Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowana analiza chodu w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej u gryzoni z uszkodzeniem nerwów obwodowych lub stłuczenia rdzenia kręgowego

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61852

⸱

6 października 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hand-, Plastic, Reconstructive and Burn Surgery, BG Trauma Center Tubingen, Eberhard Karls University, 2Ludwig Boltzmann Institute for Experimental and Clinical Traumatology, 3Austrian Cluster for Tissue Regeneration

W tym artykule

Podsumowanie

Zautomatyzowana analiza chodu jest możliwym narzędziem do oceny funkcjonalnego powrotu do zdrowia w modelach gryzoni z uszkodzeniem nerwów obwodowych i uszkodzeniem rdzenia kręgowego. Chociaż wymaga to tylko jednego zestawu do oceny funkcji lokomotorycznych w różnych modelach eksperymentalnych, bardzo ważne jest skrupulatne dostosowanie i szkolenie zwierząt w sprzęcie i sprzęcie.

Streszczenie

Uszkodzenia nerwów obwodowych i centralnych są najczęściej badane u gryzoni, zwłaszcza szczurów, biorąc pod uwagę fakt, że te modele zwierzęce są zarówno opłacalne, jak i opublikowano wiele danych porównawczych w literaturze. Obejmuje to wiele metod oceny w celu zbadania funkcjonalnej regeneracji po uszkodzeniu i naprawie nerwów. Oprócz oceny regeneracji nerwów za pomocą histologii, elektrofizjologii i innych technik oceny in vivo i in vitro, regeneracja funkcjonalna jest najważniejszym kryterium określającym stopień regeneracji neuronów. Zautomatyzowana analiza chodu umożliwia rejestrowanie ogromnej liczby parametrów związanych z chodem, takich jak obszar odcisku palca i prędkość wymachu łapy, a także pomiary koordynacji między kończynami. Ponadto metoda dostarcza cyfrowych danych o łapach szczurów po uszkodzeniu neuronów i podczas regeneracji nerwów, przyczyniając się do naszego zrozumienia, w jaki sposób urazy obwodowych i ośrodkowych nerwów wpływają na ich zachowanie lokomotoryczne. Oprócz głównie stosowanego modelu uszkodzenia nerwu kulszowego, za pomocą tej metody można badać inne modele uszkodzenia nerwów obwodowych, takie jak nerw udowy. Oprócz urazów obwodowego układu nerwowego można ocenić zmiany w ośrodkowym układzie nerwowym, np. stłuczenie rdzenia kręgowego. Prawidłowa i powtarzalna ocena danych jest silnie uzależniona od skrupulatnego dostosowania ustawień sprzętowych i programowych przed pozyskaniem danych. Dodatkowo kluczowe znaczenie ma odpowiednie szkolenie zwierząt doświadczalnych. Praca ta ma na celu zilustrowanie zastosowania skomputeryzowanej automatycznej analizy chodu do oceny funkcjonalnej regeneracji w różnych modelach zwierzęcych uszkodzenia nerwów obwodowych, a także uszkodzenia stłuczenia rdzenia kręgowego. Podkreślono również ograniczenia metody, np. ocenę regeneracji nerwów u szczurów z nerwicem nerwu kulszowego z powodu ograniczonej regeneracji funkcjonalnej. Dlatego uważa się, że protokół ten pomoże naukowcom zainteresowanym urazami obwodowych i ośrodkowego układu nerwowego w ocenie funkcjonalnego powrotu do zdrowia w modelach gryzoni.

Wprowadzenie

Urazy obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego są często badane u gryzoni, co skutkuje dużą ilością danych porównawczych dotyczących przebiegu uszkodzenia nerwów, naprawy lub neuroprotekcji, aby przeciwdziałać dalszym wtórnym urazom i regeneracji1,2,3. Wynik eksperymentalnych strategii leczenia w modelach gryzoni można ocenić za pomocą różnych technik, takich jak histologia, immunohistochemia, elektrofizjologia i techniki obrazowania, takie jak skany mikrotomografii rentgenowskiej (μCT), ale najważniejszym kryterium określającym powodzenie leczenia jest - podobnie jak u ludzi - stopień poprawy funkcjonalnej4, 5. Pierwsze badania nad sprawnością lokomotoryczną gryzoni pochodzą z lat czterdziestych XX wieku6,7,8. Szczury i myszy zostały poddane wielu badaniom nad ich zachowaniem lokomotorycznym w następnych dziesięcioleciach9,10,11. Obecnie istnieje szeroki zakres technik oceny modeli urazów nerwów obwodowych i ośrodkowych u gryzoni, począwszy od analizy ścieżki chodzenia za pomocą tuszu i papieru12,13,14 nad kinematyką stawu skokowego i chodu15,16,17 do metod ulepszonych uczenia maszynowego, które pozwalają na złożone oszacowanie trajektorii chodu, kończyn i stawów18,19.

Komputerowa Automatyczna Analiza Chodu (AGA) służy do oceny funkcji lokomotorycznych po urazach obwodowych i ośrodkowego układu nerwowego oraz potencjalnego eksperymentalnego leczenia takich urazów. Urządzenie składa się głównie ze szklanego chodnika oraz źródła światła, które oświetla odciski łap gryzoni w korelacji z przekroczonym przez nie ciśnieniem. Dane te są następnie komputeryzowane w celu obliczenia szerokiego zakresu parametrów statycznych i dynamicznych. Według Deumensa, parametry te można dalej podzielić na kategorie parametrów ogólnych, parametrów związanych z bólem, a także parametrów związanych z koordynacją chodu20 (Tabela 1). Wykonalność AGA do wykrywania zmian w zachowaniu chodu została udowodniona w różnych modelach zwierzęcych uszkodzenia nerwów obwodowych (PNI)21, takich jak nerw kulszowy20, nerw udowy22 i nerw pośrodkowy23,24. Jest również rutynowo stosowany do oceny funkcji lokomotorycznych u szczurów z uszkodzeniami ośrodkowego układu nerwowego, np. udar mózgu25 lub stłuczenie rdzenia kręgowego26. Postęp tej metody polega na dużej ilości porównywalnych danych i możliwości rejestrowania mnóstwa parametrów związanych z chodem27. Niniejszy artykuł ma na celu dostarczenie naukowcom zainteresowanym zwierzęcymi modelami PNI i uszkodzenia rdzenia kręgowego (SCI) szczegółowych i praktycznych wytycznych do oceny funkcji lokomotorycznych w takich modelach.

kategoriaparametrOpis
Ogólne parametry choduObszar wydruku (jednostka odległości)Obszar odcisku łapy
Długość wydruku (jednostka odległości)Długość odcisku łapy
Baza wsparcia (BoS) (jednostka odległości)Odległość między dwoma tylnymi lub przednimi łapami
Długość kroku (jednostka odległości)Odległość między dwoma kolejnymi położeniami łapy
Parametry chodu związane z bólemCzas wymachu (s)Czas trwania fazy wymachu
Czas stania (s)Czas trwania fazy podporu
Średnia intensywność odcisku łapy (dowolna jednostka)Średnia intensywność iIntensity odcisku łapy podczas fazy podstawienia
Parametry chodu związane z koordynacjąWzorce sekwencji kroków normalnych (NSSP)Określone sekwencje ułożenia łap podczas cyklu krokowego
Dyspersje fazowe (%)Różnice czasowe między cyklami kroków dwóch konkretnych łap
Wskaźnik regularności (RI) (%)Kwantyfikacja koordynacji międzykończynowej poprzez podzielenie ilości bezbłędnych NSSP razy 4 przez całkowitą liczbę ułożenia łap podczas jednego cyklu krokowego

Tabela 1: Parametry chodu, które można ocenić za pomocą automatycznej analizy chodu. Kategorie, w których klasyfikowane są parametry, są wybierane zgodnie z Deumens et al.20.

Protokół

Protokół eksperymentalny dla wszystkich doświadczeń został zatwierdzony z wyprzedzeniem przez Komisję ds. Protokołów Zwierzęcych Rządu Miasta Wiednia. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone w pełnej zgodności z Deklaracją Helsińską dotyczącą praw zwierząt oraz Wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych Narodowych Instytutów Zdrowia (National Institutes of Health).

1. Zakwaterowanie zwierząt

  1. Utrzymuj samce szczurów (rasy Lewis lub Sprague Dawley) o masie 250–300 g w cyklu oświetlenia 12 h światła/ciemności z dostępem ad libitum do pożywienia i wody.
  2. Kontroluj zarówno temperaturę pokojową (utrzymywaną na poziomie 20–22 °C), jak i wilgotność (45%–65 %), aby zapewnić odpowiednie warunki bytowe zwierząt. W niniejszej pracy wykorzystano samce szczurów rasy Lewis (PNIs) oraz Sprague Dawley (SCI).
  3. Zapewnij nową, wyczyszczoną klatkę dwa razy w tygodniu. Utrzymuj szczury w grupach po dwa lub trzy osobniki i uważnie monitoruj ich zachowania społeczne oraz interakcje. Pozostaw szczury na okres aklimatyzacji trwający co najmniej 1 tydzień przed jakimkolwiek zabiegiem chirurgicznym lub badaniem funkcjonalnym.
    UWAGA: Szczury wymagają co najmniej 5 dni codziennego treningu na aparaturze do analizy chodu przed operacją, dlatego należy zaplanować co najmniej 2 tygodnie odstępu między przybyciem szczurów do placówki a wyznaczoną datą operacji eksperymentalnej28.

