Ten protokół ma na celu decelularyzację serca i płuc myszy. Powstałe w ten sposób rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) mogą być barwione immunologicznie i obrazowane w celu zmapowania lokalizacji i topologii ich elementów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Decelularyzacja mysiego kompleksu krążeniowo-oddechowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Prezentujemy tutaj protokół decelularyzacji serca i płuc myszy. Wytwarza strukturalne rusztowania ECM, które można wykorzystać do analizy topologii i składu ECM. Opiera się na procedurze mikrochirurgicznej mającej na celu cewnikowanie tchawicy i aorty myszy poddanej eutanazji w celu perfuzji serca i płuc środkami decelularycznymi. Pozbawiony komórek kompleks krążeniowo-oddechowy może być następnie barwiony immunologicznie, aby ujawnić lokalizację strukturalnych białek ECM. Całą procedurę można wykonać w ciągu 4 dni.
Rusztowania ECM wynikające z tego protokołu są wolne od zniekształceń wymiarowych. Brak komórek umożliwia badanie strukturalne struktur ECM do rozdzielczości submikronowej w 3D. Protokół ten można zastosować do zdrowych i chorych tkanek myszy w wieku 4 tygodni, w tym mysich modeli zwłóknienia i raka, otwierając drogę do określenia przebudowy ECM związanej z chorobą krążeniowo-oddechową.
Wprowadzenie
ECM to trójwymiarowa sieć złożona z białek i glikanów, która mieści wszystkie komórki w organizmie wielokomórkowym, nadając narządom ich kształt i regulując zachowanie komórek przez całe życie1. Od zapłodnienia komórki jajowej budują i przebudowują ECM, a z kolei są przez niego ściśle kontrolowane. Celem tego protokołu jest otwarcie drogi do analizy i mapowania ECM myszy, ponieważ myszy są najczęściej używanym organizmem modelowym w patofizjologii ssaków.
Rozwój tej metody był spowodowany potrzebą scharakteryzowania i wyizolowania natywnego ECM2. Ponieważ guzy nie mają odpowiedniego unaczynienia anatomicznego, a myszy są stosunkowo małymi organizmami, zabiegi mikrochirurgiczne zostały zaprojektowane tak, aby wstecznie cewnikować aortę, jednocześnie izolując krążenie głównego naczynia prowadzącego do guza (np. Żył płucnych), skupiając w ten sposób przepływ odczynnika i umożliwiając decelularyzację guza. Ta metoda wytwarza rusztowania ECM o konserwatywnej strukturze2, które mogą być barwione immunologicznie i obrazowane, co pozwala na mapowanie struktury ECM w szczegółach submikronowych. Aby przeprowadzić ten protokół, konieczne jest nabycie umiejętności chirurgicznych i mikrochirurgicznych (rozwarstwienie, mikroszycie i cewnikowanie), które mogą stanowić potencjalne ograniczenie w jego stosowaniu. Zgodnie z naszą wiedzą, metoda ta reprezentuje najnowocześniejsze podejście do analizy natywnego obrazowania struktury ECM2,3.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zawarte tutaj zostały sprawdzone i zatwierdzone przez komisję etyczną regulującą medycynę eksperymentalną na Uniwersytecie w Kopenhadze i są zgodne z duńskim i europejskim ustawodawstwem. Aby zademonstrować ten protokół, użyliśmy samic myszy BALB/cJ w wieku 8-12 tygodni i samicy myszy MMTV-PyMT w wieku 11 tygodni.
UWAGA: Unikanie skażenia bakteryjnego rusztowania ECM daje najlepsze wyniki obrazowania i pozwala na długotrwałe przechowywanie próbki. Dlatego ważne jest, aby wszystkie kroki były sterylne. W związku z tym wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne, w tym szewy, mikroszwy, roztwory, rurki, łączniki Luer i cewniki, muszą być sterylne. Powierzchnie, w tym tackę z polistyrenu, należy zdezynfekować 70% etanolem, a perfuzję najlepiej przeprowadzić pod okapem z przepływem laminarnym. Wszystkie zabiegi odbywają się w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej.
