Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezlaserowe śladowanie białek rodników hydroksylowych w celu przeprowadzenia analizy strukturalnej białek wyższego rzędu

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61861

⸱

4 czerwca 2021

 ,  ,  , 
1GenNext Technologies Inc., 2Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy, University of Mississippi, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metodę wykorzystania wbudowanej dozymetrii rodnikowej i plazmowego źródła światła do przeprowadzenia błyskawicznego śladu białkowego utleniania. Metoda ta zastępuje niebezpieczny laser UV w celu uproszczenia i poprawy odtwarzalności szybkich badań utleniania fotochemicznego białek.

Streszczenie

Wprowadzenie

Konformacja białka i związana z nią struktura wyższego rzędu (HOS) są głównymi determinantami prawidłowej funkcji biologicznej i nieprawidłowego zachowania1. To samo dotyczy biofarmaceutyków, których struktura i aktywność funkcjonalna jest zależna od różnych aspektów ich produkcji i środowiska. Zmiany biofarmaceutyczne w HOS zostały powiązane z niepożądanymi reakcjami na leki (ADR) przypisywanymi niepożądanym farmakologiom i odpowiedzi immunologicznej pacjenta2,3. Pojawienie się ADR zwróciło uwagę przemysłu biofarmaceutycznego na kluczową rolę, jaką białko HOS odgrywa w bezpieczeństwie i skuteczności bioterapeutyków, a także ustaliło zapotrzebowanie na nową i ulepszoną analitykę HOS4.

Ślad białka rodnika hydroksylowego (HRPF) jest obiecującą techniką śledzenia zmian w białkowym HOS. HRPF polega na nieodwracalnym znakowaniu zewnętrznej powierzchni białka ▪OH, a następnie analizie spektrometrii mas (MS) w celu zidentyfikowania dostępnej dla rozpuszczalnika powierzchni białka5,6,7. HRPF został z powodzeniem wykorzystany do wykrywania defektów białka HOS i jego funkcji8,9, scharakteryzować HOS przeciwciał monoklonalnych (mAb)10,11,12,13, określ wiązanie Kd liganda14, i wiele więcej15,16,17,18,19. Powszechną metodą generowania ▪OH dla HRPF jest szybkie fotochemiczne utlenianie białek (FPOP), które wykorzystuje wysokoenergetyczne, szybkie lasery UV do wytwarzania ▪OH z fotolizyH2O2. W większości przypadków FPOP używa drogich laserów excimerowych wykorzystujących niebezpieczny gaz (KrF), który wymaga znacznych zabezpieczeń, aby uniknąć urazów dróg oddechowych i oczu20. Aby uniknąć zagrożeń związanych z wdychaniem, inni używali czterokrotnie zwiększonych laserów z granatu neodymowo-itrowo-aluminiowego (Nd:YAG) o poczwórnej częstotliwości21, które eliminują użycie toksycznych gazów, ale nadal są kosztowne, wymagają znacznej wiedzy operacyjnej i wymagają rozległej kontroli światła rozproszonego w celu ochrony użytkowników przed obrażeniami oczu.

Chociaż za pomocą HRPF można uzyskać wiele informacji, nie osiągnięto powszechnego zastosowania w biofarmacji. Dwie bariery dla ograniczonego przyjęcia HRPF to: 1) stosowanie niebezpiecznych i drogich laserów, które wymagają znacznych środków ostrożności20; oraz 2) nieodtwarzalność HRPF spowodowana wymiataniem ▪tła OH, które ogranicza badania porównawcze22. Aby zastąpić użycie lasera, opracowano szybkostrzelną, wysokoenergetyczną plazmową jednostkę do fotolizy, aby bezpiecznie wykonywać FPOP w łatwy sposób. Aby poprawić niepowtarzalność eksperymentów HRPF, zaimplementowano dozymetrię rodnikową w czasie rzeczywistym.