2. Indukcja uszkodzenia nerwu

UWAGA: Należy stosować środki ochrony osobistej, takie jak fartuch chirurgiczny, rękawiczki i maskę. W przypadku braku jałowego fartucha chirurgicznego wystarczający jest czysty, wyprany fartuch laboratoryjny. O ile nie ulegnie zanieczyszczeniu, fartucha lub kitla nie trzeba zmieniać między zwierzętami, a jedynie pomiędzy sesjami chirurgicznymi. Zaleca się stosowanie jałowych rękawiczek chirurgicznych. W przypadku ich braku można użyć rękawiczek do badania, które należy jednak umyć przed operacją za pomocą środka do dezynfekcji chirurgicznej. Rękawiczki należy zmieniać między zwierzętami.

  1. W dniu operacji należy starać się zminimalizować stres zwierząt, ponieważ może on wpłynąć na przebieg znieczulenia, np. zwierzęta mogą wymagać wyższych dawek środków anestetycznych.
  2. W dniu operacji, na 1 h przed zabiegiem, wstrzyknij podskórnie 0.05 mg Buprenorphine/kg masy ciała w zawiesinie z 100-200 μL 0.9% NaCl, używając kaniuli 25 G, w celu zapewnienia przeciwbólowego działania przed i w trakcie operacji. Jeśli nie wskazano inaczej, preferowanym miejscem iniekcji jest bok szczura.
  3. Uśp szczury, umieszczając je w komorze indukcyjnej do znieczulenia podłączonej do waporyzatora sewofluranu i aktywnego pochłaniacza wapna w celu absorpcji CO2. Znieczul szczura, napełniając komorę mieszanką sewofluranu z tlenem o stężeniu 4%–5% przez około 5 min przy przepływie tlenu 1.5 L/min (faza inicjacji). Przymocuj klips pulsoksymetryczny do jednej z łap, aby monitorować wysycenie krwi tlenem u gryzonia. Utrzymuj stan znieczulenia ogólnego za pomocą mieszanki sewofluranu z tlenem o stężeniu 2.5%–4.5%.
    UWAGA: W przypadku chirurgii eksperymentalnej znieczulenie ogólne jest obowiązkowe. Potwierdź wystąpienie znieczulenia ogólnego, sprawdzając brak reakcji na bodziec uciskowy ogona lub łap.
  4. Gdy szczur znajdzie się w stanie znieczulenia ogólnego, ogól odpowiedni obszar, który ma zostać zoperowany, a następnie zdezynfekuj go, przecierając naprzemiennie alkoholem i środkiem do dezynfekcji skóry. Ostatnie przetarcie powinno zostać wykonane środkiem do dezynfekcji skóry.
  5. Umieść zwierzę na regulowanej podkładce grzewczej w wymaganej pozycji (na plecach dla modelu nerwu udowego, na brzuchu dla modelu nerwu kulszowego i SCI). Wprowadź elastyczną sondę termometru do odbytnicy szczura, aby monitorować temperaturę zwierzęcia i utrzymywać ją na poziomie około 37 °C podczas operacji. Podczas znieczulenia chroń oczy szczura przed wysychaniem, stosując maść do oczu.

3. Chirurgiczne wywołanie uszkodzenia nerwu

  1. Podczas wykonywania procedur chirurgicznych należy ściśle przestrzegać siedmiu zasad Halsteda29 w następujący sposób:
    1. Tkanki należy zawsze traktować delikatnie. Należy unikać rozrywania lub miażdżenia tkanek.
      UWAGA: W celu odsunięcia mięśni i naczyń z pola operacyjnego pomocne są wykonane samodzielnie30 lub dostępne komercyjnie systemy retrakcyjne.
    2. Należy starannie utrzymywać hemostazę, stosując elektrokoagulację do wypalania naczyń lub podwiązki, aby zagwarantować dokładne zatamowanie krwawienia.
    3. Należy zawsze zachowywać ukrwienie tkanek poprzez ich ostrożne preparowanie i delikatne obchodzenie się z nimi.
    4. Należy zachować ścisłą asepsykę, nosząc maseczkę, fartuch i sterylne rękawiczki.
    5. Należy unikać naprężania tkanek, stosując szwy, które nie są ani zbyt ciasne, ani zbyt luźne.
    6. Tkaniki należy starannie zbliżyć, dopasowując ich krawędzie bez nakładania się na siebie.
      UWAGA: Jest to szczególnie istotne w przypadku neurorafii epineuralnej lub perineuralnej. Wszystkie procedury mikrochirurgiczne należy wykonywać pod powiększeniem 6x–16x przy użyciu mikroskopu operacyjnego. Idealnie, jeśli mikroskop posiada dwie pary okularów, co umożliwia obserwację operacji przez asystenta.
    7. Należy unikać powstawania przestrzeni martwych poprzez staranne zszywanie poszczególnych warstw tkanek.
  2. Indukcja neurotmezji nerwu kulszowego prawej kończyny tylnej
    1. Odsłonić prawy nerw kulszowy na poziomie środka uda, wykonując nacięcie o długości 5 cm na stronie grzbietowej kończyny tylnej za pomocą ostrza skalpela #10 zamocowanego na rękojeści skalpela #3, a następnie preparując nadkładającą muskulaturę i tkankę miękką. W ranie umieścić retraktor, aby odsunąć rozpreparowane mięśnie i skórę z pola operacyjnego. Delikatnie odsłonić nerw, usuwając otaczającą go tkankę za pomocą zakrzywionych nożyczek mikrochirurgicznych.
    2. Za pomocą prostych nożyczek mikrochirurgicznych usunąć odcinek nerwu kulszowego o długości 8 mm, 1–2 mm proksymalnie od miejsca jego trifurkacji.
    3. Obrócić odcinek nerwu o 180°, umieścić go między kikutem proksymalnym a dystalnym przeciętego nerwu kulszowego i wykonać neurorafię epineuralną w każdym miejscu za pomocą dwóch przerwanych szwów 10–0 i mikrochirurgicznego igłotrzymacza.
  3. Indukcja neurotmezji nerwu udowego prawej kończyny tylnej
    1. Wykonać podłużne nacięcie pachwiny o długości 3–4 cm za pomocą ostrza skalpela #10 zamocowanego na rękojeści skalpela #3, aby odsłonić prawy pęczek naczyniowo-nerwowy uda. Użyć nożyczek chirurgicznych do preparowania tępego, aż do odsłonięcia bifurkacji nerwu udowego. W ranie umieścić retraktor, aby odsunąć rozpreparowane mięśnie i skórę z pola operacyjnego.
    2. Przeciąć odsłonięte gałęzie ruchowe i czuciowe dystalnie od bifurkacji i wyciąć odpowiednio odcinek nerwu o długości 6 mm z każdej gałęzi za pomocą prostych nożyczek mikrochirurgicznych.
    3. Obrócić oba odcinki nerwu o 180°, umieścić je między kikutem proksymalnym a dystalnym przeciętych gałęzi nerwu udowego i wykonać neurorafię epineuralną w każdym miejscu za pomocą dwóch przerwanych szwów 11–0 i mikrochirurgicznego igłotrzymacza.
      UWAGA: Wykonać homotopowy przeszczep autologiczny nerwu, przeszczepiając odcinek ruchowy do oryginalnej gałęzi ruchowej, a odcinek czuciowy do oryginalnej gałęzi czuciowej. Alternatywnie można wykonać heterotopowy przeszczep autologiczny nerwu, przeszczepiając odcinek ruchowy do oryginalnej gałęzi czuciowej i odwrotnie.
  4. Indukcja kontuzyjnego urazu rdzenia kręgowego w odcinku piersiowym
    1. Wykonać nacięcie skóry w poprzek kręgosłupa piersiowego za pomocą ostrza skalpela #10 zamocowanego na rękojeści skalpela #3, a następnie dwa nacięcia mięśni równolegle do wyrostków kolczystych, aby ułatwić retrakcję mięśni. W ranie umieścić retraktor, aby odsunąć rozpreparowane mięśnie i skórę z pola operacyjnego.
    2. Zidentyfikować 11. kręg piersiowy (Th) i odsłonić blaszkę łuku kręgowego, usuwając nadkładającą tkankę oraz wyrostek kolczysty za pomocą kleszczy krawędziowych (rongeura).
    3. Wykonać laminektomię, używając mikrowiertarki i odpowiedniego wiertła do wywiercenia w blaszce małego otworu, nieco większego niż końcówka impaktora. Aby zapobiec uszkodzeniu rdzenia kręgowego, należy jedynie odchudzić blaszkę podczas otwierania i powiększania otworu za pomocą rongeura. Jeśli okostna jest nadal nienaruszona, należy ją ostrożnie usunąć za pomocą ostrej sondy, nie uszkadzając opony twardej.
    4. Po upewnieniu się, że otwór jest wystarczająco duży i nie destabilizuje blaszki, unieruchomić kręgosłup zwierzęcia, zaciskając go rostralnie i kaudalnie względem Th11 kleszczykami stabilizującymi impaktora. Za pomocą kółek ręcznych z przodu i z boku ustawić stalowy pręt 3–5 mm nad otworem laminektomii. Na koniec poddać wszystkie zwierzęta uderzeniu z określoną siłą 150 kilodyne, aby wywołać lekki do umiarkowanego stopień kontuzji rdzenia kręgowego4.
    5. Zamknąć ranę warstwami anatomicznymi, stosując przerwałe szwy z poliglaktynu 4–0 lub 5–0 i chirurgiczny igłotrzymacz. Dokładnie oczyścić ranę, delikatnie przecierając ją gazikiem nasączonym sterylnym 0.9% NaCl.
    6. Po operacji zwrócić zwierzęta do ich klatek i odizolować je od ekspozycji na światło i dźwięk. Ściśle monitorować zachowanie zwierząt do 7. dnia pooperacyjnego (DPO) i zapewnić odpowiednią podaż pokarmu i wody. W razie potrzeby podawać dodatkowe płyny w formie iniekcji podskórnych (np. 10 ml NaCl 0.9%).
    7. Zapewnić analgezję pooperacyjną przez minimum 2 dni, stosując np. opioidy (0.05 mg/kg masy ciała Buprenorfiny podskórnie (s.c.)) i/lub leki przeciwgorączkowe (4 mg/kg masy ciała Karprofenu s.c.). Jeśli jest to wymagane, a w przypadku modelu SCI, należy również zastosować pooperacyjną terapię antybiotykową (7.5 mg/kg masy ciała Enrofloksacyny doustnie (p.o.)).
    8. W przypadku urazu rdzenia kręgowego należy ręcznie opróżniać pęcherz szczura do czasu powrotu spontanicznego oddawania moczu.

