Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowa hodowla adipocytów jako model do badania przebudowy białej tkanki tłuszczowej wywołanej kacheksją

DOI:

10.3791/61853

⸱

18 stycznia 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Integrated Biotechnology, University of Mogi das Cruzes, 2Department of Biochemistry, Boston University School of Medicine, 3Obesity Research Center, Department of Medicine, Boston University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje trójwymiarowy (3D) system hodowli druku magnetycznego, który pozwala na przebudowę białej tkanki tłuszczowej (WAT) wywołaną przez kondycjonowane podłoże z komórek rakowych. Wykorzystanie systemu hodowli 3D adipocytów UCP1+, które wyrażają białko zielonej fluorescencji (GFP), pozwala na badanie beżowych adipocytów przyczyniających się do przebudowy tkanki tłuszczowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kacheksja nowotworowa (CC) objawia się jako zespół z wieloma objawami, powodując wyraźne zaburzenie równowagi metabolicznej wielu narządów. Ostatnio zaproponowano, aby wyniszczenie wyniszczające było stymulowane przez kilka mediatorów stanu zapalnego, które mogą zakłócić integracyjną fizjologię tkanki tłuszczowej i innych tkanek, takich jak mózg i mięśnie. W tym scenariuszu guz może przetrwać kosztem gospodarza. W ostatnich badaniach klinicznych intensywność wyczerpywania się różnych złogów tłuszczu została ujemnie skorelowana z wynikiem przeżycia pacjenta. Badania wykazały również, że różne zaburzenia metaboliczne mogą zmieniać przebudowę białej tkanki tłuszczowej (WAT), szczególnie we wczesnych stadiach rozwoju kacheksji. Dysfunkcja WAT wynikająca z przebudowy tkanek przyczynia się do ogólnej kacheksji, przy czym główne modyfikacje WAT polegają na zmianach morfofunkcjonalnych, zwiększonej lipolizie adipocytów, akumulacji komórek odpornościowych, zmniejszeniu adipogenezy, zmianach w populacji komórek progenitorowych oraz wzroście "nisz" zawierających komórki beżowe/brite.

Aby zbadać różne aspekty remodelingu WAT wywołanego kacheksją, szczególnie zmiany komórek progenitorowych i remodeling beżowy, hodowla dwuwymiarowa (2D) była pierwszą opcją do badań in vitro. Jednak takie podejście nie podsumowuje odpowiednio złożoności WAT. Ulepszone testy do rekonstrukcji funkcjonalnego AT ex vivo pomagają zrozumieć fizjologiczne interakcje między różnymi populacjami komórek. Protokół ten opisuje wydajny system hodowli tkanek do drukowania trójwymiarowego (3D) w oparciu o nanocząstki magnetyczne. Protokół jest zoptymalizowany pod kątem badania przebudowy WAT indukowanej przez czynniki indukowane kacheksją (CIF). Wyniki pokazują, że hodowla 3D jest odpowiednim narzędziem do badania modelowania WAT ex vivo i może być przydatna w funkcjonalnych badaniach przesiewowych w celu identyfikacji cząsteczek bioaktywnych do zastosowań w poszczególnych populacjach komórek tłuszczowych i pomocy w odkryciu komórkowej terapii przeciwwyniszczającej opartej na WAT.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żywe organizmy składają się z komórek w mikrośrodowiskach 3D z wzajemnym oddziaływaniem komórka-komórka i komórka-matryca oraz skomplikowaną dynamiką transportu składników odżywczych i komórek1,2. Jednak większość podstawowej wiedzy zdobytej w biologii komórki została wygenerowana przy użyciu jednowarstwowej hodowli komórkowej (2D). Chociaż hodowla 2D może odpowiedzieć na niektóre z pytań mechanistycznych, to podejście to nieodpowiednio podsumowuje naturalne środowisko, w którym żyją komórki, i może być niezgodne z przewidywaniem złożonej odpowiedzi na lek1. Co więcej, komórki wyczuwają swoje fizyczne otoczenie poprzez mechanotransdukcję. Rzeczywiście, siły mechaniczne są przekształcane w sygnały biochemiczne, które ostatecznie wpływają na wzorce ekspresji genów i los komórki. W ciągu ostatnich kilku dekad hodowla tkankowa 3D stała się nowym narzędziem in vitro, które może naśladować mikrośrodowisko in vivo z większą wiernością. Pozwala to uniknąć niektórych pułapek mechanistycznych generowanych przez podejścia 2D in vitro3.

