Artykuł metodologiczny

Mutageneza PCR, klonowanie, ekspresja, protokoły szybkiego oczyszczania białek oraz krystalizacja typu dzikiego i zmutowanych form syntazy tryptofanu

DOI:

10.3791/61839

⸱

26 września 2020

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of California-Riverside, 2Department of Biochemistry, University of California-Riverside

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia szereg następujących po sobie metod ekspresji i oczyszczania syntazy tryptofanu Salmonella typhimurium w tym protokole, szybkim systemie do oczyszczania kompleksu białkowego w ciągu jednego dnia. Omówione metody to mutageneza ukierunkowana na miejsce, ekspresja białek w Escherichia coli, chromatografia powinowactwa, chromatografia filtracji żelowej i krystalizacja.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania strukturalne z kompleksem bienzymatycznym syntazy tryptofanu (TS) (α2β2 TS) z Salmonella typhimurium zostały przeprowadzone w celu lepszego zrozumienia jego mechanizmu katalitycznego, zachowania allosterycznego i szczegółów enzymatycznej transformacji substratu w produkt w enzymach zależnych od PLP. W niniejszej pracy nowatorski system ekspresji do produkcji izolowanej podjednostki α i izolowanej β pozwolił na oczyszczenie dużych ilości czystych podjednostek i αkompleksu 2β2 StTS z izolowanych podjednostek w ciągu 2 dni. Oczyszczanie przeprowadzono za pomocą chromatografii powinowactwa, a następnie rozszczepienia znacznika powinowactwa, wytrącenia siarczanu amonu i chromatografii wykluczania wielkości (SEC). Aby lepiej zrozumieć rolę kluczowych reszt w enzymie β miejscu, we wcześniejszych badaniach strukturalnych przeprowadzono mutagenezę bezpośrednią. Kolejny protokół został stworzony w celu oczyszczenia typu dzikiego i zmutowanego α kompleksach2β2 StTS. Prosty, szybki i wydajny protokół wykorzystujący frakcjonowanie siarczanu amonu i SEC pozwolił na oczyszczenie kompleksu α2β2 StTS w ciągu jednego dnia. Oba protokoły oczyszczania opisane w tej pracy mają znaczne zalety w porównaniu z poprzednimi protokołami oczyszczania tego samego kompleksu przy użyciu PEG 8000 i sperminy do krystalizacji kompleksu α2 β 2 StTS wzdłuż protokołu oczyszczania. Krystalizacja typu dzikiego i niektórych form zmutowanych zachodzi w nieco innych warunkach, upośledzając oczyszczanie niektórych mutantów przy użyciu PEG 8000 i sperminy. Aby przygotować kryształy nadające się do badań krystalograficznych rentgenowskich, podjęto szereg wysiłków w celu optymalizacji krystalizacji, jakości kryształów i krioprotekcji. Przedstawione tutaj metody powinny być ogólnie stosowane do oczyszczania podjednostek syntazy tryptofanu oraz kompleksów typu dzikiego i zmutowanego α2β2 StTS.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kompleks bienzymów syntazy tryptofanu (TS) (α2β2) jest enzymem allosterycznym, katalizującym dwa ostatnie etapy biosyntezy aminokwasu L-tryptofanu w bakteriach, roślinach i grzybach1,2,3. Bakteria Salmonella enterica serowar typhimurium (St) powoduje poważne zakażenie przewodu pokarmowego u ludzi i innych zwierząt. Ponieważ ludzie i zwierzęta wyższe nie mają TS (EC 4.2.1.20), hamowanie S. typhimurium α kompleksu2β 2 TS (α2β2 StTS) zostało zbadane jako potencjalny cel leków w leczeniu kryptosporydiozy i gruźlicy4, infekcje narządów płciowych i oczu5, oraz potencjalne zastosowanie herbicydów w rolnictwie6. Podjednostka α katalizuje aldolityczne rozszczepienie fosforanu indolo-3-glicerolu (IGP) do aldehydo-3-fosforanu glicerynowego (GAP) i indolu, poprzez tworzenie pośredniego tautomeru indolininy, a następnie rozszczepienia wiązania węgiel-węgiel w celu wytworzenia GAP i indol3,6. Miejsce β-katalityczne zawiera cząsteczkę kofaktora 5′-fosforanu pirydoksalu (PLP) związaną z β-Lys87 za pośrednictwem zasady Schiffa, która działa jako pochłaniacz elektronów w przebiegu reakcji w enzymie β-podjednostka3,7. Miejsce β katalizuje zastąpienie hydroksylu łańcucha bocznego L-seryny przez indol w celu uzyskania L-tryptofanu i cząsteczki wody w reakcji zależnej od PLP. StTS służy jako długotrwały model do badania kanalizacji substratów i komunikacji allosterycznej w kompleksach wieloenzymatycznych2,3. Dwukierunkowa komunikacja allosteryczna między α- i β-podjednostkami TS jest niezbędna do synchronizacji etapów katalitycznych i zapobiegania uwalnianiu indolu podczas syntezy L-tryptofanu 3. Aby rozszerzyć ten wysiłek, przygotowaliśmy kilka mutantów (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr i β-Ser377Ala) przez mutację jednopunktową, które zostaną wykorzystane w dalszych badaniach związku między strukturą, mechanizmem i funkcją enzymu w miejscu katalitycznym podjednostki β StTS

.

Szczegółowe badania nad mechanizmem katalitycznym α2β2StTS zostały zainicjowane przez grupę badawczą Edith W. Miles. Wczesne badania nad rodzimym kompleksem Escherichia coli α2β2 TS koncentrowały się na oczyszczeniu i charakterystyce izolowanej podjednostki α8,9, izolowany β-subunit10,11 oraz odtworzeniu kompleksu α2β2 TS z izolowanych podjednostek12. Oczyszczanie przeprowadzono przez wytrącanie siarczanu amonu, dializę próbki, chromatografię DEAE-Sephadex, dializę i drugą rundę chromatograficzną na kolumnie DEAE-Sephadex12. W innym protokole oczyszczanie tego samego kompleksu zostało ulepszone poprzez załadowanie oczyszczonego lizatu komórkowego do kolumny DEAE-Sephadex, a następnie etap chromatograficzny na kolumnie Sepharose 4B, wytrącanie siarczanu amonu i dializę13. Oba protokoły oczyszczania utrzymują się przez 4-5 dni. Kompleks Escherichia coli α2β2 TS krystalizował, ale kryształy nie nadawały się wówczas do dyfrakcji rentgenowskiej.

