Artykuł metodologiczny

Bezkomórkowa produkcja proteoliposomów do analizy funkcjonalnej i rozwoju przeciwciał ukierunkowanych na białka błonowe

DOI:

10.3791/61871

⸱

22 września 2020

 , 
1Graduate School of Medicine, Ehime University, 2Proteo-Science Center, Ehime University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje efektywną metodę produkcji wysokiej jakości proteoliposomu metodą dializy dwuwarstwowej przy użyciu systemu bezkomórkowego pszenicy i liposomów. Metoda ta zapewnia odpowiednie środki do analizy funkcjonalnej białek błonowych, badań przesiewowych celów leków i opracowywania przeciwciał.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka błonowe odgrywają istotną rolę w różnych procesach komórkowych i pełnią ważne funkcje. Białka błonowe są ważne z medycznego punktu widzenia w odkrywaniu leków, ponieważ są celem ponad połowy wszystkich leków. Przeszkodą w prowadzeniu badań biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych białek błonowych, a także w rozwoju przeciwciał była trudność w wytwarzaniu dużych ilości wysokiej jakości białka błonowego o prawidłowej konformacji i aktywności. W tym miejscu opisujemy "metodę dializy dwuwarstwowej" wykorzystującą system wolny od komórek zarodków pszenicy, liposomy i kubki do dializy w celu wydajnej syntezy białek błonowych i przygotowania oczyszczonych proteoliposomów w krótkim czasie z wysokim wskaźnikiem sukcesu. Białka błonowe mogą być wytwarzane nawet w kilku miligramach, takie jak GPCR, kanały jonowe, transportery i tetraspaniny. Ta bezkomórkowa metoda przyczynia się do skrócenia czasu, kosztów i wysiłku związanego z przygotowaniem wysokiej jakości proteoliposomów oraz zapewnia odpowiednie środki do analizy funkcjonalnej białek błonowych, badań przesiewowych celów leków i opracowywania przeciwciał.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka błonowe są jednym z najważniejszych celów leków w diagnostyce i terapii. Rzeczywiście, połowa małych związków leczniczych to białka błonowe, takie jak receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) i kanały jonowe1. Przez lata naukowcy pracowali nad badaniami biochemicznymi, biofizycznymi i strukturalnymi białek błonowych, aby wyjaśnić ich strukturę i funkcję2,3. Aktywnie prowadzone są również prace nad przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko białkom błonowym w celu przyspieszenia badań funkcjonalnych i strukturalnych oraz opracowania zastosowań terapeutycznych i diagnostycznych4,5,6,7,8,9. Wszystkie te badania wymagają dużej ilości wysokiej jakości białek błonowych10. Na przykład do rozwoju przeciwciał potrzeba kilku miligramów oczyszczonych białek błonowych o naturalnej konformacji. Do krystalografii rentgenowskiej wymagana jest znacznie większa ilość wysoko oczyszczonych białek błonowych. Jednak masowa produkcja białek błonowych pozostaje wąskim gardłem w badaniach nad białkami błonowymi11. Białka błonowe mają skomplikowane struktury z jedną lub kilkoma helisami transbłonowymi i odgrywają ważną rolę w homeostazie komórek. Heterologiczna nadekspresja białek błonowych prowadzi do wielu przeszkód, takich jak agregacja białek błonowych, które gromadzą się w wysokich stężeniach lokalnych lub zakłócenia szlaków sygnałów komórkowych. Nawet jeśli odciąg zakończy się sukcesem, kolejne etapy przygotowania próbki również napotykają trudności. Na przykład przygotowanie proteoliposomu wymaga wysokich umiejętności i doświadczenia zawodowego w zakresie solubilizacji, oczyszczania i stabilizacji białek błonowych, a także kosztuje dużo wysiłku i czasu12,13.

