Artykuł metodologiczny

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61870

⸱

28 maja 2021

 ,  ,  , 
1Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 3Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Streszczenie

Metabolizm lipidów jest podstawowym procesem fizjologicznym niezbędnym dla zdrowia komórek i organizmu. Rozregulowanie metabolizmu lipidów często wywołuje otyłość i wiele powiązanych chorób, w tym zaburzenia sercowo-naczyniowe, cukrzycę typu II i raka. Aby pogłębić obecną wiedzę na temat regulacji metabolizmu lipidów, coraz ważniejsze i bardziej przydatne stają się metody ilościowe do precyzyjnego pomiaru poziomów magazynowania lipidów in vivo w czasie i przestrzeni. Tradycyjne podejścia do analizy magazynowania lipidów są półilościowe do oceny mikroskopowej lub pozbawione informacji czasoprzestrzennych do pomiarów biochemicznych. Mikroskopia wymuszonego rozpraszania Ramana (SRS) to bezznacznikowa technologia obrazowania chemicznego, która umożliwia szybkie i ilościowe wykrywanie lipidów w żywych komórkach z rozdzielczością subkomórkową. Ponieważ kontrast jest wykorzystywany na podstawie wewnętrznych drgań molekularnych, mikroskopia SRS umożliwia również czterowymiarowe śledzenie lipidów u żywych zwierząt. W ciągu ostatniej dekady mikroskopia SRS była szeroko stosowana do obrazowania małych cząsteczek w badaniach biomedycznych i przezwyciężyła główne ograniczenia konwencjonalnych metod barwienia fluorescencyjnego i ekstrakcji lipidów. W laboratorium połączyliśmy mikroskopię SRS z narzędziami genetycznymi i biochemicznymi dostępnymi dla potężnego organizmu modelowego, Caenorhabditis elegans, aby zbadać rozmieszczenie i niejednorodność kropelek lipidów w różnych komórkach i tkankach, a ostatecznie odkryć nowe konserwatywne szlaki sygnałowe, które modulują metabolizm lipidów. W tym miejscu przedstawiamy zasady działania i szczegółową konfigurację mikroskopu SRS oraz przedstawiamy metody jego wykorzystania do ilościowego określania magazynowania lipidów w różnych punktach czasowych rozwoju zmutowanego C. elegans typu dzikiego i z niedoborem sygnalizacji insuliny.

Wprowadzenie

Otyłość stała się globalnym problemem zdrowotnym zagrażającym jednej trzeciej populacji na całym świecie i stanowi poważny problem medyczny, biorąc pod uwagę jej związek ze słabym zdrowiem psychicznym1 i śmiertelnymi chorobami, w tym cukrzycą2, choroby sercowo-naczyniowe3 i niektóre rodzaje raka4. Badanie metabolizmu lipidów jest niezbędne, aby lepiej zrozumieć biologiczne problemy stojące za otyłością. Szybka i specyficzna kwantyfikacja magazynowania lipidów pociąga za sobą wykrywanie kwasów tłuszczowych i ich pochodnych, a także metabolitów zawierających sterole, z wysoką czułością i najlepiej z informacją przestrzenną. Lipidy są trudnymi celami do obrazowania, ponieważ brakuje im wewnętrznej fluorescencji i nie można ich łatwo oznaczyć fluorescencyjnie. Znaczniki fluorescencyjne są często większe niż cząsteczki lipidów, a zatem mogą być chemicznie inwazyjne i niepraktyczne w zastosowaniach in vivo. Strategia etykietowania bez etykietowania lub minimalna jest konieczna, aby zachować hydrofobową strukturę cząsteczek lipidów5. Ostatnie osiągnięcia w technologiach obrazowania stworzyły ekscytujące możliwości bezznacznikowego obrazowania lipidów w żywych komórkach, tkankach i organizmach.