1. Mikrochirurgia pośmiertna
- Poddaj mysz eutanazji za pomocą komory CO2.
- Umieść mysz w komorze o pojemności 4 l i zacznij napełniać ją 100% CO2, zaczynając od 0,2 l/min przez 2 min, zwiększając aż do osiągnięcia przepływu 0,8 l/min po 3 min. Mysz powinna stracić przytomność w ciągu pierwszych 2 minut, a następnie oddychanie powinno ustać (zwykle około 5 min, ale przepływ można utrzymać w razie potrzeby). Potwierdź śmierć przed przejściem do następnego kroku.
- Ogol klatkę piersiową, brzuch i grzbiet myszy maszynką do strzyżenia włosów i zdezynfekuj 70% etanolem. Golenie znacznie zmniejsza liczbę artefaktów spowodowanych obecnością włosów na próbkach do obrazowania lub analizy biochemicznej.
- Przypnij mysz do styropianowej tacy, wysuwając jej przednie i tylne kończyny, a także głowę i ogon. Umieść go pod mikroskopem mikrochirurgicznym.
- Za pomocą nożyczek Mayo z prostym wzorem ustal dostęp chirurgiczny z nacięciem skóry biegnącym od okolicy podżuchwowej do dolnej części brzucha i wypreparuj podskórnie, aby odsłonić ścianę klatki piersiowej i otrzewną.
- Za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych przetnij mięśnie piersiowe większe i piersiowe mniejsze wzdłuż szóstej przestrzeni międzyżebrowej po obu stronach ściany klatki piersiowej.
- Za pomocą nożyczek o prostym wzorze przetnij mostek wzdłuż poprzednich nacięć, a następnie zakończ sternotomię, przecinając mostek wzdłuż jego długiej osi, a następnie podnieś i przypnij obie strony ściany klatki piersiowej, aby odsłonić kompleks krążeniowo-oddechowy.
- Za pomocą mikrokleszczyków z okrągłą końcówką (lub mikrokleszczyków Dumonta) wyciąć grasicę i otaczającą ją tkankę tłuszczową, delikatnie ściągając je z przyczepów. To ujawni główne statki.
- Za pomocą kauteryzacji kauteryzuj zstępującą żyłę jamy i za pomocą nożyczek o prostym wzorze przetnij przełyk.
- Za pomocą ostrych mikrokleszczy oddziel żyły ramienno-głowowe i tętnice ramienno-głowowe, lewą tętnicę szyjną wspólną i lewą tętnicę podobojczykową od leżącej poniżej tkanki, aby ułatwić podwiązanie i kauteryzację.
- Za pomocą uchwytu mikroigłowego, ostrych mikrokleszczyków i szwu 9-0 umieść szwy powyżej pojawienia się tętnicy ramienno-głowowej, lewej tętnicy szyjnej wspólnej i lewej tętnicy podobojczykowej.
- Kauteryzuj żyły ramienno-głowowe.
- Oddziel gruczoły ślinowe podżuchwowe wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić mięśnie szyi i tchawicę. Oddziel mięśnie, aby odsłonić więzadło kości sercowej tarczycy. Za pomocą mikronożyczek otwórz wejście, przecinając więzadło.
- Wprowadzić cewnik 27 G do tchawicy i delikatnie wciskać, aż tchawica rozgałęzi się do oskrzeli (tj. do momentu napotkania oporu cewnika, a następnie wycofaj się o 3 mm). Uważaj, aby nie zakłócić działania oskrzeli. Za pomocą szwu 6-0 umieść 3 szwy wokół tchawicy, aby zabezpieczyć cewnik.
- Przekrój mysz na wysokości 12. kręgu piersiowego. Aorta zstępująca biegnie do przodu kręgosłupa i powinna być tutaj przecięta wraz z kręgosłupem. Rozsuń dolną połowę.