Z drugiej strony, w ostatnich dziesięcioleciach pojawiły się zaawansowane technologie do produkcji białek bez użycia żywych komórek14,15,16,17,18. Technologia bezkomórkowej syntezy białek odtwarza reakcję translacji w probówce. Ponieważ nie ma żadnych ograniczeń, które ma komórkowy system ekspresji, systemy bezkomórkowe mają potencjał do syntezy różnych białek, które są trudne do ekspresji lub wykazują toksyczność w komórkach. Oczyszczony ekstrakt komórkowy lub odtworzona maszyneria translacyjna jest mieszana z matrycowymi mRNA, aminokwasami i źródłami energii, a rekombinowane białka są syntetyzowane w krótkim czasie. Jeśli chodzi o syntezę białek błonowych, niektóre rodzaje rusztowań złożonych z lipidów lub amfifilów, takie jak liposomy, dwucele, nanodyski lub kopolimery, są dodawane do reakcji bezkomórkowej19,20,21,22,23,24. Zsyntetyzowane białka błonowe oddziałują z rusztowaniami i mogą być stabilizowane w wodzie. Bezkomórkowe syntetyzowane białka błonowe są szeroko stosowane w badaniach funkcjonalnych i produkcji przeciwciał25,26,27,28,29,30,31.

W tym protokole opisujemy efektywną metodę produkcji proteoliposomów bez komórek przy użyciu systemu bezkomórkowego pszenicy i liposomów. System syntezy białek bez komórek pszenicy to potężny system translacji in vitro wykorzystujący ekstrakt z kiełków pszenicy15,32,33. Zarodki pszenicy zawierają dużą ilość maszynerii translacyjnej i niewiele inhibitorów translacji. Maszyneria translacyjna w pszenicy, należącej do eukariontów, jest odpowiednia do translacji białek eukariotycznych, a na jej wydajność translacji prawie nie ma wpływu użycie kodonu matrycowego mRNA. Korzystając z systemu bezkomórkowego pszenicy, zsyntetyzowaliśmy różne białka, w tym kinazy białkowe34,35, ligazy ubikwityny36, czynniki transkrypcyjne37 oraz białka błonowe o wysokich wskaźnikach sukcesu. Do produkcji białka błonowego dodajemy liposom pęcherzyków lipidowych do mieszaniny translacyjnej jako rusztowanie19,38. Domeny hydrofobowe białka błonowego oddziałują z dwuwarstwą lipidową i są spontanicznie integrowane z liposomem. Wirowanie w gradiencie gęstości służy do ścisłego oddzielenia proteoliposomów od endogennych białek pszenicy, mimo że zwykłe odwirowanie mieszaniny reakcji translacji jest wystarczające do prostego oczyszczenia proteoliposomu20. Wiele rodzajów integralnych białek błonowych zostało zsyntetyzowanych przy użyciu systemu bezkomórkowego pszenicy i stosowanych w różnych badaniach i rozwoju25,38,39,40,41,42,43,44. Ponadto opracowaliśmy "metodę dializy dwuwarstwowej" dla produkcji na dużą skalę45,46. W tej metodzie urządzenie do dializy typu kubełkowego jest zanurzone w buforze podającym substrat, a w kubku tworzą się dwie warstwy mieszaniny reakcji translacji i buforu podającego substrat, jak pokazano na Rysunek 1. Ciągłe dostarczanie substratów i usuwanie produktu ubocznego może być skutecznie prowadzone zarówno na górze, jak i na dole mieszaniny reakcyjnej przez długi czas, co prowadzi do doskonałej skuteczności translacji (Rysunek 2A i Rysunek 2B)45.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie plazmidu ekspresji pEU

UWAGA: plazmid ekspresji pEU powinien zawierać kodon start, otwartą ramkę odczytu białka błony docelowej oraz kodon stop we fragmencie (patrz Rysunek 1). W razie potrzeby dodaj sekwencje znaczników wykrywania/oczyszczania w odpowiednim miejscu. Do podklonowania ma zastosowanie zarówno trawienie enzymem restrykcyjnym, jak i klonowanie bezszwowe. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący bezproblemową metodę klonowania.

