Artykuł metodologiczny

Kotranslacyjna insercja białek błonowych do wstępnie uformowanych nanodysków

DOI:

10.3791/61844

⸱

19 listopada 2020

 ,  ,  , 
1Institute of Biophysical Chemistry, Goethe University Frankfurt

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kotranslacyjna insercja do wstępnie uformowanych nanodysków umożliwia badanie bezkomórkowych syntetyzowanych białek błonowych w określonych środowiskach lipidowych bez kontaktu z detergentami. Protokół ten opisuje przygotowanie podstawowych komponentów systemu oraz parametry krytyczne dla poprawy wydajności odciągania i jakości próbki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezkomórkowe systemy ekspresji pozwalają na indywidualne projektowanie środowisk reakcji, aby wspierać funkcjonalne fałdowanie nawet złożonych białek, takich jak białka błonowe. Zademonstrowano eksperymentalne procedury kotranslacyjnej insercji i fałdowania białek błonowych do wstępnie uformowanych i zdefiniowanych błon dostarczanych w postaci nanodysków. Protokół jest całkowicie wolny od detergentów i może wygenerować miligramy oczyszczonych próbek w ciągu jednego dnia. Uzyskane w ten sposób próbki białek błonowych/nanodysków można wykorzystać do różnych badań funkcjonalnych i zastosowań strukturalnych, takich jak krystalizacja, magnetyczny rezonans jądrowy lub mikroskopia elektronowa. Opisano przygotowanie podstawowych kluczowych składników, takich jak lizaty bezkomórkowe, nanodyski z zaprojektowanymi membranami, krytyczne roztwory podstawowe, a także montaż dwukompartmentowych bezkomórkowych reakcji ekspresji. Ponieważ wymagania dotyczące fałdowania białek błonowych mogą być bardzo zróżnicowane, głównym celem tego protokołu jest modulacja parametrów i etapów reakcji ważnych dla jakości próbki, takich jak krytyczne podstawowe związki reakcyjne, skład błony nanodysków, środowisko redoks i opiekuńcze lub projekt matrycy DNA. Cały proces demonstruje się za pomocą syntezy proteorodopsyny i receptora sprzężonego z białkiem G.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka błonowe (MPs) są trudnym celem w badaniach produkcji białek ze względu na ich nierozpuszczalność w środowisku wodnym. Konwencjonalne platformy produkcyjne MP obejmują systemy oparte na komórkach, takich jak E. coli, drożdże lub komórki eukariotyczne. Zsyntetyzowane rekombinowane MP są albo ekstrahowane z błon komórkowych, albo ponownie składane z ciał inkluzyjnych1. Po rozpuszczeniu detergentu, MPs mogą być przenoszone do odpowiednich środowisk membranowych za pomocą ustalonych protokołów rekonstytucji in vitro. Oprócz pęcherzyków i liposomów, MP rekonstytucja w płaskie błony w postaci nanodysków2 lub salipro3 cząstki stały się w ostatnim czasie rutynowymi technikami. Jednak wszystkie te strategie implikują kontakt detergentu z MP, który może skutkować destabilizacją, dysocjacją oligomerów, a nawet utratą struktury i aktywności białek4. Badanie przesiewowe pod kątem optymalnych warunków rozpuszczania i rozpuszczania detergentu może być zatem żmudne i czasochłonne5.

Otwarta natura systemów bezkomórkowych (CF) pozwala na bezpośrednie zaopatrywanie reakcji ekspresji przez wstępnie uformowane błony o określonym składzie lipidowym. W tym trybie ekspresji opartej na lipidach (L-CF) zsyntetyzowane MP mają możliwość wspólnego translacyjnego wstawiania do dostarczonych dwuwarstw6,7 (Rysunek 1). Nanodyski składające się z białka rusztowania błonowego (MSP) otaczającego płaski dwuwarstwowy dysk lipidowy8 wydają się być szczególnie odpowiednie dla tej strategii9,10. Nanodyski mogą być rutynowo składane in vitro z różnymi lipidami, są bardzo stabilne, a zapasy mogą być skoncentrowane do 1 mM. Konieczna jest jednak ekspresja MSP w E. coli i jej oczyszczenie. Jako alternatywna strategia, MSP może być równolegle wyrażany razem z docelowym MP w reakcjach CF dostarczanych liposomami11,12,13. Matryce DNA zarówno dla MSP, jak i MP są dodawane do reakcji, a MP/nanodyski mogą tworzyć się po ekspresji. Chociaż unika się produkcji MSP, strategia koekspresji wymaga starannego dostrojenia końcowych stężeń matryc DNA i można spodziewać się większych wahań w wydajności produkcji próbek.

Współtranslacyjne wprowadzanie MPS do błon wstępnie uformowanych nanodysków jest niefizjologicznym i wciąż w dużej mierze nieznanym mechanizmem, niezależnym od maszynerii translokonowych i sekwencji sygnałowych13,14,15,16. Głównymi wyznacznikami skuteczności insercji są rodzaj białka błonowego, a także skład lipidowy dostarczonej błony, z częstą preferencją dla ujemnie naładowanych lipidów15,17. Ponieważ błony nanodysków mają stosunkowo ograniczony rozmiar, znaczna ilość lipidów jest uwalniana po wstawieniu MP18. Zmienność rozmiaru nanodysku umożliwia wprowadzanie i strojenie wyższych oligomerycznych kompleksów MP15,18. Wykazano m.in. prawidłowy montaż kompleksów homooligomerycznych dla kanału jonowego KcsA, dla pompy jonowej proteorodopsyny (PR) oraz dla transportera wielolekowego EmrE15,18. Jest prawdopodobne, że MP wejdą do symetrycznej membrany nanodysku z obu stron ze stosunkowo równą częstotliwością. Należy zatem wziąć pod uwagę, że różne monomery lub oligomery wprowadzone do jednego nanodysku mogą mieć przeciwstawne orientacje. Jednak odchylenie w orientacji może być spowodowane przez współpracujące mechanizmy insercji, jak opisano w przypadku tworzenia heksamerów PR i tetramerów KcsA18. Dalsze odchylenie w orientacji MP może wynikać z przełączników orientacji wstawionych MP, prawdopodobnie na krawędzi membran nanodysków.