W nowym badaniu, rekombinowane i dzikie formy kompleksu S. typhimurium α2β2 TS zostały oczyszczone i skrystalizowane14,15. Rekombinowany kompleks α2β 2 StTS ulegał nadekspresji w szczepie E. coli CB149 przenoszącym wektor ekspresyjny pEBA-10. Przedstawiono wstępne zbieranie i analizę danych dotyczących krystalizacji i dyfrakcji rentgenowskiej kompleksu α2 β 2 StTS14. Jednak długa i cienka igła, taka jak kryształy α2β2 StTS, upośledzała badania strukturalne. Próbując zebrać lepsze dane dyfrakcji rentgenowskiej, opisano inny protokół oczyszczania w celu oczyszczenia typu dzikiego i zmutowanych form kompleksu α2β2 StTS15. Oczyszczanie przeprowadzono ze wstępnym wytrąceniem przy użyciu sperminy i PEG 8 000 do oczyszczonego lizatu komórkowego, a duży, masywny osad usunięto przez odwirowanie. Frakcję supernatantu zawierającą duże ilości kompleksu α2β2 StTS przechowywano przez 16–48 godzin w temperaturze 4 °C do momentu wytrącenia się żółtych kryształów. Kryształy przemyto i intensywnie dializowano w stosunku do różnych. Kompleks białkowy poddano rekrystalizacji w buforze zawierającym siarczan amonu i dializowano15. Chociaż krystalizacja białek zależy od stężeń białka i strącania w roztworze, trudno jest monitorować, przewidywać i odtwarzać oczyszczanie dla innych zmutowanych form kompleksu α2β2 StTS w roztworze. Protokół ten ma tę zaletę, że nie wykorzystuje żadnych metod chromatograficznych; Jednak wadą jest długi czas oczyszczania niezbędny do krystalizacji, dializy i rekrystalizacji, zwykle wymagający 5-7 dni. Aby uzyskać kryształy nadające się do zbierania danych rentgenowskich, oceniono ponad 600 warunków krystalizacji przy użyciu kombinacji i zmienności stężenia białka, temperatury, środków strącających (PEG 4 000, 6 000 i 8 000) i dodatków (CaCl2, MnCl2, ZnCl2, kadaweryna, putrescyna, spermina lub spermidyna)15. Kryształy miały lepszą formę krystaliczną i rosły szybciej w warunkach zawierających 12% PEG 8 000 i 2 mM sperminy. Krystalizacja była bardziej korzystna w temperaturze 25 °C niż w temperaturze 4, 30 lub 42 °C i osiągnęła maksymalne wymiary w ciągu 3 dni15. W tym czasie (1996-1999) zgłoszono kilka α2β2 struktur krystalicznych StTS)16,17,18,19,20,21 i wiele innych struktur zostało opublikowanych do tej pory.

Tutaj głównym celem jest przedstawienie alternatywnych protokołów oczyszczania syntazy tryptofanu i optymalizacji krystalizacji białek. Niniejsza praca wykazała znaczące ulepszenia w zakresie oczyszczania izolowanej α podjednostki typu dzikiego (αStTS), izolowanej podjednostki β (βStTS), odtworzonej αkompleksu 2β2 StTS z izolowanych podjednostek oraz typu dzikiego i form zmutowanych kompleksu α2 β 2 StTS. Korzyści w porównaniu z wcześniejszymi protokołami są znaczące, ponieważ czas oczyszczania został znacznie skrócony, a krystalizacja i krioprotekcja zostały zoptymalizowane. Zmutowane formy kompleksu α2 β 2 StTS zaprojektowane w tej pracy wykrystalizowały się w pobliżu tego samego stanu, w którym zastosowano formę dzikiego. Jednak optymalizacja drobnej krystalizacji była konieczna, aby uzyskać duże monokryształy o jakości wystarczającej do określenia struktury w rozdzielczości bliskiej atomowej. Do tej pory w Banku Danych Białkowych (PDB) zdeponowano 134 struktury krystaliczne syntazy tryptofanu, które odpowiadają odpowiednio 101, 31 i 2 strukturom krystalicznym dla bakterii, archeonów i eukariontów. Co ciekawe, 73 struktury należą do S. enterica serowar typhimurium, a 5 struktur krystalicznych kompleksu α2β2 StTS ma granice rozdzielczości wyższe niż 1,50 angstremów. Nic dziwnego, że w naszej grupie badawczej przygotowano 4 na 5 (identyfikatory PDB: 5CGQ przy 1,18 A, 4HT3 przy rozdzielczości 1,30 A, 4HPJ przy rozdzielczości 1,45 A, 6DZ4 przy rozdzielczości 1,45 A). Oczekuje się, że wyrafinowane struktury krystaliczne zmutowanej formy kompleksu α 2 β 2 StTS dostarczą nowych informacji na temat mechanizmu i ról odgrywanych przez niezbędne reszty aminokwasowe biorące udział w syntezie L-tryptofanu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Szybki protokół oczyszczania podjednostki α i β oraz rekombinowanego kompleksu α2β2 StTS