  1. Przygotuj wstaw fragment DNA.
    1. Amplifikuj interesujący Cię gen metodą PCR przy użyciu matrycy cDNA, startera 1 i startera 2. Podkład 1 i starter 2 zawierają odpowiednio 15 punktów bazowych w celu bezproblemowego klonowania (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Nie należy dołączać sekwencji, które mają zostać przetworzone i usunięte z dojrzałego białka w komórkach (np. sekwencji sygnałowej). Przetwarzanie zsyntetyzowanego białka nie odbywa się w systemie bezkomórkowym pszenicy. Nie dodawaj sekwencji Kozaka. Wektor pEU-E01-MCS posiada wzmacniacz translacji E01.
    2. Dodaj 1/25 objętości enzymu restrykcyjnego DpnI do produktu PCR, aby usunąć matrycowe DNA plazmidu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Użyj zestawu do oczyszczania PCR, aby oczyścić produkt PCR i dostosować stężenie do 20–50 ng/μl.
  2. Linearyzuj wektor pEU-E01-MCS.
    1. Przeprowadź odwrotną reakcję PCR przy użyciu pEU-E01-MCS, startera 3 i startera 4.
    2. Dodać 1/25 objętości enzymu restrykcyjnego DpnI do produktu odwrotnego PCR. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Użyj zestawu do oczyszczania PCR, aby oczyścić produkt PCR zgodnie z zaleceniami producenta. Dostosuj stężenie do 20–50 ng/μl.
  3. Wymieszaj 2 μl wstawienia fragmentu DNA, 2 μl wektora linearyzowanego i 4 μl 2x bezszwowej mieszaniny enzymów klonujących.
  4. Przekształć szczep Escherichia coli JM109 za pomocą produktu do bezproblemowego klonowania. Za pomocą rozsiewacza rozprowadzić zawiesinę bakteryjną na płytce agarowej LB-ampicyliny.
    UWAGA: wektor pEU posiada marker oporności na ampicylinę.
  5. Potwierdź sekwencję plazmidu ekspresyjnego skonstruowanego przy użyciu startera 5 i startera 6 ze strony 5' i 3' MCS odpowiednio w plazmidzie pEU.
  6. Amplifikuj i oczyszczaj plazmidy ekspresyjne.
    1. Hodować przekształcony plazmidowo szczep E. coli JM109 w 150 ml pożywki LB-ampicyliny w temperaturze 37 °C i 125 uderzeń na minutę, wstrząsając przez noc.
    2. Wyodrębnij i oczyść plazmidy za pomocą dostępnego w handlu zestawu midi do przygotowania plazmidu. Rozpuść plazmidy w 500 μl buforu TE.
      UWAGA: Nie używaj mini zestawu przygotowawczego do ekstrakcji plazmidu. Nie zapewnia wystarczającej jakości i ilości plazmidu.
    3. Dodać 500 μl fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1). Mieszać energicznie przez 5 minut i wirować przez 5 minut w temperaturze 17 800 x g i temperaturze pokojowej. Przenieś górny roztwór plazmidu do nowej probówki.
      UWAGA: Nosić jednorazowe rękawiczki, aby chronić skórę przed fenolem i chloroformem.
      UWAGA: W celu usunięcia zanieczyszczenia RNazą z zestawu do ekstrakcji plazmidu, należy oczyścić plazmidy za pomocą oczyszczania fenolowo-chloroformowego.
    4. Dodać 500 μl chloroformu, aby całkowicie usunąć fenol. Mieszać energicznie przez 5 minut i wirować przez 5 minut w temperaturze 17 800 x g i temperaturze pokojowej. Przenieś górny roztwór plazmidu do nowej probówki.
    5. Dodać 2,5 objętości etanolu i 1/8 objętości 7,5 M octanu amonu i przechowywać w temperaturze -30 °C przez 1 godzinę.
    6. Wirować w temperaturze 17 800 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. Przemyć granulat 500 μl 70% etanolu. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i pozostawić osad na 5 minut do wyschnięcia.
    7. Całkowicie rozpuścić plazmidy ekspresyjne w 100 μl ultraczystej wody. Zmierzyć stężenie plazmidów o absorbancji przy 260 nm. Dostosuj stężenie do 1 mg/ml.