Kacheksja nowotworowa (CC) jest definiowana jako zespół o wielu objawach, powodujący wyraźny brak równowagi metabolicznej w wielu narządach. Podczas rozwoju kacheksji WAT ulega licznym zmianom morfologicznym skutkującym zwiększoną lipolizą adipocytów, akumulacją komórek odpornościowych, zmniejszeniem adipogenezy, zmianami populacji komórek progenitorowych oraz wzrostem "nisz" zawierających komórki beżowe/brite (beżowa przebudowa)4. Jednak rekapitulacja mechanizmu, za pomocą którego kacheksja wpływa na przebudowę WAT przy użyciu modeli in vitro, stanowi poważne wyzwanie techniczne. Rzeczywiście, w kilku badaniach, w których podjęto próbę zbadania komunikacji między guzem a tkanką, wykorzystano jednowarstwową hodowlę komórkową in vitro (2D), omijając złożoność mikrośrodowiska 3D WAT.

Chociaż kilka eksperymentalnych podejść generuje kulturę 3D, do produkcji adiposferoid preferowane są trzy różne metody montażu: lewitacja magnetyczna lub drukowanie5, wisząca kropla6, oraz systemy rusztowań Matrigel7. Pomimo tego, że są odpowiednie dla adiposferoidów, systemy te mają zalety i wady i powinny być wybierane zgodnie z charakterystyką każdego projektu eksperymentalnego. Opierając się na ograniczeniach wymienionych powyżej, do wygenerowania kultur komórkowych 3D zastosowano metodę druku magnetycznego5. Metoda ta wykorzystuje magnetyczny zespół nanocząstek składający się z nanocząstek złota i tlenku żelaza, dzięki czemu metoda drukowania jest odpowiednia dla większości typów komórek. W tym przypadku do indukcji adipogenezy wykorzystano hodowle komórkowe 3D, a CIF do odtworzenia warunków środowiskowych CC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Inkubacja komórek 2D z magnetycznymi nanocząstkami

  1. Hoduj przylegające kultury 2D do ~ 70% konfluencji przy użyciu standardowych procedur hodowli komórkowych.
  2. Przygotuj zespół nanocząstek magnetycznych. Wyjmij go z lodówki i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej (20-25 °C) przez około 15 minut1.
  3. Podłoże mieszane: Dodać nanocząstki magnetyczne bezpośrednio do 12 ml pożywki na płytkach do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm. Zawiesić i ponownie zawiesić pożywkę kilka razy, aby uzyskać jednorodny rozkład nanocząstek.
    UWAGA: Podłoże będzie wyglądało na ciemne ze względu na brązowy kolor tlenku żelaza. Zalecane jest stężenie 2,5 μl/cm2 w obszarze hodowli.
  4. Umyć trzykrotnie 100-milimetrową płytkę hodowlaną 2D solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  5. Dodać 12 ml zmieszanej pożywki z kroku 1.3 do płytek do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm. Inkubować płytki przez noc w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ), aby umożliwić przyłączenie nanocząstek magnetycznych do komórek