Tradycyjne metody analizy magazynowania lipidów w próbkach biologicznych obejmują testy biochemiczne i protokoły barwienia barwnikami lipofilowymi. Biochemiczne testy kwantyfikacyjne z wykorzystaniem spektrometrii mas (MS) nie mają sobie równych pod względem rozdzielczości molekularnej, ale wymagają bardzo dużych ilości próbek, a przygotowanie próbki zwykle zajmuje kilka godzin, co ogranicza ich zastosowanie do obrazowania żywych systemów w czasie rzeczywistym5. Innym poważnym ograniczeniem tych testów jest brak informacji przestrzennej. Z drugiej strony, barwniki lipofilowe, takie jak Oil Red O i Sudan Black, zapewniają tkankową i komórkową dystrybucję organelli magazynujących lipidy, a w porównaniu z technikami SM, te metody barwienia są również tanie i łatwe do wykonania. Jednak te protokoły barwienia wymagają utrwalenia, co może wpływać na hydrofobowy charakter kropelek lipidów, generować sztuczne zmiany w ich strukturze i powodować niespójności między eksperymentami6. Trudności techniczne związane z technikami biochemicznymi i barwienia doprowadziły do poszukiwania bezznacznikowych metod obrazowania cząsteczek lipidów oraz do szybkiego wzrostu wykorzystania mikroskopii koherentnego rozpraszania Ramana (CRS) w obrazowaniu lipidów.

Efekt Ramana został po raz pierwszy rozpoznany przez Ramana i Krishnana, gdzie poinformowali, że po interakcji z fotonem, cząsteczka może generować rozproszone światło bez zmiany długości fali (tzw. rozpraszanie Rayleigha) lub rzadko ze zmienioną długością fali (zwane rozpraszaniem Ramana), a ta zmiana długości fali jest charakterystyczna dla funkcjonalnych grup chemicznych w molekule7. Kiedy wiązania chemiczne w cząsteczce zostają wzbudzone do wyższego poziomu energii wibracyjnej przez padający foton, zwany fotonem pompy, energia rozproszonego fotonu, zwanego fotonem Stokesa, staje się niższa. W przeciwnym razie wiązania chemiczne mogą osiągnąć niższy poziom energii wibracyjnej, jeśli pierwotnie znajdują się na wyższym poziomie, a rozproszony foton zyskuje energię, aby stać się fotonem anty-Stokesa. Różnica częstotliwości między padającymi a rozproszonymi fotonami jest znana jako przesunięcie Ramana. Każde wiązanie chemiczne w cząsteczce ma charakterystyczne i mierzalne przesunięcie Ramana. Na przykład wiązanieCH2 ma przesunięcie Ramana 2,845 cm-1, które jest obfite w łańcuchy kwasów tłuszczowych8. Ten spontaniczny sygnał Ramana jest na ogół bardzo słaby, co znacznie ograniczyło szybkość obrazowania w konwencjonalnej spontanicznej mikroskopii Ramanowskiej. Z biegiem lat opracowano różne podejścia mające na celu zwiększenie szybkości obrazowania i czułości spontanicznej mikroskopii Ramanowskiej. Mikroskopia koherentnego rozpraszania Ramana, w tym mikroskopia koherentnego rozpraszania Ramana antystokesa (CARS) i mikroskopia wymuszonego rozpraszania Ramana (SRS), jest najnowszym postępem. CARS i SRS mają nieco inne zasady działania, ale obie są technikami bezznacznikowymi, które mają możliwość obrazowania na żywo, mogą dostarczyć informacji przestrzennych i czasowych na temat dynamiki magazynowania lipidów i wymagają jedynie niewielkiej wielkości próbki. Mikroskopia CARS cierpi z powodu nierezonansowego tła, które pochodzi z różnych procesów nieliniowych, a sygnały CARS mają również nieliniowy związek ze stężeniem cząsteczki, co razem komplikuje proces kwantyfikacji9. W przeciwieństwie do mikroskopii CARS, mikroskopia SRS nie generuje nierezonansowych sygnałów tła i oferuje liniową zależność od stężenia cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania. W związku z tym obecnie mikroskopia SRS jest szerzej stosowana do obrazowania lipidów.