4. Rekonwalescencja po zabiegach chirurgicznych przed analizą chodu

UWAGA: Szczury z uszkodzeniem nerwu kulszowego wykazują tendencję do obgryzania tylnych łap z powodu wystąpienia bolesnej neuropatii po urazie nerwu. Ta forma automutilacji może prowadzić do autoamputacji palców lub części odpowiedniej tylnej łapy. W przypadku stosowania modelu uszkodzenia nerwu kulszowego zaleca się wybór szczurów rasy Lewis zamiast innych szczepów, ponieważ szczepy te wykazują mniejszą tendencję do automutilacji31. Szczury z uszkodzeniem nerwu kulszowego wykazują również tendencję do rozwoju przykurczów operowanej kończyny, co może skutkować ich wykluczeniem z badania ze względu na utrudnienie w pozyskiwaniu danych. Takie zdarzenia niepożądane występują znacznie rzadziej u szczurów z urazem nerwu udowego.

  1. Codziennie po operacji należy sprawdzać stan zwierząt, zwracając szczególną uwagę na stan ich kończyn oraz łap.
    UWAGA: U szczurów z SCI, z uszkodzeniem na poziomie Th11, może dojść do wypadnięcia prącia lub odbytnicy z powodu upośledzenia naturalnej zdolności zwierząt do oddawania moczu i stolca. Zdarzenia te są zazwyczaj definiowane jako humanitarne punkty końcowe badania i oznaczają natychmiastowe wykluczenie dotkniętego zwierzęcia z badania.
  2. Kontynuować analgezję pooperacyjną do czasu, aż u szczurów ustaną wszelkie objawy związane z bólem.
  3. W przypadku uporczywego bólu podać gabapentynę (30–120 mg/kg masy ciała) p.o. w celu leczenia bólu neuropatycznego.

5. Przygotowanie przed przeprowadzeniem zautomatyzowanej analizy chodu

UWAGA: Metodologia systemu analizy chodu opiera się na rejestrowaniu zwierząt od dołu podczas przechodzenia przez szklaną płytę, która jest oświetlona zielonym światłem LED. W momencie kontaktu łap zwierząt z podłożem, obszar odcisku łapy zostaje oświetlony i zarejestrowany przez szybką kamerę wideo. Dane te są następnie przesyłane za pomocą kabla Ethernet do komputera z zainstalowanym oprogramowaniem do analizy chodu. Choć pojedyncze odciski łap mogą być klasyfikowane ręcznie przez eksperymentatora, najnowsza wersja oprogramowania oferuje również funkcję automatycznej klasyfikacji odcisków łap.

  1. Wszystkie procedury testowe należy przeprowadzać w ciemności i w warunkach braku zakłócających hałasów. Ponieważ szczury są w stanie odbierać częstotliwości nadźwiękowe, należy również upewnić się, że żadne źródła nie emitują takich dźwięków.
    UWAGA: Analizę chodu należy przeprowadzać w odstępach tygodniowych lub co dwa tygodnie; nie należy testować szczurów zbyt często, ponieważ zwłaszcza szczury linii Lewis mają tendencję do utraty zainteresowania udziałem w procedurze wraz z upływem czasu, gdy są zbyt często poddawane temu samemu ćwiczeniu. Wymagane jest jednak codzienne trenowanie szczurów przez 5 dni przed operacją, aby zaadaptowały się one do środowiska i procedury testowej.
  2. Podczas sesji treningowych oraz w dniu testu należy przygotować pomieszczenie do testów behawioralnych, wyłączając wszystkie źródła światła, które mogłyby zakłócać pracę kamery urządzenia do zautomatyzowanej analizy chodu. Ekran komputera niezbędny do akwizycji danych należy ustawić z dala od kamery, aby emitowane przez niego światło nie zakłócało obrazu.
  3. Należy upewnić się, że urządzenie jest zainstalowane w stabilnej pozycji i w sposób zapobiegający wszelkim wibracjom, ponieważ mogą one poważnie zakłócić procedurę akwizycji danych.
  4. Szczury należy przenieść do pomieszczenia do testów behawioralnych i poddać aklimatyzacji w ich własnej klatce domowej przez co najmniej 30 min przed testem.
    UWAGA: Podczas pracy ze zwierzętami należy stosować środki ochrony osobistej, takie jak fartuch chirurgiczny lub fartuch laboratoryjny, rękawiczki oraz maseczkę.

6. Wykonywanie zautomatyzowanej analizy chodu

  1. Sesje treningowe
    UWAGA: Podczas treningu zwierzęta będą przechodzić przez krzywą uczenia się, dlatego zaleca się stopniowe dostosowywanie harmonogramu treningów. Stosuj nagrody pokarmowe (np. 1–2 kawałki płatków śniadaniowych), aby nagrodzić zwierzęta po pomyślnym ukończeniu każdej sesji treningowej.
    1. Pierwszego dnia treningu delikatnie podnieś zwierzę, trzymając je pod tułowiem, i ostrożnie przenieś do wejścia na kładkę.
    2. Umieść zwierzę w obszarze wejściowym i pozwól mu zbadać otwór korytarza bez żadnej ingerencji osoby przeprowadzającej procedurę testową.
      UWAGA: Nie krzycz, nie gwiżdż, nie dmuchaj na zwierzę ani go nie szturchaj w próbie zmotywowania go do przejścia przez kładkę. Takie zachowania spowodują silny stres u zwierzęcia i dodatkowo skomplikują procedurę pozyskiwania danych.
    3. Czekaj, aż zwierzę dobrowolnie przejdzie przez kładkę, aby dotrzeć do swojej klatki domowej. Czasami, zwłaszcza u niewytrenowanych zwierząt, może to zająć kilka minut. Pierwszego dnia treningu nie oczekuje się ani nie wymaga się, aby zwierzę wykonywało nieprzerwane przebiegi z jednolitym tempem chodu. Zamiast tego powinno ono oswoić się z aparaturą testową i procedurą.
    4. Drugiego dnia treningu przyzwyczaj zwierzęta do wchodzenia na kładkę bez wahania, a także do powrotu do klatki domowej bez wahania. Niektóre zwierzęta prawdopodobnie będą już potrafiły przejść przez kładkę bez przerw, ale nie jest to jeszcze wymagane pod koniec drugiego dnia.
    5. Trzeciego dnia treningu dopilnuj, aby zwierzęta nauczyły się przechodzić przez kładkę bez wahania, węszenia lub innych ruchów eksploracyjnych. Upewnij się, że idą z jednolitym tempem.
    6. Czwartego i piątego dnia treningu powtórz poprzednie ćwiczenie, aby utrwalić procedurę testową.
      UWAGA: W przypadku, gdy zwierzę nie nabędzie niezbędnej umiejętności prawidłowego przechodzenia przez kładkę do końca 5-dniowego okresu treningowego, dodaj 2 dodatkowe dni treningu (np. weekend). Rozważ również przeprowadzenie do 3 sesji treningowych dziennie, oddzielonych co najmniej 2 h odpoczynku między poszczególnymi sesjami. W 95% przypadków zwierzę nabędzie wymagane doświadczenie treningowe do końca tego przedłużonego okresu. W rzadkich przypadkach, gdy zwierzę nadal nie opanuje tej umiejętności po 7 dniach treningu, zaleca się odroczenie planowanej sesji operacji eksperymentalnej o co najmniej 1 tydzień i powtórzenie wspomnianego reżimu treningowego.