2. Transkrypcja in vitro

UWAGA: Używaj plastikowych rurek i końcówek wolnych od DNaz i nukleaz w krokach transkrypcji i translacji. Unikaj autoklawowania wyrobów z tworzyw sztucznych, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

  1. Zbieraj ultraczystą wodę w nowej plastikowej tubie.
    UWAGA: Nie używaj wody uzdatnionej DEPC, ponieważ resztki DEPC silnie hamują reakcję. Do transkrypcji i tłumaczenia używaj świeżo oczyszczonej ultraczystej wody.
  2. Przygotować mieszaninę reakcji transkrypcji, mieszając 115,2 μl ultraczystej wody, 40 μl buforu transkrypcyjnego LM, 20 μl mieszaniny NTP, 2,4 μl 80 U/μL inhibitora RNazy, 2,4 μl 80 U/μL polimerazy SP6 i 20 μl plazmidów ekspresyjnych pEU 1 mg / mL. Delikatnie wymieszaj odczynniki, odwracając je. Wykonaj szybki obrót.
  3. Inkubować reakcję transkrypcji w temperaturze 37 °C przez 6 godzin.
  4. Delikatnie wymieszaj reakcję, odwracając i szybko odwiruj. Natychmiast należy go użyć do tłumaczenia, w przeciwnym razie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  5. Potwierdź produkt transkrypcji za pomocą elektroforezy.
    1. Wymieszać 100 ml 1x buforu TAE i 1 g agarozy. Podgrzej zawiesinę w kuchence mikrofalowej, aby przygotować 1% żel agarozowy TAE.
    2. Weź 1 μl reakcji transkrypcyjnej i wymieszaj z 3 μl wody i 4 μl 2x barwnika ładującego.
      UWAGA: Denaturacja RNA nie jest wymagana.
    3. Załadować 4 μl mieszaniny i 2 μl markera drabinkowego DNA do żelu TAE z agarozy.
    4. Elektroforeza pod napięciem 100 V przez 20 min.
    5. Barwić żel w bromku etydyny przez 30 minut. Sprawdź wzór pasma drabinkowego mRNA za pomocą transiluminatora UV i obrazowania żelowego.
      UWAGA: Gdy obserwuje się rozmazane pasmo mniejsze niż 500 pz, podejrzewa się degradację mRNA.

3. Przygotowanie materiałów do tłumaczenia

  1. Przygotuj bufor tłumaczenia.
    1. Wymieszaj 27 ml świeżo przygotowanej ultraczystej wody i 0,75 ml każdego 40-krotnego roztworu podstawowego dla S1, S2, S3 i S4 odpowiednio w probówce o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Moduluj ilość materiałów zgodnie z końcową wymaganą ilością 1x bufora translacyjnego.
      UWAGA: Nie przechowuj ani nie zamrażaj ponownie nadmiaru bufora translacyjnego 1x po użyciu.
  2. Przygotować roztwór podstawowy kinazy kreatynowej . Limofilizowaną kinazę kreatynową rozpuścić w ultraczystej wodzie do końcowego stężenia 20 mg/ml. Dozować roztwór w małych ilościach (po 10 do 50 μl każda) do 0,2 ml 8-paskowych probówek PCR. Zamrozić probówki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Nie zamrażaj ponownie roztworu kinazy kreatynowej po rozmrożeniu.
  3. Umyj kubki dializacyjne (o pojemności 0,1 ml) w celu usunięcia glicerolu z membrany dializy.
    UWAGA: Istnieje kilka kubków do dializy o różnych rozmiarach. Małe kubki (0,1 ml) są używane odpowiednio do testów na małą skalę (sekcja 5.4), a duże kubki (2 ml) do produkcji na dużą skalę (sekcja 5.5). Można uniknąć etapu mycia membrany dializacyjnej w dużych kubkach.
    1. Wlej 1 ml ultraczystej wody do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Włóż mały kubek do dializy (0,1 ml) do probówki. Dodaj 0,5 ml ultraczystej wody do filiżanki.
    2. Inkubować przez ponad 30 minut w temperaturze pokojowej.