Produkcja lizatów CF ze szczepów E. coli jest niezawodną rutynową techniką i może być przeprowadzona w prawie każdym laboratorium biochemicznym19,20. Należy wziąć pod uwagę, że oprócz tworzenia mostków dwusiarczkowych, większość innych modyfikacji potranslacyjnych jest nieobecna, jeśli MP jest syntetyzowany przy użyciu lizatów E. coli. Chociaż może to spowodować wygenerowanie bardziej jednorodnych próbek do badań strukturalnych, konieczne może być wykluczenie potencjalnego wpływu na funkcję poszczególnych celów MP. Jednak wydajna produkcja wysokiej jakości próbek receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR)14,21,22, transportery eukariotyczne23 lub duże zespoły heteromeryczne24 w lizatach CF E. coli wskazuje na ich przydatność nawet dla złożonych celów. Ilości skali preparatywnej (≈ 1 mg/ml) próbki można uzyskać w konfiguracji dwukomorowej z ciągłą wymianą bezkomórkową (CECF), składającej się z komory mieszaniny reakcyjnej (RM) i mieszanki zasilającej (FM). Objętość FM przekracza objętość RM od 15 do 20 razy i stanowi rezerwuar związków energetycznych i prekursorów o niskiej masie cząsteczkowej19. W ten sposób reakcja ekspresji zostaje przedłużona o kilka godzin, a ostateczna wydajność celu MP zostaje zwiększona. Przedziały RM i FM są oddzielone membraną dializacyjną z odcięciem 10-14 kDa. Obie komory wymagają specjalnej konstrukcji pojemnika reakcyjnego CECF (Rysunek 1). Odpowiednimi przykładami są komercyjne kasety do dializy jako pojemniki RM w połączeniu z dostosowanymi do potrzeb pojemnikami z pleksiglasu zawierającymi FM. Wydajnością MP można dalej manipulować, modyfikując proporcje RM:FM lub wymieniając FM po pewnym okresie inkubacji.

Wydajność i jakość MP często wymagają intensywnej optymalizacji parametrów reakcji. Ważną zaletą ekspresji CF jest możliwość modyfikacji i precyzyjnego dostrojenia prawie każdego związku zgodnie z indywidualnymi wymaganiami MP. Prostą strategią jest skupienie się najpierw na poprawie wydajności MP poprzez ustanowienie podstawowego protokołu produkcyjnego, a następnie na optymalizacji jakości MP poprzez precyzyjne dostrojenie warunków reakcji i składania. Brak procesów fizjologicznych w lizatach mukowiscydozy i ich zmniejszona złożoność skutkują wysokimi wskaźnikami sukcesu w wydajnej produkcji MPs25. Rutynowe rozważania dotyczące projektowania matrycy DNA i optymalizacji stężenia jonów Mg2+ są w większości przypadków wystarczające do uzyskania zadowalających plonów26. W zależności od trybu wyrażenia, optymalizacja jakości MP może stać się czasochłonna, ponieważ konieczne jest prześwietlenie większej liczby parametrów14,17,22.

Aby ustanowić opisaną platformę ekspresji CF, niezbędne są protokoły do produkcji lizatu CF E. coli (i), polimerazy T7 RNA (ii), nanodysków (iii) i podstawowych związków reakcyjnych CECF (iv) (Rysunek 1). Pochodne szczepu E. coli K12 A1927 lub BL21 są często używane do przygotowania wydajnych lizatów S30 (wirowanie przy 30 000 x g). Oprócz lizatów S30 można stosować odpowiednie lizaty odwirowane przy innych siłach g (np. S12). Lizaty różnią się wydajnością ekspresji i złożonością proteomu. Proteom lizatu S30 przygotowany za pomocą opisanego protokołu został szczegółowo przebadany28. Proteom S30 nadal zawiera pewne szczątkowe białka błony zewnętrznej, które mogą powodować problemy z tłem podczas ekspresji i analizy kanałów jonowych. W przypadku takich celów zaleca się stosowanie lizatów S80-S100. Cenną modyfikacją podczas przygotowywania lizatu jest indukcja odpowiedzi SOS przez połączony szok cieplny i dostarczanie etanolu w środkowej fazie wzrostu komórek. Powstałe w ten sposób lizaty HS30 są wzbogacone w białka opiekuńcze i mogą być używane w mieszankach z lizatami S30 w celu poprawy składania MP22. Ekspresja mukowiscydozy w lizatach E. coli przebiega jako sprzężony proces transkrypcji/translacji z matrycami DNA zawierającymi promotory kontrolowane przez polimerazę T7 RNA (T7RNAP). Enzym może być efektywnie wytwarzany w komórkach gwiazdowych BL21(DE3) zawierających plazmid pAR1219 29.

Dwie kopie MSP1E3D1 łączą się w jeden nanodysk o średnicy 10-12 nm, ale protokół opisany poniżej może również działać dla innych pochodnych MSP. Jednak nanodyski większe niż te utworzone z MSP1E3D1 są zwykle mniej stabilne, podczas gdy mniejsze nanodyski utworzone z pochodnych MSP, takich jak MSP1, mogą nie pomieścić większych MP lub kompleksów MP. MSP1E3D1 nanodyski mogą być składane in vitro z dużą różnorodnością różnych lipidów lub mieszanin lipidów. Wstępnie uformowane nanodyski są zwykle stabilne przez > 1 rok w temperaturze -80 °C, przy czym stabilność może się różnić w zależności od składników lipidowych. W celu przeprowadzenia badań przesiewowych wpływu lipidów na fałdowanie i stabilność MP konieczne jest przygotowanie kompleksowego zestawu nanodysków połączonych z reprezentatywną różnorodnością mieszanin lipidów/lipidów. Dobrym wyborem wyjściowym mogą być następujące lipidy: 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) i 1-palmitoilo-2-oleoilo-glycero-3-fosfocholina (POPC).

