących może się różnić w zależności od dni eksperymentalnych, co odzwierciedlają Rycina 4A oraz Rycina 4C.

Rysunek 5 przedstawia objętość spożytych posiłków zawierających leki regulujące zachowanie komarów podczas poszukiwania żywiciela. W tych eksperymentach samicom oferowano posiłki składające się z krwi, soli fizjologicznej + ATP lub soli fizjologicznej + ATP z dodatkiem 100 μM agonisty ludzkiego receptora NPY Y2, TM30338. Lek ten zmienia zachowanie podczas poszukiwania żywiciela poprzez aktywację receptora podobnego do NPY 7 u Ae. aegypti. Pomiar wielkości posiłku jest kluczowy dla interpretacji eksperymentów oceniających wpływ tego leku na zachowanie po spożyciu krwi, ponieważ pozwala badaczowi obliczyć dawkę przyjętą przez każdą samicę.

W poprzednich przykładach samice były karmione krwią lub zamiennikiem krwi, co w każdym przypadku skutkowało przyjęciem posiłków o objętości 3–5 µL (Rycina 3, Rycina 4, Rycina 5). Ten test oparty na fluorescencji może być również wykorzystany do pomiaru mniejszych i/lub bardziej zróżnicowanych wielkości posiłków, których nie można precyzyjnie określić na podstawie pomiarów średniej masy grupy. Na Rycynie 6 ten sam protokół kwantyfikacji fluorescencji zastosowano do pomiaru zachowań związanych z pobieraniem nektaru, zastępując Glytube kulką waty nasączoną 10% sacharozą zawierającą 0,002% fluoresceiny. Cukry nektarowe nie mogą być podawane w teście z użyciem Glytube, ponieważ samice nie są w stanie wykryć obecności cukrów nektarowych za pomocą styletu i nie rozpoczynają żerowania27. Dane te pozwalają badaczowi stwierdzić, że posiłki cukrowe są konsekwentnie mniejsze niż posiłki krwiste, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami34 (Rycina 6).