Praktyka HRPF została ograniczona przez nieodtwarzalność przypisaną oczyszczaniu ▪tła OH22. Chociaż ▪OH są doskonałymi sondami topografii białek, reagują również z wieloma składnikami znajdującymi się w preparatach, co sprawia, że konieczne jest zmierzenie efektywnego stężenia rodnika dostępnego do utlenienia białka docelowego. Różnice w przygotowaniu buforu, stężeniu nadtlenku wodoru, właściwościach ligandów lub fotolizie mogą powodować różnice w utlenianiu między grupami kontrolnymi i eksperymentalnymi, które powodują niejednoznaczność w badaniach różnicowych HOS. Dodanie dozymetrii rodnikowej w czasie rzeczywistym umożliwia dostosowanie efektu ▪obciążenia OH, a tym samym zwiększa pewność i powtarzalność podczas eksperymentu HRPF. Zastosowanie dozymetrii radykalnej w FPOP zostało opisane gdzie indziej23,24,25, a dokładniej omówiono je w niedawnej publikacji26. W tym miejscu opisujemy zastosowanie nowatorskiego systemu fotolizy błyskawicznej i dozymetrii w czasie rzeczywistym do znakowania apo-mioglobiny koni (aMb), porównując poziomy utleniania peptydów w eksperymencie FPOP z poziomami uzyskanymi przy użyciu lasera excimerowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Instalacja kapilary

  1. Za pomocą przecinaka do krzemionki utnij kapilarę kwarcową o średnicy wewnętrznej (ID) 250 µm na długość 27 cali. Sprawdź, czy końce kapilary są czyste i cięte prosto.
  2. Utwórz dwa okna o długości około 15 mm poprzez wypalenie powłoki polimidowej. Licząc od „dolnego końca”, wykonaj pierwsze okno do fotolizy w odległości 90 mm od „dolnego końca”, a drugie okno dozymetru w odległości 225 mm od „dolnego końca”.
    UWAGA: Po wypaleniu powłoki kapilara staje się bardzo krucha.
  3. Odkręć nakrętkę i tulejkę w porcie 5, a następnie wprowadź „dolny koniec” kapilary tuż za stożkowy koniec tulejki (Rycina 1A).
  4. W module do fotolizy zdejmij nasadkę celi do fotolizy, wyciągając ją prosto, a następnie usuń magnetyczną maskę metalową, która będzie utrzymywać kapilarę na miejscu.
    OSTROŻNIE: Wewnątrz nasadki celi do fotolizy znajduje się zakrzywione lustro; nie wolno dopuścić do dotknięcia lustra przez jakikolwiek przedmiot.
  5. W module dozymetru otwórz celę dozymetryczną, naciskając zakładkę po lewej stronie i odchylając celę do짐etryczną w prawo. Zdejmij magnetyczne klipsy, które będą utrzymywać kapilarę na miejscu.
  6. Umieść kapilarę w rowku w podstawie celi do fotolizy. Wycentruj okno kapilary względem okna celi do fotolizy. Przytrzymując kapilarę jedną ręką, załóż maskę magnetyczną, aby unieruchomić kapilarę. Załóż nasadkę celi do fotolizy z powrotem na miejsce.
  7. Umieść kapilarę w rowku w podstawie celi dozymetrycznej. Wycentruj drugie okno kapilary względem małego otworu w centrum podstawy celi dozymetrycznej. Przytrzymując kapilarę jedną ręką, zamocuj dwa klipsy magnetyczne, aby unieruchomić kapilarę. Zamknij celę dozymetryczną, aż usłyszysz kliknięcie.
  8. Wsuń kapilarę przez radełkowaną nakrętkę na górze uchwytu kapilary w kolektor produktu (Rycina 1B). Wysuń kapilarę do poziomu tuż nad dno fiolki.
    UWAGA: Ważne jest, aby kapilara sięgała dna fiolki, co zapewni jej zanurzenie w roztworze gaszącym podczas przeprowadzania eksperymentu.