4. Przygotowanie liposomów

UWAGA: Tutaj opisujemy dwa protokoły przygotowania liposomów. Jeden wykorzystuje gotowe do użycia liofilizowane liposomy (sekcja 4.1), podczas gdy drugi wytwarza liposomy poprzez uwodnienie cienkiego filmu lipidowego (sekcja 4.2).

  1. Przygotuj liposomy za pomocą liofilizowanych liposomów.
    UWAGA: Łatwiejszym sposobem wytwarzania proteoliposomu jest użycie dostępnego w handlu liposomu asolektyny. Asolektyna to rodzaj naturalnego lipidu ekstrahowanego z soi.
    1. Otworzyć fiolkę zawierającą 10 mg liofilizowanych liposomów asolektyny (patrz tabela materiałów) i dodać 200 μl buforu translacyjnego (sekcja 3.1) na dno fiolki. Zamknąć fiolkę i inkubować przez 10 minut.
    2. Energicznie wymieszać, umieszczając fiolkę na mieszalniku wirowym na 1 minutę.
    3. Umieścić fiolkę w probówce o pojemności 50 ml. Odwirować probówkę, odwirowując przy 500 x g przez 1 minutę.
    4. Za pomocą pipety przenieś zawiesinę liposomów asolektyny (50 mg lipidów/ml) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Natychmiast użyj liposomu do translacji, w przeciwnym razie zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C.
  2. Przygotuj liposomy, nawilżając cienki film lipidowy.
    1. Jeśli lipid jest sprzedawany w postaci proszku, rozpuścić go w chloroformie lub odpowiednim rozpuszczalniku organicznym do stężenia 10-100 mg/ml.
      UWAGA: Cienki film lipidowy można przygotować przy użyciu oczyszczonych i/lub zsyntetyzowanych lipidów amfifilowych. Metoda oczyszczania asolektyny jest wcześniej opisana38. Funkcjonalnie zmodyfikowane lipidy, takie jak lipidy biotynylowane, lipidy fluorescencyjne i lipidy adiuwantowe, mogą być dodawane do lipidów podstawowych w celu wytworzenia funkcjonalnych liposomów.
    2. Przenieść roztwór lipidowy zawierający 50 mg lipidu(-ów) do kolby odparowującej.
    3. Za pomocą wyparki obrotowej odparować rozpuszczalnik i równomiernie rozprowadzić lipid na ściance dna kolby, tworząc cienką warstwę lipidu.
    4. Umieścić kolbę w eksykatorze próżniowym i pozostawić na noc pod podciśnieniem w celu całkowitego usunięcia rozpuszczalnika.
    5. Dodać 1 ml buforu translacyjnego do kolby odparowującej. Obrócić kolbę, aby rozprowadzić bufor na cienkim filmie lipidowym. Inkubuj przez 5 minut, aby nawodnić film.
    6. Sonizować kolbę za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego lub myjki ultradźwiękowej. Od czasu do czasu zmieniać kąt kolby, aby roztwór mógł dokładnie dotknąć folii. Upewnij się, że cienka warstwa lipidowa jest oderwana od spodu i całkowicie i jednorodnie zemulgowana.
      UWAGA: Mikrografia elektronowa biotynylowanych lipidów zawierających liposomy jest pokazana na Rysunek 1.
    7. Przenieś zawiesinę liposomów (50 mg lipidów/ml) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Jeśli nie ma być użyty natychmiast, zamroź liposomy w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C.