Układ do karmienia komarów; probówki stożkowe w 45°C, schemat procesu pobierania pokarmu i obrazy z wynikami.
Rysunek 1: Konfiguracja metody Glytube stosowanej do karmienia komarów. (A) Schemat rozłożonej konstrukcji Glytube używanej do podawania krwi oraz innych pokarmów komarom. (B) Schemat Glytube umieszczonego na pojemniku z komarami z pokrywką z siatki. Samice komarów mogą przebić się przez siatkę, aby pobrać pokarm. (C) Fotografie Glytube (góra) oraz samic Aedes aegypti przed, w trakcie i po karmieniu (dół, od lewej do prawej) za pomocą Glytube. Przedstawiono komary przebijające się przez siatkę pokrywającą pojemnik w celu uzyskania dostępu do karmnika membranowego. (D) Fotografie przedstawiające wygląd niekarmionych samic Ae. aegypti (lewo) oraz samic, które nasyciły się sztucznym pokarmem krwiowym (prawo, góra) lub roztworem soli fizjologicznej + ATP (prawo, dół). Metoda Glytube została wcześniej opisana w publikacji Costa-da-Silva et al. (2013)20. Fotografie w częściach (C) i (D) udostępnił Alex Wild. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat eksperymentu karmienia komarów z analizą opartą na fluoresceinie w grupach kontrolnych karmionych krwią i niekarmionych.
Rycina 2: Schemat ilościowego oznaczania wielkości posiłku po zastosowaniu protokołu karmienia krwią z użyciem Glytube.(A) Komary otrzymują posiłek z fluoresceiną (góra, grupa eksperymentalna) lub nie otrzymują posiłku (dół, niekarmiona grupa kontrolna ujemna). (B) Po zakończeniu eksperymentu karmienia poszczególne komary przenosi się do płytki 96-dołkowej. (C) Krzywa wzorcowa jest generowana przy użyciu znanych ilości posiłku zawierającego 0,002% fluoresceiny. (D) Komary są homogenizowane w celu uwolnienia spożytej fluoresceiny, a poziomy fluorescencji w każdym dołku są oznaczane ilościowo za pomocą czytnika płytek. Niniejsza metoda ilościowego oznaczania fluorescencji została zmodyfikowana na podstawie pracy Liesch et al. (2013)34. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Krzywa wzorcowa pomiaru fluorescencji i wykres porównawczy wielkości posiłku z danymi dla osobników po żerowaniu na krwi.
Rysunek 3: Eksperyment żerowania na krwi w systemie Glytube z kwantyfikacją opartą na fluoresceinie. (A) Pomiary krzywej wzorcowej uzyskane z dołków, do których dodano komara z grupy kontrolnej niepożywionej do znanej ilości posiłku zawierającego 0,002% fluoresceiny (skala osi y = jednostki umowne). (B) Objętość posiłku obliczona na podstawie odczytów fluorescencji dla samic w grupie kontrolnej niepożywionej (lewo, czarny, n = 40), grupie eksperymentalnej, która żerowała na krwi (środek, czerwony, n = 37), oraz grupie eksperymentalnej, która nie żerowała na krwi (prawo, czerwony, n = 23). Każdy punkt reprezentuje pomiar od pojedynczej samicy. Dane przedstawiono jako medianę z zakresem. Litery oznaczają grupy statystycznie różne, test Kruskala-Wallisa z wielokrotnym porównaniem Dunna, p<0,01. Dane te zostały opublikowane w Jové et al. (2020)27. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Eksperyment karmienia komarów; wykres skrzypcowy przedstawiający pobranie posiłku z krwi: owcza, sztuczna, sól fizjologiczna+ATP.
Rysunek 4: Ilościowe oznaczenie posiłków o różnym składzie białkowym. Samicom oferowano posiłki składające się z krwi owczej (czerwony), sztucznej krwi z ludzkimi białkami krwi (Kogan (1990)22) (pomarańczowy) lub posiłku z soli fizjologicznej + ATP bez białek (błękitny)7. (A) Procent nakarmionych samic oceniony na podstawie odczytów fluorescencji. Każdy punkt reprezentuje grupę 12–16 samic. Dane przedstawiono jako mediany z zakresami, n = 12. (B) Objętość posiłku obliczona na podstawie odczytów fluorescencji. Każdy punkt reprezentuje pomiar od pojedynczej samicy w jednej próbie z Rysunku 4A. Dane przedstawiono jako mediany z zakresami, n = 12. (C) Procent samic całkowicie nasyconych po karmieniu przez sztuczną membranę, oceniony wizualnie. Każdy punkt reprezentuje procent nasyconych samic z grup liczących 20–30 osobników. Dane przedstawiono jako mediany z zakresami, n = 23. (D) Wielkość posiłków oceniona jako masa/samica po wizualnej ocenie statusu karmienia. Masę obliczono jako średnią z grup po 5 komarów. Dane przedstawiono jako mediany z zakresami, n = 23. A–D: Litery oznaczają grupy statystycznie różne, test Kruskala-Wallisa z wielokrotnym porównaniem Dunna, p<0.05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres skrzypcowy wielkości posiłków komarów w zależności od roztworu pokarmowego (krew, sól fizjologiczna+ATP, sól fizjologiczna+ATP+agonista NPYR).
Rysunek 5: Ilościowe oznaczenie posiłków z zastosowaniem związków farmakologicznych. Samice przyjmują posiłki o tej samej wielkości w przypadku krwi owczej (czerwony), soli fizjologicznej + ATP (akwamaryna) oraz soli fizjologicznej + ATP + dawką 100 µM ludzkiego agonisty receptora NPY Y2 TM30338 (ciemnoniebieski). Objętość posiłku obliczono na podstawie odczytów fluorescencji. Każdy punkt reprezentuje pomiar od pojedynczej samicy. Dane przedstawiono jako mediany z zakresami, n = 12. Litery oznaczają grupy istotnie statystycznie różne, test Kruskala-Wallisa z wielokrotnym porównaniem Dunna, p<0.05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Test żerowania na nektarze; schemat z użyciem bawełnianej kulki; wykres wielkości posiłków dla wyników karmienia cukrem.
Rycina 6: Kwantyfikacja mniejszych porcji nektaru. (A) Schemat testu żerowania na nektarze. (B) Objętość posiłku obliczona na podstawie odczytów fluorescencji dla samic typu dzikiego, którym w teście żerowania na nektarze oferowano posiłki składające się z wody (kolor niebieski, n = 36) lub 10% sacharozy (kolor zielony, n = 53), z dodatkiem 0,002% fluoresceiny. Każdy punkt reprezentuje pomiar od pojedynczej samicy. Dane przedstawiono jako mediany z zakresami. Litery oznaczają grupy statystycznie różne, test Manna-Whitneya, p<0.05. Dane te zostały opublikowane w pracy Jové et al. (2020)27. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Sztuczny posiłek z krwi
Stężenie roztworu zapasu (mg/mL)Objętość roztworu zapasu w posiłku (μL/mL)Końcowe stężenie w posiłku (mg/mL)
Komponenty białkowe*
γ-Globuliny5030015
Hemoglobina352308
Albumina300340102
Całkowite białko--125
Komponenty niebiałkowe
Stężenie roztworu zapasu (mM)Objętość roztworu zapasu w posiłku (μL/mL)Końcowe stężenie w posiłku (mM)
NaClW zapasie γ-globuliny-5-10
NaHCO3W zapasie γ-globuliny-120
ATP20051
Woda-125-
*Komponenty białkowe przygotowuje się w roztworze zapasu z wody dwukrotnie destylowanej, z wyjątkiem γ-globulin, które rozpuszcza się w 400 mM NaHCO3 i zawierają zmienną ilość NaCl (2-4%) w produkcie.

