Method Article

Ocena przeprogramowania serca za pomocą analizy obrazowej o wysokiej zawartości

DOI:

10.3791/61859

⸱

October 26th, 2020

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Vanderbilt Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół do ilościowego oznaczania bezpośrednio przeprogramowanych indukowanych komórek kardiomiocytów (iCMs) in vitro za pomocą analizy obrazowania o wysokiej treści. Metoda ta pozwala nam określić ilościowo skuteczność przeprogramowania serca w sposób zautomatyzowany i bezpośrednio wizualizować iCM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest opisanie metody ilościowego oznaczania indukowanych komórek podobnych do kardiomiocytów (iCMs), które są bezpośrednio przeprogramowywane in vitro za pomocą techniki przeprogramowywania. Przeprogramowanie serca zapewnia strategię generowania nowych kardiomiocytów. Poprzez wprowadzenie podstawowych kardiogennych czynników transkrypcyjnych do fibroblastów; fibroblasty mogą być przekształcane w iCM bez przejścia przez stan pluripotencjalnych komórek macierzystych. Jednak współczynnik konwersji fibroblastów do iCM nadal pozostaje niski. W związku z tym istnieje wiele dodatkowych podejść mających na celu zwiększenie wydajności przeprogramowania serca. Większość z tych badań oceniała skuteczność przeprogramowania serca za pomocą cytometrii przepływowej, jednocześnie przeprowadzając immunocytochemię w celu wizualizacji iCM. W związku z tym wymagane są co najmniej dwa oddzielne zestawy eksperymentów z przeprogramowaniem, aby wykazać sukces przeprogramowania iCM. W przeciwieństwie do tego, zautomatyzowana analiza obrazowania o wysokiej zawartości zapewni zarówno kwantyfikację, jak i kwalifikację przeprogramowania iCM przy stosunkowo niewielkiej liczbie komórek. Dzięki tej metodzie możliwa jest bezpośrednia ocena ilości i jakości iCM za pomocą pojedynczego eksperymentu przeprogramowania. Takie podejście będzie w stanie ułatwić przyszłe badania nad przeprogramowaniem serca, które wymagają eksperymentów z przeprogramowaniem na dużą skalę, takich jak badania przesiewowe czynników genetycznych lub farmakologicznych w celu zwiększenia wydajności przeprogramowywania. Ponadto zastosowanie protokołu analizy obrazowania o wysokiej zawartości nie ogranicza się do przeprogramowania serca. Może być stosowany do przeprogramowania innych linii komórkowych, a także do wszelkich eksperymentów barwienia immunologicznego, które wymagają zarówno kwantyfikacji, jak i wizualizacji komórek barwionych immunologicznie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprogramowanie serca zostało opracowane jako alternatywne podejście do generowania nowych kardiomiocytów za pośrednictwem komórek macierzystych. Biorąc pod uwagę, że nie przechodzi przez stan komórek macierzystych, ma wysoki potencjał do ominięcia niektórych dziedzicznych ograniczeń w podejściach za pośrednictwem komórek macierzystych. Wykazano, że infekcja wirusowa co najmniej trzech lub czterech kardiogennych czynników transkrypcyjnych do fibroblastów może przekształcić fibroblasty w kierunku losu serca poprzez eliminację programów genów fibroblastów i odbudowę kardiogennych sieci transkrypcyjnych w fibroblastach1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Od czasu pierwszego przełomowego badania demonstrującego przeprogramowanie serca in vitro1, protokół przeprogramowania serca został zoptymalizowany przez liczne badania3,5,6,7,9,11,12,13,14,15,16,18. Powszechnymi podejściami technicznymi do oceny fenotypów serca w fibroblastach po przeprogramowaniu serca były analiza cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia komórek wyrażających określone markery kardiomiocytów oraz immunocytochemia do wizualizacji tych komórek na poziomie pojedynczej komórki. Chociaż oba eksperymenty (tj. cytometria przepływowa i immunocytochemia) mają wykazać ekspresję markerów kardiomiocytów przy użyciu tych samych przeciwciał, muszą być przeprowadzone oddzielnie. Ponadto cytometria przepływowa wymaga stosunkowo większej liczby komórek, zwiększając w ten sposób ilość odczynników potrzebnych do eksperymentu. Alternatywnie, komórki dodatnie pod względem markerów kardiomiocytów można określić ilościowo przez ręczne liczenie zgodnie z immunocytochemią. Jest to jednak bardzo pracochłonne i zwykle mniej dokładne.