- Wstecznie cewnikuj aortę i popchnij cewnik, aż dotrze do łuku aorty. Za pomocą szwu 9-0 umieść 4 szwy wokół aorty, zaczynając 5 mm poniżej końcówki cewnika.
2. Decelularyzacja
- Podłącz mysz do systemu pompy za pomocą silikonowych wężyków i złączy Luer. Perfuzja z wodą dejonizowaną w stężeniu 200 μl/min przez 15 min. Utrzymuj to natężenie przepływu podczas decelularyzacji.
- Zmień środek perfuzyjny na 0,5% deoksycholan sodu (DOC) rozcieńczony w wodzie dejonizowanej i perfuzuj przez noc.
- Zmienić środek perfuzyjny na 0,1% dodecylosiarczan sodu (SDS) rozcieńczony w wodzie dejonizowanej i perfuzjonować przez 8 godzin.
- Perfuzję z wodą dejonizowaną przez noc, aby zmyć SDS i DOC przez 24 godziny.
- Wyciąć pozbawione komórek serce i płuca, dzieląc ich przyczepy do klatki piersiowej za pomocą zakrzywionych nożyczek i przechowywać w sterylnej krioprobówce z dejonizowaną wodą z 1% (v/v) penicyliną-streptomycyną i 0,3 μM azydkiem sodu w temperaturze 4 °C. Rusztowania ECM mogą być przechowywane przez co najmniej 12 tygodni1. Jeśli rusztowanie będzie używane do analizy biochemicznej (np. spektrometrii mas), należy je zamrozić w ciekłym azocie.
3. Barwienie immunologiczne
- Zaplanuj obrazowanie: określ przeciwciało pierwszorzędowe (lub przeciwciała) i kombinację fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciał drugorzędowych, aby pasowały do siebie i pasowały do linii laserowych mikroskopu fluorescencyjnego.
- Zablokuj próbkę, zanurzając ją w krioprobówce zawierającej 6% (v/v) surowicy osła - 3% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez noc.
- Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem (lub przeciwciałami) w 3% surowicy osła w PBS przez 24 godziny.
- Prać 5 razy przez 1 godzinę za każdym razem w 0,05% tween 20 w PBS (PBST).
- Inkubować próbkę z fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym (lub przeciwciałami) w 3% surowicy osła w PBS przez 24 godziny.
- Prać 5 razy przez 1 godzinę w 0,05% (PBST). Odczekaj 1 godzinę między każdym praniem.
- Dodać wodę dejonizowaną i przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od bezpośredniego światła. W tym momencie rusztowanie jest gotowe do obrazowania.
4. Obrazowanie
- Umieść próbkę w naczyniu ze szklanym dnem i zwilż ją dwiema kropelkami roztworu do przechowywania (PBS lub woda dejonizowana).
- Przygotuj cel. Zalecamy korzystanie z obiektywu do zanurzenia w wodzie.
- Zbadać próbkę za pomocą światła fluorescencyjnego.
- Przełącz się na sterowanie komputerowe. Włącz lasery i dostosuj intensywność lasera, aperturę otworkową, długości fal detektorów, wzmocnienie, rozdzielczość i zoom. Ustaw liczbę i rozmiar kroku dla stosu z i rozpocznij akwizycję. Zalecamy stosowanie wzbudzenia laserem wielofotonowym w celu zwiększenia penetracji tkanek i zminimalizowania rozpraszania światła, wybielania i uszkodzenia tkanek.
5. Barwienie hematoksyliną i eozyną
- Wyciąć 1 płat płuca od myszy poddanej eutanazji.
- Umieścić w kriomold o wymiarach 10 mm x 10 mm x 5 mm i przykryć około 500 μl związku OCT.
- Zamrażać na suchym lodzie (-70 °C) i utrzymywać próbkę w tej temperaturze.
