Podejście oparte na otwartym oknie naczyniowym przy użyciu znaczników fluorescencyjnych zapewnia wystarczającą rozdzielczość do pomiaru przepływu krwi w ślimaku (CoBF). Metoda ułatwia badanie zmian strukturalnych i funkcjonalnych w CoBF u myszy w warunkach normalnych i patologicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar przepływu krwi w ślimaku myszy z wykorzystaniem otwartego okna naczyniowego i przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Transdukcja dźwięku jest metabolicznie wymagająca, a normalna funkcja mikrokrążenia w ścianie bocznej jest kluczowa dla utrzymania potencjału wewnątrzślimakowego, transportu jonów i równowagi płynów. Zgłasza się, że różne formy zaburzeń słuchu obejmują nieprawidłowe mikrokrążenie w ślimaku. Badanie wpływu przepływu krwi w ślimaku (CoBF) na funkcje słuchu jest trudne ze względu na brak wykonalnych metod przesłuchań i trudności w dostępie do ucha wewnętrznego. Otwarte okno naczyniowe w bocznej ścianie ślimaka, w połączeniu z fluorescencyjną mikroskopią przyżyciową, zostało wykorzystane do badania zmian CoBF in vivo, ale głównie u świnki morskiej, a dopiero ostatnio u myszy. Ten artykuł i związany z nim film opisują metodę otwartego okna naczyniowego do wizualizacji przepływu krwi w ślimaku myszy. Szczegóły obejmują: 1) przygotowanie znakowanej fluorescencyjnie zawiesiny komórek krwi od myszy; 2) budowa otwartego okna naczyniowego do mikroskopii przyżyciowej u znieczulonej myszy oraz 3) pomiar prędkości i objętości przepływu krwi za pomocą zapisu obrazowania offline. Metoda została przedstawiona w formie wideo, aby pokazać, jak wykorzystać podejście otwartego okna u myszy do badania strukturalnych i funkcjonalnych zmian w mikrokrążeniu ślimakowym w warunkach normalnych i patologicznych.
Wprowadzenie
Normalna funkcja mikrokrążenia w bocznej ścianie ślimaka (obejmującej większość naczyń włosowatych w więzadle spiralnym i prążkowiu naczyniowym) jest niezwykle ważna dla utrzymania funkcji słuchu1. Nieprawidłowy CoBF jest związany z patofizjologią wielu zaburzeń ucha wewnętrznego, w tym utraty słuchu spowodowanej hałasem, wodniaka ucha i prezbiotyki2,3,4,5,6,7,8,9. Wizualizacja CoBF w obrębie układu przyżyciowego umożliwi lepsze zrozumienie powiązań między funkcją słuchu a patologią naczyń ślimakowych.
Chociaż złożoność i lokalizacja ślimaka w kości skroniowej uniemożliwia bezpośrednią wizualizację i pomiar CoBF, opracowano różne metody oceny CoBF, w tym laserowo-dopplerowska przepływomierz (LDF)10,11,12, obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI)13, fluorescencyjna mikroskopia przyżyciowej (FIVM)14, mikroendoskopia fluorescencyjna (FME)15, endoskopowe laserowe obrazowanie z kontrastem plamkowym (LSCI)16, oraz podejścia oparte na wstrzyknięciu znakowanych markerów i radioaktywnie znakowanych mikrosfer do krwiobiegu (mikroangiografia optyczna, OMAG)17,18,19,20. Jednak żadna z tych metod nie umożliwiła bezwzględnego śledzenia zmian w CoBF in vivo, w czasie rzeczywistym, z wyjątkiem FIVM. FIVM, w połączeniu z okienkiem naczynia w bocznej ścianie ślimaka, jest podejściem, które zostało zastosowane i zatwierdzone na świnkach morskich w różnych warunkach eksperymentalnych przez różne laboratoria14,21,22.
Pomyślnie ustanowiono metodę FIVM do badania strukturalnych i funkcjonalnych zmian w mikrokrążeniu ślimakowym u myszy przy użyciu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dekstranu jako środka kontrastowego i barwnika fluorescencyjnego - DiO (nadchloran 3,3′-dioctadecyloksakarbocyjaniny, zielony) lub Dil (nadchloran 1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetrametylindokarbocyjaniny, czerwony)-do wstępnego znakowania komórek krwi, wizualizacji naczyń krwionośnych i śledzenia prędkości przepływu krwi. W niniejszym badaniu opisano protokół tej metody do obrazowania i ilościowego oznaczania zmian CoBF u myszy w warunkach normalnych i patologicznych (np. po ekspozycji na hałas). Technika ta daje badaczowi narzędzia potrzebne do zbadania podstawowych mechanizmów CoBF związanych z dysfunkcją słuchu i patologią w prążkowiu naczyniowym, zwłaszcza w połączeniu z łatwo dostępnymi transgenicznymi modelami myszy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: To jest operacja, która nie daje szans na przeżycie. Wszystkie procedury związane z wykorzystaniem zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania na Uniwersytecie Zdrowia i Nauki w Oregonie (numer zatwierdzenia IACUC: TR01_IP00000968).
1. Przygotowanie znakowanych fluorescencyjnie komórek krwi
- Znieczulić myszy dawcy (samce myszy C57BL/6J w wieku ~ 6 tygodni) za pomocą dootrzewnowego (i.p.) wstrzyknięcia roztworu znieczulającego ketamina/ksylazyna (5 ml/kg, patrz tabela materiałów).
UWAGA: Ten protokół znieczulenia jest bardzo niezawodny i utrzymuje ogólnoustrojowe ciśnienie krwi. - Połóż mysz na plecach, otwórz skórę i odsłoń klatkę piersiową za pomocą pęsety i nożyczek preparacyjnych. Rozciąć przeponę, chwycić podstawę mostka za pomocą nożyczek zaciskowych, przeciąć klatkę piersiową i podnieść, aby odsłonić serce. Zebrać 1 ml krwi w heparynie (15 j.m./ml krwi) przez nakłucie serca i odwirować przy 3 000 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy po pobraniu krwi.
- Usunąć osocze, przemyć osad krwinek 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i odwirować 3x w stężeniu 3000 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
- Oznacz komórki krwi 1 ml 20 mM DiO lub Dil w PBS i inkubuj w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej23,24.
- Odwirować i przepłukać znakowane krwinki 1 ml PBS, odwirować 3x w 3000 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad komórkowy w 30% hematokrycie z ~0,9 ml PBS (końcowa objętość ~1,3 ml) przed wstrzyknięciem.
2. Operacja tworzenia otwartego okna 25
- Przygotuj sterylne narzędzia chirurgiczne i platformę do obrazowania, a następnie umieść poduszkę grzewczą pod serwetą (Rysunek 1A). Znieczulij myszy (samce myszy C57BL/6J w wieku ~6 tygodni) zgodnie z opisem w kroku 1.1 i sprawdź głębokość znieczulenia, monitorując odruch łapy i ogólne napięcie mięśniowe. Umieść zwierzę na ciepłej poduszce grzewczej i utrzymuj temperaturę w odbycie na poziomie 37 °C.
- Umieść ogon zwierzęcia w systemie monitorującym CODATM w celu monitorowania ciśnienia krwi i bicia serca (patrz Tabela materiałów). Zapisz skurczowe ciśnienie krwi zwierzęcia, rozkurczowe ciśnienie krwi i średnie ciśnienie krwi (MBP) w stanie znieczulonym.
UWAGA: W zwierzęcym MBP nie obserwuje się różnicy w stanie znieczulonym i nieznieczulonym (107 ± 11 mmHg vs. 97 ± 7 mmHg). Tętno zwierzęcia jest stabilne w znieczuleniu, choć niższe (nadal w normalnym zakresie) niż w stanie nieznieczulonym (357 ± 12 bmp vs. 709 ± 3 bmp). U zwierząt umieszczonych w układzie utrzymywanym w uwięzi należy spodziewać się nieznacznie przyspieszonego bicia serca26. - Otwórz lewą błonę bębenkową przez dostęp boczny i brzuszny pod mikroskopem stereoskopowym (patrz Tabela materiałów), pozostawiając błonę bębenkową i kosteczki słuchowe nienaruszone21.
- Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej szyi zwierzęcia z unieruchomioną głową i ustawioną tak, aby zminimalizować ruch (Rysunek 1B). Usuń lewy gruczoł podżuchwowy i tylny brzuch mięśnia dwubrzuścowego i kauteryzuj.
UWAGA: Buprenorfinę należy wstrzyknąć podskórnie w dawce 0,05 mg/kg w celu zmniejszenia bólu podczas zabiegu chirurgicznego. - Zlokalizuj i odsłoń kostną pęcherz, identyfikując mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy i nerw twarzowy rozciągający się do przodu w kierunku pęcherza.
- Otwórz pęcherz kostny za pomocą igły 30 G i ostrożnie usuń otaczającą kość pęsetą chirurgiczną, aby zapewnić wyraźny widok ślimaka i tętnicy strzemiączkowej, z jej przyśrodkowym brzegiem leżącym nad krawędzią niszy okrągłego okna i biegnącym przednio-górnym w kierunku okienka owalnego (Rysunek 1C, D).
UWAGA: Tracheotomia jest wykonywana w celu utrzymania drożności dróg oddechowych i powinna być wykonywana tylko wtedy, gdy zwierzę ma problem z oddychaniem podczas operacji. Ogólnie rzecz biorąc, większość zwierząt pod narkozą ma płynny oddech. Jeśli jednak zwierzęta otrzymały tracheotomię podczas operacji, zarejestrowany przepływ krwi nie powinien być wykorzystywany do żadnego porównania.
- Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej szyi zwierzęcia z unieruchomioną głową i ustawioną tak, aby zminimalizować ruch (Rysunek 1B). Usuń lewy gruczoł podżuchwowy i tylny brzuch mięśnia dwubrzuścowego i kauteryzuj.
- Użyj małego ostrza noża (specjalnie frezowanego skalpela #16), aby zeskrobać kość bocznej ścianki w środkowym zwoju wierzchołka ślimaka myszy, około 1,25 mm od wierzchołka, aż do pęknięcia cienkiego miejsca. Usuń wióry kostne za pomocą małych drucianych haczyków (Rysunek 1E).
- Przykryć okienko naczynia wyciętym szkiełkiem nakrywkowym, aby zachować normalne warunki fizjologiczne i zapewnić widok optyczny do rejestrowania obrazów naczynia.
UWAGA: Wszystkie procedury należy wykonywać z zachowaniem ostrożności. Oprócz monitorowania temperatury ciała, parametry życiowe zwierzęcia, w tym ciśnienie krwi i bicie serca, powinny być również monitorowane przez cały czas trwania operacji.
3. Obrazowanie CoBF w FIVM
- Wykonaj nacięcie ~1 cm wzdłuż prawej żyły odpiszczelowej, aby odsłonić naczynie (Rysunek 1F).
- Wlej kolejno 100 μl roztworu FITC-dekstranu (2000 kDa, 40 mg/ml w PBS) i 100 μl zawiesiny krwinek (30% hematokrytu) kolejno do zwierzęcia przez żyłę odpiszczelową (Rysunek 1G), aby umożliwić wizualizację naczyń krwionośnych i śledzenie prędkości przepływu krwi.
- Obserwuj przepływ krwi w czasie rzeczywistym bezpośrednio na monitorze wideo 5 minut po wstrzyknięciu. Zobrazuj naczynia krwionośne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw o dużej odległości roboczej (WD) (WD 30,5 mm, 10x, apertura numeryczna 0,26) i obudowę lampy zawierającą wielopasmowy filtr wzbudzenia i kompatybilny filtr emisyjny (tabela materiałów). Nagraj wideo za pomocą cyfrowej czarno-białej kamery o wysokiej rozdzielczości ze sprzężeniem ładunkowym (tabela materiałów) z prędkością 2 klatek/s). Pozyskaj ponad 350 obrazów w każdym filmie, aby zapewnić pomyślną analizę prędkości przepływu.
UWAGA: Naczynia krwionośne zarówno więzadła spiralnego, jak i naczynia naczyniowego prążkowia można obrazować, regulując ostrość optyczną (Dodatkowe wideo 1).
4. Analiza wideo
- Zmierz średnicę naczynia za pomocą odpowiedniego oprogramowania (Tabela materiałów) i określ odległość między dwoma stałymi punktami w poprzek naczynia na uzyskanych obrazach.
- Oblicz prędkość przepływu krwi na podstawie przechwyconych klatek wideo, śledząc ruch oznakowanych krwinek w odległości przestrzennej między lokalizacjami obrazu27.
- Otwórz film przedstawiający przepływ krwi w oprogramowaniu (w tym protokole użyto Fidżi [ImageJ]) i ustaw skalę obrazów.
- Śledź wybrane krwinki barwione DiO za pomocą funkcji śledzenia. Użyj odległości, na jaką przesunęły się komórki, oraz odstępu czasu między klatkami obrazu w filmie, aby automatycznie obliczyć prędkość przepływu.
- Obliczyć przepływ objętościowy (F) według następującego równania: F = V × A. (V: prędkość; A: pole przekroju poprzecznego naczynia).
5. Narażenie na hałas
- Umieść zwierzęta w klatkach z siatki drucianej. Wystaw je na działanie hałasu szerokopasmowego o poziomie ciśnienia akustycznego 120 dB w kabinie dźwiękochłonnej przez 3 godziny i przez dodatkowe 3 godziny następnego dnia.
UWAGA: Ten reżim ekspozycji na hałas, rutynowo stosowany w tym laboratorium, powoduje trwałą utratę czułości ślimaka28.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po chirurgicznym odsłonięciu naczyń kapilarnych ślimaka w ścianie bocznej (Rysunek 1), możliwe było przeprowadzenie intravitalnej obserwacji mikroskopowej o wysokiej rozdzielczości z użyciem fluorescencji w celu analizy komórek krwi znakowanych DiI w naczyniach znakowanych FITC-dekstraną poprzez otwarte okno naczyniowe. Rysunek 2A przedstawia reprezentatywny obraz uzyskany za pomocą FIVM, ukazujący naczynia kapilarne ściany boczn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule pokazano, w jaki sposób naczynia włosowate w bocznej ścianie ślimaka (i w prążkowiu naczyniowym) modelu mysiego można uwidocznić za pomocą znakowania fluoroforem w preparacie z otwartym okienkiem naczyniowym w systemie FIVM. Model mysi jest szeroko stosowany i preferowany jako model ssaków do badania ludzkiego zdrowia i chorób. Opisany tutaj protokół jest wykonalnym podejściem do obrazowania i badania CoBF w bocznej ścianie myszy (szczególnie w prążkowiu naczyniowym) przy użyciu otwartego okna naczynia w syste...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) oraz Fundację Badań Medycznych z Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,9% Chlorek sodu | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0,6 ml (na 1 ml) |
| 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetrametyloindokarbocyjaniny nadchloran | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µ M |
| 3,3′-nadchloran dioktadecyloksakarbocyjaninyDio (3,3′-nadchloran dioktadecyloksakarbocyjaniny | Sigma Aldrich | D4292 | 20 &mikro; System monitorowania M |
| CODA Kent | scientific | CODA Monitor, do monitorowania ciśnienia krwi i bicia serca | |
| Szkiełko nakrywkowe | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Regulator temperatury DC | FHC | 40-90-8D | |
| Fidżi/ImageJ | NIH | Pomiar średnicy naczynia | |
| FITC-dekstran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/ml |
| Heparyna Wstrzyknięcie sodu, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 jednostek USP / ml |
| Katathesia (100 mg / ml) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0,2 ml (na 1 ml) |
| Obiektyw mikroskopu | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Kamera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Ksylaina (100 mg/ml, 5x rozcieńczona do użycia) | Lloyd | LPFL04821 | 0,2 ml (na 1 ml) |
| Mikroskop stereoskopowy Zoom | Olympus | Model: SZ61, mikroskop fluorescencyjny |
Bibliografia
- Shi, X. Physiopathology of the cochlear microcirculation. Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).
- Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice. Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).
- Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research. Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).
- Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention. Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).
- Miller, J., Ren, T. -Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. Hydrops-induced changes in cochlear blood flow. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).
- Miller, J. M., Ren, T. -Y., Nuttall, A. L. Studies of inner ear blood flow in animals and human beings. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).
- Nakashima, T., et al. Disorders of cochlear blood flow. Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).
- Nuttall, A. L. Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss. Noise and Health. 2 (5), 17(1999).
- Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. Vascular pathophysiology in hearing disorders. Seminars in Hearing. , Thieme Medical Publishers. 242-250 (2012).
- Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).
- Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF). Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).
- Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow. Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).
- Le Floc'h, J., et al. Markers of cochlear inflammation using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).
- Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy. Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).
- Monfared, A., et al. In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy. Otology & Neurotology. 27 (2), 144(2006).
- Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system. PLoS One. 13 (2), 0191978(2018).
- Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. The microsphere method for studies of inner ear blood flow. ORL. 50 (6), 355-362 (1988).
- Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).
- Subhash, H. M., et al. Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).
- Reif, R., et al. Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system. PLoS One. 7 (12), 52041(2012).
- Nuttall, A. L. Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea. Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).
- Nuttall, A. L. Cochlear blood flow: measurement techniques. American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).
- Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. Journal of Visualized Experiments. (147), e59803(2019).
- Shi, X., et al. Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow. Hearing Research. 313, 38-46 (2014).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).
- Dai, M., Shi, X. Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow. PloS One. 6 (6), 20652(2011).
- Shi, X. Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor. American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).
- Hou, Z., et al. Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).
- Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry. American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