5. Tłumaczenie in vitro

  1. Szybko rozmrozić ekstrakt z kiełków pszenicy, unosząc rurki na wodzie o temperaturze pokojowej przez kilka minut. Po rozmrożeniu natychmiast delikatnie wymieszaj, odwracając rurki, odwiruj i schładzaj na lodzie do użycia.
    UWAGA: Po użyciu ekstrakt z kiełków pszenicy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Wytrzymuje kilka cykli zamrażania/rozmrażania.
  2. Rozmrozić 20 mg/ml roztworu podstawowego kinazy kreatyny. Zmieszać 5 μl roztworu podstawowego i 45 μl buforu translacyjnego, aby przygotować 2 mg/ml roztworu roboczego kinazy kreatynowej
    UWAGA: Ponowne zamrażanie kinazy kreatynowej nie jest zalecane.
  3. W razie potrzeby rozmrozić liposomy lub mRNA.
  4. Przeprowadź translację białek na małą skalę.
    1. Usunąć wodę zarówno z probówki, jak i z kubka do dializy (0,1 ml), jak przygotowano w kroku 3.3.2.
    2. Wstrzyknąć odpowiednio 1 ml i 300 μl buforu translacyjnego do probówki i kubka do dializy.
      UWAGA: W przypadku, gdy dno kubka do dializy nie sięga powierzchni buforu translacyjnego w probówce o pojemności 1,5 ml, należy wstrzyknąć do probówki dodatkowe 50–100 μl buforu.
    3. Przygotować mieszaninę reakcji translacji, mieszając 15,6 μl buforu translacyjnego, 2,4 μl 2 mg/ml kinazy kreatyny, 12 μl liposomów 50 mg/mL, 15 μl ekstraktu z kiełków pszenicy i 15 μl mRNA. Delikatnie wymieszaj, odwracając rurki i odwiruj.
    4. Odessać 60 μl mieszaniny reakcyjnej translacji za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
    5. Włożyć końcówkę pipety do spodniej powierzchni buforu translacyjnego w kubku dializacyjnym. Powoli i delikatnie odpipetować mieszaninę reakcyjną. Przykryj kubek do dializy pokrywką, aby zapobiec parowaniu.
      UWAGA: Mieszanina reakcyjna opada naturalnie na dno kubka i tworzy dwuwarstwę. Nie naruszaj dwuwarstwy, mieszając lub potrząsając filiżanką.
  5. Przeprowadź tłumaczenie na dużą skalę (Rysunek 1).
    1. Wlać 22 ml buforu translacyjnego do probówki o pojemności 25 ml. Włóż duży kubek do dializy (2 ml) do probówki i dodaj 2 ml buforu translacyjnego do kubka.
    2. Przygotować mieszaninę reakcji translacji, mieszając 130 μl buforu translacyjnego, 20 μl kinazy kreatynowej 2 mg/mL, 100 μl liposomu 50 mg/ml, 125 μl ekstraktu z kiełków pszenicy i 125 μl mRNA. Delikatnie wymieszać, pipetując.
    3. Odessać całą mieszaninę reakcji translacji (500 μl) za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl. Wstrzyknąć mieszaninę reakcji translacji do kubka dializacyjnego w taki sam sposób, jak opisano w kroku 5.4.5. Przykryj kubek do dializy pokrywką, aby zapobiec parowaniu.
  6. Inkubować reakcje w temperaturze 15 °C przez 24 godziny.
  7. Dobrze wymieszać reakcję w kubku dializacyjnym przez pipetowanie. Przenieś surową zawiesinę proteoliposomu do nowej probówki.
    UWAGA: Do zebrania proteoliposomu z translacji na małą skalę zalecana jest probówka o płaskim dnie o pojemności 1,5 ml. Po odwirowaniu liposomy tworzą zwarty i łatwo widoczny osad w dolnym rogu probówki.

6. Oczyszczanie proteoliposomów

  1. Odwirować probówkę zawierającą surową zawiesinę proteoliposomów o sile 17 800 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  2. Usunąć supernatant. Zawiesić osad proteoliposomu w PBS (mała skala: 1 ml, duża skala: 10 ml) przez pipetowanie.
  3. Powtórz wirowanie i mycie proteoliposomów przez kolejne dwa kręgi.
  4. Po umyciu dodać niewielką ilość PBS i dobrze zawiesić osad proteoliposomu przez pipetowanie. Zmierzyć objętość zawiesiny za pomocą mikropipety. Dodaj PBS, aby dostosować objętość do 60 μl (mała skala) lub 500 μl (duża skala). Przenieść zawiesinę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Przenieś 10 μl zawiesiny proteoliposomów do nowej probówki do PCR dla SDS-PAGE. Resztę próbek należy podzielić na mniejsze porcje do wykorzystania w razie potrzeby. Zamrażać w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