Opisano protokół przygotowania 3 ml reakcji CECF. Możliwe jest dalsze skalowanie w górę lub w dół w stosunku 1:1. Dla dwukomorowej konfiguracji CECF należy przygotować RM zawierający wszystkie związki i FM zawierający tylko związki o niskiej masie cząsteczkowej. Komercyjne urządzenia do dializy o pojemności 3 ml z MWCO 10-14 kDa mogą być używane jako pojemniki RM, które są następnie umieszczane w specjalnie wykonanych pojemnikach z pleksiglasu zawierających FM (Rysunek 1D)30. Stosunek RM:FM wynosi 1:20, więc 60 ml FM musi być przygotowane na 3 ml RM. Jakość, stężenie lub rodzaj kilku składników mogą mieć kluczowe znaczenie dla końcowej wydajności i/lub jakości zsyntetyzowanego MP (Tabela 1). Matryce DNA powinny być przygotowywane zgodnie z opublikowanymi wytycznymi, a optymalizacja kodonów ramki odczytu celu może jeszcze bardziej znacznie poprawić wydajność produktu26. Dla reakcji CECF w skali preparatywnej opisano ustalony protokół wytwarzania PR. Aby ustalić protokoły ekspresji dla nowych MP, zwykle konieczne jest przeprowadzenie badań optymalizacyjnych niektórych związków (Tabela 1) w celu poprawy wydajności i jakości. W przypadku jonów Mg2+ istnieje dobrze skoncentrowane optimum stężenia, które często wykazuje znaczną zmienność dla różnych matryc DNA. Inne związki reakcyjne CF, takie jak nowe partie lizatów T7RNAP lub S30, mogą dodatkowo przesuwać optymalne stężenieMg2+. Jako przykład opisano typowy ekran Mg2+ w zakresie stężeń 14-24 mM i w krokach co 2 mM. Każde stężenie jest badane przesiewowo w duplikatach i w reakcjach CECF w skali analitycznej. Jako pojemnik reakcyjny CECF, wykonane na zamówienie pojemniki z pleksiglasu Mini-CECF 30 zawierające RM są używane w połączeniu ze standardowymi 24-dołkowymi mikropłytkami zawierającymi FM (Rysunek 1B). Alternatywnie można zastosować komercyjne wkłady dializacyjne w połączeniu z mikropłytkami o głębokości 96 lub innymi komercyjnymi urządzeniami dializacyjnymi w odpowiednich konfiguracjach (Rysunek 1C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie lizatu S30

  1. Dzień 1: Usunąć komórki z zapasów glicerolu na płytce agarowej LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Dzień 2: Zaszczepić 200 ml pożywki LB komórkami z płytki agarowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 12-14 godzin.
  3. Dzień 3: Zaszczepić 10 l sterylnego podłoża YPTG (10 g/l ekstraktu drożdżowego, 16 g/l tryptonu, 5 g/l NaCl, 19,8 g/l glukozy, 4,4 mM KH2PO4, 8 mM K2HPO4) podgrzanego do 37 °C w 15 l reaktorze z mieszadłem ze 100 ml kultury wstępnej (1:100). Uprawiać w temperaturze 37 °C, 500 obr./min i wysokim napowietrzeniu (~ 3 objętości powietrza na minutę). Aby zapobiec nadmiernemu pienieniu, dodaj sterylny środek przeciwpieniący.
  4. Mierz gęstość optyczną (OD) przy 600 nm w regularnych odstępach czasu. Po około 2 godzinach kultura wejdzie w fazę logarytmiczną.
  5. Modyfikacja dla lizatu HS30: Gdy komórki znajdują się w środkowej fazie logarytmicznej (OD600 ≈ 3,6-4,2), dodaj 300 ml etanolu do pożywki hodowlanej i kontynuuj uprawę w temperaturze 42 °C, 500 obr./min i wysokim napowietrzeniu (około 3 objętości powietrza na minutę) przez kolejne 45 minut. Następnie należy przystąpić do schładzania i pobierania hodowli komórkowej zgodnie z opisem w kroku 1.6. W przypadku produkcji standardowego lizatu S30 należy pominąć ten krok i przejść do kroku 1.6.
  6. Gdy komórki znajdują się w środkowej fazie logarytmicznej (OD600 ≈ 3,6-4,2), schłodzić fermentor poniżej 20 °C w ciągu < 30 minut. Końcowy OD600 powinien wynosić około 4,5-5,5. Zbierać komórki w temperaturze 4 500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Utrzymuj komórki w temperaturze 4 °C podczas wykonywania następujących czynności.
    UWAGA: Podczas chłodzenia może wystąpić nadmierne pienienie. W takim przypadku należy dodać środek przeciwpieniący lub zmniejszyć prędkość mieszania i/lub zmniejszyć strumień powietrza w bioreaktorze.
  7. Całkowicie zawiesić komórki w 300 ml buforu S30-A (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KCl, 6 mM 2-merkaptoetanolu) za pomocą szpatułki, a następnie pipetować zawiesinę w górę iw dół aż do uzyskania jednorodności. Wirować przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.
    UWAGA: 2-merkaptoetanol jest toksyczny. Unikać kontaktu ze skórą lub drogami oddechowymi. Jeśli to możliwe, pracuj pod maską. Zważyć pustą zlewkę wirówkową przed ostatnim etapem mycia. Po odwirowaniu zważyć osad o mokrych komórkach i albo przejść do kroku 1.8, albo przechowywać osad do dalszego użycia.
    UWAGA: Masa osadu z mokrymi komórkami wynosi 5-7 g na 1 l kultury bioreaktora. W tym momencie protokół może zostać wstrzymany, a granulat można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez 4-8 tygodni.
  8. Dokładnie zawiesić komórki w 1,1 objętości (1 g = 1 ml) buforu S30-B (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 1 tabletka inhibitora proteazy cOmplete). Wlej zawiesinę do wstępnie schłodzonej komory ciśnieniowej French Press i rozerwij ogniwa przy ciśnieniu 1,000 psig. Przepuść komórki przez francuską prasę raz.
  9. Odwirować lizat przy 30 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do świeżej probówki i powtórzyć etap wirowania.
    UWAGA: Po pierwszym odwirowaniu na wierzchu osadu może znajdować się luźna i śluzowata warstwa, której nie należy przenosić wraz z supernatantem.
  10. Zastosuj etap o wysokiej zawartości soli i ciepła, aby usunąć niestabilne składniki lizatu i uwolnić mRNA z rybosomów. Doprowadzić lizat do 0,4 M NaCl i inkubować w temperaturze 42 °C przez 45 minut w łaźni wodnej.
    UWAGA: Ten krok spowoduje znaczne tworzenie się osadów. Od czasu do czasu odwracaj lub odwracaj probówkę podczas inkubacji.
  11. Przenieś mętną zawiesinę (zwykle 50-80 ml) do probówek dializacyjnych z odcięciem 10-14 kDa i dializ z 5 l buforu S30-C (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 0,5 mM DTT). Po 2-3 godzinach należy wymienić bufor do dializy S30-C i dializować przez kolejne 12-14 godzin.
  12. Dzień 4: Przenieść dializowaną zawiesinę do probówek wirówkowych i odwirować przy 30 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant (lizat S30) do świeżych probówek o pojemności 50 ml i delikatnie wymieszać. Stężenie białka w lizacie powinno wynosić około 30-40 mg/ml. Szokowe zamrożenie podwielokrotności (np. 0,5 ml, 1 ml) w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Podwielokrotności są stabilne przez > 1 rok.