7. Pozyskiwanie danych

UWAGA: System analizy chodu wizualizuje każdy odcisk łapy podczas chodzenia zwierzęcia i automatycznie analizuje różne parametry chodu, takie jak powierzchnia odcisku łapy (Paw Print Area), intensywność odcisku łapy (Paw Print Intensity), czas przenoszenia łapy (Paw Swing Time) oraz prędkość przenoszenia łapy (Paw Swing Speed) (Tabela 1). Ponieważ system analizy chodu rejestruje wszystkie dane na podstawie intensywności generowanej przez odciski łap zwierząt, należy upewnić się, że ustawienia kamery zostały dostosowane do masy i rozmiaru szczurów. Ponadto przed rozpoczęciem rejestracji danych należy upewnić się, że ścieżka jest sucha i czysta, aby zapobiec jakimkolwiek zakłóceniom w pozyskiwaniu danych.

  1. Przed rozpoczęciem pozyskiwania danych należy wyczyścić ścieżkę za pomocą komercyjnego środka do mycia szyb i ściągaczki. Spryskaj płytę szklaną kilka razy, a następnie przetrzyj ją ściągaczką, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z jej powierzchni. Wyczyść również spód płyty. Upewnij się, że usunąłeś wszelkie pozostałości płynu z końców ścieżki, ponieważ zwierzęta mogłyby na nie nadepnąć, co wpłynęłoby na zapisane dane.
  2. Powtarzaj procedurę czyszczenia w razie potrzeby, np. w przypadku zanieczyszczenia ścieżki oraz przed rejestracją danych szczura z innej klatki. Uważa się, że zapobiega to rozpraszaniu zwierzęcia przez zapach osobników tego samego gatunku.
  3. Przed pierwszym pozyskaniem danych dostosuj ustawienia kamery do masy zwierząt. Potwierdź to, umieszczając na ścieżce najlżejsze i najcięższe zwierzę, a następnie wybierz ustawienia kamery, które zapewnią dobrą jakość danych w obu przypadkach. Dostosuj wzmocnienie kamery (Camera Gain), czerwone światło górne (Red Ceiling Light), zielone światło ścieżki (Green Walkway Light) oraz próg intensywności zieleni (Green Intensity Threshold, GIT), aby zapewnić optymalną detekcję odcisków łap.
    UWAGA: Nie zmieniaj wybranych ustawień po rozpoczęciu pozyskiwania danych, ponieważ utrudni to porównywalność uzyskanych wyników. Wyjątkiem jest GIT, który może zostać zmieniony podczas klasyfikacji danych, jednak musi to zostać zrobione jednolicie dla wszystkich prób.
  4. Zdefiniuj i skalibruj ścieżkę, korzystając z dołączonego arkusza kalibracyjnego.
  5. Wybierz zarejestrowaną kamerę z listy w zakładce Setup.
  6. Kliknij przycisk Open Acquisition znajdujący się w zakładce Acquire.
  7. Wykonaj zdjęcie pustej, wyczyszczonej ścieżki, które będzie służyć jako referencja podczas całej następującej procedury pozyskiwania danych.
  8. Zwróć uwagę na zmianę statusu z Waiting for Snapshot na Ready for Acquisition.
  9. Kliknij przycisk Start Acquisition i zauważ zmianę statusu z Ready for Acquisition na Waiting for Run to Start.
  10. Umieść szczura na ścieżce i śledź ruch zwierzęcia na ekranie komputera. Zauważ zmianę statusu z Waiting for Run to Start na Recording Run.
    UWAGA: Oprogramowanie automatycznie sklasyfikuje przebiegi uznane za zgodne z zaprogramowanymi parametrami za pomocą zielonego symbolu, natomiast przebiegi niezgodne zostaną oznaczone symbolem czerwonym. Oprogramowanie automatycznie zatrzymuje pozyskiwanie danych po zarejestrowaniu trzech zgodnych przebiegów, ale można kontynuować proces, klikając ponownie przycisk Start Acquisition.

8. Klasyfikacja danych

UWAGA: Listę parametrów wynikowych AGA znajduje się w Tabeli 1. Wymagane są co najmniej trzy prawidłowe próby, w których zwierzę musi pewnie, bez wahania, pokonać korytarz27. Dodatkowo prędkości biegu powinny mieścić się w tych samych kategoriach, które zdefiniowano w literaturze30.

  1. Kliknij przycisk Classify w zakładce Experimental Explorer dla odpowiednich prób, które mają zostać sklasyfikowane.
  2. Odtwórz zarejestrowany przebieg z normalną prędkością, aby ocenić, czy dane są zgodne z wcześniej wymienionymi wymaganiami.
  3. W lewym górnym rogu kliknij przycisk Auto Classify, aby oprogramowanie automatycznie sklasyfikowało odciski łap.
    UWAGA: Choć oprogramowanie wykazuje wysoki stopień poprawności klasyfikacji łap, zdarza się, że nie przypisuje ono łapy do odcisków lub przypisuje ją błędnie. Należy therefore zawsze ponownie sprawdzić automatycznie sklasyfikowane odciski łap.
  4. Aby zapewnić prawidłowe obliczenie normalnych wzorców sekwencji kroków (NSSPs), należy upewnić się, że algorytm klasyfikujący nie zostanie zmylony przez niewidoczne odciski łap, co prowadziłoby do błędnych wyników NSSP (Rycina 1A). W związku z tym do obliczeń NSSP należy włączać tylko te odciski łap, które są wykrywalne w momencie, gdy widoczna jest również łapa przeciwległa, np. lewa przednia łapa (LF) i prawa tylna łapa (RH) (Rycina 1B).

Schemat analizy lokomocji z pomiarem czasu kroku do oceny ruchu czworonogów.
Rycina 1: Przykładowe dane AGA, wykazujące konieczność ręcznej weryfikacji poprawnej klasyfikacji danych. W przypadku, gdy po wykrytym postawieniu przedniej łapy następuje wykrycie postawienia drugiej przedniej łapy (A), oprogramowanie AGA może błędnie zinterpretować to jako nieskoordynowany wzorzec chodu, ponieważ nie wykryto żadnej tylnej łapy. Dlatego zaleca się zawsze dwukrotną weryfikację i wybranie początkowego odcisku łapy, który jest wykrywany w momencie, gdy widoczna jest również łapa przeciwległa (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

9. Obliczanie statystyk

UWAGA: Aby skorygować dane z przebiegu badania o zmiany związane z przyrostem masy ciała w czasie, zdecydowanie zaleca się obliczenie stosunku wartości dla łapy doświadczalnej do łapy niedoświadczalnej (np. kontrolnej). Dodatkowo należy obliczyć stosunek tego porównania łapa-do-łapy do wartości przedoperacyjnych, aby uwzględnić indywidualne różnice w wykorzystaniu łap.

  1. Kliknij przycisk View Run Statistics, aby uzyskać szczegółowy przegląd statystyk przebiegu.
  2. Wybierz File, a następnie Export, aby wyeksportować statystyki przebiegu lub statystyki prób do programu arkusza kalkulacyjnego.

Wyniki

12 szczurów poddano eksperymentalnej operacji nerwów obwodowych. U 7 szczurów wykonano resekcję nerwu kulszowego (Rysunek 2A), natomiast u 5 szczurów wywołano neurotmezję nerwu udowego (Rysunek 2B). U wszystkich zwierząt ubytek nerwu zrekonstruowano za pomocą autologicznego przeszczepu nerwu. U 6 szczurów wywołano stłuczenie rdzenia kręgowego (Rysunek 2C) na poziomie Th11, co dało łącznie 18 szczurów.

Procedura chirurgiczna na próbkach tkanek; paski skali 5 mm i 2 mm; metoda sekcji anatomicznej.
Rysunek 2: Miejsca operacyjne po rekonstrukcji nerwu.Rekonstrukcja nerwu z zastosowaniem autograftów w nerwie kulszowym (A) i nerwie udowym (B) oraz po urazie kontuzyjnym rdzenia kręgowego (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wszystkie zwierzęta dobrze zniosły zabieg chirurgiczny i nie odnotowano przypadków samookaleczeń. U jednego zwierzęcia z grupy z uszkodzeniem nerwu kulszowego w trakcie okresu obserwacji pooperacyjnej rozwinęły się silne przykurcze prawej tylnej łapy, co wymagało wykluczenia go z dalszej analizy danych.