  1. Subklonowanie DNA do wektora ekspresyjnego pETSUMO
    1. Otrzymać gen sprzęgający translacyjnie (trpA i trpB) kodujący α- i β-podjednostki syntazy tryptofanu z bakterii Salmonella enterica serowar typhimurium sklonowanej w wektorze ekspresji pEBA-1022. Użyj wektora pEBA-10 jako matrycy DNA.
      UWAGA: Alternatywnie, wymienione poniżej startery mogą być użyte do amplifikacji obu genów z genomu serowara typhimurium Salmonella enterica. Wszystkie kroki biologii molekularnej zostały wykonane zgodnie z opisem w Molecular Cloning: A Laboratory Manual23.
    2. Użyj reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), aby indywidualnie amplifikować pełnowymiarową sekwencję polinukleotydową podjednostki α (αStTS) za pomocą starterów αStTS-FW-Bam i αStTS-Rev-Eco oraz pełnej długości sekwencji podjednostki β (βStTS) ze starterami βStTS-FW-Bam i βStTS-Rev-Hind. Stosować temperaturę topnienia około 55 °C i czas wydłużania polimerazy wynoszący 2 minuty.
      1. Użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności (np. Phusion) i protokołu producenta, aby amplifikować sekwencje DNA. Do reakcji PCR o objętości 50 μl należy dodać 34 μl wody wolnej od nukleaz, 10 μl buforu 5x reakcji, 1 μl 10 mM dNTP, 1 μL 10 μM startera do przodu, 1 μL 10 μM startera odwrotnego, 1 μL matrycy DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μl polimerazy DNA Phusion.
      2. W przypadku programu PCR należy zastosować gorący start (180 sekund w temperaturze 98 °C), po którym następuje 30 cykli amplifikacji (30 sekund w temperaturze 98 °C, 30 sekund w temperaturze 55 °C i 120 sekund w temperaturze 72 °C) oraz końcowe przedłużenie (300 sekund w temperaturze 72 °C).
        UWAGA: Sekwencje pisane kursywą odpowiadają odpowiednio miejscom restrykcji BamHI, EcoRI, BamHI i HindIII. Wydajność rozszczepienia enzymów w pobliżu końców fragmentów PCR została zwiększona poprzez dodanie dodatkowych zasad (sekwencji pisanych małymi literami).
        αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3′
        αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
        βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
        βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3′
    3. Załaduj produkt PCR na 0,8% żelu agarozowym w 1x bufor TAE (40 mM Tris, 20 mM kwas octowy i 1 mM EDTA) przy 6 V/cm, żel ekstrahuje interesujący nas prążek DNA i żelem oczyść fragment PCR za pomocą zestawu kulek krzemionkowych zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. Trawić co najmniej 200 ng każdego fragmentu DNA za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych i w warunkach zalecanych przez producenta przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
      2. Aby przygotować reakcję trawienia restrykcyjnego o objętości 50 μl, dodaj 34 μl wody wolnej od nukleaz, 10 μl DNA (200 ng), 5 μl 10-krotnego buforu reakcyjnego, 0,5 μl enzymu restrykcyjnego 1 i 0,5 μl enzymu restrykcyjnego 2.
      3. Załaduj produkt wytrawiający na 0,8% żelu agarozowym na 1x TAE przy 6 V/cm, ekstrakt żelowy i żel oczyść strawiony fragment za pomocą komercyjnego zestawu.
    4. Subklonować indywidualnie każdy fragment do zmodyfikowanego przez ekspresję E. coli wektora pET SUMO, uprzednio strawionego odpowiednimi enzymami i oczyszczonego żelem.
      UWAGA: Ten wektor jest zmodyfikowaną wersją komercyjnego pET SUMO. Ten wektor został zoptymalizowany pod kątem klonowania enzymów restrykcyjnych. Miejsce wielokrotnego klonowania (MCS) wektora pET28b (BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI i XhoI) zostało wstawione do miejsca klonowania pET SUMO. Ten wektor zawiera N-końcowy znacznik 6x-histydyny w ramce z małym białkiem modyfikatora podobnym do ubikwityny (SUMO) i wieloma miejscami klonowania.
    5. Wiązać 100 ng zmodyfikowanego pET SUMO i 50 ng fragmentu PCR z ligazą DNA T4 przez 2 godziny w temperaturze 25 °C.
    6. Przekształć zbudowany plazmid w kompetentne komórki α szczepu E. coli DH10B. Komórki płytki na płytkach agarowych LB zawierających 35 μg/ml kanamycyny. Inkubować odwróconą płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
    7. Wybierz pojedynczą kolonię z każdej transformacji, przygotuj ultra-czyste plazmidowe DNA i wykonaj sekwencjonowanie DNA, aby sprawdzić, czy α StTS lub βStTS zostały sklonowane w ramce z N-końcowym znacznikiem His6-SUMO.
      UWAGA: Przygotować zapasy glicerolu w hodowli komórkowej (zawiesinę komórkową obrócić w 16% końcowym stężeniu sterylnego glicerolu) i przechowywać je przez długi czas w temperaturze -80 °C.
    8. Przekształć plazmid ekspresyjny SUMO-α StTS lub SUMO-βStTS indywidualnie w kompetentne komórki szczepu ekspresyjnego E. coli Rosetta (DE3) pLysS z systemem opartym na promotorze T7. Umieść rekombinowane komórki na płytkach agarowych Luria Bertani (LB) zawierających 35 μg/ml kanamycyny i chloramfenikolu. Inkubować odwróconą płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
    9. Po udanym utworzeniu kolonii wybierz jedną pojedynczą kolonię (bez żadnych kolonii satelitarnych) i rozproszyj ją w 5 ml pożywki LB z obydwoma antybiotykami. Hodowla komórek przez noc z wytrząsaniem przy 200 obr./min w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Przygotować zapasy glicerolu w hodowli komórkowej, przechowywać przez długi czas w temperaturze -80 °C lub natychmiast użyć do ekspresji białka rekombinowanego.
  2. Wyrażenie podjednostek SUMO-α StTS i SUMO-βStTS
    1. Zaszczepić świeże komórki pLysS szczepu E. coli Rosetta (DE3) zawierające konstrukty SUMO-α StTS lub SUMO-βStTS lub zeskrobać część zamrożonego zapasu glicerolu do 50 ml kultury LB zawierającej 35 μg/ml kanamycyny i chloramfenikolu. Hodować komórki przez noc, wytrząsając z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 °C.
    2. Następnego ranka zaszczepić 5 ml nocnej hodowli komórkowej w świeżej i sterylnej mieszance 2x 1000 ml LB zawierającej 2% glicerolu oraz kanamycynę i chloramfenikol (kolba Fernbacha o pojemności 2,8 l). Hodowla komórkowa z wytrząsaniem przy 200 obr./min w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Ekspresja SUMO-α StTS lub SUMO-βStTS w bulionie LB daje 125-150 mg oznakowanego białka na litr. Rozważ skalowanie protokołu w górę lub w dół, aby spełnić określone wymagania.
    3. Indukować ekspresję białka rekombinowanego, gdy OD600 osiągnie 0,6-0,8, przez dodanie tiogalaktopiranozydu izopropylu β-D-1 (IPTG) o końcowym stężeniu 0,4 mM, a następnie inkubację w temperaturze 30 °C przez noc z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    4. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek za pomocą buforu do lizy na zimno 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, zawierającego 500 mM NaCl, 5% glicerolu, 10 mM 2-merkaptoetanolu i 40 mM imidazolu-Cl) do końcowej objętości 60 ml.