2. Ekspresja i oczyszczanie polimerazy RNA T7

  1. Dzień 1: Zaszczepić 200 ml pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny świeżo posianymi komórkami BL21(DE3) Star x pAR1219 i inkubować w temperaturze 37 °C i 180 obr./min przez 12-16 godzin.
  2. Dzień 2: Zaszczepić 1 l wspaniałego bulionu (12 g/l tryptonu, 24 g/l ekstraktu drożdżowego, 4 ml/l glicerolu) w 2-litrowej kolbie z przegrodami z 10 ml kultury wstępnej i inkubować w temperaturze 37 °C i mieszaniu 180 obr./min. Początkowy OD600 powinien wynosić około 0,1.
  3. Gdy OD600 osiągnie 0,6-0,9, dodaj IPTG do końcowego stężenia 1 mM, aby indukować ekspresję T7RNAP i kontynuuj hodowlę przez kolejne 5 godzin.
  4. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zamrozić komórki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany.
  5. Dzień 3: Dodać 30 ml lodowatego buforu zawiesinowego (30 mM Tris-HCl, pH 8,0 z jedną tabletką inhibitora proteazy cOmplete) do zamrożonych osadów komórkowych i rozmrozić osad w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej. Następnie zawiesić osad, pipetując w górę i w dół, aż do uzyskania jednorodności.
  6. Wykonaj rozbijanie komórek za pomocą prasy francuskiej, jak opisano w poprzednim rozdziale lub użyj urządzenia do sonikacji zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie odwirować przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do świeżej probówki.
  7. Aby wytrącić genomowe DNA, należy powoli i pod delikatnym mieszaniem dodawać siarczan streptomycyny do supernatantu, aż do osiągnięcia końcowego stężenia 3% (w/v). Inkubować w temperaturze 4 °C przez 5-10 minut pod delikatnym mieszaniem. Wirować przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra 0,45 μm i załadować go do kolumny Q-Sepharose o objętości kolumny (CV) wynoszącej 40 ml zrównoważonej buforem równoważącym 2 CV (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% glicerolu i 10 mM 2-merkaptoetanolu) za pomocą pompy perystaltycznej przy natężeniu przepływu 4 ml / min. Następnie podłączyć kolumnę do detektora UV i kontynuować elucję z buforem równoważącym, aż sygnał UV o długości fali 280 nm osiągnie stabilną linię podstawową.
  9. Elute T7RNAP o gradiencie od 50 mM do 500 mM NaCl na CV przy natężeniu przepływu 3 mL/min. Zebrać 1 ml frakcji i przygotować próbki do analizy SDS-PAGE, mieszając 10 μL każdej frakcji z 2 x buforem próbki SDS. Uruchom SDS-PAGE i zabarwij żel Coomassie Blue R. T7RNAP powinien pojawić się jako wyraźne pasmo o wartości około 90 kDa wraz z licznymi dodatkowymi pasmami zanieczyszczeń.
  10. Pula frakcji zawierających T7RNAP i dializa za pomocą membran z 12-14 kDa MWCO przez 12-16 godzin w buforze dializacyjnym (10 mM K2HPO4 / KH2PO4, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% (w/v) glicerol).
  11. Dzień 4: Zebrać roztwór T7RNAP i skoncentrować za pomocą jednostek filtrujących z 12-14 MWCO do końcowego stężenia 3-10 mg / ml. T7RNAP może zacząć wytrącać się podczas koncentracji. Należy natychmiast zatrzymać zagęszczanie, gdy tylko wystąpi zmętnienie próbki. Dodaj glicerol do końcowego stężenia 50% (w/v) i delikatnie wymieszaj. Szokowe zamrażanie 0,5-1 ml porcji i przechowywanie w temperaturze -80 °C. Robocze porcje T7RNAP można przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Około 20-40 ml częściowo oczyszczonego T7RNAP o stężeniu 5 mg/ml z 20 000-40 000 jednostek należy uzyskać z fermentacji o pojemności 1 litra. W celu zbadania optymalnej ilości każdej partii T7RNAP należy przeprowadzić reakcje ekspresji CF białka zielonej fluorescencji (GFP) zawierającego 0,02 mg/mL-0,1 mg/ml przygotowanej próbki T7RNAP.