Tabela 1: Receptura przygotowania sztucznych posiłków krwi (zaadaptowana z Kogan (1990)22). Sztuczna krew składa się z komponentów białkowych i niebiałkowych regularnie występujących w ludzkiej krwi i umożliwia zmianę proporcji tych składników. Komary mogą składać jaja po żywieniu się sztuczną krwią7,22.

Posiłek solny
KomponentStężenie roztworu zapasowego (mM)Objętość roztworu zapasowego w posiłku (μL/mL)Końcowe stężenie posiłku (mM)
NaCl---
NaHCO₃3400300120
ATP20051
Woda-695-

Tabela 2: Receptura posiłku solnego z ATP (adaptowana z Duvall et al. (2019)7). Bezbiałkowe posiłki solne mogą być wykorzystywane do podawania interesujących związków komórkom komarów, naśladując rozciągnięcie odwłoka występujące po żerowaniu na krwi, ale bez wywoływania rozwoju jaj, który następuje po spożyciu białek.

Dyskusja

W przypadku wielu zastosowań laboratoryjnych karmniki ze sztuczną membraną oferują wyraźne korzyści w porównaniu z żywymi żywicielami, umożliwiając naukowcom bezpośrednie manipulowanie zawartością posiłku. Chociaż dostępnych jest wiele metod karmienia sztuczną membraną, opisana tutaj metoda oferuje korzyści w zakresie elastyczności, kosztów i przepustowości. W porównaniu z innymi komercyjnymi podajnikami membranowymi, test Glytube wymaga małej objętości mączki, co czyni go wydajnym mechanizmem dostarczania kosztownych odczynników, w tym leków lub patogenów, poprzez zminimalizowanie całkowitej wymaganej objętości 7,35. Ponieważ zarówno bezbiałkowy roztwór soli fizjologicznej, jak i sztuczne posiłki z krwi sprzyjają obrzękowi, związki lub patogeny mogą być dodawane do każdego posiłku jako wysokoprzepustowa i nieinwazyjna alternatywa dla zastrzyków. Dodatkowo, każdy składnik Glytube może być łatwo myty, wymieniany lub zwiększany, aby dostarczyć i określić ilościowo wiele rodzajów posiłków bez zanieczyszczenia krzyżowego aparatu do karmienia.

Aby określić ilościowo objętość posiłków spożywanych przez komary, metoda oparta na fluorescencji umożliwia bardziej precyzyjne określenie ilościowe wielkości posiłku niż ważenie komarów przed i po karmieniu. Należy zauważyć, że ta metoda jest testem punktu końcowego. W przeciwieństwie do tego, ważenie pozwala utrzymać komary przy życiu w celu dalszych eksperymentów. Korzystając z czytnika płytek, metodę opartą na fluorescencji można łatwo rozszerzyć w celu wysokoprzepustowej kwantyfikacji posiłków spożywanych przez setki pojedynczych samic.