W mikroskopii SRS, słabe spontaniczne sygnały Ramana mogą być wzmocnione po wzbudzeniu przez dwie zsynchronizowane wiązki laserowe o różnicy częstotliwości odpowiadającej częstotliwości drgań wiązania chemicznego. Cząsteczka doświadczy wzmocnionego przejścia do stanu wzbudzonego dzięki spójnemu wzbudzeniu. W rezultacie, tempo generowania fotonów Stokesa jest zwiększone. W konsekwencji intensywność transmitowanej wiązki "Stokesa" wzrasta (wymuszone wzmocnienie Ramana, SRG), a intensywność transmitowanej wiązki "pompy" maleje (wymuszona utrata Ramana, SRL). Detekcja sygnałów SRG lub SRL leży u podstaw obrazowania mikroskopowego wymuszonego rozpraszania Ramana (SRS) cząsteczek o określonych wiązaniach chemicznych10. Jeśli różnica częstotliwości między dwiema wiązkami laserowymi nie odpowiada częstotliwości drgań wiązania chemicznego w interesującej cząsteczce, nie zostaną wygenerowane ani sygnały SRG, ani SRL. Szybkość obrazowania w mikroskopii SRS wynosi około 2 μs na piksel lub 1 sekundę na klatkę, co jest znacznie szybsze niż w przypadku spontanicznej mikroskopii Ramana11. Typowa rozdzielczość boczna dla mikroskopii SRS jest ograniczona dyfrakcyjnie i wynosi około 300 nm. Ponadto dwufotonowe procesy optyczne mikroskopii SRS pozwalają na wolumetryczne obrazowanie 3D próbek tkanek o względnej grubości, a głębokość obrazowania może sięgać 300–500 μm. Ogólnie rzecz biorąc, mikroskopia SRS stanowi wydajną, bezznacznikową technikę obrazowania do wykrywania określonych biomolekuł, zwłaszcza lipidów.

Kropelki lipidów to organelle jednobłonowe, które są głównym miejscem przechowywania neutralnych lipidów, w tym triacylogliceroli (TAGs) i estrów cholesterolu (CEs). WiązaniaCH2 w łańcuchach kwasów tłuszczowych tych cząsteczek lipidów generują silne sygnały SRS na wysokości 2,845 cm-1 po wzbudzeniu8, umożliwiając w ten sposób wykrywanie i ilościowe określanie poziomów lipidów magazynujących w nienaruszonych komórkach, skrawkach tkanki, a nawet całych organizmach12,13,14,15. W szczególności C. elegans są przydatne do badań obrazowania lipidów ze względu na ich przezroczystość. Podobnie jak ssaki, C. elegans również magazynuje lipidy w kropelkach lipidów, a szlaki syntezy i degradacji cząsteczek lipidów są wysoce konserwatywne16. W tym protokole przedstawimy zasadę działania mikroskopii SRS, jej podstawową konfigurację i opiszemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu lipidów u C. elegans.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Instrumentalny zestaw do mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

UWAGA: System mikroskopowy SRS zbudowany jest na pikosekundowym laserze ze zintegrowanym z pompą optycznym oscylatorem parametrycznym i konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym. Oscylator zapewnia dwa pikosekundowe ciągi impulsów, w tym wiązkę Stokesa o długości fali 1,064 nm i wiązkę pompy przestrajaną w zakresie 700–990 nm. Czasowe i przestrzenne nakładanie się dwóch wiązek uzyskuje się wewnątrz lasera. Wbudowany modulator elektrooptyczny (EOM) został zaprojektowany specjalnie do mikroskopii SRS. Protokół ten skupi się na sprzężeniu lasera z mikroskopem i codziennym działaniu tego systemu (Rysunek 1). Konfiguracja systemu mikroskopowego SRS ewoluowała w ciągu ostatniej dekady. Należy zauważyć, że poniższy opis reprezentuje tylko jedną z kilku konfiguracji.