- Wytnij jeden pozbawiony komórek płat płuc od przetworzonej myszy zgodnie z krokiem 2.5.
- Umieść w kriofordzie największą powierzchnią do dołu i przykryj ją związkiem OCT, jak określono w kroku 5.2.
- Zamrozić na suchym lodzie (-70°C) i utrzymać próbkę w tej temperaturze do czasu, gdy będzie to wymagane. Próbka może być przechowywana przez co najmniej 12 tygodni.
- Zamrożone bloki tkanek należy rozciąć w temperaturze -20 °C w kriostacie o grubości 5 μm, a następnie umieścić skrawki na szkiełkach samoprzylepnych i przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Weź szkiełka do temperatury pokojowej, aż wyschną na powietrzu (około 20 min).
- Krótko zanurzyć w PBS i utrwalić, zanurzając szkiełka w 4% paraformaldehydzie w PBS na 15 minut. Umyć raz w PBS przez 5 minut, a następnie dwa razy w wodzie destylowanej przez 5 minut.
- Zanurzyć w roztworze hematoksyliny Mayera na 10 minut. Czas ten można zoptymalizować w zależności od źródła tkanki i przygotowania plamy.
- Myć w słoiku Coplin pod bieżącą wodą destylowaną przez 10 minut.
- Zanurzyć w roztworze eozyny na 7 minut. Czas ten można zoptymalizować w zależności od źródła tkanki i przygotowania plamy.
- Zanurz w 50% etanolu, aby usunąć nadmiar eozyny i odwodnić, zanurzając na krótko w 70% etanolu oraz w 96% i 100% etanolu na 30 sekund. Zanurz kilkakrotnie w ksylenie.
- Nałóż kilka kropli podłoża montażowego DPX i umieść szklane szkiełko nakrywkowe.
- Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc pod kapturem chemicznym.
- Skanowanie slajdów w skanerze slajdów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Dekomórkowanie krążeniowo-oddechowe
Po pomyślnym przeprowadzeniu protokołu serce i płuca, a także tkanki przyległe, takie jak łuk aorty, będą wolne od komórek. Dekomórkowanie można potwierdzić za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (Rysunek 1) rusztowań ECM, wykazującego usunięcie jąder komórkowych w porównaniu z tkanką natywną. Rusztowania te zachowują wymiary świeżych organów, a ich nierozpuszczalna struktura ECM pozostaje nienarusz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Techniki decelularyzacji oparte na mieszaniu tkanek zmieniają strukturę ECM, co czyni je nieodpowiednimi do analizy struktury ECM4. Decelularyzacja perfuzyjna, przy użyciu drogi anatomicznej, takiej jak aorta tchawicy, pozwala dotrzeć do łożyska naczyń włosowatych lub końcowych pęcherzyków płucnych i ułatwia dostarczanie środków decelularyzujących w całym narządzie. Stosowanie detergentów obojczojonowych, anionowych i niejonowych do decelularyzacji tkanek jest zgłaszane
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy prof. Ivanie Novak i dr Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), University of Copenhagen) za udostępnienie mikroskopu. Prace te były wspierane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR i JTE); stypendium doktoranckie Fundacji Lundbeck (R286-2018-621; MR); Szwedzka Rada ds. Badań Naukowych (2017-03389; CDM); Szwedzkie Towarzystwo Onkologiczne, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj i 190007; CDM); Niemiecka Organizacja Pomocy Chorym na Raka (Deutsche Krebshilfe; RR); oraz Duńskie Towarzystwo Onkologiczne (R204-A12454; RR).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 szew, igła o przekroju trójkątnym (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 mikroszew (Safil) | Braun | G1048611 | |
| Adson | Narzędzia Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Kleszcze Adson z zębami | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Uchwyt mikroigłowy Castroviejo | Fine Science Tools | nr 12061-01 | |
| CO2 komora wentylacyjna do eutanazji myszy | |||
| Woda dejonizowana (Milli-Q IQ 7000, system ultraczystej wody laboratoryjnej) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Jednorazowa tacka polistyrenowa (~30 & razy; 50 cm) | |||
| Mikroskop preparacyjny (Greenough, z dwuramienną gęsią szyją) | Leica | S6 D | |