2. Tworzenie kultur 3D z montażem sferoidów na płytkach 96-dołkowych

  1. Po całonocnej inkubacji umyj komórki w celu usunięcia wszelkich pozostałości pożywki i nieprzyłączonych nanocząstek magnetycznych, delikatnie mieszając płytki z 3 x 10 ml PBS.
  2. Odessać PBS z płytki Petriego i odłączyć komórki przez inkubację w 0,25% roztworze kwasu trypsynowo-etylenodiaminowego (EDTA) przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Czekając, aż ogniwa się odłączą, zdezynfekuj napędy magnetyczne 70% etanolem1.
  4. Po odłączeniu komórek dodaj pożywkę zawierającą surowicę o objętości 4x większej od objętości roztworu trypsyny-EDTA, aby zneutralizować działanie trypsyny, a następnie przenieś zawiesinę do stożkowej probówki.
  5. Odwirować zawiesinę o stężeniu 500 × g przez 10 minut. Odessać supernatant, uważając, aby nie dotknąć osadu.
    UWAGA: Po odwirowaniu komórki powinny wydawać się brązowe, a zawiesiny komórek w pożywce powinny wydawać się ciemniejsze niż zwykle. Komórki powinny wyglądać na usiane nanocząstkami1.
  6. Policz komórki w zawiesinie i oblicz objętość pożywki potrzebną do stworzenia kultur 3D. W przypadku adiposferoid użyj od 5 000 do 10 000 komórek w 150 μl na płytkach 96-dołkowych.
  7. Korzystając z 96-dołkowego zestawu do bioprintingu, umieść 96-dołkową płytkę odpychającą komórki na górze Spheroid Drive.
  8. Odpipetować 150 μl zawiesiny komórek do każdego dołka płytki 96-dołkowej i zamknąć płytkę, aby umożliwić agregację komórek na dnie w kształcie magnesu.
  9. Pozostaw płytkę na napędzie sferoidalnym w inkubatorze na 1-2 godziny, aby uzyskać właściwą sferoidę.
    UWAGA: Kultury te powinny wydawać się gęste i brązowe i powinny być wydrukowane na płycie (Rysunek S1). Rysunek S2 przedstawia podsumowanie przebiegu pracy głównych etapów druku magnetycznego 3D zespołu sferoidalnego na płytkach 96-dołkowych.

3. Indukcja białej adipogenezy

  1. Przygotuj media do konserwacji i indukcji8; przygotuj podłoże indukcyjne przed każdym użyciem.
    1. Przygotować pożywkę podtrzymującą zawierającą 5 μg/ml insuliny (10 mg/ml insuliny przechowywanej w temperaturze 4 °C przez tydzień) i 0,5 μM rozyglitazonu (10 mM zapasu dimetylosulfotlenku (DMSO)).
    2. Przygotować pożywkę indukcyjną zawierającą 125 μM indometacyny z 0,125 M zapasu etanolu, 2 μg/ml deksametazonu z 2 mg/ml roztworu etanolowego, 0,5 mM izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX) z 0,25 M zapasu DMSO i 0,5 μM rozyglitazonu z 10 mM zapasu DMSO.
      UWAGA: Podgrzej indometacynę do 60 °C, aby się rozpuściła.
  2. Po 24-48 godzinach drukowania sferoid należy zastąpić zwykłą pożywkę kompletną pożywką medium indukcyjnego (dzień 0).
  3. Po 48 godzinach (dzień 2) należy wymienić pożywkę indukcyjną na pożywkę konserwacyjną.
  4. Zmieniaj pożywkę co 3-5 dni, aż komórki w pełni się zróżnicują.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, po 7-8 dniach stymulacji pożywką indukcyjną komórki różnicują się w dojrzałe komórki tłuszczowe i są wypełnione kropelkami oleju, które można zobaczyć na krawędziach adiposferoid.