3. Wyrażanie i oczyszczanie MSP1E3D1

  1. Dzień 1: Przekształć komórki gwiazdowe E. coli BL21 (DE3) za pomocą wektora pET28(a)-MSP1E3D1 vector31 przy użyciu standardowych protokołów transformacji szoku cieplnego lub elektroporacji. Na agarze LB zawierającym 30 μg/ml kanamycyny należy usunąć lub uformować na płytkę przekształcone komórki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin.
  2. Dzień 2: Zaszczepić 200 ml pożywki LB uzupełnionej 0,5% (w/v) glukozy i 30 μg/ml kanamycyny pojedynczą kolonią pobraną z płytki agarowej i inkubować w temperaturze 37 °C przy 180 obr./min przez 12-16 godzin.
  3. Dzień 3: Zaszczepić 10 l pożywki LB uzupełnionej 0,5% (w/v) glukozy i 30 μg/ml kanamycyny 100 ml kultury wstępnej w bioreaktorze z mieszadłem. Przeprowadzić fermentację w temperaturze 37 °C, 500 obr./min i napowietrzanie z prędkością około 3 objętości bioreaktora na minutę. W przypadku nadmiernego pienienia należy dodać środek przeciwpieniący.
    UWAGA: Zamiast fermentora można użyć kolb z przegrodami.
  4. Przy OD600 wynoszącym 6,5-7,5 dodać IPTG do końcowego stężenia 1 mM i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 4,500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć granulki komórek 200 ml 0,9% (w/v) NaCl i ponownie odwirować przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przenieść komórki do probówek o pojemności 50 ml za pomocą szpatułki. Oczekiwana masa mokrego granulatu wynosi 8-12 g na litr kultury w bioreaktorze. Szokowe zamrażanie granulek komórek w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  5. Dzień 4: W celu oczyszczenia rozmrozić granulki komórek w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej. Zawiesić komórki w buforze MSP-A (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100, 1 tabletka koktajlu inhibitorów proteazy c0mplete na 50 ml zawiesiny komórek), aby uzyskać 30-40% (w/v) zawiesinę komórek.
  6. Rozbić komórki za pomocą sonikacji lub za pomocą prasy francuskiej i odwirować przy 30 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do świeżej probówki i przefiltrować przez filtr 0,45 μm. Nanieść filtrat na kolumnę kwasu nitrylotrioctowego obciążoną Ni2+ (CV > 15 ml) zrównoważoną 5 CV buforu MSP-B (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100) za pomocą pompy perystaltycznej.
    UWAGA: Aby ułatwić filtrację, supernatant może być poddawany sonikacji przez kolejną minutę w celu rozbicia dużych fragmentów DNA.
  7. Po załadowaniu próbki przemyć kolumnę 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl, 50 mM kwasu cholowego), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl) i 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol).
    UWAGA: Kwas cholowy w buforze MSP-C jest ważny dla usunięcia lipidów przyłączonych do MSP. Kwas cholowy nie jest całkowicie rozpuszczalny przy niskich wartościach pH. Dlatego wartość pH należy dostosować do 8,9 w MSP-C i MSP-D. Ważne jest, aby przemyć kolumnę buforem MSP-D, ponieważ niższe pH może spowodować wytrącanie się resztkowego kwasu cholowego i zablokowanie lub uszkodzenie kolumny.
  8. Elute MSP za pomocą MSP-G (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol). Zebrać frakcje 1 ml i monitorować absorpcję promieniowania UV przy 280 nm. Zbierz i połącz frakcje piku elucji.
  9. Przenieść zebrane frakcje MSP do probówek z membraną dializacyjną MWCO o masie 12-14 kDa i dializować z 5 litrami MSP-H (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% (w/v) glicerolu) przez 2-3 godziny w temperaturze 4 °C. Zmienić na świeży 5 l buforu MSP-H i dializować przez kolejne 12-16 godzin w temperaturze 4 °C.
  10. Dzień 5: Przenieść roztwór MSP do probówek wirówkowych i odwirować przy 18 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia osadu. Przenieść supernatant do świeżej probówki i zagęścić do 200-800 μM za pomocą urządzeń ultrafiltracyjnych z 12-14 kDa MWCO w temperaturze 4 °C. Zmierzyć stężenie za pomocą urządzenia pomiarowego UV/VIS. Do obliczenia stężenia należy użyć współczynnika ekstynkcji 27,31 M-1 cm-1 i masy cząsteczkowej 31,96 kDa.
    UWAGA: Ekspresja w bioreaktorze zwykle daje 15-30 mg MSP1E3D1 na kulturę L.
  11. Szokowe zamrażanie podwielokrotności stężonego roztworu MSP w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Montaż MSP1E3D1 nanodysków