      UWAGA: Komórki mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C lub natychmiast wykorzystane do oczyszczania białek. Aby przechowywać komórki, podziel zawiesinę komórkową na 2 jednorazowe stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml i utrzymuj granulki komórkowe w temperaturze -80 °C do etapu oczyszczania białka.
  3. Oczyszczanie α- i β-podjednostek syntazy tryptofanu
    UWAGA: Wszystkie procedury należy przeprowadzać w temperaturze 4 °C, chyba że zaznaczono inaczej. Aby skrócić czas oczyszczania, należy zrównoważyć kolumny powinowactwa Ni-NTA z agarozą naładowaną niklem i kolumnę wykluczającą wielkość w buforze przed oczyszczaniem białka lub podczas ekspresji białka rekombinowanego.
    1. Rozbij osad komórkowy przez sonikację za pomocą sonifikatora cyfrowego z sondą Horn 1/2" (lub podobnym sprzętem). Wykonaj 20 cykli przy cyklu pracy o amplitudzie 80% na lodowatej kąpieli wodnej, używając 10 s impulsu i 20 s spoczynku lub do całkowitego rozerwania komórek.
    2. Odwirować lizat komórkowy przy stężeniu 30 000 x g przez 30 min. Odsysać supernatant, upewniając się, że osad nie wysunie się z probówki. Przefiltrować supernatant za pomocą jednostki filtrującej 0,45 μm na lodzie i przepuścić go przez 15 ml kolumny powinowactwa do agarozy Ni-NTA, wstępnie zrównoważonej w buforze do lizy 1,
      UWAGA: Każda kolumna agarozowa Ni-NTA będzie używana do oczyszczania białka rekombinowanego SUMO-α StTS lub SUMO-βStTS. Oczyszczanie można przeprowadzić w kolumnie Ni-NiTA o pojemności 2 ml po 5 ml podłączonej do systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek. Oczyszczaj jedno białko na raz.
    3. Przemyć kolumnę agarozy Ni-NTA w 100 ml buforu do lizy 1.
    4. Kontynuować jednoetapową elucję o objętości 80 ml z buforem E1 (25 mM bufor Tris-Cl, pH 7,8, zawierający 200 mM NaCl, 5% glicerolu i 400 mM imidazolu-Cl).
      UWAGA: SUMO-proteaza toleruje do 300 mM imidazolu, a membrana odśrodkowych urządzeń filtrujących toleruje do 100 mM imidazolu. Zalecamy wykonanie wytrącania siarczanu amonu w celu usunięcia dużych ilości imidazolu i skrócenia czasu oczyszczania, zamiast rozcieńczania próbki białka i marnowania czasu na koncentrację białka.
    5. Ocenić początkową objętość frakcji supernatantu. Powoli dodawaj jednorazowo niewielkie ilości siarczanu amonu, aż do osiągnięcia 60% nasycenia (39,48 g/100 ml) w temperaturze 25 °C. Delikatnie mieszaj roztwór przez 30 minut i unikaj bąbelków. Wirować przy 10 000 x g przez 15 min.
    6. Frakcję sklarowaną nad osadem należy ostrożnie odessać i wyrzucić. Zawiesić frakcję osadów w 20 ml buforu do próbek (20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 300 mM NaCl i 5% glicerolu).
    7. W przypadku rozszczepienia znacznika His-SUMO z proteazą SUMO, dodać rekombinowany fragment proteazy 1 specyficznej dla Ubl z Saccharomyces cerevisiae w stosunku 1:1000 i inkubować mieszaninę przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    8. Odwirować produkt wytrawiania w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 25 °C przez 20 minut w celu usunięcia agregatów białkowych przed załadowaniem próbki przez kolumnę chromatografii powinowactwa.
    9. Usunąć ślady znacznika His6-SUMO przechodzącego przez 20 ml ponownie zawieszonej próbki na 15 ml kolumnie agarozowej Ni-NTA, uprzednio zrównoważonej w buforze do lizy 1.
    10. Pobrać próbkę przelotową zawierającą nieoznakowane αStTS lub βStTS.
    11. Umyj kolumnę Ni-NTA w 20 ml buforu 1, aby zebrać resztki nieoznakowanych αStTS lub βStTS.
    12. Zagęścić każdą podjednostkę oddzielnie za pomocą odśrodkowego filtra odśrodkowego o pojemności 15 ml i stężeniu 10 kDa, wirując w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść skoncentrowane białko do świeżej probówki o pojemności 2,0 ml i przeprowadzić mikrowirówkę (10 000 x g, 10 min, 4 °C) w celu usunięcia kruszyw. Określ stężenie białka24, przygotuj 1 ml porcji w 20-25 mg mL-1, oznacz, błyskawicznie zamroź w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Wstępnie oczyszczone próbki białek mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C lub natychmiast wykorzystane do oczyszczania białek na kolumnie chromatografii wykluczającej wielkość (SEC).
    13. Pobrać porcję białka (20 mg) i mikrowirować przy 10 000 x g przez 10 minut w celu usunięcia agregatów przed SEC.
    14. Załadować próbkę do kolumny chromatograficznej wykluczającej wielkość (np. HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) podłączonej do szybkiej chromatografii cieczowej białek z szybkością przepływu 0,5 ml min-1, uprzednio zrównoważoną w buforze SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glicerolu, 0,1 mM fosforanu pirydoksalu).
      UWAGA: Aby oczyścić większe ilości izolowanej podjednostkiα StTS lub βStTS i zmniejszyć liczbę rund SEC, należy załadować 5 ml próbki o stężeniu 20-25 mg mL-1 na kolumnę chromatografii wykluczającej wielkość przy natężeniu przepływu 1,5 ml min-1.
    15. Oceń jakość αStTS lub βStTS we frakcji szczytowej za pomocą odpowiednio 12% lub 15% elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), wybarwionej barwnikiem Coomassie brylantowo niebieskim25.
    16. Skoncentrować białko za pomocą świeżych 15 ml 10 kDa odśrodkowych jednostek filtrujących, oznaczyć stężenie białka24, przygotować 0,5 ml podwielokrotności w 20-25 mg mL-1, oznaczyć, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Oczyszczanie kompleksu α2 β 2 StTS z podjednostek α i β
    UWAGA: Zrównoważyć kolumnę chromatografii wykluczającej wielkość (Sephadex S-200 HR lub Superdex 200 pg) w buforze SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glicerolu, 0,1 mM fosforanu pirydoksalu).
    1. W celu oczyszczenia kompleksu α 2 β 2 St TSz podjednostek α i β, należy rozmrozić próbki koncentratu podjednostek αStTS i βStTS w temperaturze 4 °C.
    2. Połączyć podwielokrotności (1,2 αStTS: 1,0 β stosunku molowegoStTS) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 h.
      UWAGA: Nadmiar αStTS jest konieczny, aby zapewnić, że większośćβ StTS zostanie włączona do kompleksu α2β2 StTS.
    3. Usunąć agregaty białkowe przez mikrowirowanie (10 000 x g, 10 min, 4 °C).
    4. Załaduj oczyszczony supernatant do kolumny wykluczenia rozmiaru.
    5. Oceń jakość αStTS lub βStTS we frakcji szczytowej za pomocą odpowiednio 12% lub 15% elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), wybarwionej barwnikiem Coomassie brylantowo niebieskim25.
    6. Określ stężenie białka24, przygotuj 250-1000 μL porcji w 15-20 mg mL-1, błyskawicznie zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C.