  1. Wprowadzanie wiązek laserowych do mikroskopu
    1. Ustaw peryskop tak, aby podnosił wiązkę od wyjścia pikosekundowego źródła światła do portu wejściowego lasera IR w skanerze mikroskopu.
      UWAGA: Przed przystąpieniem do obsługi należy zapoznać się z instrukcją obsługi systemu laserowego i podjąć wszelkie wymagane środki ostrożności, ponieważ promieniowanie bliskiej podczerwieni generowane przez ten system laserowy klasy IV może spowodować poważne obrażenia oczu i skóry. Ukończ szkolenia, które są wymagane przez instytucjonalne działy bezpieczeństwa środowiskowego. Nosić okulary ochronne i fartuch laboratoryjny z rękawami z mankietami.
    2. Najpierw ustaw wiązkę pompy na 750 nm i zmniejsz moc lasera do 50 mW, którą można sprawdzić wizualnie, przyporządkowując wyrównanie. Następnie użyj ekspandera wiązki (Rysunek 1, L1 i L2), aby dostosować średnicę wiązki tak, aby pasowała do tylnej apertury obiektywów mikroskopu. Użyj dwóch luster przekaźnikowych (Rysunek 1, M1 i M2), aby skierować wiązkę laserową do peryskopu (Rysunek 1, P1 i P2). Peryskop podniesie wiązkę na wysokość otworu skanera i posłuży również jako lusterko sterujące do wyrównania.
    3. Ustaw pokrętła na peryskopie w środku zakresu strojenia i wybierz początkową pozycję i kąt każdego lustra tak, aby wiązka lasera uderzała w środek lustra w przybliżeniu.
    4. Wykonaj zgrubne wyrównanie za pomocą pustego portu na wieżyczce obiektywu i umieść sondę miernika mocy, aby zmierzyć moc przepuszczanego światła. Ustaw skaner mikroskopu na najwyższy zoom (50x), a następnie zmierz moc przepuszczanego światła za pomocą skupionej plamki wiązki laserowej. Zoptymalizuj pokrętła na każdym lustrze, M1 i M2, iteracyjnie, aby osiągnąć najwyższą transmitowaną moc lasera.
    5. Wykonaj dokładne wyrównanie za pomocą narzędzia do wyrównywania. Umieść nasadkę wyrównującą cel fluorescencji na pustym gnieździe obiektywu i wyreguluj pokrętła M1, aby wyśrodkować plamkę. Następnie wprowadź rurkę przedłużającą do celu i dostrój pokrętła M2, aby wyśrodkować miejsce.
    6. Powtarzaj kroki 1.1.4 i 1.1.5, aż wiązka wyśrodkuje cel w obu pozycjach.
  2. Podłączanie detekcji i elektroniki
    1. Skonfiguruj moduł detekcji SRS. Umieść kostkę rozdzielacza wiązki za kondensatorem, aby skierować transmitowany laser do modułu fotodiody. Moduł zawiera teleskop do przekazywania i zmiany rozmiaru wiązki w celu dopasowania do aktywnego obszaru fotodiody, a także filtr optyczny do usuwania modulowanej wiązki Stokesa i przepuszczania wiązki pompy w celu demodulacji.
    2. Skonfiguruj połączenie elektroniczne (Rysunek 1). Intensywność wiązki Stokesa jest modulowana przez wbudowaną EOM o częstotliwości 20 MHz wewnątrz pikosekundowego lasera przestrajalnego. Częstotliwość modulacji wyjściowa z lasera jest wprowadzana do wzmacniacza typu lock-in jako częstotliwość referencyjna dla demodulacji. Wprowadź sygnał wyjściowy fotodiody do wzmacniacza lock-in w celu demodulacji SRL.