Celem tego protokołu jest opisanie metody, która może określić ilościowo i uwidocznić iCM za pomocą pojedynczego eksperymentu immunologicznego przy użyciu automatycznej analizy obrazowania o wysokiej zawartości. Wymaga stosunkowo niewielkiej liczby komórek wyjściowych, ponieważ protokół ten jest wykonywany w studzience z 24-dołkową płytką. W tym samym czasie można używać aż trzech różnych markerów. Pojedyncze, podwójne i potrójnie dodatnie komórki mogą być automatycznie oznaczane ilościowo. Oprócz kwantyfikacji komórek wybarwionych immunologicznie, analiza obrazowania o wysokiej zawartości zapewnia wysokiej jakości obrazy obiektywów 2-100x. W razie potrzeby te same komórki wybarwione immunologicznie, które są używane w analizie obrazowania o wysokiej treści, można ponownie wykorzystać do dalszych badań obrazowych, takich jak mikroskopia konfokalna. Główną zaletą tego protokołu jest to, że zapewnia on nie tylko bezstronną kwantyfikację iCM przy znacznie mniejszej liczbie komórek, ale także wizualizację iCM. Co więcej, protokół ten może być wykorzystany do oceny przeprogramowania linii niesercowych (np. przeprogramowania iPSC, neuronów i hepatocytów).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Medycznego Uniwersytetu Vanderbilt.