Neurotmeza nerwu kulszowego
Ponieważ nerw kulszowy zapewnia unerwienie mięśniowe i czuciowe większości kończyny tylnej, jego resekcja skutkuje ciężkim upośledzeniem funkcji motorycznych. Po urazie szczury wykorzystują do podparcia ciężaru ciała jedynie piętę łapy (Rycina 3B–E), a kończyna jest poruszana w szerokim ruchu okrężnym. W związku z tym zmiany motoryczne oceniane za pomocą AGA stają się widoczne poprzez znaczące zmniejszenie powierzchni śladu (Print Area) (Rycyna 4A) oraz znaczące wydłużenie czasu przeniesienia (Swing Time) (Rycyna 4B). Oba parametry pozostawały istotnie zmienione w porównaniu z pomiarami przedoperacyjnymi (Pre-OP) jeszcze pod koniec okresu obserwacji. Co istotne, u jednego zwierzęcia od 10. tygodnia po operacji (WPO) rozwinęły się silne przykurcze prawej tylnej łapy. Doprowadziło to do zwiększenia powierzchni śladu prawej tylnej łapy do ponad 150% w porównaniu z lewą łapą w 12. tygodniu po operacji (WPO12) (Rycina 5). Ponieważ była to wartość ekstremalna w porównaniu ze wszystkimi innymi zwierzętami ocenianymi w tym badaniu, wykluczyliśmy to zwierzę z analizy danych dotyczących powierzchni śladu.

Obrazowanie mózgu, analiza plastyczności kory wzrokowej przed i po operacji, wyniki mikroskopii fluorescencyjnej.
Rysunek 3: Reprezentatywne odciski łap przed i po resekcji krytycznej wielkości prawego nerwu kulszowego oraz naprawie za pomocą autoprzeszczepu. Zwróć uwagę na znaczny spadek powierzchni odcisku (Print Area) po uszkodzeniu nerwu (B) w porównaniu do stanu przedoperacyjnego (A). Pomimo niewielkiego wzrostu powierzchni odcisku w trakcie okresu obserwacji (C–E), odciski łap prawej kończyny tylnej pozostały wyraźnie zmienione w stosunku do pomiarów wyjściowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykresy stosunku powierzchni nadruku (Print Area) i czasu przenoszenia (Swing Time) (RH/LH) przedstawiają wyniki analizy statystycznej, wykres liniowy.
Rycina 4: Przebieg regeneracji funkcjonalnej po resekcji krytycznej długości i naprawie aut przeszczepem nerwu kulszowego. Stosunek powierzchni nadruku (Print Area Ratio) (A) oraz stosunek czasu przenoszenia (Swing Time Ratio) (B) uległy istotnym statystycznie zmianom w stosunku do wartości przedoperacyjnych (Pre-OP) bezpośrednio po resekcji nerwu kulszowego. Podczas gdy powierzchnia nadruku pozostawała istotnie zmniejszona w porównaniu z wartością wyjściową aż do 10. tygodnia po operacji (WPO10), czas przenoszenia był nadal istotnie zwiększony w stosunku do wartości Pre-OP w WPO12. *: p < 0.05 w porównaniu do Pre-OP, **: p < 0.01 w porównaniu do Pre-OP. Słupki błędów oznaczają średnią ± błąd standardowy średniej (SEM). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza stosunku powierzchni druku; wykres pudełkowy; analiza danych w okresie 12 tygodni przed i po operacji.
Rysunek 5: Wykres pudełkowy przebiegu powierzchni druku (Print Area) po uszkodzeniu nerwu kulszowego. Należy zwrócić uwagę na wartość ekstremalną (czerwona elipsa) w WPO12, co wynika z faktu, że u jednego zwierzęcia od WPO10 rozwinęły się silne przykurcze prawej tylnej łapy. Zwierzę to zostało zatem wykluczone z analizy statystycznej przedstawionej na Rysunku 4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Neurotmeza nerwu udowego
Resekcja nerwu udowego prowadzi do denerwacji mięśnia czworogłowego uda33,34. W konsekwencji upośledzone zostaje wyprost kolana, co skutkuje nadmiernym zgięciem stawu skokowego i następczym unoszeniem pięty łapy. W związku z tym powierzchnia odcisku łapy (Print Area) (Rycina 6B) odpowiedniej kończyny jest po operacji znacznie zredukowana. Powierzchnia odcisku lewej tylnej łapy zwiększa się z powodu kompensacyjnego przeniesienia ciężaru ciała na lewą stronę. Należy mieć to na uwadze, ponieważ zjawisko to bezpośrednio wpływa na obliczony stosunek między łapą „eksperymentalną” a „kontrolną”. Począwszy od WPO4, reinnerwacja mięśnia czworogłowego przez regenerujący się nerw udowy prowadzi do odwrócenia tych zmian, co skutkuje zwiększeniem powierzchni odcisku prawej tylnej łapy (Rycina 7A). Ponieważ mięsień czworogłowy uda odgrywa również rolę w fazie przenoszenia odpowiedniej łapy, czas przenoszenia (Swing Time) (Rycina 7B) jest znacznie wydłużony u szczurów z uszkodzeniem nerwu udowego. Podobnie jak w przypadku powrotu powierzchni odcisku, czas przenoszenia ulega skróceniu w miarę docierania regenerującego się nerwu udowego do mięśnia czworogłowego uda. W WPO10 oba parametry chodu powróciły do wartości wyjściowych, co sygnalizuje pełny powrót funkcji.

Diagram aktywności mózgu przed i po operacji; obrazowanie w kolejnych tygodniach; identyfikacja obszarów RH i LH.
Rycina 6: Reprezentatywne odciski łap. Reprezentatywne odciski łap przed (A) i po (B–E) resekcji prawego nerwu udowego i naprawie za pomocą autoprzeszczepu. Powierzchnia odcisku RH silnie zmniejszyła się w WPO2 (B), podczas gdy widoczny stał się wzrost powierzchni odcisku lewej tylnej łapy (LH) z powodu zwiększonego obciążenia wagą. Powierzchnia odcisku RH zaczęła rosnąć od WPO6 (C), czemu towarzyszył spadek powierzchni odcisku LH. W WPO8 (D) i WPO10 (E) powierzchnia odcisku RH powróciła do poziomu zbliżonego do wartości przedoperacyjnych. (Zaadaptowano za zgodą Heinzel et al.22, na licencji CC BY 4.0.) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres liniowy stosunków powierzchni nadcisku i czasu przenoszenia (RH/LH); wyniki analizy chodu w ciągu 10 tygodni.
Rysunek 7: Przebieg powrotu do sprawności funkcjonalnej po resekcji 7 mm i naprawie aut przeszczepem nerwu udowego. Przebieg stosunku powierzchni nadcisku (A) oraz stosunku czasu przenoszenia (B) wykazał gwałtowną zmianę bezpośrednio po resekcji nerwu udowego, jednak wartości powróciły do poziomu przedoperacyjnego w 8. tygodniu po operacji (WPO8). #: p < 0,05. Słupki błędów oznaczają średnią ± SEM. (Adaptowano za zgodą Heinzel i wsp.22, na licencji CC BY 4.0.) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Stłuczenie rdzenia kręgowego
Analiza chodu wykazała wyraźnie zmienione odciski łap po stłuczeniu rdzenia kręgowego na poziomie piersiowym (Rysunek 8), z czego najbardziej zauważalny był spadek pola powierzchni odcisku (Print Area) oraz wyraźna rotacja wewnętrzna tylnych łap w WPO2 (Rysunek 8B). Co istotne, rotacja łap jest również uwzględniona jako mierzalna cecha w skali BBB, co podkreśla przydatność komputerowej analizy chodu w ocenie zmian w sposobie poruszania się, które pierwotnie oceniano za pomocą testu Open Field. W odniesieniu do przebiegu poszczególnych parametrów chodu, stłuczenie rdzenia kręgowego na poziomie Th11 spowodowało spadek stosunku pola powierzchni odcisku (Print Area Ratio) (Rysunek 9A) oraz wzrost stosunku czasu przenoszenia łapy (Swing Time Ratio) (Rysunek 9B). Oba parametry wykazywały tendencję do powrotu do poziomów bazowych w dalszym okresie obserwacji, jednak nie zaobserwowano statystycznie istotnych zmian. Parametr związany z koordynacją, wskaźnik regularności (Regularity Index) (Rysunek 9C), również uległ zmniejszeniu w WPO2, jednak stopień tego spadku znacznie różnił się między zwierzętami. Wykazywał on również tendencję do powrotu do wartości przedoperacyjnych aż do WPO16. Podstawa podparcia (Base of Support) tylnych łap (Rysunek 9D), będąca ogólnym parametrem chodu według Deumensa, wykazała wyraźny wzrost, który był statystycznie istotny od WPO10 do WPO14. W WPO16 parametr ten dążył do poziomów bazowych i w tym punkcie czasowym nie był już istotnie zmieniony w stosunku do wartości przedoperacyjnej (Pre-OP).