Aby osiągnąć wysokie wskaźniki karmienia, musi być obecna kombinacja wystarczających sygnałów żywiciela, aby aktywować zachowanie samicy w poszukiwaniu żywiciela i przyciągnąć samice do karmnika. Jeśli komary nie tłoczą się pod rurką glikulacyjną, posiłek może nie być odpowiednio podgrzany lub dostarczanie CO2 może być niewystarczające. Dodanie ludzkiego zapachu do powierzchni membrany niezawodnie zwiększa atrakcyjność sztucznej membrany. Jeśli komary zostaną zaobserwowane pod rurką Glytube, ale nie będą się odżywiać, może to oznaczać wadliwy skład posiłku. Samice mogą nie jeść, jeśli sam posiłek nie jest ciepły, krew jest zbyt stara lub jeśli dodatki do posiłku są wewnętrznie awersyjne lub powodują niepożądaną reakcję chemiczną36. Dodatkowe ATP niezawodnie zwiększa również dawki karmienia i może być skalowane do końcowego stężenia 2 mM w każdej z dostarczonych receptur. Samice nie mogą karmić się, jeśli parafilm nie jest napięty w poprzek nasadki Glytube; Parafilm powinien być jednolicie przezroczysty i nie powinien się wyginać, ponieważ uniemożliwia to samicy skuteczne przebicie parafilmu swoim styletem. Jeśli mączka przecieka przez rurkę glikulową na siatkę, parafilm mógł się rozerwać podczas rozciągania i należy go wymienić.

Zmiana składu posiłku może również pozwolić naukowcom na manipulowanie czasem potrzebnym do usunięcia posiłku z jelita środkowego, a także późniejszym zachowaniem związanym z poszukiwaniem żywiciela. Prezentowane tu posiłki wymagają 24–36 godzin na trawienie7 podobnie jak krew pochodzenia zwierzęcego. Po zjedzeniu któregokolwiek z tych posiłków samice będą tłumić poszukiwanie żywiciela w oknie trawienia. Ponieważ w solankowym posiłku brakuje białka, samice wracają do poszukiwania żywiciela po oczyszczeniu posiłku. Jeśli pożądany jest szybszy powrót, naukowcy mogą wybrać alternatywne posiłki solne "szybko oczyszczające", które są wydalane w ciągu około 6 godzin27. Podczas gdy skład prezentowanej tutaj mączki solankowej jest dopasowany do bezpośredniego porównania wyników ze sztuczną mączką z krwi, posiłek "szybkiego oczyszczania" bardziej odpowiada fizjologicznym poziomom soli znajdującym się we krwi kręgowców.

Opisane tutaj metody mają ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę przed wyborem testu, który jest najbardziej odpowiedni dla celów eksperymentalnych badacza. Opisane pomiary fluoresceiny nie pozwalają na ponowne wykorzystanie komarów do dodatkowych eksperymentów. Jednak pomiary masy ciała można wykonać przed ilościowym określeniem wielkości posiłku za pomocą testu fluoresceiny. Jeśli waga i wielkość posiłku są spójne w wielu badaniach dla danego posiłku, waga może być używana jako wskaźnik zastępczy w przyszłych eksperymentach. Co więcej, protokół ten nie rozróżnia deficytów w zachowaniach związanych z poszukiwaniem żywiciela a zachowaniami związanymi z karmieniem krwią; Komary, które wykazują trudności w znalezieniu karmnika membranowego, będą miały zmniejszone tempo żerowania i/lub wielkość posiłku. Dodając kamerę do rejestrowania zachowania podczas trwania testu, naukowcy mogą określić, czy samice nie mogą znaleźć glituby, czy też znajdują glirurkę, ale nie żerują.

