Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

3.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61863

⸱

2 listopada 2020

 ,  ,  ,  , 
1Facultad de CC Experimentales, Universidad Francisco de Vitoria, 2Dept. Biomedical and Biotechnological Sciences, Section of Physiology, University of Catania, 3Dept. Anatomía, Histología y Neurociencia, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej gleju otoczającego węch (OEG) po uszkodzeniu neuronalnym. Opiera się na kokulturze aksotomijnych dorosłych neuronów zwojowych siatkówki (RGN) na monowarstwach OEG, a następnie badaniu regeneracji aksonów, poprzez analizę markerów aksonalnych i somatodendrytycznych RGN.

Streszczenie

Komórki glejowe otoczki węchowej (OEG) są zlokalizowane na całej długości od błony śluzowej węchu do warstwy nerwu węchowego (ONL) opuszki węchowej. Przez całe dorosłe życie odgrywają kluczową rolę w aksonalnym wzroście nowo wytworzonych neuronów węchowych, od blaszki właściwej do ONL. Ze względu na swoje właściwości proregeneracyjne, komórki te zostały wykorzystane do wspomagania regeneracji aksonów w modelach uszkodzeń rdzenia kręgowego lub nerwu wzrokowego.

Prezentujemy model in vitro do testowania i mierzenia zdolności neuroregeneracyjnej OEG po uszkodzeniu nerwowym. W tym modelu odwracalnie unieśmiertelniony ludzki OEG (ihOEG) jest hodowany jako monowarstwa, siatkówki są ekstrahowane od dorosłych szczurów, a neurony zwojowe siatkówki (RGN) są kohodowane na monowarstwie OEG. Po 96 godzinach markery aksonalne i somatodendrytyczne w RGN analizuje się metodą immunofluorescencji, a liczbę RGN z aksonem i średnią długość aksonów / neuron określa się ilościowo.

Ten protokół ma tę przewagę nad innymi testami in vitro, które opierają się na neuronach embrionalnych lub postnatalnych, że ocenia właściwości neuroregeneracyjne OEG w tkance dorosłej. Jest również przydatny nie tylko do oceny potencjału neuroregeneracyjnego ihOEG, ale może być rozszerzony na różne źródła OEG lub innych komórek glejowych.

Wprowadzenie

Dorosłe neurony ośrodkowego układu nerwowego (OUN) mają ograniczoną zdolność regeneracyjną po urazie lub chorobie. Powszechną strategią wspomagania regeneracji OUN jest przeszczepianie, w miejscu urazu, typów komórek, które indukują wzrost aksonów, takich jak komórki macierzyste, komórki Schwanna, astrocyty lub komórki glejowe otaczające węch (OEG)1,2,3,4,5.

OEG wywodzi się z grzebienia neuronalnego6 i znajduje się w błonie śluzowej węchu oraz w opuszce węchowej. U dorosłego osobnika węchowe neurony czuciowe obumierają regularnie w wyniku ekspozycji środowiskowej i są zastępowane przez nowo różnicujące się neurony. OEG otacza i prowadzi te nowe aksony węchowe, aby weszły do opuszki węchowej i ustanowiły nowe synapsy z ich celami w klasie CNS7. Ze względu na te cechy fizjologiczne, OEG został wykorzystany w modelach uszkodzeń OUN, takich jak uszkodzenie rdzenia kręgowego lub nerwu wzrokowego, a jego właściwości neuroregeneracyjne i neuroprotekcyjne zostały udowodnione8,9,10,11. Zidentyfikowano kilka czynników odpowiedzialnych za proregeneracyjne cechy tych komórek, w tym produkcję proteaz macierzy zewnątrzkomórkowej lub wydzielanie neurotroficznych i aksonalnych czynników wzrostu12,13,14.

Biorąc pod uwagę techniczne ograniczenia związane z rozszerzaniem pierwotnych komórek OEG, wcześniej ustaliliśmy i scharakteryzowaliśmy odwracalne, unieśmiertelnione ludzkie linie klonalne OEG (ihOEG), które zapewniają nieograniczoną podaż jednorodnych OEG. Te komórki ihOEG pochodzą z kultur pierwotnych, przygotowanych z opuszki węchowej uzyskanej w autopsjach. Zostały one unieśmiertelnione przez transdukcję podjednostki katalitycznej telomerazy (TERT) i onkogenu Bmi-1 oraz zmodyfikowane dużym antygenem T wirusa SV4015,16,17,18. Dwie z tych linii komórkowych ihOEG to Ts14, która utrzymuje zdolność regeneracyjną oryginalnych kultur i Ts12, linia o niskiej regeneracji, która jest używana jako kontrola niskiej regeneracji w tych eksperymentach18.