Schemat aktywności mózgu w fMRI; oś czasu rekonwalescencji pooperacyjnej, od przedoperacyjnego do 16. tygodnia po operacji, analiza prawej i lewej półkuli.
Rycina 8: Reprezentatywne odciski obu tylnych łap. Odciski łap przed operacją (A) oraz po urazie kontuzyjnym piersiowego odcinka rdzenia kręgowego (B–F). Zauważalny jest spadek powierzchni odcisku począwszy od WPO2 (B), któremu towarzyszy wyraźna rotacja wewnętrzna łap. W trakcie okresu obserwacji (C–F) widoczny jest wzrost powierzchni odcisku oraz ustępowanie rotacji wewnętrznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza równowagi statycznej z wykresami dla powierzchni nadruku, czasu przeniesienia, indeksu regularności, podstawy podparcia.
Rycina 9: Stłuczenie rdzenia kręgowego na poziomie Th 11.Stłuczenie rdzenia kręgowego na poziomie Th 11 spowodowało zauważalne zmiany w stosunku powierzchni nadruku (A), czasie przeniesienia (B) oraz indeksie regularności (C), jednak zmiany te nie były istotne statystycznie. Po urazie podstawa podparcia tylnych łap wykazała wyraźny wzrost w porównaniu z wartością bazową, co było istotne statystycznie od WPO10 do WPO14. *: p < 0.05 w porównaniu z Pre-OP. Słupki błędów oznaczają średnią ± SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający 1: Szczegóły rozwiązywania problemów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Ocena odbudowy funkcjonalnej w modelach zwierzęcych PNI i SCI pozostaje wyzwaniem ze względu na dużą różnorodność metod oceny, z których każda ma indywidualne zalety i wady. Tylko kilka podejść zostało przetestowanych i zweryfikowanych w wielu modelach urazów obwodowych i ośrodkowego układu nerwowego, chociaż obiecujące nowe techniki, które łączą śledzenie ruchu i uczenie maszynowe, mogą potencjalnie przenieść badania neurobehawioralne na wyższy poziom testów funkcjonalnych. Jesteśmy przekonani, że wkrótce pojawią się najnowocześniejsze metody, które będą miały szerokie zastosowanie w wielu różnych modelach zwierząt i urazów. W świetle tych rozważań jedną z zalet AGA jest możliwość oceny funkcjonalnej rekonwalescencji w wielu modelach uszkodzenia nerwów przy użyciu tylko jednego urządzenia. Od początku 2000 roku podejście to jest stosowane w eksperymentalnych modelach PNI, takich jak rwa kulszowa37, strzałkowa38 i model uszkodzenia nerwu udowego22, a także po zwichnięciu korzenia zarówno odcinka lędźwiowego39, jak i splotu ramiennego40. Za pomocą tej metody badano również różne urazy ośrodkowego układu nerwowego, w tym stłuczenie rdzenia kręgowego41,42. W tym artykule przedstawiliśmy szczegółowy protokół dotyczący indukcji trzech powszechnie badanych uszkodzeń nerwów, a także sposobu oceny późniejszej sprawności funkcjonalnej. Naszym zdaniem, bardzo pomocne byłyby praktyczne wytyczne dla badaczy zainteresowanych obszarem eksperymentalnego uszkodzenia, naprawy i regeneracji nerwów, jak optymalnie wykorzystać korzystne cechy tej metody.

Kilku autorów zajęło się potencjałem AGA w ocenie odzyskiwania funkcjonalnego u gryzoni, podkreślając zaletę metody w jednoczesnej ocenie parametrów chodu związanych z unerwieniem motorycznym i czuciowym27,28. Dodatkowo, porównanie danych z doświadczalnej łapy, np. zrekonstruowanego uszkodzenia nerwu z nieoperowaną łapą, jak to wykazano w obu prezentowanych modelach, pozwala na włączenie wewnątrzzwierzęcej kontroli dodatniej. I odwrotnie, operowana łapa bez rekonstrukcji chirurgicznej lub dodatkowego leczenia może służyć jako wewnątrzzwierzęca kontrola ujemna. Wykazano również, że możliwe jest połączenie AGA z podejściami opartymi na uczeniu maszynowym43. Pomimo zalet tej metody, ma ona również kilka ograniczeń i wad, takich jak czasochłonne wysiłki szkoleniowe, które są obowiązkowe, aby przyzwyczaić zwierzę do procedury nabycia28,44. Kolejnym ograniczeniem AGA jest maksymalna wielkość zwierząt kwalifikujących się do badania ze względu na ograniczone wymiary aparatury. W związku z tym stosowanie AGA jest obecnie ograniczone do zwierząt wielkości gryzoni i fretek45. Dodatkowo, pojawiające się ostatnio podejścia do oceny neurobehawioralnej w dziedzinie śledzenia ruchu zdolne do uczenia maszynowego mogą przewyższyć AGA zarówno pod względem kompleksowości, jak i możliwych zastosowań 18,19,46. Najbardziej godne uwagi, ale zgodnie z innymi metodami oceny, wydaje się, że poprawa funkcjonalna oceniana przez AGA jest silnie ograniczona - jeśli w ogóle występuje - w modelach nerwicy nerwu kulszowego47,48. Z drugiej strony, AGA pozwala na kompleksową ocenę przebiegu powrotu do zdrowia funkcjonalnego po nerwicy nerwu udowego, co pokazują nasze dane. Dzięki tej pracy wykazaliśmy, że Paw Print Area jest reprezentatywnym parametrem chodu ocenianym za pomocą AGA, który jest wzorcowy dla przebiegu powrotu do zdrowia funkcjonalnego w dwóch przedstawionych przez nas wyżej wymienionych modelach uszkodzenia nerwów obwodowych. Podczas gdy funkcjonalne odzyskanie ad integrum można było zaobserwować po autoprzeszczepie nerwu udowego, parametry AGA nadal ulegały znacznej zmianie w stosunku do wartości wyjściowej pod koniec okresu obserwacji po autoprzeszczepowej naprawie nerwu kulszowego. W tym kontekście warto zauważyć, że przykurcze kończyn są powszechnym zjawiskiem u szczurów z uszkodzeniem nerwu kulszowego i należy zachować ostrożność, aby nie pomylić tych objawów nierównowagi mięśniowej i paraliżu z postępującym odzyskiwaniem funkcjonalnym32. Z jednej strony podkreśla to niezdolność metody AGA do wykrycia znaczącej poprawy funkcjonalnej po uszkodzeniu nerwicy w tym modelu. Z drugiej strony rodzi to pytanie, czy możliwa jest ocena modelu uszkodzenia nerwu kulszowego u szczura, który jest nadal najczęściej stosowanym eksperymentalnym modelem naprawy nerwów, za pomocą ogólnej analizy chodu w przypadku, gdy uszkodzenie nerwu jest poważniejsze niż aksonotmeza48. Szczegółowe informacje na temat rozwiązywania problemów znajdują się w pliku uzupełniającym 1.

Przedstawiliśmy również przykładowe dane dotyczące zastosowania metody do oceny funkcji lokomotorycznych u szczurów z uszkodzeniem rdzenia kręgowego, co jest możliwe bez konieczności wprowadzania zmian w konfiguracji sprzętu lub procedurze akwizycji. Ta sama zasada dotyczy innych modeli uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego (CNI) u gryzoni)26,49,50 i uszkodzenia zwichnięcia korzeni. W przeciwieństwie do izolowanych PNI, urazy rdzenia kręgowego są znacznie bardziej złożone w swoich patofizjologicznych konsekwencjach, ponieważ wiele bardzo ważnych struktur ulega uszkodzeniu, w tym drogi odprowadzające, takie jak drogi korowo-rdzeniowe i rubrordzeniowe oraz drogi doprowadzające, takie jak kolumny grzbietowe i drogi rdzeniowo-wzgórzowe35. Wyzwanie, jakim jest odpowiednia ocena tych patologicznych zmian, znajduje odzwierciedlenie w kompleksowym arsenału testów behawioralnych, takich jak wynik Basso, Beattie i Bresnahan (BBB)36. Doniesiono, że parametr chodu Base of Support wzrasta po urazach ośrodkowego układu nerwowego, najprawdopodobniej w celu wyjaśnienia wynikającego z tego niestabilnego chodu. Baza podparcia uległa istotnej zmianie w stosunku do wartości wyjściowej od WPO10 do WPO14 w naszym modelu, co potwierdza nasze przypuszczenie, że parametr ten pozwala na ocenę przebiegu powrotu do zdrowia funkcjonalnego przez AGA po urazie stłuczenia rdzenia kręgowego w odcinku piersiowym.