2. Oczyszczanie dzikiego typu lub zmutowanej formy kompleksu α2β2 StTS

  1. Mutageneza ukierunkowana na miejsce w celu przygotowania zmutowanych βStTS
    1. Użyj wektora ekspresji konstruktu pEBA-1022 jako matrycy DNA podczas dwuetapowej reakcji łańcuchowej polimerazy, aby wprowadzić specyficzne mutacje punktowe w sekwencji polinukleotydów TS o β łańcuchu.
      UWAGA: Protokół ten może być wykorzystany do wprowadzenia pojedynczej mutacji punktowej w podjednostce α lub β syntazy tryptofanu Salmonella typhimurium. W przypadku dodatkowych, nowe startery oligonukleotydowe zawierające pożądaną mutację muszą być odpowiednio zaprojektowane. W tej pracy wymieniono mutacje βQ114A, βK167T βS377A.
    2. Wykonuj reakcje PCR przy użyciu par starterów nukleotydowych TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev i TS-FW-NcoI/S377A-Rev w celu wygenerowania fragmentów odpowiednio A1, B1 i C1.
      UWAGA: Oligonukleotydy TS-NcoI-FW i TS-SacI-Rev, odpowiednio, wyżarzają się przed i za sekwencją polinukleotydową αβ StTS sklonowaną w wektorze pEBA-10.
      1. Użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności (np. Phusion) i protokołu producenta, aby amplifikować sekwencje DNA. Do 50 μL reakcji PCR dodać 34 μL wody wolnej od nukleaz, 10 μL 5x buforu reakcyjnego, 1 μL 10 mM dNTPs, 1 μL 10 μM startera do przodu, 1 μL 10 μM startera odwrotnego, 1 μL matrycy DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μl polimerazy DNA.
      2. W przypadku programu PCR należy zastosować gorący start (180 sekund w temperaturze 98 °C), po którym następuje 30 cykli amplifikacji (30 sekund w temperaturze 98 °C, 30 sekund w temperaturze 55 °C i 120 sekund w temperaturze 72 °C) oraz końcowe przedłużenie (300 sekund w temperaturze 72°C).
        UWAGA: Wszystkie kroki biologii molekularnej zostały wykonane zgodnie z opisem w Molecular Cloning: A Laboratory Manual23. Podczas gdy sekwencja pisana małymi literami odpowiada miejscu ograniczenia, pogrubiona i kursywa odpowiada mutacji.
        TS-FW-NCOI: 5'-CAA, TTT, CAC, ACA, GGA, AAC, AGA cca tgg-3'
        Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
        K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
        S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
    3. Wykonaj reakcje PCR przy użyciu par starterów nukleotydowych TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF i TS-Rev-SacI/S377A-FF w celu wygenerowania fragmentów odpowiednio A2, B2 i C2.
      TS-Rev-SacI (5'-TTA, tgc, gcg, GCT, GGC, GGC, TTT, CAT, GGC, TGA, G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT GC GC TCT G-3'
      K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3'
    4. Użyj reakcji łańcuchowej polimerazy, aby indywidualnie wzmocnić częściowe fragmenty. Stosować temperaturę topnienia 55 °C i czas wydłużania polimerazy wynoszący 2 min.
    5. Aby przeprowadzić drugą rundę reakcji PCR, załaduj powyższy produkt PCR na 0,8% żelu agarozowym na 1x TAE przy 6 V/cm, a ekstrakt żelowy i żel oczyść interesujące fragmenty.
      1. Wymieszać fragmenty A1/A2, B1/B2 i C1/C2 oddzielnie w ilościach równomolowych, podgrzać denaturację mieszaniny przez 10 minut w temperaturze 96 °C i wyżarzanie w temperaturze 25 °C. Przedłużyć rekombinowane nici za pomocą polimerazy o wysokiej wierności i dezoksyrybonukleotydów zgodnie z protokołem producenta.
    6. Aby wygenerować dużą liczbę kopii pełnowymiarowego zmutowanego fragmentu DNA, dodaj startery oligologiczne TS-FW-NcoI i TS-Rev-SacI, aby przeprowadzić drugi PCR.
    7. Załadować produkt PCR na 0,8% agarozy do 1x buforu TAE o natężeniu 6 V/cm, wyekstrahować żelem pas DNA, oczyścić fragment PCR żelem i kontynuować odpowiednie trawienie restrykcyjne przez 2 godziny w temperaturze 37 °C zgodnie z odpowiednim buforem i warunkami zalecanymi przez producenta.
      1. Trawić co najmniej 200 ng każdego fragmentu DNA za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych i w warunkach zalecanych przez producenta przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Aby przygotować reakcję trawienia restrykcyjnego o objętości 50 μl, dodaj 34 μl wody wolnej od nukleaz, 10 μl DNA (200 ng), 5 μl 10-krotnego buforu reakcyjnego, 0,5 μl enzymu restrykcyjnego 1 i 0,5 μl enzymu restrykcyjnego 2. Załadować produkt mineralizacji na 0,8% agarozy w 1x buforze TAE o napięciu 6 V/cm i oczyścić strawiony fragment PCR.
    8. Strawić 200 ng konstruktu pEBA-10 z enzymami restrykcyjnymi NcoI i SacI zgodnie z zaleceniami producenta. Załadować produkt trawienia na 0,8% żelu agarozowym w 1x buforze TAE o natężeniu 6 V/cm, wyciąć pasmo odpowiadające wektorowi i żel oczyścić strawiony wektor.
    9. Związać 100 ng wektora z 50 ng fragmentu PCR, uprzednio strawionego i oczyszczonego, ligazą DNA T4 przez 2 godziny w temperaturze 25 °C. Przekształć zbudowany plazmid w kompetentne komórki szczepu E. coli Komórki DH10B. Komórki płytki na płytkach agarowych LB zawierających 50 μg/ml ampicyliny. Inkubować odwróconą płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
    10. Wybierz pojedynczą kolonię (bez żadnych kolonii satelitarnych) z każdej transformacji komórkowej i rozprowadź ją w 5 ml pożywki LB zawierającej ampicylinę. Hoduj komórki przez noc, wstrząsając z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 °C. Przygotuj 10 μg ultraczystego plazmidowego DNA z każdego zmodyfikowanego konstruktu. Przygotować zapasy glicerolu w hodowli komórkowej (obrócić zawiesinę komórek w 16% końcowym stężeniu sterylnego glicerolu) i przechowywać przez długi czas w temperaturze -80 °C.
    11. Wykonaj sekwencjonowanie DNA, aby potwierdzić pełną długość sekwencji kodującej α- i β-podjednostki syntazy tryptofanu. Potwierdź każdą pojedynczą mutację i odrzuć wszelkie konstrukty plazmidowe zawierające niepożądaną losową mutację. Startery oligonukleotydowe użyte w tym badaniu są wymienione poniżej.
      TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3'
      TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
      TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
      TS-3F: 5'-GATGATGCAAACAGC-3'
      TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
      TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCTCATTG-3'
      UWAGA: Startery oligonukleotydowe TS-1F, TS-1R, TS-2F i TS-3F wyżarzanie na sekwencji polinukleotydowej podjednostki β (kod dostępu GenBank: CP051286.1). Startery TS-4F i TS-5F wyżarzanie na sekwencji polinukleotydowej podjednostki α (kod dostępu GenBank: CP053865.1).
    12. Użyj 200 ng każdego konstruktu plazmidowego (pEBA-10-β Q114A, pEBA-10-β K167T i pEBA-10-β S377A) do transformacji kompetentnych komórek szczepu ekspresyjnego E. coli CB149, bez trp operon26. Po udanym utworzeniu kolonii wybierz jedną pojedynczą kolonię i hoduj komórki w 5 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml ampicyliny. Hodowla w inkubatorze bakteryjnym w temperaturze 37 °C przez noc. Przygotować zapasy glicerolu w hodowli komórkowej, przechowywać przez długi czas w temperaturze -80 °C lub natychmiast użyć do ekspresji białka rekombinowanego.