Aby ocenić zdolność OEG do wspomagania regeneracji aksonów po uszkodzeniu neuronów, zaimplementowano kilka modeli in vitro. W tych modelach OEG stosuje się do kultur o różnym pochodzeniu neuronalnym i bada się tworzenie i wydłużanie neurytów - w odpowiedzi na kokulturę glejową. Przykładami takich źródeł neuronalnych są neurony korowe noworodków szczurów19, rany zadrapań wykonywane na neuronach embrionalnych szczura z tkanki korowej20, eksplantaty siatkówki szczura21, neurony postnatalne podwzgórza lub hipokampa szczura22,23, postnatal ratal rat grzbiet root ganglions24, postnatal mouse corticospinal tracts25, ludzkie neurony NT226, lub postnatalne neurony korowe mózgu na reaktywnych kulturach przypominających blizny astrocytów27.

W tych modelach test regeneracji opiera się na neuronach embrionalnych lub postnatalnych, które mają wewnętrzną plastyczność, której nie ma w uszkodzonych neuronach dorosłych. Aby przezwyciężyć tę wadę, przedstawiamy model regeneracji aksonów dorosłych w kokulturach linii OEG z dorosłymi neuronami zwojowymi siatkówki (RGN), oparty na modelu pierwotnie opracowanym przez Wigleya i wsp.28,29,30,31 i zmodyfikowany i używany przez naszą grupę12,13,14,15,16,17,18,32,33. Krótko mówiąc, tkanka siatkówki jest ekstrahowana od dorosłych szczurów i trawiona papainą. Zawiesina komórek siatkówki jest następnie posiewana na szkiełkach nakrywkowych poddanych działaniu polilizyny lub na monowarstwach Ts14 i Ts12. Hodowle są utrzymywane przez 96 godzin przed ich utrwaleniem, a następnie przeprowadza się immunofluorescencję dla markerów aksonalnych (MAP1B i NF-H)34 i somatodendrytycznych (MAP2A i B)35. Regeneracja aksonów jest określana ilościowo jako procent neuronów z aksonem, w odniesieniu do całkowitej populacji RGN, a wskaźnik regeneracji aksonów jest obliczany jako średnia długość aksonów na neuron. Protokół ten jest nie tylko przydatny do oceny potencjału neuroregeneracyjnego ihOEG, ale może być rozszerzony na różne źródła OEG lub innych komórek glejowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez krajowe i instytucjonalne komisje bioetyczne.

1. Kultura ihOEG (Ts12 i Ts14)

UWAGA: Ta procedura jest wykonywana w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego do hodowli tkankowej.

  1. Przygotować 50 ml pożywki ME10 OEG zgodnie z tabelą 1.
  2. Przygotować 5 ml DMEM/F12-FBS, jak podano w Tabeli 1, w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  3. Ogrzewać oba media w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 15 minut.
  4. Rozmrozić fiolki z komórkami Ts12 i Ts14 w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
  5. Ponownie zawiesić i dodać komórki do pożywki hodowlanej DMEM/F12-FBS przygotowanej w kroku 2.
  6. Wirować przez 5 minut przy 200 x g.
  7. Aspiruj do supernatantu.
  8. Dodać 500 μl pożywki ME10 i ponownie zawiesić osad.
  9. Przygotuj naczynie do hodowli komórkowej p60 z 3 ml ME10 i dodaj zawiesinę komórkową kroplami.
  10. Przesuń, aby równomiernie rozprowadzić komórki na płytce.
  11. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w 5% CO2,
    UWAGA: Po osiągnięciu konfluencji należy wykonać co najmniej kolejne przejście, aby zoptymalizować komórki pod kątem kokultury. 90% konfluencji jest potrzebne przed wysiewem ich na szkiełkach nakrywkowych w celu kokultury. Zlewający się p-60 ma średnią liczbę komórek 7 x 105 dla linii komórkowych Ts14 i 2,5 x 106 dla linii komórkowych Ts12. Linie komórkowe Ts12 i Ts14 należy przechodzić co 2–3 dni.