Opisany tutaj test można zaadaptować do zbadania wielu nierozstrzygniętych kwestii związanych z zachowaniami żywieniowymi komarów. Na przykład udział określonych białek krwi można zbadać, zmieniając stosunek białek składowych lub całkowite stężenie białka w sztucznej mączce z krwi. Aby ocenić wielkość posiłków na podstawie wielu zdarzeń żywieniowych, można dodać barwniki o wyraźnych widmach fluorescencji, aby odróżnić posiłki od unikalnych źródeł37. Protokół ten można również zmodyfikować, aby oddzielnie stymulować wewnętrzne aparaty gębowe, które wykrywają krew i które są używane do spożycia (tj. Stylet), oraz przydatki chemosensoryczne, które stykają się ze skórą (tj. Wargi sromowe, nogi), gdy komar ląduje, aby rozpocząć karmienie krwią36. Na przykład, jeśli ligandy zostaną dodane bezpośrednio do posiłku, nie stykają się z wargami sromowymi i nogami, ponieważ błona jest przebijana tylko przez trzonek. Jeśli zamiast tego ligandy zostaną dodane do zewnętrznej powierzchni parafilmu, pozostają one oddzielone od mączki i mogą mieć kontakt z wargą sromową i nogami36. Wreszcie, szczegółowa kinetyka zachowań związanych z karmieniem krwią nie jest dobrze poznana, a przedstawiona tutaj metoda może zostać zmodyfikowana, aby połączyć śledzenie w wysokiej rozdzielczości z narzędziami uczenia maszynowego w celu wyodrębnienia odczytów behawioralnych lokomocji, postawy i dynamiki karmienia38.

Protokół ten ma być przyjazny dla użytkownika i opłacalny, z możliwością służenia naukowcom stosującym manipulacje farmakologiczne i genetyczne do badania zachowań komarów związanych z karmieniem krwią i po karmieniu krwią.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Nipun Basrur, Adrianie K. Rosas Villegas, Nadavowi Shai i Trevorowi Sorrellsowi za komentarze do manuskryptów, a także Zhongyanowi Gongowi i Kyrollosowi Barsoumowi za pomoc techniczną. Dziękujemy Alexowi Wildowi za zdjęcia wykorzystane w Rysunek 1. K.V. był wspierany przez stypendium doktoranckie Boehringer Ingelheim Fonds. V.J. był częściowo wspierany przez NIH T32-MH095246. Praca ta została częściowo wsparta grantem dla Uniwersytetu Rockefellera z Instytutu Medycznego Howarda Hughesa w ramach programu James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study dla V.J. Materiał ten opiera się na pracach wspieranych przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program w ramach grantu nr. NSF DGE-1325261 do V.J. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki stożkowe 15 mlFisher Scientific14-959-70C
Koralik borokrzemianowy z litego szkła o średnicy 3 mmMilliporeSigmaZ143928Do stosowania do homogenizatora młynka perełkowego; nie jest wymagane w przypadku używania młynka do peletów
32 uncje plastikowy kubek z polietylenu o dużej gęstości (HDPE)VWR89009-668Pokazano przykładowy pojemnik na komary używany do testów karmienia; można użyć alternatywnych opcji
Probówki stożkowe 50 mlFisher Scientific14-959-49A
płytka polistyrenowaThermoFisher12-566-09
96-dołkowa folia uszczelniająca do płytek PCRBio-RadMSB1001Można zastosować alternatywne
opcje 96-dołkowe płytki PCRBio-RadHSP9621Można zastosować alternatywne opcje
Sól disodowa 5′-trifosforanu (ATP) adenozyny hydratMilliporeSigmaA6419
Albumina (surowica ludzka)MilliporeSigmaA9511
Folia aluminiowaFisher Scientific01-213Alternatywne opcje mogą być użyte do zablokowania światła wpadającego do pojemnika z fluoresceiną
BalanceFisher Scientific01-911Można zastosować alternatywne opcje
Homogenizator młyna perełkowegoQiagen85300Nie jest wymagane w przypadku korzystania z młynka do peletów
WacikFisher Scientific22456880Do karmienia nektarem; można użyć alternatywnych opcji
Defibrynowana krew owczaHemostat LaboratoriesDSB100Można użyć alternatywnych opcji
Drosophila CO2 podkładka przeciw muchomTritech ResearchMINJ-DROS-FPMożna użyć alternatywnych opcji
FluoresceinaMilliporeSigmaF6377
Fluorescencyjny czytnik płytekThermoFisherVL0000D0Można zastosować alternatywne opcje
Gamma-globulina (krew ludzka)MiliporeSigmaH7379
GlicerolMiliporeSigmaG7893
Hemoglobina (ludzka)MiliporeSigmaG4386
Laboratoryjna folia do pakowania - parafilmFisher Scientific13-374
Mieszadło magnetyczneFisher Scientific90-691Można stosować alternatywne mieszadła magnetyczne
Mikrowirówka do płytki 96-dołkowejVWR80094-180Można zastosować alternatywne opcje
Probówki do mikrowirówekMilliporeSigma2236412Można zastosować alternatywne opcje
Młynek do peletówVWRKT749521-1500Nie jest wymagane w przypadku korzystania z homogenizatora młyna perełkowego
Roztwór buforowany fosforanami (PBS)Fisher ScientificBW17-516FOpcjonalnie
ŻyletkiFisher Scientific12-640Można zastosować alternatywne opcje, takie jak tokarka dla lepszej spójności cięcia
Gumki
Rurki silikonoweMcMaster CarrPotrzebne w przypadku używania podkładki przeciwmuchowej do dostarczania CO2
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Fisher ScientificS233
Chlorek sodu (NaCl)MiliporeSigmaS9888
MieszadłoFisher Scientific14-512Można użyć alternatywnych mieszadeł magnetycznych
Przezroczyste pudełko do przechowywania z polipropylenu ze zdejmowaną pokrywąPokazano przykładowe pudełko używane do testów karmienia
Mieszalnik
ŁaźniaMożna zastosować alternatywne urządzenie grzewcze
Biała moskitiera poliestrowa 0,8 mm AmericanHome & Nawyk Inc.F03A-PONO-MOSQ-M008-WTMożna użyć alternatywnych opcji
96-dołkowa wirowy wodna