2. Instalacja pętli wtryskowej

  1. Należy użyć rurek teflonowych o średnicy zewnętrznej 1/16” i średnicy wewnętrznej 0.015” (381 µm). Aby obliczyć długość rurki potrzebną do uzyskania pożądanej objętości, należy zastosować równanie 1.
    Wzór hydrodynamiki \(L=\frac{V}{π(\frac{d}{2})^2}\); równanie dotyczące dynamiki przepływu.
    Gdzie L to długość rurki w milimetrach, V to pożądana objętość w mikrolitrach, a d to średnica wewnętrzna rurki w milimetrach. Dla objętości wtrysku 25 µL i średnicy wewnętrznej 381 µm długość rurki powinna wynosić około 219,3 mm.
    UWAGA: Dla objętości mniejszych niż 20 µL należy użyć rurek PTFE o średnicy wewnętrznej 0.01”.
  2. Uciąć rurkę teflonową na wymaganą długość za pomocą obcinaka do rurek. Sprawdzić, czy końce rurki są przycięte czysto i prosto.
  3. Wsunąć jeden koniec nowej pętli wtryskowej przez jedną z nakrętek i nałożyć nową tulejkę na koniec rurki. Przytrzymać tulejkę i nakrętkę w odpowiedniej pozycji, a następnie wsunąć rurkę do portu 3 zaworu wtryskowego, aż dotknie dna zaworu. Mocno przytrzymać rurkę i dokręcić nakrętkę palcami. Za pomocą klucza dokręcić nakrętkę o kolejne ¼ obrotu. Wyjąć i sprawdzić montaż.
    UWAGA: Jeśli tulejka nie jest stabilnie zamocowana, należy ją ponownie zainstalować i dokręcić o kolejne 1/8 obrotu. Powtórzyć czynność z drugim końcem pętli.
  4. Gdy oba końce będą posiadały nakrętkę i zamocowaną tulejkę, należy luźno przykręcić jeden koniec do portu 3, a drugi do portu 6 (Rysunek 1C). Po ustawieniu w odpowiedniej pozycji dokręcić obie strony palcami, a następnie o kolejne ¼ obrotu za pomocą klucza.