2. Przygotowanie ihOEG (Ts12 i Ts14) do testu

UWAGA: Ten krok musi być wykonany 24 godziny przed sekcją RGN i kokulturą.

  1. Szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm należy traktować 10 μg/ml poli-L-lizyny (PLL) przez 1 godz.
    UWAGA: Szkiełka nakrywkowe można pozostawić na noc w roztworze PLL.
  2. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1x solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS).
  3. Odłącz komórki Ts12 i Ts14 ihOEG od naczynia do hodowli komórek p60.
    1. Dodać 4 ml pożywki hodowlanej DMEM/F12-FBS (Tabela 1) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Ogrzewać w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    2. Usunąć pożywkę z płytek i przemyć komórki 1 ml 1x PBS-EDTA, jeden raz.
    3. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA do komórek OEG i inkubować przez 3–5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    4. Zebrać komórki za pomocą pipety p1000 i przenieść je do podłoża przygotowanego w kroku 3.1.
    5. Wirować przez 5 minut przy 200 x g.
    6. Aspiruj do supernatantu.
    7. Dodać 1 ml pożywki ME10 i ponownie zawiesić osad.
    8. Policz numer komórki w hemocytometrze.
  4. Wysiać 80 000 komórek Ts14 lub 100 000 komórek Ts12 / basenik na szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowych płytkach w 500 μl pożywki ME10.
  5. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 24 godziny.

3. Sekcja tkanki siatkówki

UWAGA: 2-miesięczne samce szczurów rasy Wistar są używane jako źródło RGN. Dwie siatkówki (jedna szczura) na 20 dołków 24-dołkowej płytki komórkowej. Autoklaw materiału chirurgicznego przed użyciem. Zestaw do dysocjacji papainy jest kupowany komercyjnie (tabela materiałów). Należy postępować zgodnie z instrukcjami dostawcy dotyczącymi rekonstytucji. Rozpuścić kwas D,L-2-amino-5-fosfonowalerianowy (APV) w 5 mM i przygotować podwielokrotności.

  1. W dniu testu należy przygotować następujące podłoża.
    1. Przygotuj naczynie do hodowli komórek p60 z 5 ml zimnego EBSS (fiolka 1 zestawu do dysocjacji papainy).
    2. Przygotować naczynie do hodowli komórek p60 z odtworzoną fiolką 2 (papainą) zestawu do dysocjacji papainy oraz 50 μl APV. Następnie dodać 250 μl odtworzonej fiolki 3 (DNaza plus 5 μL APV).
    3. W sterylnej probówce wymieszać 2,7 ml fiolki 1 z 300 μl fiolki 4 (inhibitor proteazy albuminowo-jajnikowej). Dodać 150 μl fiolki 3 (DNazy) plus 30 μl APV.
    4. Przygotować 20 ml pożywki Neurobasal-B27 (NB-B27) zgodnie z tabelą 1.
  2. Złożyć ofiarę szczura przez uduszenie CO2 .
  3. Usunąć głowę przez ścięcie głowy gilotyną; umieścić ją na szalce Petriego o średnicy 100 mm i spryskać głowę etanolem o stężeniu 70% przed umieszczeniem jej w okapie z przepływem laminarnym.
  4. Obetnij wąsy szczura nożyczkami, aby nie przeszkadzały w manipulacji oczami.
  5. Chwyć nerw wzrokowy kleszczami, aby wyciągnąć gałkę oczną na tyle, aby móc wykonać nacięcie w poprzek oka skalpelem.
  6. Usuń soczewkę i ciało szkliste i wyciągnij siatkówkę (tkankę podobną do pomarańczy), podczas gdy pozostałe warstwy oka pozostają w środku (w tym warstwa nabłonka pigmentowego).
  7. Umieścić siatkówkę w naczyniu do hodowli komórkowej p60 przygotowanym w kroku 3.1.1.
  8. Przenieść siatkówkę do szalki do hodowli komórkowej p60 przygotowanej w kroku 3.1.2 i pokroić ją skalpelem na małe kawałki o przybliżonej wielkości < 1 mm.
  9. Przenieść do plastikowej probówki o pojemności 15 ml.
  10. Inkubować tkankę przez 30 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 i mieszając co 10 minut.
  11. Dysocjuj grudki komórek, pipetując w górę i w dół za pomocą szklanej pipety Pasteura.
  12. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut.
  13. Odrzucić supernatant i w celu dezaktywacji papainy ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze przygotowanym w kroku 3.1.3. (1,5 ml na 2 oczy).
  14. Ostrożnie odpipetować zawiesinę komórkową do 5 ml przygotowanej fiolki 4.
  15. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
  16. Podczas wirowania należy całkowicie usunąć pożywkę ME-10 z płytki kuwety OEG 24 dołkowej (wcześniej przygotowanej w kroku 2) i zastąpić ją 500 μl pożywki NB-B27 na studzienkę.
  17. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki NB-B27.
  18. Płytka 100 μl zawiesiny komórek siatkówki, na dołek płytki m24, na monowarstwy nakrywki poddane działaniu PLL lub OEG.
  19. Utrzymywać kultury w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 96 godzin w pożywce NB-B27.