      UWAGA: Jednoczęściowe systemy laserowe można modernizować, a zatem ich specyfikacje mogą się różnić ze względu na różną datę produkcji. Poprzednia wersja pikosekundowego przestrajalnego systemu laserowego, używanego w tym protokole, ma wiązkę Stokesa 1,064 nm, ale najnowsza wersja ma wiązkę Stokesa 1,031 nm. Częstotliwość modulacji EOM używana w tym protokole jest dostosowana do 8 MHz, ale domyślna częstotliwość modulacji dla najnowszego systemu może wynosić 10 lub 20 MHz.
    3. Na koniec wprowadź wyjście wzmacniacza lock-in do skrzynki analogowej mikroskopu, aby przekonwertować elektryczny sygnał analogowy na sygnał cyfrowy. System powinien być gotowy do przetworzenia sygnału SRS.
  3. Zoptymalizuj warunki obrazowania
    1. Wykonaj próbkę chemiczną w celu wyrównania systemu. Na przykład użyj dodekanu do optymalizacji mikroskopu, ponieważ dodekan ma bardzo silny sygnał SRS z wiązań C-H. Użyj bezpiecznej uszczelki, aby zrobić mini komorę; wsypać 5 μl dodekanu i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.
      UWAGA: Wymień próbkę dodekanu, gdy wygląda na niewyraźną lub przedstawia zanieczyszczenia, nową próbką, której można używać do wyrównania przez 2–3 miesiące.
    2. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu. Właściwie skup się na kropelce cieczy. Można to zrobić szybciej, szukając krawędzi podkładki dodekanowej. Dostosuj kondensator do oświetlenia Kohlera.
    3. Ustaw parametry obrazowania. Sprawdź, czy stopień opóźnienia znajduje się na właściwych numerach. Ustaw długość fali wiązki pompy na 795,8 nm. Za pomocą karty czujnika podczerwieni i przeglądarki podczerwieni sprawdź, czy ścieżka wiązki pompy jest nadal prawidłowa.
    4. Ustaw moc wiązki pompy na 200 mW, a wiązki Stokesa na 400 mW na panelu sterowania systemu pikosekundowego.
      UWAGA: Przepustowość lasera od wyjścia lasera do celu słupka dwóch wiązek wynosi około 25% dla pompy i 14% dla Stokesa dla tej konfiguracji systemu. W związku z tym moc słupkowa obiektywna belki pompy wynosi około 50 mW, a dla belki Stokesa około 56 mW. Szerokość impulsu najnowszego systemu lasera pikosekundowego zmieniła się z 6 ps na 2 ps, dlatego zastosowana moc lasera powinna być jeszcze niższa.
    5. Ustaw blokadę amplifier wzmocnienie na maksimum. Otwórz migawkę zarówno dla wiązek, jak i dla głównej migawki lasera.
    6. Zeskanuj próbkę i sprawdź obraz na ekranie komputera. Zmień tryb wyświetlania na Hi-Lo w oprogramowaniu do obrazowania. Dostosuj zakres, aby zobaczyć nasycenie ~50%. Sprawdź, czy nasycenie jest wyśrodkowane na obrazie. Jeśli nie, ostrożnie wyreguluj lusterka kierownicze, M1 i M2, aby zmaksymalizować intensywność obrazu i wyśrodkować intensywność szczytową.
    7. Dostosuj stopień opóźnienia i znajdź maksymalne natężenie sygnału SRS z próbki dodekanu. System jest wtedy gotowy do użycia.