3. Inicjalizacja systemu fotolizy

  1. Włącz moduły fotolizy w następującej kolejności: (1) Moduł hydrauliki (Fluidics Module), (2) Moduł fotolizy (Photolysis Module), (3) Moduł dosymetrii (Dosimetry Module), (4) Kolektor produktu (Product Collector), a na koniec (5) komputer systemowy i uruchom oprogramowanie sterujące.
    UWAGA: Moduł dosymetrii wymaga co najmniej pół godziny na rozgrzanie po zimnym starcie.
  2. Całkowicie zanurz rurkę z pozycji „Valve” pompy strzykawkowej (Rysunek 1D) w 10 mL buforu. Rurkę z pozycji „Waste” (Rysunek 1D) oraz rurkę z portu 2 portu strzykawkowego (Rysunek 1C) umieść w pustym pojemniku na odpady.
    UWAGA: Należy użyć buforu, w którym zawieszone będzie białko. Zalecanym buforem jest 10 mM NaPO4.
  3. Na karuzeli kolektora produktu umieść probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL w pozycjach oznaczonych jako H oraz 6.
  4. W przypadku zastosowania kapilary o średnicy wewnętrznej (ID) 250 µm, ustaw prędkość przepływu załadunku na 500 µL/min, prędkość przepływu przetwarzania na 7,5 µL/min oraz prędkość przepływu odpadów na 500 µL/min.
  5. Oblicz opóźnienie błysku (flash delay), czas produktu (product time) i czas odpadów (waste time) dla trybu półautomatycznego (Semi-Automatic Mode), korzystając z równania 2.
    Równanie prędkości przepływu cieczy; formuła: \( t = \frac{s \pi (d/2)^2}{f} \); schemat fizyczny.
    Gdzie t to czas w minutach, s to odległość kapilary w milimetrach, d to średnica wewnętrzna kapilary w milimetrach, a f to prędkość przepływu w µL/min.
    1. W przypadku opóźnienia błysku odległość mierzona jest od „dolnego końca” kapilary do pierwszego okna i powinna wynosić około 90 mm. Przy zastosowaniu kapilary o średnicy wewnętrznej 250 µm i prędkości przepływu przetwarzania 7,5 µL/min próbka dotrze do okna fotolizy w około 35 sekundach. Aby umożliwić wystąpienie dwóch błysków przy częstotliwości 1 Hz przed dotarciem próbek, ustaw opóźnienie błysku na 33 sekundy.
    2. W przypadku czasu produktu wprowadź czas, jaki zajmie przepływ wstrzykniętego roztworu z zaworu wstrzykiwania do końca kapilary. Dla kapilary o długości 27” i średnicy wewnętrznej 250 µm ustaw czas produktu na 4,5 minuty.
    3. W przypadku czasu odpadów wprowadź czas potrzebny na zebranie całkowitej objętości wstrzykniętego roztworu. W tym momencie kolektor produktu przesunie się z pozycji produktu do fiolki na odpady. Dla objętości wstrzyknięcia 25 µL i prędkości przepływu 7,5 µL/min ustaw czas odpadów na 7,8 minuty.
  6. Przepłucz pętlę wstrzykiwania pięciokrotnie, wstrzykując 25 µL wody klasy HPLC do portu wstrzykiwania przy ustawionym zaworze wstrzykiwania w pozycji załadunku (load).
  7. Ręcznie przekręć zawór wstrzykiwania do pozycji „inject position”, aby przepłukać resztę systemu. Wybierz Process (Out) w oprogramowaniu sterującym, aby rozpocząć przepływ wody. Podczas przepływu podnieś kapilarę kolektora produktu, wybierając Up w sekcji kolektora produktu, tak aby widzieć koniec kapilary. Przepuszczaj wodę przez kapilarę, aż utworzy się kropla.
    UWAGA: Jeśli kropla się nie utworzy, sprawdź zawór wstrzykiwacza pod kątem nieszczelności. W przypadku wycieku poluzuj nakrętkę, ponownie osadź kapilarę i dokręć.

4. Wyznaczenie rzeczywistej wydajności ▪OH w celu przetestowania efektów usuwania rodników przez bufor.

  1. W oprogramowaniu sterującym uruchom przepływ, wybierając Process (Out). W karcie ustawień ustaw napięcie błysku na 0 V. W karcie Manual Control, w sekcji danych dozymetrycznych, wybierz Start Data + AutoZero.
  2. Wybierz pozycję dla fiolki z produktem (H) i fiolki na odpady (6).
  3. Wybierz Ready, ręcznie przekręć zawór wtryskowy w dół do pozycji załadunku i wstrzyknij 25 µL 1 mM adeniny z 100 mM H2O2 do portu wtryskowego. Po wstrzyknięciu ręcznie przekręć zawór wtryskowy w górę do pozycji wtrysku.
    UWAGA: Powoduje to automatyczne uruchomienie przepływu w systemie, włączenie źródła plazmy i rozpoczęcie pozyskiwania danych dozymetrycznych.
  4. Zwiększaj napięcie, przechodząc do karty ustawień i zmieniając napięcie błysku. Powtórz kroki 4.2 i 4.3, stosując napięcia 500 V, 750 V, 1000 V i 1250 V. Odczyt absorbancji adeniny przy każdym napięciu wykonaj w trzech powtórzeniach.
  5. Wybierz kartę obliczeń, aby wyznaczyć średnią absorbancję każdej próbki. Najpierw kliknij Select, a następnie ręcznie zaznacz początek i koniec piku absorbancji. W dostępnym polu wpisz opis próbki. Powtórz czynność dla wszystkich pozyskanych danych.
    UWAGA: Mogą tworzyć się pęcherzyki powietrza, powodując skoki w odczytach dozymetru. Wybierając dane do wyznaczenia średniej absorbancji, pomiń obszary z pęcherzykami.
  6. Skopiuj i wklej dane do programu Excel, aby obliczyć średnią zmianę absorbancji adeniny dla każdego napięcia, określając w ten sposób efektywną wydajność ▪OH.
  7. Powtórz kroki 4.1-4.6, jeśli stosowane są wiele warunków próbkowych (różne bufory/dodatki), aby znormalizować efektywną wydajność ▪OH dla każdego warunku.