Jesteśmy przekonani, że AGA jest realnym narzędziem do oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej u gryzoni z uszkodzeniami układu nerwowego. Niemniej jednak zalecamy dokładne i dokładne odzwierciedlenie zaobserwowanych zmian chodu w każdej odpowiedniej konfiguracji eksperymentalnej. Zmiany parametrów chodu, np. zwiększenie powierzchni wydruku po natychmiastowym spadku pooperacyjnym lub skrócenie czasu wymachu poprzedzające natychmiastowe pooperacyjne podniesienie tego parametru, w trakcie okresu obserwacji nie są nieuchronnie związane z powrotem do sprawności. Zamiast tego zmiany te mogą być również związane z możliwą adaptacją funkcjonalną do utrzymania niepozornego chodu, biorąc pod uwagę, że szczury są gatunkami drapieżnymi i starają się unikać okazywania bólu lub niepełnosprawności potencjalnym drapieżnikom51. W związku z tym zaleca się stosowanie automatycznej analizy chodu jako narzędzia uzupełniającego w celu powiązania zmian chodu z innymi miarami wyników uszkodzenia i regeneracji nerwów obwodowych21. Jak wspomniano wcześniej, uważamy również, że należy dokładnie rozważyć, czy gryzonie z nerwicem nerwu kulszowego powinny być badane za pomocą AGA, ponieważ nasze odkrycie zdecydowanie wskazuje, że powrót do sprawności funkcjonalnej jest w tym przypadku poważnie ograniczony.

Jak wykazano w naszej pracy, głównym atutem AGA jest możliwość badania zarówno renerwacji motorycznej, jak i sensorycznej w wielu eksperymentalnych modelach PNI, a także CNI, przy czym wymaga to tylko jednego zestawu. Dlatego metoda jest naszym zdaniem bardzo cennym narzędziem do kompleksowych testów neurobehawioralnych. Jedną z zalet AGA, jaką jest możliwość badania unerwienia motorycznego i czuciowego w różnych modelach zwierzęcych PNI i CNI, przy czym wymaga to tylko jednej konfiguracji, jest naszym zdaniem główną zaletą metody w porównaniu z innymi metodami oceny do badania funkcjonalnego odzyskiwania, takimi jak analiza ścieżki spacerowej52, testy von Freya53, lub kinematyka chodu16. Możliwość jednoczesnej oceny zmian chodu, które korelują z wynikami badań elektrofizjologicznych mięśni unerwionych22 lub metodami oceny funkcji czuciowych54 , jest obiecująca w odniesieniu do przyszłych zastosowań tej metody. Dlatego zalecamy stosowanie AGA do badania odzyskiwania funkcjonalnego w modelach PNI kończyn przednich u gryzoni, takich jak nerw łokciowy, promieniowy lub pośrodkowy, lub eksperymentalnych modeli transferu nerwów55, które pozostają jeszcze niezbadane tą metodą.

Niniejszym przedstawiamy szczegółowy protokół, w jaki sposób korzystać z automatycznej analizy chodu w celu zbadania funkcjonalnej regeneracji w trzech modelach uszkodzenia nerwów u gryzoni. Chociaż metoda ta wymaga starannego rozważenia różnych kluczowych aspektów, takich jak odpowiednie szkolenie oraz skrupulatna kalibracja sprzętu i oprogramowania, jest ona wykonalnym i cennym narzędziem uzupełniającym do oceny regeneracji nerwów w modelach gryzoni z uszkodzeniem nerwów centralnych i obwodowych.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że praca ta została wsparta przez Noldus Inc. poprzez pokrycie opłaty za publikację w otwartym dostępie. Żaden z autorów nie otrzymywał żadnego honorarium ani żadnej gratyfikacji finansowej. Autorzy nie mają żadnych innych sprzecznych interesów do zadeklarowania.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Karin Brenner za jej pełną pasji opiekę nad zwierzętami. Autorzy pragną również podziękować Claudii Keibl, Jamesowi Fergusonowi, Gabriele Leinfellner i Susanne Drechsler za ich pomoc podczas eksperymentalnych operacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% sól fizjologicznaB. Braun Austria3570410Pojazd do dostarczania leków
Strzykawka 1 mlB. Braun Austria9161708VUrządzenie do wstrzykiwań
Strzykawka 10 mlB. Braun Austria4606728 VUrządzenie do wstrzykiwań
1-Propanol, 2-Propanol, HexetidinGebro PharmaN/AAlkoholowa dezynfekcja skóry
23-gauge (G) canulaB. Braun Austria4657667Canula do iniekcji s.c.
Canula 26-gauge (G)B. Braun Austria4657683Canula do strzykawki strzykawki s.c. do wstrzykiwań s.c
. B. Braun Austria4606710 VUrządzenie do wstrzykiwania
chlorowodorku buprenorfinySigmaB9275Środek przeciwbólowy
Frezy do mikrowiertarkiFST19007-29Wiercenie otworu wewnątrz blaszka
CaprofenZoetis AustriaN/AŚrodek przeciwbólowy
Wybieg Zautomatyzowany system analizy choduNoldusN/AOprogramowanie do automatycznej analizy chodu zwierząt
Zestaw kauteryzacyjny FST18010-00Kauteryzacja naczyń podczas operacji
EnrofloksacynaBayer AustriaN/A Antybiotyk
Ethilon (10-0)ETHICON2810GMateriał do szycia neurrorhaphy
Ethilon (11-0)ETHICONEH7465GMateriał do szycia do neurrorhaphy
Maść do oczuFresenius Kabi Austria4302436Ochrona oczu podczas znieczulenia
Friedman-Pearson RongeursFST16221-14Instrument chirurgiczny
GabapentynaWedgewood PharmacyN/AŚrodek przeciwbólowy
Retraktor GoldsteinaFST17003-03Retrakcja tkanek podczas operacji
Maszynka do strzyżenia włosówAescularN/AMaszynka do golenia miejsca operacji przed zabiegiem
Poduszka grzewcza dla gryzoniALA Scientific InstrumentsN/ARegulacja temperatury ciała
ImpaktorPrecyzyjne systemy i oprzyrządowanieN/AIndukcja stłuczenia rdzenia kręgowego
Szczur Lewisa (figure-materials-1)JanvierN/AZwierzę doświadczalne
System retrakcji stabilizatora magnetycznegoFST18200-50Retrakcja tkanek podczas operacji
Nożyczki dla niemowląt MetzenbaumFST14019-13Instrument chirurgiczny
Micro DrillWord Precision Instruments503599Instrument do wiercenia kości
Uchwyt na mikroigłęFST12076-12Instrument chirurgiczny
Mikronożyczki (zakrzywione)FST15023-10Narzędzie chirurgiczne
Mikronożyczki (proste)FST15007-08Narzędzie chirurgiczne
Kleszcze do lustrzanego wykończeniaFST11251-23Instrument chirurgiczny
Uchwyt igłyFST12002-12Instrument chirurgiczny
Mikroskop operacyjnyLeicaM651 MSDPowiększenie miejsca operowanego
Povidone IodB. Braun MelsungenN/ABezalkoholowy środek do dezynfekcji skóry
PulsoksymetrSTARR Nauki przyrodniczeNie dotyczyMonitorowanie tętna i saturacji tlenem
Termometr dla gryzoniBIOSEBBIO-TK8851Nadzór nad temperaturą ciała
Ostrze skalpelaF.S.T10010-00 (#10)Narzędzie chirurgiczne do wykonania nacięcia
Rękojeść skalpelaFST10003-12Narzędzie chirurgiczne do wykonania nacięcia
Sewofluran Opary do inhalacji, płyn (100%)BaxterHDG9117Aznieczulający
Szpatułka & Sonda FST10090-13Instrument chirurgiczny
Sprague Dawley szczur (figure-materials-2)JanvierN/AZwierzę doświadczalne
Gaza sterila 5x5cmEVAC MEDICALE010.03.00215Sterylny kompres z gazy
Kleszcze do tkanekFST11021-12Instrument chirurgiczny
Vicryl (4-0)ETHICONV3040HMateriał do szwów podskórnych
Vicryl (5-0)ETHICONV303HMateriał do szwów podskórnych
Igła do cięcia Vicryl (4-0)ETHICONV392ZHMateriał do
Igła do cięcia Vicryl (5-0)ETHICONV391HMateriał do szwów skórnych
szycia skóry