  1. Dzień 1: Przygotuj 1-2 ml 50 mM zapasów lipidów (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC lub POPC) w 100 mM cholanu sodu. Przechowywać w temperaturze -20 °C, jeśli nie jest używany tego samego dnia.
    UWAGA: Roztwór lipidowy musi być klarowny. Jeśli roztwór nie jest klarowny, stężenie cholanu sodu można zwiększyć do 150 mM.
  2. Wymieszać MSP1E3D1 roztwór z roztworem lipidowym. Dodać dodecylofosfocholinę (DPC) w końcowym stężeniu 0,1% (w/v). Reakcje montażu można dostosować do końcowych objętości 3 ml (tabela 2) lub 12 ml odpowiadających typowym objętościom kaset dializacyjnych (10 kDa MWCO). Reakcje składania inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 21 °C przy delikatnym mieszaniu.
    UWAGA: Dla każdego lipidu należy zastosować określony stosunek MSP1E3D1 do lipidów, aby zapewnić jednorodne przygotowanie nanodysku (Tabela 2). W przypadku nowych lipidów lub mieszanin lipidów optymalny stosunek należy określić za pomocą eksperymentu pilotażowego i analizy chromatografii wykluczającej rozmiar14.
  3. Wstępnie zwilżyć membranę kasety dializacyjnej buforem do tworzenia krążków (DF) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl). Przenieść mieszaninę montażową do kasety dializacyjnej za pomocą strzykawki. Potencjalne pęcherzyki powietrza można usunąć poprzez aspirację za pomocą strzykawki.
  4. Dni 1-4: Dializować na 3 x 5 l buforze DF przez 10-20 godzin w temperaturze pokojowej pod mieszaniem za pomocą mieszadła. Następnie przenieść mieszaninę montażową z kasety dializacyjnej do odśrodkowych jednostek filtrujących o mocy 10 kDa MWCO zrównoważonej buforem DF. Koncentrat w temperaturze 4 000 x g w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Mętna mieszanina dializacyjna może wskazywać na nieprawidłowy stosunek stechiometryczny MSP:lipid. Osad musi być usuwany w temperaturze 18 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C przed zatężeniem próbki. Aby uniknąć wytrącania się podczas zagęszczania próbki, należy stosować jednostki ultrafiltracji z dużym martwym punktem.
  5. Zagęścić zmontowane nanodyski do stężenia co najmniej 300 μM. Zmierzyć stężenie za pomocą czytnika UV/VIS. Weź pod uwagę, że jeden nanodysk jest tworzony przez dwie cząsteczki MSP1E3D1, a zatem stężenie MSP należy podzielić przez 2, aby określić prawidłową ilość nanodysków.
    UWAGA: Opisany układ (Tabela 2) da 0,6-1 ml roztworu nanodysku o stężeniu 300 μM.
  6. Odwirować skoncentrowany preparat nanodysku o sile 18 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia osadu. Następnie odessać supernatant i szokowo zamrozić 50 μl podwielokrotności w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Zaleca się ocenę powodzenia tworzenia nanodysków za pomocą chromatografii wykluczania wielkości. Próbka powinna być monodyspersyjna i powinna zawierać tylko niewielką ilość kruszyw. Agregaty wskazują, że ilość lipidów w zestawie jest zbyt wysoka. Jako odniesienie można użyć oczyszczonej MSP1E3D1. Jeśli preparat nanodysku wykazuje pik na wysokości piku referencyjnego MSP1E3D1, wybrany stosunek lipidów do MSP1E3D1 był zbyt niski.

5. Skala preparatywna 3 ml CECF zestaw do reakcji

  1. Dzień 1: Przygotować wszystkie niezbędne roztwory podstawowe zgodnie z podanymi danymi (Tabela 3). Zapasy są przechowywane w temperaturze -20 °C i rozmrażane w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że wszystkie buliony zostały dokładnie wymieszane po rozmrożeniu i przed pipetowaniem. Obliczyć wymagane objętości dla wszystkich zapasów i sporządzić schemat pipetowania (tabela 4). Związki o dużej masie cząsteczkowej będą dodawane tylko do RM. Dla związków o niskiej masie cząsteczkowej można przygotować kombinowaną 3 x mastermix dla RM i FM.
    UWAGA: Końcowe objętości mieszanin złożonych mogą być mniejsze niż obliczone ze względu na utratę objętości podczas mieszania. Można tego uniknąć, dodając nadmiar objętości 2-5%, aby skompensować utratę objętości.
  2. Zrównoważyć membranę kasety dializacyjnej o pojemności 3 ml w 100 mM octanu trisu o pH 8,0. Upewnij się, że usunąłeś nadmiar bufora.
  3. Za pomocą strzykawki przenieść RM do kasety dializowej. Usunąć nadmiar powietrza z komory RM przez zassanie strzykawką. Umieścić kasetę dializacyjną w komorze dializy.
  4. Napełnij komorę dializacyjną 60 ml FM. Umieść pokrywę na komorze i dokręć, aby ją zamocować. Inkubować komorę przez 12-16 godzin w temperaturze 30 °C przy 200 obr./min.
    UWAGA: Upewnij się, że komora pozostaje w pozycji pionowej podczas mieszania, w przeciwnym razie wymiana związków o niskiej masie cząsteczkowej będzie utrudniona.
  5. Dzień 2: Za pomocą strzykawki odessać RM z komory dializowej. Przenieść RM do świeżych probówek i odwirować przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu usunięcia osadu. Przenieść supernatant do świeżych probówek. Białko w supernatancie może być teraz dalej analizowane.
    UWAGA: W niektórych przypadkach po odwirowaniu pojawi się osad. Może to dostarczyć ważnych informacji na temat przydatności analizowanych nanodysków lub związków reakcyjnych do utrzymania rozpuszczalności zsyntetyzowanego MP. Dlatego zaleca się analizę ilości celu potencjalnie obecnego w osadzie za pomocą SDS-PAGE, Western Blot lub poprzez wizualną ocenę wielkości osadu.