Bibliografia

  1. Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).
  2. Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. The global distribution of yellow fever and dengue. Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).
  3. Chouin-Carneiro, T., et al. Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).
  4. Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias. Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
  5. Weaver, S. C., et al. Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control. Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).
  6. Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).
  7. Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting. Cell. 176 (4), 687-701 (2019).
  8. Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. The amino acids required for egg production in Aedes aegypti. The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).
  9. Guerrero, D., Cantaert, T., Missé, D. Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).
  10. Raquin, V., Lambrechts, L. Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands. Virology. 507, 75-81 (2017).
  11. Farjana, T., Tuno, N. Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).
  12. Scott, T. W., Takken, W. Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission. Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).
  13. Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes. PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).
  14. Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia. Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).
  15. Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).
  16. McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).
  17. Pakes, S. P., et al. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academic Press. Washington, DC, USA. (2011).
  18. Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus. Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).
  19. Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka. BioMed Research International. 2017, 3196924(2017).
  20. Costa-da-Silva, A. L., et al. Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS ONE. 8 (1), 53816(2013).
  21. Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).
  22. Kogan, P. H. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).
  23. Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial diets for mosquitoes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), (2016).
  24. Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142(2017).
  25. Galun, R. Feeding stimuli and artificial feeding. Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).
  26. Galun, R. Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate. Science. 142, 1674-1675 (1963).
  27. Jové, V., et al. Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes. Neuron. 108, 1-18 (2020).
  28. Petersen, M. T., et al. The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity. PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).
  29. Sissoko, F., et al. Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB). PLoS ONE. 14 (6), 0214170(2019).
  30. Houseman, J. G., Downe, A. E. R. Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae). The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).
  31. Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).
  32. Gonzales, K. K., et al. The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  33. Klowden, M. J. The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior. Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).
  34. Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486(2013).
  35. Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet. Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).
  36. Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact. Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).
  37. Harrington, L. C., et al. Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048(2014).
  38. Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 9, 1-24 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Karm wka krwisztuczny pokarmkarm wka membranowailo ciowe oznaczenie fluoresceinyanaliza z u yciem czytnika p ytekobj to pokarmuprob wka z glicerolemkrzywa standardowapomiar fluorescencji

Powiązane artykuły