2. Przygotowanie próbek C. elegans do obrazowania mikroskopowego SRS

UWAGA: Jako organizmy modelowe, Caenorhabditis elegans okazały się bardzo przydatne w wielu technikach obrazowania. Są przezroczyste dla całego ciała, dlatego w nienaruszonym zwierzęciu można obrazować różne tkanki bez konieczności sekcji. U C. elegans obojętne lipidy są przechowywane w kropelkach lipidów znajdujących się w jelicie, który składa się z 20 komórek nabłonkowych rozmieszczonych bisymetrycznie wokół światła jelita16. Komórki podskórne i oocyty również przechowują lipidy. Główną formą magazynowania lipidów w kropelkach lipidów C. elegans są triacyloglicerole (TAGs)17, które generują silne sygnały SRS ze względu na obfitość wiązańCH2 obecnych w ich łańcuchach kwasów tłuszczowych. W tej sekcji skupimy się na tym, jak przygotować próbki C. elegans do obrazowania mikroskopowego SRS i ilościowego określenia ich całkowitego poziomu magazynowania lipidów w jelitach.

  1. Przygotowanie preparatów obrazowych
    1. Najpierw przygotuj 2% roztwór agarozy w destylowanymH2Oi upewnij się, że cała agaroza topi się przed przygotowaniem wabek agarozowych.
    2. Dodać jedną kroplę ciepłej 2% agarozy na czyste szkiełko podstawowe (około 100 μl), które umieszcza się między szkiełkami nośnymi za pomocą dwóch warstw taśmy laboratoryjnej i szybko umieść drugie szkiełko na pierwszym szkiełku. Delikatnie dociśnij, aby utworzyć cienką, równą podkładkę agarozową.
    3. Odłóż te prowadnice na bok w pozycji zamkniętej i nie rozdzielaj ich, dopóki robaki nie będą gotowe do zamontowania. Przygotuj świeże szkiełka podstawowe przed każdą sesją obrazowania, ponieważ płatki wyschną po 1 dniu.
      UWAGA: Użyj wielodołkowych komór obrazowania, jeśli obrazujesz kilka robaków w wysokoprzepustowych badaniach genetycznych18. Użyj ustawień obrazowania na żywo, aby zobrazować przestrzenno-czasową dynamikę metabolizmu lipidów poprzez rozwój i starzenie się19.
  2. Montowanie robaków
    1. Przygotować środek znieczulający, dodając azydek sodu lub lewamizol w buforze M9 do końcowego stężenia odpowiednio 100 mM lub 1 mM.
      UWAGA: Użyj lewamizolu, jeśli robaki muszą zostać odzyskane po obrazowaniu w celu genotypowania po badaniach genetycznych.
      UWAGA: Kilka środków znieczulających, w tym azydek sodu i lewamizol, są szkodliwe w przypadku wdychania. Podczas przygotowywania roztworów roboczych należy nosić rękawice i odzież ochronną, a także używać okapu chemicznego.
    2. Umieść kroplę środka znieczulającego w szkiełku nakrywkowym (około 4–5 μl na 10–20 robaków).
      UWAGA: Dostosuj ilość środka znieczulającego zgodnie z liczbą robaków, aby robaki były jak najbliżej siebie. Użycie zbyt dużej ilości płynu na kilka robaków może spowodować rozprzestrzenianie się robaków na podkładce agarozowej.
    3. Pobrać robaki, które mają być zobrazowane pod mikroskopią preparacyjną i przenieść je do kropli środka znieczulającego. Po dodaniu wszystkich robaków do kropli przesuwaj je za pomocą selektora robaków i upewnij się, że nie zachodzą na siebie.
    4. Oddzielić szkiełka podstawowe (od kroku 2.1) bez naruszania waciki agarozowej.
    5. Przykryj kroplę robaka szklanym szkiełkiem z podkładką agarozową. Upewnij się, że podkładka agarozowa jest skierowana w stronę robaków. Alternatywnie, znieczulającą kroplę starzenia można również dodać do podkładki agarozowej, a robaki można przykryć szkiełkiem nakrywkowym.
    6. Na koniec zaznacz położenie robaków za pomocą trwałego markera na szkiełku
      7. podstawowym.