6. Waga analityczna 60 μL CECF do badania przesiewowego jonów Mg2+

  1. Dzień 1: Wymieszaj wszystkie składniki odpowiedniej 3x mieszanki głównej i rozprowadź 60 μl do RM i 825 μl do FM. Napełnij FMH2Oi wymieszaj FM przez wirowanie. Przenieś FM do 3 dołków 24-dołkowej mikropłytki (Tabela 5).
    UWAGA: Ponieważ niestandardowy pojemnik Mini-CECF może być niedostępny, objętości w tabeli 5 są obliczane dla reakcji przeprowadzonej we wkładach dializacyjnych (10-14 kDa MWCO, RM: 100 μL) o objętości FM 1,7 ml w 96 płytkach z głęboką studzienką (2 ml) (Rysunek 1).
  2. Pociąć probówki dializacyjne z regenerowanej celulozy za pomocą MWCO 10-14 kDa na kawałki o wymiarach około 25 x 20 mm i przechowywać w H2O z 0,05% (w/v) azydkiem sodu.
    UWAGA: Azydek sodu jest bardzo toksyczny. Unikać kontaktu ze skórą lub błoną śluzową. Nie używaj metalowych pojemników, ponieważ azydek sodu może reagować z metalami, tworząc wybuchowe azydki metali.
  3. Przed złożeniem pojemnika Mini-CECF należy usunąć nadmiarH2Oz błon dializacyjnych za pomocą chusteczki. Umieść jeden kawałek membrany na każdym pojemniku i przymocuj membrany za pomocą pierścienia z politetrafluoroetylenu.
  4. Przenieść pojemnik Mini-CECF do studzienek 24-dołkowej płytki z 825 μl FM. Należy unikać pęcherzyków powietrza poniżej membrany dializacyjnej pojemnika Mini-CECF.
  5. Dodać składniki wysokocząsteczkowe do RM zgodnie z opisem (Tabela 5) i mieszać, pipetując w górę i w dół. Dodać 60 μl do pojemnika reakcyjnego. Unikać pęcherzyków powietrza podczas przenoszenia lepkiego roztworu.
  6. Wyciąć 2 arkusze termoplastycznej folii uszczelniającej o wymiarach 8 x 10 cm i owinąć je wokół płytki 24-dołkowej z pojemnikami reakcyjnymi w środku. Zmniejszy to parowanie z mieszaniny reakcyjnej. Teraz umieść pokrywkę płytki do hodowli komórkowej na płytce i przymocuj ją taśmą. Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C i mieszaniu 200 obr./min przez 12-16 godzin.
  7. Dzień 2: Zebrać mieszaninę reakcyjną, przebijając przez membranę dializacyjną końcówką pipety w pojemniku Mini-CECF i odessać RM. Przenieść RM do świeżych probówek i odwirować przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu usunięcia osadów. Przenieść supernatant do świeżych probówek. Białko w supernatancie może być teraz dalej analizowane.
    UWAGA: W niektórych przypadkach po odwirowaniu będzie obecny osad. Może to dostarczyć ważnych informacji na temat przydatności analizowanych nanodysków lub innych związków reakcyjnych do utrzymania rozpuszczalności zsyntetyzowanego MP. Dlatego zaleca się analizę ilości celu potencjalnie obecnego w osadzie za pomocą SDS-PAGE, Western Blot lub wizualnej oceny wielkości granulek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wpływ precyzyjnego dostrajania związków reakcyjnych na ostateczną wydajność lub jakość syntetyzowanych MPs jest zilustrowany. Często rutynowym podejściem jest dostosowanie optymalnego stężeniaMg2+ w reakcjach CF poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) jako wygodnego monitorowania wydajności systemu. Na przykład GFP zsyntetyzowano z wektora pET-21a(+) przy stężeniach Mg2+ między 14 a 24 mM (Rysunek 2). Analiza SDS-PAGE pozwoliła na zidentyfikowanie optymalnego stężen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano konfigurację i strategie optymalizacji ekspresji mukowiscydozy i kotranslacyjnej insercji funkcjonalnych MP do nanodysków. Wymagane wyposażenie składa się z bioreaktora, prasy francuskiej lub podobnego, czytnika UV/VIS i fluorescencji, naczyń reakcyjnych CF odpowiednich do konfiguracji dwukomorowej oraz inkubatora z kontrolowaną temperaturą. Kolejnym standardowym wyposażeniem są wirówki do zbierania komórek E. coli, a także wirówki stołowe o wydajności co najmniej 30 000 x g do przygotowania liz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) grant BE1911/8-1, projektowi GLUE LOEWE oraz wspólnemu centrum badawczemu Transport and Communication across Membranes (SFB807) za wsparcie finansowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sól sodowa) (DMPG)Avanti Polar Lipids (USA)840445P
1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC)Avanti Polar Lipids (USA)850345C
1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina (sól sodowa) (DOPC)Avanti Polar Lipids (USA)850375C
1,2 dioleoilo-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sól sodowa) (DOPG)Avanti Polar Lipids (USA)840475C
1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina (POPC)Avanti Polar Lipids (USA)850457C
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sól sodowa) (POPG)Avanti Polar Lipids (USA)840034C
2-amino-2-(hydroksymetylo)- propan-1,3-diol (Tris)Carl Roth (Niemcy)4855
2-merkaptoetanolCarl Roth (Niemcy)4227
2-propanolCarl Roth (Niemcy)9781
[3H]-dihydroalprenololChlorowodorek American Radiolabeled Chemicals (USA)ART0134
Sól litowo-potasowa fosforanu acetylu (ACP)Merck ( Niemcy)1409
5'-trifosforan adenozyny (ATP)Sigma Aldrich (Niemcy)A9251
Chlorowodorek alprenololuMerck (Niemcy)A0360000
Materiał kolumny do chromatografii anionowej: Q-sepharose®Sigma-Aldrich (Niemcy)Q1126
Autoklaw Typ GE 446EC-1Gettinge (Niemcy)
Bioreaktor Typ 884 124/1B.Braun (Niemcy)
WirówkaSorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Niemcy); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Niemcy); Mikro 22 R; Hettich (Niemcy)
Kwas cholowyCarl Roth (Niemcy)8137
Coomassie Brilliant Blue R250Carl Roth (Niemcy)3862
Kolby hodowlane Kolby z przegrodami 500 ml, kolby z przegrodami 2 lSchott Duran (Niemcy)
Sól disodowa 5'-trifosforanu cytydynySigma-Aldrich (Niemcy)C1506
D-glukoza jednowodnaCarl Roth (Niemcy)6780