1. Generacja retrowirusów i przeprogramowanie serca in vitro

  1. Hodowla komórek E platyny w DMEM uzupełniona 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 1 μg/ml puromycyny i 10 μg/ml blasticydyny, aż zbieg komórek Platinum E osiągnie 70%-80%.
  2. W dniu 1 wysiewaj ~0,55 x 106 komórek (pierwsza studzienka) i ~0,18 x 106 komórek (druga studzienka) do dwóch oddzielnych dołków 12-dołkowej płytki z 1 ml DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny na dzień przed pierwszą transfekcją.
    UWAGA: Można użyć różnych rozmiarów naczyń hodowlanych w zależności od ilości pożywki wirusowej potrzebnej do eksperymentów. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z innymi skalami eksperymentów.
  3. W dniu 2 należy przetransfekować quad-cistroniczny konstrukt retrowirusowy M-G-T-H kodujący Mef2c, Gata4, Tbx5 i Hand2 opisane w poprzednim badaniu9 lub pusty wektor do komórek Platinum E pierwszego dołka. Dodać 3 μl odczynnika do transfekcji do 30 μl zredukowanej pożywki surowicy. Pięć minut później dodać 1 μg konstruktu retrowirusowego lub pusty wektor do mieszaniny odczynnika do transfekcji i zredukowanej pożywki surowicy. Po 20 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej dodać mieszaninę do komórek E platyny.
  4. W dniu 3, 16–20 godzin po transfekcji, usuń pożywkę i uzupełnij świeży DMEM uzupełniony 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.
  5. W dniu 3, 24 godziny po pierwszej transfekcji, przeprowadzić drugą transfekcję do drugiego dołka, w którym w dniu 1 posiano komórki E platyny, jak opisano w kroku 1.3).
  6. W dniu 3 nasiona ~ 5 x 104 zamrożone mysie fibroblasty embrionalne (MEF) wyizolowane z myszy reporterowych Titin-GFP knock-in19 do studzienki z 24-dołkową płytką. W sumie potrzebne są dwie studzienki z 24-dołkową płytką (tj. niezakażona kontrola i infekcja M-G-T-H).
    UWAGA: Może być konieczne dostosowanie liczby posianych MEF-ów, ponieważ szybkość odzysku zamrożonych MEF-ów może się różnić w zależności od warunków zamrażania komórek. Około 10% konfluencji dziennie po wysianiu komórek jest wystarczające do przeprogramowania. Wydajność przeprogramowywania można zwiększyć za pomocą świeżo rozmrożonych MEF-ów.
  7. W 4 dniu, 16–20 godzin po drugiej transfekcji, usuń pożywkę i uzupełnij świeży DMEM uzupełniony 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.
  8. W dniu 4, 48 godzin po pierwszej transfekcji, zebrać pożywkę wirusową w pierwszym dołku komórek E platyny za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i przefiltrować je przez filtr membranowy z polieterosulfonu (PES) o grubości 0,45 μm. Usuń pożywki wzrostowe fibroblastów z MEF i zastąp je pożywką wirusową uzupełnioną polibrenem w stężeniu 6 μg/ml (pierwsza infekcja).
  9. W dniu 5, 48 godzin po drugiej transfekcji, wykonaj drugą infekcję przy użyciu pożywki wirusowej w drugiej studzience, jak opisano w kroku 1.8).
  10. W dniu 6, 24 godziny po drugim zakażeniu, pożywki wirusowe są zastępowane pożywkami indukcyjnymi serca składającymi się z DMEM/199 (4:1), 10% FBS, 5% surowicy końskiej, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% aminokwasów endogennych, 1% aminokwasów egzogennych, 1% B-27, 1% insuliny, selenu-transferyny, 1% mieszaniny witamin i 1% pirogronianu sodu, 1 μM SB431542 i 0,5 μm A83-01. Zmieniaj pożywkę indukcyjną serca co trzy dni, aż do pobrania komórek.

2. Barwienie immunologiczne

  1. Po 14–15 dniach od zakażenia umieść komórki na 24-dołkowej płytce z 2% paraformaldehydem przez 15 minut.
  2. Przepuszczalność utrwalonych komórek za pomocą buforu permeabilizacji (0,05% Triton-X w PBS) poprzez trzykrotne przemywanie komórek buforem permeabilizacji co 5 minut.
  3. Inkubować komórki z uniwersalnym buforem blokującym przez 45 minut.
  4. Inkubować komórki z mysią α-aktyniną (rozcieńczenie 1:400) i przeciwciałami GFP kurczaka (rozcieńczenie 1:400) przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Około 150 μl roztworu przeciwciał może pokryć całą powierzchnię dołka na płytce 24-dołkowej.
  5. Przemyć komórki buforem permeabilacyjnym przez 5 minut trzy razy.
  6. Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi anty-mysim Alexa-555 i anty-kurczakiem Alexa-488 (rozcieńczenie 1:400) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej
  7. Przemyć komórki buforem permeabilacyjnym przez 5 minut trzy razy.
  8. Dodać 2,5 μl roztworu DAPI do 250 μl buforu permeabilizacyjnego.