      UWAGA: Pojedyncza mutacja punktowa w podjednostce α lub β syntazy tryptofanu Salmonella typhimurium może upośledzać funkcję enzymu lub obniżać syntezę L-tryptofanu w szczepie E. coli CB149. Należy rozważyć użycie szczepu E. coli BL21(DE)pLys-S lub Rosetta (DE3)pLys-S, jeśli w żelu SDS-PAGE nie zostanie wykryta ekspresja lub mniejsze ilości rekombinowanego kompleksu α2β2 StTS
      13. .
  2. Ekspresja typu dzikiego i zmutowanej formy kompleksu α2β2 StTS w E. coli
    1. Wyhodować szczep ekspresyjny E. coli zawierający pożądany konstrukt w świeżej i sterylnej pożywce LB o pojemności 50 ml zawierającej 50 μg/ml ampicyliny. Hodować komórki przez noc, wytrząsając z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 5 ml nocnej hodowli komórkowej do świeżego i sterylnego 2x 1000 ml LB zawierającego 2% glicerolu i ampicylinę (2,8 l kolby Fernbacha). Hodować hodowlę komórkową z wytrząsaniem przy 200 obr./min w temperaturze 37 °C.
    3. Indukować ekspresję białka rekombinowanego, gdy OD600 osiągnie 0,6-0,8 przez dodanie IPTG o końcowym stężeniu 0,4 mM, a następnie inkubację w temperaturze 30 °C przez noc z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    4. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 000 x g w 4 °C przez 20 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek za pomocą buforu do lizy na zimno 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, zawierającego 100 mM NaCl, 5 mM ditiotreitolu, 1 mM EDTA i 1 mM PMSF) do końcowej objętości 50 ml buforu.
      UWAGA: Komórki mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C lub natychmiast wykorzystane do oczyszczania białek. Aby przechowywać komórki, podziel zawiesinę komórkową na 2 jednorazowe stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml i utrzymuj granulki komórkowe w temperaturze -80 °C do etapu oczyszczania białka. Ekspresja zmutowanej i dzikiej formy kompleksu α2 β 2 StTS w bulionie LB daje 125-150 mg białka na litr. Rozważ skalowanie protokołu w górę lub w dół, aby spełnić określone wymagania.
  3. Oczyszczanie typu dzikiego lub zmutowanej formy α2β2 StTS complex
    UWAGA: Poniższy protokół ma na celu oczyszczenie nieoznakowanego rekombinowanego typu dzikiego lub zmutowanej formy rekombinowanego kompleksu α2β2 StTS w ciągu 1 dnia, w zależności od zestawu umiejętności i wysiłku. Aby skrócić czas oczyszczania, należy zrównoważyć kolumnę wykluczającą wielkość w buforze przed oczyszczaniem/ekspresją białka. Oczyszczanie typu dzikiego lub zmutowanego α kompleksu2β2 StTS przeprowadza się przez dwuetapowe oczyszczanie obejmujące frakcjonowanie siarczanu amonu i chromatografię wykluczającą wielkość alkoholu. Protokół ten daje 60-100 mg czystego kompleksu z 1 l pożywki LB.
    1. Rozbij osad komórkowy przez sonikację za pomocą sonifikatora cyfrowego z sondą Horn 1/2" (lub podobnym sprzętem). Wykonaj 20 cykli przy cyklu pracy o amplitudzie 80% na lodowatej kąpieli wodnej, używając 10 s impulsu i 20 s spoczynku lub do całkowitego rozerwania komórek.
    2. Odwirować lizat komórkowy przy 30 000 x g przez 30 minut w temperaturze 25 °C. Odessać supernatant, upewniając się, że osad nie wysunie się z probówki. Oczyszczoną frakcję supernatantu przefiltrować filtrem 0,45 μm w temperaturze pokojowej.
    3. Ocenić początkową objętość oczyszczonej frakcji supernatantu. Powoli dodawaj jednorazowo niewielkie ilości siarczanu amonu, aż do osiągnięcia 20% nasycenia (11,51 g / 100 ml). Przeprowadzić frakcjonowanie siarczanu amonu w temperaturze 25 °C. Delikatnie mieszać roztwór przez 10 minut i unikać pęcherzyków.
    4. Wirować przy 30 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C. Przenieść 20% frakcję supernatantu do czystej kolby. Delikatnie zawiesić 20% frakcji osadu w 20 ml buforu próbki 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, zawierające 100 mM NaCl, 1 mM EDTA i 2 mM ditiotreitolu) i przygotować próbkę do uruchomienia żelu SDS-PAGE. Wyrzuć 20% frakcji granulek.
    5. Ocenić początkową objętość 20% frakcji supernatantu. Dodaj siarczan amonu do 30% nasycenia, aby osiągnąć (5,94 g / 100 ml), wymieszać roztwór, unikać pęcherzyków i odwirować jak poprzednio. Przenieść 30% frakcję sklarowaną nad osadem do czystej kolby. Delikatnie zawiesić 30% frakcji granulek w 20 ml buforu próbki 2 i przygotować próbkę do uruchomienia żelu SDS-PAGE. Wyrzuć 30% frakcji granulek.
    6. Ocenić początkową objętość 30% frakcji supernatantu. Dodaj siarczan amonu przy osiągnięciu 40% nasycenia (6,14 g / 100 ml), wymieszaj roztwór, unikaj pęcherzyków i odwiruj jak poprzednio. Przenieść 40% frakcję sklarowanej nad osadem do czystej kolby. Delikatnie zawiesić ponownie 40% frakcję osadu w 10 ml buforu próbki 2 i przygotować próbkę do uruchomienia żelu SDS-PAGE. Odrzucić 40% frakcję supernatantu.
      UWAGA: Ocenić jakość kompleksu αβStTS przy użyciu próbek 30% i 40% frakcji supernatantu i osadu w 12% żelu SDS-PAGE25. Jeśli sprawdzisz, czy jakikolwiek inny zmutowany kompleks αβStTS znajduje się w 40% frakcji supernatantu, przystąp do 60% nasycenia siarczanu amonu (13,0 g / 100 ml). Wstępnie oczyszczone podwielokrotności białkowe wstępnie oczyszczonego kompleksu α2 β 2 StTS mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C lub natychmiast wykorzystane do oczyszczania białek na kolumnie chromatograficznej z wykluczeniem wielkości białka (SEC).
    7. Mikrowirować próbkę białka przy 10 000 x g, 20 min, 4 °C i załadować frakcję supernatantu na kolumnę HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR podłączoną do szybkiej chromatografii cieczowej białek przy natężeniu przepływu 0,5 ml min-1, uprzednio zrównoważonym w buforze SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glicerol, 0,1 mM fosforanu pirydoksalu).
      UWAGA: Aby oczyścić duże ilości kompleksu, załaduj próbkę o pojemności 5 ml w 20-25 mg mL-1 na kolumnę HiLoad 26/600 Superdex 200 pg przy natężeniu przepływu 1,5 ml min-1.
    8. Oceń próbki pobrane wzdłuż frakcjonowania siarczanu amonu i frakcji pikowych z kolumny SEC na 12% żelu SDS-PAGE wybarwionym kolorem Coomassie brilliant blue stain25.
    9. Zagęścić typ dziki lub zmutowany αkompleksie 2β2 StTS za pomocą 15 ml 100 kDa odśrodkowego filtra odśrodkowego, wirując z prędkością 3 000 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść skoncentrowane białko do świeżej probówki o pojemności 2,0 ml i przeprowadzić mikrowirówkę (10 000 x g, 10 min, 4 °C) w celu usunięcia kruszyw.
    10. Określ stężenie białka24, przygotuj 0,5 ml porcji w 20-25 mg mL-1, oznacz, błyskawicznie zamroź w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze -80 °C.