3. Akwizycja i analiza obrazu

  1. Pozyskiwanie obrazów za pomocą systemu mikroskopowego SRS.
    1. Przed obrazowaniem jakiejkolwiek próbki należy określić parametry obrazowania i zweryfikować sygnały SRS (jak wyjaśniono w Protokole 1).
    2. Zamontuj szkiełko z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w stronę soczewki obiektywu. Włącz źródło światła w jasnym polu i skieruj je do okularu, aby zlokalizować robaki.
      UWAGA: Użyj soczewki obiektywowej 20x, aby zobrazować magazynowanie lipidów w całym jelicie. Rozważ użycie soczewki obiektywowej 60x, aby zobrazować podskórne magazynowanie tłuszczu lub określić ilościowo wielkość/liczbę kropelek lipidów.
    3. Ustaw ostrość ślimaków i odpowiednio dostosuj położenie skraplacza.
    4. Wyłącz źródło światła w jasnym polu i przełącz się na skaner laserowy. Rozpocznij skanowanie pierwszego robaka z dużą szybkością skanowania (np. 512 x 512 pikseli) i dostosuj precyzyjną ostrość, aby znaleźć obszar zainteresowania. Aby uzyskać pierwszą próbkę, która ma być zobrazowana, dostosuj moc lasera do poziomu, w którym sygnały SRS nie są nasycone.
    5. Przełącz się na wolniejszą szybkość skanowania (np. 2 μs/piksel) i wyższą rozdzielczość (np. 1024 x 1024 piksele), aby uzyskać obraz SRS.
      UWAGA: Utrzymuj stałą moc lasera dla każdej próbki, która ma być obrazowana podczas sesji obrazowania.
    6. Zapisz obraz SRS w żądanym formacie, który umożliwia wysoką rozdzielczość (np. plik .tiff). W zależności od używanego oprogramowania do obrazowania i konfiguracji, zapisz lokalizację pierwszego robaka przed przejściem do następnego.
    7. Pełne obrazowanie wszystkich robaków, które były zamontowane na zamku. Wyłącz migawkę, aby zablokować wiązki laserowe. Nie wyłączaj źródła lasera, dopóki wszystkie sample nie zostaną zobrazowane.
    8. Wyjmij szkiełko przed umieszczeniem następnego przykładowego szkiełka. Powtórz kroki 3.1.2–3.1.7.
    9. Po zobrazowaniu wszystkich próbek należy przełączyć źródło lasera w tryb czuwania i wyłączyć powiązane urządzenia, w tym wzmacniacz, detektor, mikroskop i komputer.
  2. Analiza obrazów za pomocą ImageJ
    1. Otwórz pliki obrazów (zwykle .tiff), które mają zostać określone ilościowo w ImageJ, zaznaczając pliki, a następnie przeciągając je i upuszczając do okna ImageJ. Pobierz odpowiednie wtyczki ImageJ, jeśli używasz określonych formatów mikroskopów Olympus (takich jak pliki .oib).
    2. Wybierz właściwości, które mają być analizowane (Analizuj > ustaw pomiary). Aby określić ilościowo całkowite zapasy lipidów, wybierz opcję Obszar, Minimalna i maksymalna wartość szarości oraz Średnia wartość szarości.
    3. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów i nakreśl obszar jelita robaka, który ma zostać określony ilościowo. Aby zmierzyć parametry wybrane w kroku 3.2.2, kliknij Analizuj > Mierz. Pojawi się nowe okno z wynikami pomiarów. Powtórz ten krok dla wszystkich otwartych obrazów.
    4. Wybierz pomiary dla wszystkich robaków w danym genotypie i skopiuj/wklej wyniki do nowego arkusza kalkulacyjnego. Powtórz kroki 3.2.1–3.2.4 dla wszystkich genotypów w tej samej sesji obrazowania.
    5. Wybierz obszar w pobliżu robaka, który nie ma żadnego sygnału SRS, aby określić ilościowo jako tło. Upewnij się, że obszar wybrany do pomiaru tła nie zawiera żadnych bakterii ani zanieczyszczeń, które również mogłyby dawać sygnał SRS.
    6. Odejmij średnią wartość szarości tła od pomiarów każdego pojedynczego robaka. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe tła odjęte średnie wartości szarości od wszystkich robaków w danym genotypie/grupie testowej. Znormalizuj tę wartość do średniej z grupy kontrolnej.
    7. Na koniec przeprowadź odpowiednią analizę statystyczną, używając średniej wartości szarości jako miary poziomu lipidów w każdym robaku. Zazwyczaj stosuje się test t Studenta dla dwóch grup i jednoczynnikowy ANOVA z odpowiednim testem wielokrotnych porównań dla więcej niż dwóch grup.
      UWAGA: Wybierając obrazy do prezentacji postaci, upewnij się, że wybrane obrazy mają ten sam rozkład intensywności pikseli. Ustaw jasność i kontrast na te same wartości dla wszystkich obrazów na tym samym rysunku (Obraz > Dostosuj > Jasność i Kontrast).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Sygnalizacja insulinowa jest ważną ścieżką endokrynną, która wpływa na rozwój, reprodukcję, długość życia i metabolizm. U nicieni sygnalizacja insulinowa składa się z około 40 ligandów peptydów insulinopodobnych, ortologa receptora insulinopodobnego czynnika wzrostu DAF-2, kaskady kinaz PI3K/AKT działającej poniżej oraz ortologa czynnika transkrypcyjnego FoxO, DAF-1620. Mutanty daf-2, którym brakuje receptora insuliny, posiadają więcej kropli lipidowych w jelicie, które u nicieni jest tka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W obronie przed otyłością i związanymi z nią zaburzeniami metabolicznymi podjęto ważne wysiłki badawcze, aby lepiej zrozumieć mechanizmy regulacyjne homeostazy lipidów. Udowodniono, że do ilościowego wykrywania cząsteczek lipidów w próbkach biologicznych obrazowanie bezznacznikowe za pomocą mikroskopii SRS jest niezawodną alternatywą dla testów biochemicznych i innych metod barwienia. Nasza grupa i inni odkryli nowe mechanizmy biologiczne w regulacji metabolizmu lipidów, łącząc użycie C. elegans i mikroskopii SR...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty NIH R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.) oraz przez badacza HHMI (M.C.W.). Dziękujemy Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC) za szczepy C. elegans.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przetwornik A/COlympusAnalog Unit