3. Obrazowanie o wysokiej zawartości

  1. Włącz system obrazowania.
  2. Otwórz powiązane oprogramowanie.
  3. Zaloguj się do systemu.
  4. Na pasku zadań wybierz opcję Uruchom blachę.
  5. Kliknij przycisk Otwórz płytę wysuwania drzwi, aby otworzyć drzwiczki w maszynie i włożyć płytkę. Upewnij się, że płyta jest skierowana we właściwym kierunku. Kliknij Zamknij tabliczkę załadunku drzwi, aby zamknąć drzwi.
  6. Kliknij Ustawienia płyty obciążeniowej. Wybierz protokół szablonu, a następnie kliknij Załaduj z bazy danych.
  7. Kliknij Ustawienia pobierania.
  8. W oknie dialogowym Ustawienia akwizycji blachy kliknij przycisk Konfiguruj.
  9. Na karcie Objective (Obiektyw) i Camera (Aparat) wybierz opcję 10x lens (Obiektyw 10x).
  10. Na karcie Płytka wybierz płytkę 24-dołkową.
  11. Na karcie Sites to Visit (Witryny do odwiedzenia) w oknie Site Options (Opcje witryny) wybierz opcję "Stała liczba witryn", aby określić liczbę witryn obrazowania, wybierając liczbę w kolumnach i wierszach. Łącznie 36 miejsc obrazowania jest używanych przez wybranie 6 w kolumnach i 6 w wierszach. Wybierz odstęp między każdym miejscem obrazowania (tj. 500 μm).
  12. Na karcie Akwizycja ustaw liczbę długości fali na 3.
  13. Na karcie Wavelengths (Długości fal) w obszarze Illumination (Oświetlenie) wybierz DAPI, FITC lub Texas Red dla każdej długości fali osobno.
  14. Kliknij kartę Uruchom, a następnie ustaw "Nazwa folderu" i "Nazwa płyty" dla płyty. Kliknij dołki na schemacie płytki do obrazowania, a następnie Oblicz, aby ustawić przesunięcie ostrości dla każdej długości fali. Najpierw skonfiguruj korekcję foucs dla DAPI. Kliknij Auto Exposure, aby automatycznie ustawić czas ekspozycji dla każdej długości fali. Następnie kliknij Acquire Plate, aby rozpocząć obrazowanie wybranych miejsc.