3. Zoptymalizowana krystalizacja dla typu dzikiego i zmutowanej formy kompleksu α2β2 StTS

UWAGA: Początkowy warunek krystalizacji dla kompleksu α2 β 2 StTS został wcześniej zgłoszony w warunkach zawierających 12% PEG 8,000 i 2 mM sperminy22.

  1. Przygotuj roztwory podstawowe przed testami krystalizacji, aby uzyskać lepszą powtarzalność krystalizacji. Aby przeprowadzić badania strukturalne za pomocą TS, należy skrystalizować białko jonem Na+ lub Cs+ w miejscu koordynacji metalu kompleksu bienzymatycznego.
    1. Przygotować 5 ml roztworu podstawowego 200 mM sperminy w wodzie i przechowywać 500 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotować 50 ml roztworu podstawowego 30% (w/v) PEG 8000 w wodzie i przechowywać 25 ml porcji w jednorazowych kolbach stożkowych wirówki o pojemności 50 ml w temperaturze 25 °C.
    3. Przygotować 25 ml roztworu podstawowego o stężeniu 1 M CsCl w wodzie i przechowywać w temperaturze 25 °C.
    4. Przygotować 25 ml roztworu podstawowego 1 M NaCl w wodzie i przechowywać w temperaturze 25 °C.
    5. Przygotować 3 x 50 ml roztworu podstawowego 1 M bicyny i miareczkować CsOH lub NaOH w celu otrzymania roztworów buforowych o pH 7,6, 7,8 i 8,0. Przechowywać 25 ml porcji w temperaturze 4 °C.
  2. Rozmrozić próbkę α2β2 StTS complex (20-25 mg mL-1) w łaźni lodowej.
  3. Mikrowirować próbkę o masie 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C w celu usunięcia agregatów białkowych.
  4. Przenieść oczyszczoną frakcję supernatantu do czystej probówki do mikrowirówki.
  5. Szacowane stężenie białka24 i rozcieńczone porcje białka (150-200 μL) w 15 mg mL-1 z 50 mM bicine-CsOH lub -NaOH, pH 7,8 zawierające 50 mM CsCl lub NaCl. Utrzymać próbkę białka w temperaturze 25 °C.
  6. Przygotuj roztwory zbiornikowe o pojemności 500 μl na 3 24-dołkowe płytki osadzające w sterylnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml z etykietą. Roztwór zbiornika zawiera 50 mM bicine-CsOH lub -NaOH, 50 mM CsCl lub NaCl i PEG 8000. Zmieniaj stężenie PEG 8000 (6-11%) na kolumnach płytek i stężenie sperminy (2-8 mM) w rzędach płytek. Zmień pH buforu (pH 7,6, 7,8 i 8,0) dla każdego zestawu.
  7. Zakryj probówki i energicznie wiruj przez co najmniej 10 sekund. Odwiruj probówki o sile 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C w celu usunięcia pęcherzyków. Dozować 500 μl roztworu buforowego do każdego oznakowanego zbiornika.
  8. Użyj mikropipety P-10 i dozuj 5 μl roztworu białkowego o stężeniu 15 mg mL-1 na każdą kroplę do siedzenia. Unikaj bąbelków. Dodać 5 μl każdego odpowiedniego roztworu rezerwuarowego do kropli białka. Unikaj pęcherzyków powietrza podczas mieszania i nie pipetuj w górę i w dół w celu homogenizacji mieszaniny.
  9. Oklej płytkę przezroczystą taśmą klejącą i przechowuj ją w temperaturze 25 °C. Kryształy pojawiają się w ciągu 2-5 dni i osiągają pełne wymiary w ciągu dwóch tygodni.

4. Gromadzenie danych dyfrakcji rentgenowskiej i α2β2 Rozwiązaniezłożonej struktury St TS

UWAGA: Przed zebraniem danych dyfrakcji rentgenowskiej, przygotuj wcześniej roztwór krioprotektantu dla każdego kryształu. Użyć specjalnego roztworu zbiornika, aby przygotować 3 podwielokrotności zawierające rosnące stężeniadimetylosulfotlenku w roztworze (10, 20 i 30% v/v) i specyficznego ligandu (s). Stwierdzono, że dimetylosulfotlenek jest lepszym krioprotektantem niż glicerol, glikol etylenowy i PEG 200-300.