| Dwustronna mikroszpatułka | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Mikrokleszcze Dumont (dwa) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Mikrokleszcze Dumont z 45° końcówki (dwa) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Maszynka do strzyżenia włosów | Oster | 76998-320-051 | |
| Uchwyt igły Halsey (ze szczękami z węglika wolframu) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Cewnik dożylny o rozmiarze 24 (Insyte) | BD | 381512 | |
| Cewnik dożylny o rozmiarze 26 (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Nożyczki majonezowe (twarde, proste) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Mikrokleszcze z końcówkami z pierścieniami (dwa) | Aesculap | FM571R | |
| Nożyczki mikrosprężynowe (Vannas, zakrzywione) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Igły (rozmiar 27; Microlance) | BD | 21018 | |
| Ręcznik papierowy (sterylny) lub serwetka chirurgiczna | |||
| Nożyczki ząbkowane (CeramaCut, proste) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Szpatułka (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| strzykawki (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Nożyczki do ścięgien (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 oślica anty-świnka morska IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 osioł anty-królik IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA (albumina frakcji bydlęcej V, gatunku standardowego, liofilizowana) | Serva | 11930.03 | |
| Przeciwciało poliklonalne Collagen IV (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Gospodarz: królik |
| PBS (pH 7,4, 10&razy;, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Gospodarz: koza |
| Przeciwciało poliklonalne Periostin (miły prezent od Manuela Kocha. RRID:AB2801621) | Gospodarz: świnka morska | ||
| Skalpel jednorazowy z ostrzem nr 11 (szt. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Surowica (normalna surowica osła) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| strong>IMAGING | |||
| Detektory (detektor hybrydowy (model Leica, HyD S) i lampy fotopowielacza (PMT; ) | Leica | ||
| Fluorescencyjne źródło światła | Leica | EL6000 | |
| Mikroskop (odwrócony mikroskop wielofotonowy) | Leica | SP5-X MP | |
| Obiektyw (lambda blue, 20×, 0,70 apertura numeryczna (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO& | |
| nbsp; Dwufotonowy Ti– laser szafirowy (fizyka widm, model Mai Tai DeepSee) | |||
| Laser światła białego (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Etanol (alkohol bezwzględny 99,9%); alkohol bezwzględny należy dostosować do 70% (vol/vol) przy użyciu wody dejonizowanej | Śliwka | 1680766 | |
| Woda dejonizowana (Milli-Q IQ 7000, system ultraczystej wody laboratoryjnej) | Złączki | ||
| Luer-to-tubing (1/8 cala) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7,4, 10&x;, Gibco) | Thermo Fisher Scientific 70011044 | ||
| Penicylina-streptomycyna | Gibco | 15140122 | |
| Pompa perystaltyczna (z 12 kanałami) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Rurka silikonowa (z średnicą wewnętrzną 2 mm i średnicą zewnętrzną 4 mm) | Ole Dich | 31399 | |
| Azydek sodu | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Deoksycholan sodu (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Dodecylosiarczan sodu | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H& E BARWIENIE | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% | Etanol Śliwka | 201446-5L | |
| Absolutny etanol | Śliwka | 201152-1L | |
| Szkiełka nakrywkowe (24x50mm; 1000 szt) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 szt) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX medium montażowe | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eozyna Y roztwór alkoholowy 0,5% | Sigma | 1024390500 | |
| Pióro mikrotomu ze stali nierdzewnej, C35 (50 szt) | Pfm medyczne | 207500003 | |
Prowadnice Fisherbrand Superfrost Plus (25 x 75 mm; 144 szt) | Thermofisher | ||
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E Skaner slajdów | |
| (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
Bibliografia
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