4. Barwienie immunologiczne

  1. Po 96 godzinach utrwalić komórki na 10 minut, dodając taką samą objętość 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS do pożywki hodowlanej (600 μL) (stężenie końcowe PFA 2%).
  2. Usuń pożywkę i PFA z płytki 24-dołkowej i ponownie dodaj 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS. Inkubować przez 10 minut.
  3. Wyrzuć utrwalacz i umyj 3 razy 1x PBS przez 5 minut.
  4. Blokuj 0,1% Triton X-100/1% FBS w PBS (PBS-TS) przez 30–40 min.
  5. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe w buforze PBS-TS w następujący sposób: przeciwciało monoklonalne SMI31 (przeciwko białkom MAP1B i NF-H) (1:500). 514 (rozpoznaje białka MAP2A i B) królicza surowica poliklonalna (1:400).
  6. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe do kokultur i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  7. Następnego dnia wyrzuć przeciwciała i przemyj szkiełka nakrywkowe 1x PBS, 3 razy, przez 5 minut.
  8. Przygotować przeciwciała drugorzędowe w buforze PBS-TS w następujący sposób: Dla SMI-31, anty-mysi Alexa Fluor 488 (1:500). Dla 514 anty-królik Alexa-594 (1:500).
  9. Inkubować komórki z odpowiednimi fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę, w temperaturze pokojowej, w ciemności.
  10. Umyj szkiełka nakrywkowe 1x PBS, 3 razy, przez 5 minut, w ciemności.
  11. Na koniec zamontować szkiełka nakrywkowe z podłożem montażowym (tabela materiałów) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W razie potrzeby można przeprowadzić barwienie jąder fluorescencyjnych DAPI (4,6-diamidyno-2-fenyloindol). Przed montażem inkubować komórki przez 10 minut w ciemności z DAPI (10 μg/ml w 1x PBS). Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą 1x PBS i na koniec zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą medium montażowego.

5. Kwantyfikacja regeneracji aksonów

UWAGA: Próbki są oznaczane ilościowo pod 40-krotnym obiektywem mikroskopu epifluorescencyjnego. Należy wykonać co najmniej 30 zdjęć na losowych polach, z co najmniej 200 neuronami, które należy określić ilościowo dla każdego leczenia. Każdy eksperyment należy powtórzyć co najmniej trzy razy.