  1. Zbierz duży pojedynczy kryształ za pomocą kriopętli pod mikroskopem stereoskopowym.
  2. Odpipetować 2 μl każdego roztworu krioprotektantu zawierającego roztwór strącający oraz wyższe stężeniadimetylosulfotlenku i ligandu (s) na nowe szkiełko podstawowe.
  3. Kolejno zanurz kryształw każdej kropli i pozwól kryształowi zrównoważyć się przez 30 s w roztworze krioprotektantu.
  4. Błyskawiczne chłodzenie kryształu chronionego kriogenicznie za pomocą strumienia azotu gazowego w temperaturze -173 °C (100 K) lub zanurzenie w ciekłym azocie w celu długotrwałego przechowywania w krążkach.
    UWAGA: Napełnij piankę Dewara ciekłym azotem, wstępnie schłodź kryształowy krążek, przechowuj kryształy w kriogenicznym magazynie Dewara i wyślij kryształy do synchrotronu za pomocą suchego transportera.
  5. Kontynuuj zbieranie danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze -173 °C. Rejestruj dane dyfrakcji rentgenowskiej przy użyciu czasu naświetlania 0,5-4,0 s i oscylacji 0,5°. Obróć kryształ o 180-360 °.
  6. Przetwarzaj obrazy dyfrakcji rentgenowskiej za pomocą iMosflm27, aby wygenerować plik odbicia w odpowiedniej grupie przestrzeni. Ogólnie rzecz biorąc, α2β2 kryształy StTS należą do grupy przestrzennej C 121 (C2).
  7. Skaluj razem wiele obserwacji odbić za pomocą Scala28, zaimplementowanego w pakiecie CCP429.
  8. Rozwiąż strukturę kompleksu TS o wysokiej rozdzielczościα 2β2 Stprzez zastąpienie molekularne za pomocą MolRep30 i odpowiedniego modelu wyszukiwania. Sprawdź model i mapę gęstości elektronów w Coot31 po udanym rozwiązaniu struktury.
    UWAGA: W Banku Danych Białkowych zdeponowanych jest wiele struktur kryształów TS z różnymi ligandami. Aby uzyskać lepszy etap wymiany molekularnej i skrócić czas dopasowania do nowszej struktury krystalicznej, użyj najlepszego modelu wyszukiwania zawierającego interesujące nas ligandy. Kontynuuj doskonalenie struktury krystalicznej w CCP429,30 lub Phenix31.
  9. Dokonaj ręcznych korekt modelu za pomocą Coot32, a następnie automatycznie uściślij za pomocą Refmac29,33 lub phenix.refine31,34. Zbuduj i udoskonal ostateczny model, uruchamiając iteracyjne rundy budowania modelu w Coot32 i automatyczne udoskonalanie.
  10. Kontynuuj osadzanie czynników współrzędnych i strukturalnych na stronie internetowej Banku Danych o Białkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyszczanie α- i β-podjednostek syntazy tryptofanu
Podjednostka α (αStTS) i podjednostka β (βStTS) syntazy tryptofanu Salmonella typhimurium poddano subklonowaniu w zmodyfikowanym wektorze pET SUMO. Rysunek 1A pokazuje reprezentatywne wyniki SDS-PAGE dwóch silnych pasm odpowiadających białku fuzyjnemu His6-SUMO-αStTS (pas αON) i His6-SUMO-β<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udało nam się zaprojektować zmutowane formy α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T i α2β2 βS377A StTS do badań korelacji struktura-funkcja. Początkowo próbowaliśmy oczyścić mutanty przy użyciu poprzedniego protokołu oczyszczania22, który wymaga krystalizacji kompleksu α2β2 StTS za pomocą PEG 8000 i sperminy podczas oczyszczania. Chociaż szybkość krystalizacji zależy od zmutowanej formy i stężenia kompleksu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodowy Instytut Zdrowia Stanów Zjednoczonych (GM097569).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr 15 ml 10 kDaMilliporeJednostkafiltra odśrodkowegoUFC901024
Filtr 15 ml 100 kDaMiliporeJednostkafiltra odśrodkowegoUFC910024
Fiolki kriogeniczne 2 ml Fiolki kriogeniczneCorningCLS430489Fiolki kriogeniczne
2 mlFisher Scientific05-408-141probówki do mikrowirówek
24-dołkowe Płyta CryschemHampton ResearchHR3-15824-dołkowe płytki opadowe do siedzenia
2-merkaptoetanolFisher ScientificO3446I-100Chemiczne
probówki stożkowe wirówki wirówkowe 50 mlThermo Scientific12-565-270Wirówka stożkowa
AB15 ACCUMET BasicFisher Scientific13-636-AB15pH-metr
AgarozaFisher ScientificBP1356-100Żel agarozowy
siarczan amonuFisher ScientificA702-500Chemiczna
ampicylinaFisher ScientificBP1760-5
Inkubator bakteriiInkubatorFisher ScientificS35836
BamHINew England BiolabsR0136SEnzym restrykcyjny
bicynaFisher ScientificBP2646100Chemical
Branson 450 Digital SonifierBrasonB450Zakłócacz komórek
Chlorek cezuFisher ScientificBP210-100Chemiczny
Wodorotlenek cezuAcros OrganicsAC213601000Chemiczny
ChloramfenikolFisher ScientificBP904-100Antybiotyk
dimetylosulfotlenekFisher ScientificD1391Chemiczny
ditiotreitolFisher ScientificBP172-5Chemiczna
polimeraza DNAThermo ScientificF530Spolimerazy
HF dNTPZestaw Invitrogen10-297-018dNTPs
EcoRINew England BiolabsR0101SEnzym restrykcyjny
Kwas etylenodiaminotetraoctowyFisher ScientificS311-100Chemical
Excella E25R Wytrząsarka orbitalnaEppendorf New BrunswickM1353-0004Inkubator orbitalny
GE AKTA Prime PlusGE Healthcare8149-30-0004
Zestaw do ekstrakcji żeluInvitrogenK210012zestaw do oczyszczania DNA
GlicerolFisher ScientificG33-500Chemical
HindIIINew England BiolabsR0104SEnzym restrykcyjny
Kolumny His-TrapGE HealthcareGE17-5255-015 ml Kolumna Histrap
imidazolFisher ScientificO3196-500Chemiczny
IPTGThermo Fisher ScientificR0392Induktor
KanamycynaFisher ScientificBP906-5Antybiotyk
Kelwinator Seria-100Kelwinatorwycofanyz produkcji Bulion LB w ultra niskiej zamrażarce
Fisher ScientificBP1426-500Płynny bulion
Luria BertaniFisher ScientificBP1425-2Bulion stały
NaClFisher ScientificS271-500Chemical
NcoINew England BiolabsR0193SEnzym restrykcyjny
Koraliki powinowactwa Ni-NTAThermo Fisher ScientificR90115Koraliki agarozy Ni-NTA
PEG 8000Fisher ScientificBP233-100Chemiczny
fluorek fenylometylosulfonyluFisher Scientific44-865-0Chemiczny
Fosforan pirydoksaluAcros OrganicsAC228170010Chemical
S-200 HRCytiva45-000-196Kolumna wykluczająca rozmiar
SacINew England BiolabsR0156SEnzym restrykcyjny
Wodorotlenek soduFisher ScientificS318-100Wirówka chemiczna
Sorvall RC-5BSorvall8327-30-1004Cetrifuge podłogowy
SpermineAcros OrganicsAC132750010Chemical
Superdex 200 klasaprzygotowawcza Cytiva45-002-491Kolumna wykluczająca rozmiar
Ligaza DNA T4New England BiolabsM0202SDNA liagse
TrisFisher ScientificBP152-500Chemiczna
proteaza specyficzna dla Ubl 1Thermo Scientific12588018SUMO Proteazy
Sigma Sigma antybiotykowych . Zestaw FPLC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miles, E. W. Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel. Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).
  2. Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Tryptophan synthase: a mine for enzymologists. Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).
  3. Dunn, M. F. Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).
  4. Chaudhary, K., Roos, D. S. Protozoan genomics for drug discovery. Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).
  5. Caldwell, H. D., et al. Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates. Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).
  6. Kulik, V., et al. On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).
  7. Barends, T. R., et al. Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate. Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).
  8. Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).
  9. Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies. Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).
  10. Wilson, D. A., Crawford, I. P. Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase. Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).
  11. Adachi, O., Miles, E. W. A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield. Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).
  12. Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex. Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).
  13. Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments. Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).
  14. Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).
  15. Miles, E. W., et al. The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230. Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).
  16. Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex. Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).
  17. Rhee, S., et al. Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes. Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).
  18. Schneider, T. R., et al. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase. Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).
  19. Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49. Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).
  20. Weyand, M., Schlichting, I. Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate. Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).
  21. Sachpatzidis, A., et al. Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase. Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).
  22. Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382. Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
  24. Lowry, O. H., et al. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
  25. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  26. Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits. Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).
  27. Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, Pt 4 271-281 (2011).
  28. Evans, P. Scaling and Assessment of Data Quality. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, Pt 1 72-82 (2006).
  29. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
  30. Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 1 22-25 (2010).
  31. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  32. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  33. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, Pt 3 240-255 (1997).
  34. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, Pt 4 352-367 (2012).
  35. Matthews, B. W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).
  36. Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals. Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

frakcjonowanie siarczanem amonuchromatografia elowamutageneza celowanakrystalizacja bia ekPEG 8000 sperminachromatografia powinowactwaanaliza SDS PAGEst enie bia ka

Powiązane artykuły