5. Modyfikacja białka w celu wykrycia zmian w strukturze wysokiego rzędu.

  1. Wymieszać adeninę o stężeniu 4 mM z białkiem o stężeniu 20 µM w stosunku jeden do jednego, aby otrzymać roztwór zawierający 2 mM adeniny i 10 µM białka.
  2. Przygotować roztwór gaszący, stosując katalazę w stężeniu 0,3 mg/mL w celu rozkładu nadmiaru nadtlenku wodoru oraz amid metioniny w stężeniu 35 mM w celu zneutralizowania pozostałych rodników. Odmierzyć 25 µL roztworu gaszącego do mikroprowetki o pojemności 200 µL, tak aby zmieszać go z równą objętością produktu znakowanego.
  3. Rozcieńczyć H2O2 do stężenia 200 mM i przechowywać w lodzie.
  4. W oprogramowaniu sterującym (Control Software), w zakładce ustawień, rozpocząć pomiar napięcia błysku od 0 V, aby określić poziom utleniania tła.
  5. W zakładce sterowania ręcznego wybrać Start Data + AutoZero, następnie Process (Out), potem Ready, a na koniec przestawić zawór wtryskowy do pozycji załadunku (load).
  6. Umieścić roztwór gaszący w pozycji 1 na karuzeli zbierania produktów. W oprogramowaniu sterującym systemem (System Control Software) zmienić fiolkę produktu na 1.
  7. Bezpośrednio przed wtryskiem wymieszać 12,5 µL mieszaniny adeniny i białka z 12,5 µL H2O2, aby uzyskać stężenie końcowe 1 mM adeniny, 5 µM białka i 100 mM H2O2. Delikatnie wymieszać za pomocą pipety, krótko odwirować i wstrzyknąć 25 µL przez port wtryskowy w ciągu 10 sekund od wymieszania.
  8. Przestawić zawór wtryskowy do pozycji wtrysku (inject) i odczekać do czasu przetworzenia próbki.
  9. Powtórzyć akwizycję dla napięć 500 V, 750 V, 1000 V i 1250 V. Każdy pomiar napięcia wykonać w trzech powtórzeniach.
  10. Obliczyć średnią absorbancję zgodnie z opisem w kroku 4.5. Skopiować i wkleić wszystkie dane do programu Excel.

6. Wyłączenie systemu

  1. Po pobraniu wszystkich próbek, wypłucz port strzykawki i pętlę próbkową, ustawiając zawór wtryskowy w pozycji załadunku (load) i wstrzykując 25 µL wody do HPLC pięć razy.
  2. Przekręć zawór wtryskowy do pozycji wtrysku (inject), aby wypłukać resztę systemu wodą do HPLC.
  3. Zatrzymaj przepływ, zamknij oprogramowanie sterujące systemem i wyłącz moduły, zaczynając od kolektora produktów, modułu dozownika, modułu fotolizy, a na koniec modułu hydrauliki.