  1. Określ ilościowo odsetek neuronów z aksonem (neuryt SMI31 dodatni) w stosunku do całkowitej populacji RGN (zidentyfikowanych z MAP2A/B 514 dodatnim immunobarwieniem ciała neuronalnego i dendrytów).
  2. Określ ilościowo wskaźnik regeneracji aksonów lub średnią długość aksonów (μm/neuron). Ten parametr jest zdefiniowany jako suma długości (w μm) wszystkich zidentyfikowanych aksonów, podzielona przez całkowitą liczbę zliczonych neuronów, niezależnie od tego, czy prezentowały one akson, czy nie. Długość aksonów jest określana za pomocą wtyczki NeuronJ oprogramowania do obrazowania ImageJ (NIH-USA).
  3. Oblicz średnią, odchylenie standardowe i istotność statystyczną za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym protokole przedstawiamy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej OEG po uszkodzeniu neuronalnym. Jak pokazano na Rycini 1, źródłem OEG jest odwracalnie unieśmiertelniona klonalna linia komórkowa ludzkich OEG – Ts14 i Ts12 –, pochodząca z kultur pierwotnych przygotowanych z cebulek węchowych uzyskanych podczas autopsji15,17,18. Tkankę siatkówki pobiera się od dorosłych szczu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przeszczep OEG w miejscach uszkodzenia OUN jest uważany za obiecującą terapię uszkodzenia OUN ze względu na jego konstytutywne właściwości proneuroregeneracyjne 7,8,9. Jednak w zależności od źródła tkanki – błony śluzowej węchu (OM-OEG) w porównaniu z opuszką węchową (OB-OEG) – lub wieku dawcy, istnieje znaczna różnica w tej pojemności 26,31,33,36....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana finansowo przez projekt SAF2017-82736-C2-1-R od Ministerio de Ciencia e Innovación do MTM-F oraz przez Fundación Universidad Francisco de Vitoria do JS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
przeciwciało 514Odniesienie 34Surowica poliklonalna królika, która rozpoznaje MAP2A i B.
przeciwciało SMI-31BioLegend801601Przeciwciało monoklonalne przeciwko białkom MAP1B i NF-H
przeciwko mysim przeciwciałom Alexa Fluor 488ThermoFisherA-21202
przeciwciało przeciw królikowi Alexa Fluor 594ThermoFisherA-21207
B-27 SuplementGibco17504044
Kwas D,L-2-amino-5-fosfonowalerianowySigma283967Inhibitor receptora NMDA
DAPISigmaD9542Barwienie fluorescencyjne jąder
DMEM-F12Gibco11320033Pożywka do hodowli komórkowych
FBSGibco11573397Płodowa surowica bydlęca
FBS-HycloneFisher Scientific16291082Płodowa surowica bydlęca
FluoromountSouthern Biotech0100-01Medium montażowe
ImageJNational Institutes of Health (NIH-USA)Oprogramowanie do obrazowania
L-GlutaminaLonzaBE17-605F
Pożywka neuropodstawowaGibco21103049Pożywka do hodowli komórek nerwowych
dysocjacji papainyWorthington Biochemical CorporationLK003150Do stosowania w izolacji komórek nerwowych
PBSDomowej roboty
PBS-EDTALonzaH3BE02-017F
Penicylina/Streptomycyna/Amfoterycyna BLonza17-745EBakteriostatyczny i bakteriobójczy
Ekstrakt z przysadki mózgowejGibco13028014Ekstrakt z przysadki bydlęcej
Poly -L- lizyna (PLL)SigmaA-003-M
System

Bibliografia

  1. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
  2. Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).
  3. Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury. Glia. 65 (4), 639-656 (2017).
  4. Moreno-Flores, M. T., et al. A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord. Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).
  5. Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair. Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).
  6. Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
  7. Su, Z., He, C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration. Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).
  8. Yao, R., et al. Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues. Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).
  9. Gómez, R. M., et al. Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs). Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).
  10. Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system. Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).
  11. Xue, L., et al. Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress. Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).
  12. Pastrana, E., et al. Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2. The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).
  13. Pastrana, E., et al. BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).
  14. Simón, D., et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration. Glia. 59, 1458-1471 (2011).
  15. Lim, F., et al. Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity. Glia. 58, 546-558 (2010).
  16. García-Escudero, V., et al. Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization. Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).
  17. García-Escudero, V., et al. A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth. Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).
  18. Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept. Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).
  19. Deumens, R., et al. Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro. Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).
  20. Chung, R. S., et al. Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors. Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).
  21. Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro. Glia. 53 (5), 467-476 (2006).
  22. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro. Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).
  23. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study. International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).
  24. Runyan, S. A., Phelps, P. E. Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro. Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).
  25. Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism. Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).
  26. Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro. BMC Neuroscience. 14, 141(2013).
  27. Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures. Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).
  28. Wigley, C. B., Berry, M. Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons. Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).
  29. Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture. Glia. 25 (3), 256-269 (1999).
  30. Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture. Glia. 44 (3), 232-241 (2003).
  31. Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration. Glia. 50 (1), 12-20 (2005).
  32. Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons. Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).
  33. García-Escudero, V., et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons. Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).
  34. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).
  35. Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons. Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).
  36. Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair. Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza immunofluorescencyjnakokultura komórkowasekcja siatkówkiwzrost neurytówmikroskopia fluorescencyjnailościowe oznaczanie długości aksonów
Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.