AgarozaGeneMate3119Do wykonywania podkładek agarozowych
Narzędzie do wyrównywania - adapterThorlabsSM1A4Do montażu narzędzia na lunecie
Narzędzie do wyrównywania - tarczaThorlabsVRC2SM1Do oglądania lasera IR
Narzędzie do wyrównywania - rurkaThorlabsSM1L40Długość puszki Vary
Autokorelator (opcjonalnie)ImpulsAPESprawdź
miniobwodyfiltra pasmowoprzepustowegoBBP-21.4+ w przypadku modulacji 20 MHz lub KR Electronics 2724 w przypadku modulacji w zakresie 8 MHzDo sygnału z modulacją Filtrowanie częstotliwości
Mikroskop preparacyjnyNikonSMZ800Do przenoszenia i zbierania robaków do obrazowania
DodekanSigma-Aldrich44010Służy do kalibracji sygnału SRS
FiltrChroma Technology890/220 CARSDo usuwania wiązki Stokesa
Taśma do etykietowania laboratoryjnego ogólnego przeznaczeniaVWR89097Do produkcji waci agarozowych
Szkiełka nakrywkoweszklane VWR48393-106Do pokrywania ślimaków do obrazowania
Szkiełko mikroskopoweszklane VWR16004-422Do wykonywania płatków agarozowych
Laserowy mikroskop skaningowyOlympusFV3000
ObiektywThorlabsL1: AC254-050-B
L2: AC254-075-B		Do ekspandera wiązki
Wzmacniacz blokującyZurychHF2LI
Miniobwodyfiltra dolnoprzepustowegoBLP-1.9+Do tłumienia szumów zasilania
LustraThorlabsBB1-E03Do przekaźnika i peryskopu
ObiektywOlympusUPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
FotodiodaThorlabsFDS1010
Picosecond źródło laseroweAPEpicoEmerald
ZasilaczTEKPOWERTP1342UDo fotodiody, odwrócone napięcie 50V
Azydek soduSigmaS2002Do znieczulania robaków
Zbieracz robakówWormStuff59-AWP
BNC

Bibliografia

  1. Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
  2. Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
  3. Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
  4. Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
  5. Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
  6. Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
  7. Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), Palo Alto, Calif. 271-291 (2017).
  8. Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
  9. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, Palo Alto, Calif. 883-909 (2008).
  10. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  11. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  12. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  13. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
  14. Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
  15. Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31(2015).
  16. Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
  17. Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
  18. Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865(2017).
  19. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
  20. Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
  21. Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
  22. Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (2), 413-446 (2017).
  23. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
  24. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  25. Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (2), 613-629 (2015).
  26. Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
  27. Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450(2020).
  28. Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
  29. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  30. Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
  31. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
  32. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
  33. Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
  34. Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
  35. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  36. Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), Cambridge, England. 152-155 (2018).
  37. Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
  38. Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
  39. Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930(2015).
  40. Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
  41. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  42. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  43. Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie kropel lipidowychkonfiguracja mikroskopii SRSmutanty sygnalizacji insulinowejanaliza izoform Daf 16regulacja metabolizmu lipid whiperspektralne obrazowanie SRS

Powiązane artykuły