4. Produkcja podłoża kondycjonowanego rakiem płuca Lewisa ( LLC-CM)

  1. Nasiona raka płuca Lewisa (LL/2) na 100 mm płytkach hodowli komórkowej w pożywce o gęstości 6000 komórek/cm2,
    UWAGA: Pożywka wzrostowa zawiera zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny.
  2. Po 2 dniach zastąp podłoże w każdej płytce świeżym podłożem wzrostowym.
    UWAGA: Komórki LL / 2 zawierają niejednorodną mieszankę komórek przylegających (większa liczba) i pływających.
  3. Po 2 dniach (dzień 4) należy zebrać kondycjonowane podłoże i oczyścić je z komórek i zanieczyszczeń przez odwirowanie (500 × g, 10 min).
  4. Zamrozić podwielokrotności kondycjonowanej pożywki w ciekłym azocie do późniejszego wykorzystania.
    UWAGA: Aby traktować sferoidy kondycjonowaną pożywką, użyj kombinacji 75% świeżej pożywki wzrostowej i 25% pożywki kondycjonowanej LLC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adiposferoidy z hodowli 3D komórek frakcji naczyniowej zrębu (SVF)
Zarówno hodowle 3D, jak i konfluentne 2D zostały stworzone z tą samą liczbą komórek SVF z tego samego mysiego preparatu pachwinowego WAT (Rysunek 1A, Figura 1B) i poddane temu samemu protokołowi eksperymentalnemu w celu porównania markera ekspresji genów. Sferoidy stymulowane pożywką indukcyjną rozszerzały się z czasem. Rysunek 2B pokazuje wzr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten ustanawia system hodowli komórek 3D w celu zbadania różnicowania adipocytów w adiposferoidach pochodzących z pierwotnych komórek SVF z WAT. W porównaniu z konwencjonalną hodowlą adherentną 2D, ten system 3D ułatwia przebudowę AT, która bardzo przypomina warunki in vivo. W ciągu ostatnich kilku lat badania wykazały, że hodowla komórek w 3D daje odrębną morfologię komórkową i sygnalizację w porównaniu z systemem hodowli 2D3. Morfologia fibroblastów w 3D różni się od tej występującej w 2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z NIH DK117161, DK117163 dla SRF i P30-DK-046200 dla Adipose Biology and Nutrient Metabolism Core of Boston Nutrition and Obesity Research Center, oraz przez Granty Fundacji Badawczej São Paulo (FAPESP): 2018/20905-1 i CNPq 311319/2018-1 dla MLBJr.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-Izobutylo-1-metyloksantynaSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)I-5879Hodowla komórkowa
96-dołkowy zestaw do biodruku,Greiner (Monroe, NC, USA)655841Hodowla komórkowa
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment osiołka Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-606-152Barwienie immunofluorescencyjne, wtórne, 1:400 w TBS Z 0,1%
MIKROPŁYTKĄ DO HODOWLI KOMÓRKOWYCH TWEEN-20, 96 DOŁKÓW, PS, F-BOTTOM I mikro; BEZBARWNY,, CELLSTAR, POWIERZCHNIA ODSTRASZAJĄCA KOMÓRKI, POKRYWKA, STERYLNA, 8 SZT./WOREKGreiner (Monroe, NC, USA)655976Hodowla komórkowa
DeksametazonSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)D-1756Hodowla komórkowa
DMEMCorning (Manassas, VA, USA)10-017-CVHodowla komórkowa
Płodowa surowica bydlęca (Tova)Gemini Bio (West Sacramento, CA)100-500Hodowla komórkowa
IndometacynaSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)I-7378Hodowla komórkowa
InsulinaSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)I0516Hodowla komórkowa
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)CRL-1642Linia komórkowa raka płuc Lewisa
NanoShuttle-PLGreiner (Monroe, NC, USA)657843Hodowla komórkowa
Odczynnik NucBlue Fixed Cell ReadyProbes (DAPI)ThermoFisher (Waltham, MA, USA)R37606Barwienie immunofluorescencyjne, zgodnie z instrukcjami producenta
PaciorkowiecCorning (Manassas, VA, USA)30-002-CIHodowla komórkowa
Perilipin-1 (D1D8) XP  Technologia sygnalizacji komórkowej mAb królika(Danvers, MA, USA)9349Barwienie immunofluorescencyjne, pierwotne, 1:1000 w TBS z 0,1%
rozyglitazonemSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)R-2408Hodowla komórkowa
Trypsin-EDTA, 0,05%Corning (Manassas, VA, USA)25-052-CIHodowla
komórkowaStartery PCR z odwrotną transkrypcją
PrimerForward<strong>Reverse
AdipoqGTTCCCAATGTACCCATTCGCTGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
Col4a1TCCAAGGGCGAAGTGGGTTTACCCTTGCTCGCCTTTGACT
Cyklofilina aATGGCACTGGCGGCAGGTCCTTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4TGGTGACAAGCTGGTGGTGGTAATGTCCAGGCCTCTTTTTGGCTCA
em>Fn1GCTTCCCCAACTGGTTACCCTGGGTTGGATGAAGGGGGG
Pgc1aGAAAACAGAGAGCAGCAGAGGGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
em>Ucp1TCCTAGGGACCATCACCACCACCCAGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
strong>Mouse genotypping
Nazwa podkładuDescriptionSequence
Cre FGeneric Cre forwardGCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre RGeneric Cre reverseGTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318mT/mG forwardCTC TGC TGC CTG GCT TCT
oIMR7319mT/mG wild type reverseCGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320mT/mG mutant reverseTCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336UCP1 mutant forwardCAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337UCP1 mutant reverseGTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338UCP1 wild type forwardGGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339UCP1 wild type reverseGAT, CTC CAG CTC CTC CTC CTC TGT C
Tween-20 <<< oIMR7320 mT/mG mutant reverse TCA ATG ATG ATG GG GGT