Di-potaswodorofosforan trójwodnyCarl Roth (Niemcy)6878
Rurki do dializy SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standardowe rurki RCFisher Scientific (Niemcy)8700152
DithiothreitCarl Roth (Niemcy)6908
EtanolCarl Roth (Niemcy)K928
Kwas folinowy, hydrat soli wapniowejSigma-Aldrich (Niemcy)47612
Francuski zaburzacz ogniw ciśnieniowychSLM; Amico Instruments (USA)
GlicerolCarl Roth (Niemcy)3783
Sól disodowa 5'-trifosforanu guanozyny (GTP)Sigma-Aldrich (Niemcy)G8877
Kwas solnyCarl Roth (Niemcy)K025
Kolumna IMAC: HiTrap IMAC HP 5 mLGE Life Sciences (Niemcy)GE17-5248
ImidazolCarl Roth (Niemcy)3899
Izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Carl Roth (Niemcy)2316
KanamycynaCarl Roth (Niemcy)T832
L-alaninaCarl Roth (Niemcy)3076.1
L-argininaCarl Roth (Niemcy)6908
L-asparaginaCarl Roth (Niemcy)HN23
Kwas L-asparaginowyCarl Roth (Niemcy)T202
L-cysteinaCarl Roth (Niemcy)T203
Kwas L-glutaminowyCarl Roth (Niemcy)3774
L-glutaminaCarl Roth (Niemcy)3772
L-glicynaCarl Roth (Niemcy)3187
L-histydynaCarl Roth (Niemcy)3852
L-izoleucynaCarl Roth (Niemcy)3922
L-leucynaCarl Roth (Niemcy)1699
L-lizynaCarl Roth (Niemcy)4207
L-metioninaCarl Roth (Niemcy)9359
L-prolinaCarl Roth (Niemcy)1713
L-fenyloalaninaCarl Roth (Niemcy)1709
L-SerineCarl Roth (Niemcy)4682
L-treoninaCarl Roth (Niemcy)1738
L-tryptofanCarl Roth (Niemcy)7700
L-TyrozynaCarl Roth (Niemcy)T207
Jednostki dializ MD100Scienova (Niemcy)40077
N-2-hydroksyetylopiperazyna-N'-2-etanasulfonowy kwas (HEPES)Carl Roth (Niemcy)6763
n-dodecylofosfocholinaAntrace (USA)F308S
Komora PAGE: Mini-Protean Tetra CellBiorad (Niemcy)
System odlewania żelu PAGE: Mini Protean Systemy HandcastBiorad (Niemcy)
Zasilacz żelowy PAGE: Power Pac 3000Biorad (Niemcy)
Trypton/pepton z kazeinyCarl Roth (Niemcy)6681
Pompa perystaltyczna: ip-12Ismatec (Niemcy)
Sól monopotasowa pirogronianu fosfoenoluSigma Aldrich (Niemcy)860077
Diwodorofosforan potasuCarl Roth (Niemcy)P018
Octan potasuCarl Roth (Niemcy)4986
Chlorek potasuCarl Roth (Niemcy)6781
Kinaza pirogronianowaRoche (Niemcy)10109045001
Licznik scyntylacyjny: Hidex 300 SLHidex (Finlandia)
Granulki SDSCarl Roth (Niemcy)8029
Azydek soduSigma-Aldrich (Niemcy)K305
Chlorek soduCarl Roth (Niemcy)P029
Spektrofotometr NanodropPeqlab (Niemcy)
Spektrofotometr/czytnik fluorescencji Spark®Tecan (Szwajcaria)
tRNA (E. coli)Roche (Niemcy)10109550001
UltrasonificatorLabsonic U, B. Braun (Niemcy)
Sól trisodowa 5'-trifosforanu urydyny (UTP)Sigma-Aldrich (Niemcy)U6625
Y-30 przeciwpieniącySigma-Aldrich (Niemcy)A6457
Ekstrakt drożdżowyCarl Roth (Niemcy)2904

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  2. Ritchie, T. K., et al. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs. Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).
  3. Frauenfeld, J., et al. A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  4. Yang, Z., et al. Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains. Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).
  5. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  6. Junge, F., et al. Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology. 28 (3), (2011).
  7. Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).
  8. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  9. Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Membrane protein expression: no cells required. Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).
  10. Roos, C., et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).
  11. Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).
  12. Patriarchi, T., et al. Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).
  14. Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).
  15. Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 1-19 (2017).
  16. Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  17. Henrich, E., et al. Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway. Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).
  18. Peetz, O., et al. Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).
  19. Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).
  20. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  21. Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs. BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).
  22. Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding. Methods. 147 (1), 73-83 (2018).
  23. Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer. Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).
  24. Matthies, D., et al. Cell-free expression and assembly of ATP synthase. Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).
  25. Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins. Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).
  26. Haberstock, S., et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).
  27. Falkinham, J. O., Clark, A. J. Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12. Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).
  28. Foshag, D., et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).
  29. Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).
  30. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  31. Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).
  32. Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).
  33. Henrich, E., et al. From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs. Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).
  34. Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspresja bezkom rkowafa dowanie bia ekbez u ycia detergent wsk ad lipidowyproteorodopsynaGPCRanaliza strukturalna

Powiązane artykuły