7. Przygotowanie próbek oraz chromatografia cieczowa sprzężona z spektrometrią mas

  1. Zdenaturuj białko, inkubując próbki w temperaturze 80 °C przez 20 min w obecności 50 mM Tris i 1 mM CaCl2. Ochłodź próbki do temperatury pokojowej i dodaj trypsynę w stosunku 1:20 do białka. Traw białko przez noc w temperaturze 37 °C z mieszaniem próbek. Następnego dnia przerwij trawienie trypsyną, podgrzewając próbki do 95 °C przez 10 minut.
  2. Wykryj peptydy przy użyciu systemu LC-MS/MS o wysokiej rozdzielczości połączonego z systemem UPLC.
  3. Nałóż próbkę najpierw na kolumnę pułapkową (300 µm ID X 5 mm, wielkość porów 100 Å, wielkość cząstek 5 µm) i przemyj przy przepływie 5,0 µL/mL przez 3 min wodą zawierającą 2% rozpuszczalnika B (acetonitryl i 0,1% kwasu mrówkowego).
  4. Rozdziel peptydy na nanokolumnie C18 (0,75 mm x 150 mm, wielkość cząstek 2 µm, wielkość porów 100 Å) przy szybkości przepływu 300 nL/min z gradientem między rozpuszczalnikiem A (woda zawierająca 0,1% kwasu mrówkowego) a rozpuszczalnikiem B. Gradient elucji peptydów składa się z liniowego wzrostu od 2 do 35% B w ciągu 22 min, wzrostu do 95% B w ciągu 5 min i utrzymania tej wartości przez 3 min w celu przemycia kolumny, a następnie powrotu do 2% B w ciągu 3 min i utrzymania tej wartości przez 9 min w celu ponownej ekwilibracji kolumny.
  5. Zbierz dane w trybie jonów dodatnich. Ustaw napięcie rozpylania na 2400 V oraz temperaturę rurki transferowej jonów na 300 °C.
  6. Wykonaj pełne skanowanie MS w zakresie 250-2000 m/z, a następnie osiem kolejnych skanowań MS/MS zależnych od danych (data-dependent) dla ośmiu najliczniejszych jonów peptydowych. Do fragmentacji peptydów zastosuj dysocjację indukowaną zderzeniem przy 35% energii znormalizowanej.
  7. Zidentyfikuj wszystkie wykryte niemodyfikowane peptydy z analizy MS/MS, używając dostępnego oprogramowania do analizy białek w oparciu o odpowiedni plik FASTA zawierający sekwencję białka i stosowny enzym proteolityczny.
  8. Wyszukaj i skwantyfikuj zmodyfikowane peptydy za pomocą oprogramowania HRPF Data Processing Software. Stopień utlenienia każdego zidentyfikowanego peptydu oblicza się, dzieląc sumaryczną powierzchnię piku chromatograficznego zmodyfikowanego peptydu przez całkowitą powierzchnię piku chromatograficznego tego peptydu w formie zmodyfikowanej i niemodyfikowanej, korzystając z równania 3.
    P = [I(pojedynczo utleniony) X 1 + I (podwójnie utleniony) X 2 + I(potrójnie utleniony) X 3 + .../[Iunoxidized + I(pojedynczo utleniony) + I(podwójnie utleniony) + I(potrójnie utleniony) ...]
    gdzie P oznacza średnią liczbę zdarzeń utleniania na cząsteczkę peptydu, a I reprezentuje powierzchnię piku peptydu nieutlenionego (Iunoxidized) oraz peptydu z n zdarzeniami utleniania.

8. W celu przeprowadzenia badania różnicowego powtórz kroki 5-7 dla drugiego wariantu warunków.

UWAGA: Aby potwierdzić powtarzalność, zaleca się wykonanie dwóch powtórzeń biologicznych oprócz powtórzeń technicznych w trzech próbkach dla każdego warunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Źródło plazmy wysokociśnieniowej połączone z dosymetrią w czasie rzeczywistym pozwala na lepszą kontrolę wydajności ▪OH, co umożliwia dokładniejszą obserwację zmian w strukturze białek wyższego rzędu. Dodatek adeniny pozwala na stworzenie skutecznego dosymetru rodników działającego w czasie rzeczywistym. Po utlenieniu adenina traci absorbancję w UV przy 265 nm (Rysunek 2A). Zmiana absorbancji adeniny jest bezpośrednio powiązana z koncentracją rodników dostępnych dla HRPF, co zapew...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieje kilka krytycznych kroków, aby zapewnić prawidłowe znakowanie białek podczas każdego eksperymentu HRPF. Po pierwsze, dobiera się odpowiednie natężenie przepływu i szybkość błysku źródła, aby upewnić się, że każdy bolus próbki jest napromieniany jeden raz. Gwarantuje to, że białko jest wystawione na działanie pojedynczego bolusa nowo powstałego ▪OH. Gdy białko zostanie utalone, struktura białka wyższego rzędu może zostać zmieniona. Aby mieć pewność, że natywna struktura białka jest badana, każda cząstec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