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haisler, W. L., et al. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nature Protocol. 8 (10), 1940-1949 (2013).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  3. Eisenstein, M. Organoids: the body builders. Nature Methods. 15 (1), 19-22 (2018).
  4. Henriques, F., Júnior, M. L. B. Adipose tissue remodeling during cancer-associated cachexia: Translational features from adipose tissue dysfunction. Immunometabolism. 2 (4), 200032(2020).
  5. Tseng, H., et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging. Scientific Reports. 5 (1), 13987(2015).
  6. Akama, T., Leung, B. M., Labuz, J., Takayama, S., Chun, T. H. Designing 3-D adipospheres for quantitative metabolic study. Methods Molecular Biology. 1566, 177-183 (2017).
  7. Muller, S., et al. Human adipose stromal-vascular fraction self-organizes to form vascularized adipose tissue in 3D cultures. Scientific Reports. 9 (1), 7250(2019).
  8. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).
  9. Henriques, F., et al. Toll-like receptor-4 disruption suppresses adipose tissue remodeling and increases survival in cancer cachexia syndrome. Scientific Reports. 8 (1), 18024(2018).
  10. Kir, S., et al. Tumour-derived PTH-related protein triggers adipose tissue browning and cancer cachexia. Nature. 513 (7516), 100-104 (2014).
  11. Petruzzelli, M., et al. A switch from white to brown fat increases energy expenditure in cancer-associated cachexia. Cell Metabolism. 20 (3), 433-447 (2014).
  12. Lopes, M. A., Oliveira Franco, F., Henriques, F., Peres, S. B., Batista, M. L. LLC tumor cells-derivated factors reduces adipogenesis in co-culture system. Heliyon. 4 (7), 00708(2018).
  13. Wang, H., Liu, L., Lin, J. Z., Aprahamian, T. R., Farmer, S. R. Browning of white adipose tissue with roscovitine induces a distinct population of UCP1(+) adipocytes. Cell Metabolism. 24 (6), 835-847 (2016).
  14. Grinnell, F. Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices. Trends Cell Biology. 13 (5), 264-269 (2003).
  15. Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).
  16. Fisher, M. F., Rao, S. S. Three-dimensional culture models to study drug resistance in breast cancer. Biotechnology Bioengineering. 117 (7), 2262-2278 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cachexia Induced WAT RemodelingMagnetic Nanoparticle SystemProgenitor CellsBeige RemodelingAdipocyte LipolysisAdipogenesis ReductionImmune Cell AccumulationBeige Brite Cells
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły