Ocena przeprogramowania serca za pomocą analizy obrazowej o wysokiej zawartości

Summary

Przedstawiamy protokół do ilościowego oznaczania bezpośrednio przeprogramowanych indukowanych komórek kardiomiocytów (iCMs) in vitro za pomocą analizy obrazowania o wysokiej treści. Metoda ta pozwala nam określić ilościowo skuteczność przeprogramowania serca w sposób zautomatyzowany i bezpośrednio wizualizować iCM.

Abstract

Celem tego protokołu jest opisanie metody ilościowego oznaczania indukowanych komórek podobnych do kardiomiocytów (iCMs), które są bezpośrednio przeprogramowywane in vitro za pomocą techniki przeprogramowywania. Przeprogramowanie serca zapewnia strategię generowania nowych kardiomiocytów. Poprzez wprowadzenie podstawowych kardiogennych czynników transkrypcyjnych do fibroblastów; fibroblasty mogą być przekształcane w iCM bez przejścia przez stan pluripotencjalnych komórek macierzystych. Jednak współczynnik konwersji fibroblastów do iCM nadal pozostaje niski. W związku z tym istnieje wiele dodatkowych podejść mających na celu zwiększenie wydajności przeprogramowania serca. Większość z tych badań oceniała skuteczność przeprogramowania serca za pomocą cytometrii przepływowej, jednocześnie przeprowadzając immunocytochemię w celu wizualizacji iCM. W związku z tym wymagane są co najmniej dwa oddzielne zestawy eksperymentów z przeprogramowaniem, aby wykazać sukces przeprogramowania iCM. W przeciwieństwie do tego, zautomatyzowana analiza obrazowania o wysokiej zawartości zapewni zarówno kwantyfikację, jak i kwalifikację przeprogramowania iCM przy stosunkowo niewielkiej liczbie komórek. Dzięki tej metodzie możliwa jest bezpośrednia ocena ilości i jakości iCM za pomocą pojedynczego eksperymentu przeprogramowania. Takie podejście będzie w stanie ułatwić przyszłe badania nad przeprogramowaniem serca, które wymagają eksperymentów z przeprogramowaniem na dużą skalę, takich jak badania przesiewowe czynników genetycznych lub farmakologicznych w celu zwiększenia wydajności przeprogramowywania. Ponadto zastosowanie protokołu analizy obrazowania o wysokiej zawartości nie ogranicza się do przeprogramowania serca. Może być stosowany do przeprogramowania innych linii komórkowych, a także do wszelkich eksperymentów barwienia immunologicznego, które wymagają zarówno kwantyfikacji, jak i wizualizacji komórek barwionych immunologicznie.

Introduction

Przeprogramowanie serca zostało opracowane jako alternatywne podejście do generowania nowych kardiomiocytów za pośrednictwem komórek macierzystych. Biorąc pod uwagę, że nie przechodzi przez stan komórek macierzystych, ma wysoki potencjał do ominięcia niektórych dziedzicznych ograniczeń w podejściach za pośrednictwem komórek macierzystych. Wykazano, że infekcja wirusowa co najmniej trzech lub czterech kardiogennych czynników transkrypcyjnych do fibroblastów może przekształcić fibroblasty w kierunku losu serca poprzez eliminację programów genów fibroblastów i odbudowę kardiogennych sieci transkrypcyjnych w fibroblastach^1,

Protocol

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Medycznego Uniwersytetu Vanderbilt.

1. Generacja retrowirusów i przeprogramowanie serca in vitro

1. Hodowla komórek E platyny w DMEM uzupełniona 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 1 μg/ml puromycyny i 10 μg/ml blasticydyny, aż zbieg komórek Platinum E osiągnie 70%-80%.
2. W dniu 1 wysiewaj ~0,55 x 10⁶ komórek (pierwsza studzienka) i ~0,18 x 10⁶ komórek (druga studzienka) do dwóch oddzielnych dołków 12-dołkowej płytki z 1 ml DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny na dz....

Results

Po eksperymentach z przeprogramowaniem, określiliśmy ilościowo iCM za pomocą analizy obrazowania o wysokiej zawartości, jak opisano powyżej. Złożone obrazy 36 miejsc obrazowania, które zostały wykorzystane do analizy obrazowania o wysokiej zawartości, zostały pokazane w Rysunek 1. iCM definiuje się jako podwójnie dodatnie komórki (α-aktynina ⁺ Titin-eGFP⁺) w tych eksperymentach. Analiza obrazowania o wysokiej zawartości pokazuje, że ~26% komórek wykazywało oba markery s.......

Discussion

W poprzednich badaniach nad przeprogramowaniem oceniano skuteczność przeprogramowywania za pomocą cytometrii przepływowej i wykazano jakość strukturalną iCM przy użyciu immunocytochemii w dwóch oddzielnych eksperymentach. Analiza cytometrii przepływowej wymaga znacznie większej liczby komórek wyjściowych, co zwiększa skalę eksperymentów. W przeciwieństwie do tego, analiza obrazowania o wysokiej zawartości może ocenić zarówno jakość, jak i ilość przeprogramowania iCM za pomocą pojedynczego eksperymentu ze stosunkowo niewi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
przeciwciało anty-kurczakowe Alexa 488	Thermofisher	A11039
przeciwciało anty-GFP	Invitrogen	A10262
anty-myszy Alexa 555	Thermofisher	A21422
przeciwciało anty-&alfa;-aktyninowe	Sigma	A7811
Roztwór DAPI	Vector labs	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
Suplement insuliny-transferyny-selenu	G Invitrogen	41400-045
Medium 199	Invitrogen	11150059
MEM roztwór witaminowy	Invitrogen	11120-052
Oprogramowanie MetaXpress	Urządzenie
Micro XL zautomatyzowany system obrazowania komórek			molekularne
Minimalny roztwór aminokwasów egzogennych	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
Filtr PES (0,45 i mikro; m)	Thomas scientific	1159T84
Platninum E cells	Cell Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
Uniwersalny bufor blokujący	BiogeneX	HK083-50K