E.E.C., J.S.S. i S.R.W. ujawniają znaczne udziały finansowe w GenNext Technologies, Inc., firmie na wczesnym etapie rozwoju, która dąży do komercjalizacji technologii analizy struktury białek wyższego rzędu. Udostępnione reprezentatywne dane zostały zweryfikowane przez S.K.M., który nie znajduje się w finansowym konflikcie interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 i R44GM125420).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stożkowe probówki wirówkowe 15 mlFisher Scientific14-959-53Awystarczy dowolna marka
50 & mikro; L SGE Strzykawki gazoszczelneFisher ScientificSG-00723
Acclaim PepMap 100 C18 nanokolumna (0,75 mm X 150 mm, 2 &mikro; m)Thermo Scientific
Acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym (v/v), klasa LC/MSFisher ScientificLS120-500
ApomyoglobinaSigma-Aldrich
KatalazaSigma-AldrichC9322
WirówkaEppendorf022625501
Delikatne wycieraczki do zadańFisher Scientific06-666A
Nadtlenek wodoruFisher ScientificH325-100wystarczy dowolny 30% nadtlenek wodoru
Amid metioninyChem-Impex03109
MikrowirówkaThermo Scientific75002436
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Spektrometr masowyThermo ScientificOrbitrap Fusion Lumos Tribrid Spektrometrmasowymożna użyć innych instrumentów o wysokiej rozdzielczości (np. Q exactive Orbitrap lub Orbitrap Fusion)
Pierce Trypsin Protease, MS GradeThermo Scientific90058
Polymicro Cleave Stone, 1" x 1" x 1/32"Molex1068680064dowolny obcinak do rurek kapilarnych jest wystarczający
UPLCThermo Scientific
Water z 0,1% kwasem mrówkowym (v/v), LC/MS GradeFisher ScientificLS118-500
Water, LC/MS GradeFisher ScientificW6-4

Bibliografia

  1. Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
  2. Giezen, T. J., Schneider, C. K. Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective. Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).
  3. Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union. Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).
  4. Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).
  5. Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).
  6. Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structure and dynamics of the actin filament. Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).
  7. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).
  8. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  9. Watson, C., Sharp, J. S. Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).
  10. Deperalta, G., et al. Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting. mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).
  11. Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
  12. Storek, K. M., et al. Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  13. Vij, R., et al. A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies. Scientific Reports. 8 (1), 7136(2018).
  14. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  15. Lu, Y., et al. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc. Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).
  16. Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).
  17. Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  18. Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
  19. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).
  20. Linde. Linde Specialty Gases of North America. , (2009).
  21. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).
  22. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  23. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87(2019).
  24. Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. Communications Biology. 3 (1), 498(2020).
  25. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  26. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).
  27. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  28. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355(2020).
  29. Ultraviolet Absorption Spectrum of Hydrogen Peroxide. , Available from: http://www.h2o2.com/technical-library/physical-chemical-properties/radiation-properties/default.aspx?pid=65&name=Ultraviolet-Absorption-Spectrum (2016).
  30. Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
  31. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).
  32. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  33. Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).
  34. Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity. Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).
  35. Poor, T. A., et al. Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).
  36. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  37. Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).
  38. Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity. Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bezlaserowy system HRPFplazmowe źródło światładozymetria rodników w układzie przepływowymznakowanie rodnikami hydroksylowymianaliza strukturalna białekoddziaływania białko-białkooddziaływania białko-ligandtechnologia błyskawicznego utlenianiadozymetria rodników
Bezlaserowe śladowanie białek rodników hydroksylowych w celu przeprowadzenia analizy strukturalnej białek wyższego rzędu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.