Bibliografia

  1. Mohanty, C. B., Bhat, D. I., Devi, B. I. Use of animal models in peripheral nerve surgery and research. Neurology India. 9, Supplement 100-105 (2019).
  2. Vela, F. J., et al. Animal models used to study direct peripheral nerve repair: a systematic review. Neural Regeneration Research. 15 (3), 491-502 (2020).
  3. Verma, R., Virdi, J. K., Singh, N., Jaggi, A. S. Animals models of spinal cord contusion injury. The Korean Journal of Pain. 32 (1), 12-21 (2019).
  4. de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
  5. Navarro, X. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration and target reinnervation in animal models: a critical overview. The European Journal of Neuroscience. 43 (3), 271-286 (2016).
  6. Sperry, R. W. The functional results of muscle transposition in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 73 (3), 379-404 (1940).
  7. Sperry, R. W. The effect of crossing nerves to antagonistic muscles in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 75 (1), 1-19 (1941).
  8. Sperry, R. W. Transplantation of motor nerves and muscles in the forelimb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 76 (2), 283-321 (1942).
  9. Zimmerman, E. A., Chambers, W. W., Liu, C. N. An experimental study of the anatomical organization of the Cortico-Bulbar System in the Albino Rat. The Journal of Comparative Neurology. 123, 301-323 (1964).
  10. Cohen, A. H., Gans, C. Muscle activity in rat locomotion: movement analysis and electromyography of the flexors and extensors of the elbow. Journal of Morphology. 146 (2), 177-196 (1975).
  11. Barnett, S. A. The Rat: A Study in Behaviour. , Aldine Publishing Company. (1963).
  12. Hare, G. M., et al. Walking track analysis: utilization of individual footprint parameters. Annals of Plastic Surgery. 30 (2), 147-153 (1993).
  13. Hare, G. M., et al. Walking track analysis: a long-term assessment of peripheral nerve recovery. Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (2), 251-258 (1992).
  14. Bertelli, J. A., Mira, J. C. Behavioral evaluating methods in the objective clinical assessment of motor function after experimental brachial plexus reconstruction in the rat. Journa of Neuroscience Methods. 46 (3), 203-208 (1993).
  15. Varejao, A. S., Melo-Pinto, P., Meek, M. F., Filipe, V. M., Bulas-Cruz, J. Methods for the experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Neurological Research. 26 (2), 186-194 (2004).
  16. Varejao, A. S., et al. Functional assessment of peripheral nerve recovery in the rat: gait kinematics. Microsurgery. 21 (8), 383-388 (2001).
  17. Varejao, A. S., et al. Ankle kinematics to evaluate functional recovery in crushed rat sciatic nerve. Muscle and Nerve. 27 (6), 706-714 (2003).
  18. Nath, T., et al. Using DeepLabCut for 3D markerless pose estimation across species and behaviors. Nature Protocols. 14 (7), 2152-2176 (2019).
  19. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
  20. Deumens, R., Jaken, R. J., Marcus, M. A., Joosten, E. A. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
  21. Heinzel, J., et al. Use of the CatWalk gait analysis system to assess functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury - a systematic review. Journal of Neuroscience Methods. 345, 108889(2020).
  22. Heinzel, J. C., Hercher, D., Redl, H. The course of recovery of locomotor function over a 10-week observation period in a rat model of femoral nerve resection and autograft repair. Brain and Behavior. , 01580(2020).
  23. Chen, S. H., et al. Changes in GABA and GABA(B) receptor expressions are involved in neuropathy in the rat cuneate nucleus following median nerve transection. Synapse. 66 (6), 561-572 (2012).
  24. Chen, S. H., et al. Decreases of glycine receptor expression induced by median nerve injury in the rat cuneate nucleus contribute to NPY release and c-Fos expression. Life Sciences. 90 (7-8), 278-288 (2012).
  25. Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
  26. Sandner, B., et al. Systemic epothilone D improves hindlimb function after spinal cord contusion injury in rats. Experimental Neurology. 306, 250-259 (2018).
  27. Kappos, E. A., et al. Validity and reliability of the CatWalk system as a static and dynamic gait analysis tool for the assessment of functional nerve recovery in small animal models. Brain and Behavior. 7 (7), 00723(2017).
  28. Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 1162, 179-188 (2014).
  29. Webster, G. V. Halstedian principles in the practice of plastic and reconstructive surgery. Stanford Medical Bulletin. 13 (3), 315-316 (1955).
  30. Bozkurt, A., et al. A flexible, sterile, and cost-effective retractor system for microsurgery. Microsurgery. 31 (8), 668-670 (2011).
  31. Carr, M. M., Best, T. J., Mackinnon, S. E., Evans, P. J. Strain differences in autotomy in rats undergoing sciatic nerve transection or repair. Annals of Plastic Surgery. 28 (6), 538-544 (1992).
  32. Dellon, A. L., Mackinnon, S. E. Sciatic nerve regeneration in the rat. Validity of walking track assessment in the presence of chronic contractures. Microsurgery. 10 (3), 220-225 (1989).
  33. Jackson, C. M. Anatomy of the rat. Transactions of the American Philosophical Society, Philadelphia, New Series, Volume XXVII, 1935. The Anatomical Record. 65 (1), By Eunice Chace Greene. With Foreword by Henry H Donaldson 127-129 (1936).
  34. Pena, M. C., Baron, J. Femoral nerve and rectus femoris muscle of the rat: a study in anatomy, histology, and histoenzymes. Annals of Plastic Surgery. 20 (6), 527-532 (1988).
  35. Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models and Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
  36. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  37. Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
  38. Godinho, M. J., et al. Immunohistochemical, ultrastructural and functional analysis of axonal regeneration through peripheral nerve grafts containing Schwann cells expressing BDNF, CNTF or NT3. PLoS One. 8 (8), 69987(2013).
  39. Pajenda, G., et al. Spatiotemporally limited BDNF and GDNF overexpression rescues motoneurons destined to die and induces elongative axon growth. Experimental Neurology. 261, 367-376 (2014).
  40. Matsuura, Y., et al. The effect of anti-NGF receptor (p75 Neurotrophin Receptor) antibodies on nociceptive behavior and activation of spinal microglia in the rat brachial plexus avulsion model. Spine (Phila Pa 1976). 38 (6), 332-338 (2013).
  41. Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
  42. Koopmans, G. C., et al. The assessment of locomotor function in spinal cord injured rats: the importance of objective analysis of coordination. Journal of Neurotrauma. 22 (2), 214-225 (2005).
  43. Frohlich, H., Claes, K., De Wolf, C., Van Damme, X., Michel, A. A machine learning approach to automated gait analysis for the Noldus Catwalk system. IEEE Transaction on Bio-medical Engineering. 65 (5), 1133-1139 (2018).
  44. Batka, R. J., et al. The need for speed in rodent locomotion analyses. Anatomical Record (Hoboken, N. J). 297 (10), 1839-1864 (2014).
  45. Wood, T., et al. A ferret model of encephalopathy of prematurity. Developmental Neuroscience. 40 (5-6), 475-489 (2018).
  46. Abbas, W., Masip Rodo, D. Computer methods for automatic locomotion and gesture tracking in mice and small animals for neuroscience applications: a survey. Sensors. 19 (15), Basel, Switzerland. (2019).
  47. Irintchev, A. Potentials and limitations of peripheral nerve injury models in rodents with particular reference to the femoral nerve. Annals of Anatomy. 193 (4), 276-285 (2011).
  48. Haastert-Talini, K. Modern Concepts of Peripheral Nerve Repair. Haastert-Talini, K., Assmus, H., Antoniadis, G. , Springer International Publishing. 127-138 (2017).
  49. Lu, L., et al. Growth differentiation factor 11 promotes neurovascular recovery after stroke in mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
  50. Caballero-Garrido, E., Pena-Philippides, J. C., Galochkina, Z., Erhardt, E., Roitbak, T. Characterization of long-term gait deficits in mouse dMCAO, using the CatWalk system. Behavioral Brain Research. 331, 282-296 (2017).
  51. Graham, D. M., Hampshire, V. Methods for measuring pain in laboratory animals. Lab Animal. 45 (3), 99-101 (2016).
  52. Monte-Raso, V. V., Barbieri, C. H., Mazzer, N., Yamasita, A. C., Barbieri, G. Is the sciatic functional index always reliable and reproducible. Journal of Neuroscience Methods. 170 (2), 255-261 (2008).
  53. Stossel, M., et al. Comparative evaluation of chitosan nerve guides with regular or increased bendability for acute and delayed peripheral nerve repair: a comprehensive comparison with autologous nerve grafts and muscle-in-vein grafts. Anatomical Record (Hoboken). 301 (10), 1697-1713 (2018).
  54. Vrinten, D. H., Hamers, F. F. CatWalk' automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. Pain. 102 (1-2), 203-209 (2003).
  55. Aman, M., Sporer, M., Bergmeister, K., Aszmann, O. Animal models for selective nerve transfers of the upper extremity. Handchirurgie Mikrochirurgie Plastische Chirurgie. 51 (4), 319-326 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Uszkodzenie nerwów obwodowychmodele gryzonipowierzchnia odcisku łapyczas przeniesieniakoordynacja międzykończynowatrenowanie zwierzątkalibracja sprzętu
Zautomatyzowana analiza chodu w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej u gryzoni z uszkodzeniem nerwów obwodowych lub stłuczenia rdzenia kręgowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.