4. Analiza obrazowania o wysokiej zawartości

  1. Po zakończeniu obrazowania o wysokiej zawartości kliknij menu Screening (Klasyfikowanie) i wybierz opcję Review Plate Data (Przejrzyj dane płyty), aby wybrać płytę do analizy.
  2. Kliknij Wybierz płytę. W oknie dialogowym Wybierz blachę do przeglądu otwórz folder i wybierz blachę zapisaną w bazie danych, a następnie kliknij Select.
    UWAGA: Aby wyświetlić obrazy, wybierz DAPI, FITC i Texas Red w polu Wavelengths (Długości fal). W polu Lokacje wybierz opcję Wszystkie lokacje. Kliknij witrynę spośród wybranych 36 witryn, aby wyświetlić ją w każdym oknie obrazu o długości fali, a następnie kliknij Tabela przeglądowa, aby wybrać kolor dla długości fali. Użyj Print Screen na klawiaturze i wklej obraz w oprogramowaniu do edycji zdjęć (np. Paint i Photoshop), aby go zapisać.
  3. Kliknij pozycję Uruchom analizę i wybierz ustawienie szablonu.
  4. Kliknij Konfiguruj ustawienia, a następnie Liczba długości fal. Wybierz trzy długości fal (tj. DAPI do barwienia jąder, Teaxs Red do α-aktyniny i FITC do tytyny-GFP).
  5. Za pomocą narzędzia Linia na pasku narzędzi zmierz szerokość wzdłuż krótkiej osi komórki. Na podstawie zmierzonych szerokości komórek ustaw "Przybliżoną minimalną szerokość" i "Przybliżoną maksymalną szerokość", aby uwzględnić większość komórek w wybranym miejscu obrazowania.
  6. Kliknij Podgląd, aby sprawdzić, czy prawie wszystkie jądra są zaznaczone. Wybrane jądra mają kolor biały, podczas gdy jądra niewybrane pozostają niebieskie (wybarwione DAPI). W razie potrzeby dostosuj pola "Przybliżona minimalna szerokość" i "Przybliżona maksymalna szerokość".
  7. Aby ustawić intensywność powyżej lokalnego tła, umieść kursor myszy wewnątrz i na zewnątrz komórki. Wartość intensywności jest wyświetlana u dołu okna. Nieznacznie zmniejsz intensywność przyciemnionej komórki, aby równomiernie wyświetlić intensywność na całym obszarze każdej komórki. Zdefiniuj tę wartość intensywności jako wartość Intensywność powyżej lokalnego tła. Wartość tę należy ustawić osobno dla każdego kanału.
  8. Kliknij menu Klasyfikacja i wybierz Narzędzia do przechowywania danych płyt. W oknie dialogowym Narzędzia danych blachy kliknij opcję Uruchom analizę, aby wybrać blachę.
  9. W polu Ustawienia wybierz zapisane ustawienie do analizy, wybierz opcję Dodaj do listy automatycznego uruchamiania, a następnie kliknij przycisk OK, aby uruchomić analizę.
  10. Po zakończeniu analizy kliknij menu Klasyfikacja i wybierz Narzędzia do danych płyt. Następnie w oknie dialogowym Narzędzia do zbierania danych blachy kliknij opcję Eksportuj pomiary, aby wyeksportować wyniki analizy.
  11. Kliknij Pomiary komórek i obrazów, a następnie OK.
  12. Na stronie Kreator eksportu pomiarów - Krok 1 wybierz tabliczkę i kliknij przycisk Dalej.
  13. Na stronie Eksport pomiarów - Krok 2 kliknij przycisk Zakończ.
  14. Na stronie Konfiguruj eksport danych wybierz typy danych (tj. nazwa studni, łączna liczba komórek, suma częściowa numer komórki dla DAPI+, suma częściowa numer komórki dla Texas Red+, suma częściowa numer komórki dla FITC+, suma częściowa numer komórki dla DAPI+Texas Red+, suma częściowa numer komórki dla DAPI+FITC+, numer komórki sumy częściowej dla DAPI+FITC+Texas Red+, procent DAPI+ komórki, procent komórek DAPI + Texas Red+, procent komórek DAPI + FITC + i procent komórek DAPI + Texas Red + FITC+), a następnie kliknij OK.
  15. Na stronie Eksportuj jako plik tekstowy wybierz miejsce docelowe, w którym chcesz zapisać plik, i kliknij przycisk OK.
  16. Otwórz plik w programie Microsoft Excel. Wyniki zostaną przedstawione przez każdą z placówek (tabela 2). W każdym odwiercie znajduje się 36 miejsc. Korzystając z narzędzia analitycznego, tabeli przestawnej, podsumuj dane z 36 witryn (tj. sumy liczb komórek i średnie wartości procentowych wskazanych komórek we wszystkich 36 witrynach) (Tabela 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po eksperymentach z przeprogramowaniem, określiliśmy ilościowo iCM za pomocą analizy obrazowania o wysokiej zawartości, jak opisano powyżej. Złożone obrazy 36 miejsc obrazowania, które zostały wykorzystane do analizy obrazowania o wysokiej zawartości, zostały pokazane w Rysunek 1. iCM definiuje się jako podwójnie dodatnie komórki (α-aktynina + Titin-eGFP+) w tych eksperymentach. Analiza obrazowania o wysokiej zawartości pokazuje, że ~26% komórek wykazywało oba markery s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W poprzednich badaniach nad przeprogramowaniem oceniano skuteczność przeprogramowywania za pomocą cytometrii przepływowej i wykazano jakość strukturalną iCM przy użyciu immunocytochemii w dwóch oddzielnych eksperymentach. Analiza cytometrii przepływowej wymaga znacznie większej liczby komórek wyjściowych, co zwiększa skalę eksperymentów. W przeciwieństwie do tego, analiza obrazowania o wysokiej zawartości może ocenić zarówno jakość, jak i ilość przeprogramowania iCM za pomocą pojedynczego eksperymentu ze stosunkowo niewi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza obrazowania o wysokiej zawartości została przeprowadzona w Vanderbilt High-Throughput Screening (HTS) Core Facility z pomocą Davida Westovera i Joshuy Bauera. HTS Core otrzymuje wsparcie od Vanderbilt Institute of Chemical Biology i Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485). Praca ta była wspierana przez AHA Innovative Project Award 18IPA34110341 i NIH R01 HL146524 (Y-.J. N.) oraz stypendium podoktoranckie AHA 20POST35210170 (Z.Z).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A83-01Tocris2939
przeciwciało anty-kurczakowe Alexa 488ThermofisherA11039
przeciwciało anty-GFPInvitrogenA10262
anty-myszy Alexa 555ThermofisherA21422
przeciwciało anty-&alfa;-aktyninoweSigmaA7811
Roztwór DAPIVector labsH1200
Fugene 6PromegaE2691
Suplement insuliny-transferyny-selenuG Invitrogen41400-045
Medium 199Invitrogen11150059
MEM roztwór witaminowyInvitrogen11120-052
Oprogramowanie MetaXpressUrządzenie
Micro XL zautomatyzowany system obrazowania komórekmolekularne
Minimalny roztwór aminokwasów egzogennychSigmaM7145
Opti-MEMGibco31905-070
Filtr PES (0,45 i mikro; m)Thomas scientific1159T84
Platninum E cellsCell BiolabsRV-101
PolybreneSigmaH9268
SB431542SigmaS4317
Uniwersalny bufor blokującyBiogeneXHK083-50K
molekularne Urządzenie

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  2. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  3. Ifkovits, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFbeta signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), 89678(2014).
  4. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  5. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. The EMBO Journal. 33 (14), 1565-1581 (2014).
  6. Umei, T. C., et al. Single-construct polycistronic doxycycline-inducible vectors improve direct cardiac reprogramming and can be used to identify the critical timing of transgene expression. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1805(2017).
  7. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 influences the efficiency and quality of induced cardiac myocyte reprogramming. Circulation Research. 116 (2), 237-244 (2015).
  8. Zhang, Z., Zhang, A. D., Kim, L. J., Nam, Y. J. Ensuring expression of four core cardiogenic transcription factors enhances cardiac reprogramming. Science Reports. 9 (1), 6362(2019).
  9. Zhang, Z., Zhang, W., Nam, Y. J. Stoichiometric optimization of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 expression for contractile cardiomyocyte reprogramming. Science Reports. 9 (1), 14970(2019).
  10. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 8243(2015).
  11. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  12. Zhou, H., et al. ZNF281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Development. 31 (17), 1770-1783 (2017).
  13. Zhou, Y., et al. Bmi1 is a key epigenetic barrier to direct cardiac reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  14. Muraoka, N., et al. Role of cyclooxygenase-2-mediated prostaglandin E2-prostaglandin E receptor 4 signaling in cardiac reprogramming. Nature Communications. 10 (1), 674(2019).
  15. Yamakawa, H., et al. Fibroblast growth factors and vascular endothelial growth factor promote cardiac reprogramming under defined conditions. Stem Cell Reports. 5 (6), 1128-1142 (2015).
  16. Abad, M., et al. Notch inhibition enhances cardiac reprogramming by increasing MEF2C transcriptional activity. Stem Cell Reports. 8 (3), 548-560 (2017).
  17. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 53 (3), 323-332 (2012).
  18. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 60, 97-106 (2013).
  19. da Silva Lopes, K., Pietas, A., Radke, M. H., Gotthardt, M. Titin visualization in real time reveals an unexpected level of mobility within and between sarcomeres. The Journal of Cell Biology. 193 (4), 785-798 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac ReprogrammingHigh Content ImagingInduced Cardiomyocyte like CellsFlow CytometryImmunocytochemistryTranscription Factor ReprogrammingFibroblast ConversionAutomated Image AnalysisReprogramming EfficiencyGenetic Screening
Video Coming Soon

Related Articles