7. SDS-PAGE i barwienie CBB

  1. Dodać 70 μl wody i 40 μl 3x buforu do próbek SDS-PAGE do 10 μl zawiesiny proteoliposomów.
    UWAGA: Nie gotuj próbki SDS-PAGE, ponieważ białka błonowe agregują się i prawie nie przenikają do żelu akrylowego podczas elektroforezy. Do buforu próbki SDS-PAGE należy również dodać wystarczającą ilość środka redukującego (np. 2-merkaptoetanol o stężeniu końcowym 3%), aby zapobiec utlenianiu.
  2. Umieść żel SDS-PAGE o gradiacji 5%–20% w komorze elektroforetycznej. Załaduj 3 μl, 6 μl, 12 μl próbek proteoliposomów, 2 μl markera wielkości białka, a także standardową serię BSA.
  3. Elektroforeza przy 52 mA, 400 V przez 30 min.
  4. Odbarwić żel barwnikiem CBB przez 1 godzinę. Odbarwić w gorącej wodzie i zeskanować obraz żelu.
  5. Korzystając z oprogramowania NIH Image J (https://imagej.nih.gov/ij/), określ ilościowo intensywność pasma białka błonowego na każdym pasie. Oszacuj ilość zsyntetyzowanych białek błonowych za pomocą standardowych serii BSA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego protokołu, można uzyskać częściowo oczyszczone proteoliposomy w krótkim czasie. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 2A. Dwadzieścia pięć GPCR klasy A, B i C udało się zsyntetyzować metodą dializy dwuwarstwowej (na małą skalę) i częściowo oczyścić przez wirowanie i płukanie buforowe. Chociaż ilość syntetyzowanych białek różni się w zależności od rodzaju białka, zwykle można zsyntetyzować od 50 do 400 μg białek błonowych na reakcję, gdy używane są duże kubki do dializy. Kilka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony protokół zapewnia metodę wytwarzania białek błonowych z wysokim wskaźnikiem sukcesu. Ten protokół jest prosty, wysoce powtarzalny i łatwy do skalowania w górę. Ma również potencjał do skrócenia czasu i kosztów eksperymentów, które zużywają dużą ilość białek błonowych. Metoda dializy dwuwarstwowej zwiększa wydajność od 4 do 10 razy w porównaniu z metodą dwuwarstwową lub metodą dializy (ryc. 2B)45. W skrajnym przypadku wydajność kanału jonowego i transport...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Projekt Platformy do Wspierania Odkrywania Leków i Badań w Naukach Przyrodniczych (Podstawa Wspierania Innowacyjnych Odkryć Leków i Badań Nauk Przyrodniczych (BINDS)) od AMED pod numerem grantu JP20am0101077. Prace te były również częściowo wspierane przez JSPS KAKENHI Grant Grant Number 20K05709.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały


Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
&czasy; 3 BuforZawierający 10% 2-merkaptoetanol
5-20% gradientowy żel SDS-PAGEATTOE-D520L
70% etanoluRozcieńczony etanol ultraczystą wodą.
AgarozaTakara Bio
Octan amonuNakalai tesque02406-95Ponieważ ten odczynnik rozpływa się, po otwarciu rozpuść go w wodzie i przechowuj w temperaturze -30& stopni C.
Ampicillin SodiumNakalai tesque02739-74
Liposom asolektyny, liofilizowanyCellFree SciencesCFS-PLE-ASLFiolka zawiera 10 mg liofilizowanych liposomów.
Norma1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 i mikro; L i razy; 1 SDS-PAGE bufor do próbek
CBB barwienie żelem
klon cDNA będący przedmiotem zainteresowaniaPlazmid zawierający klon cDNA lub syntetyczny fragment DNA
ChloroformNakalai tesque08402-84
Chłodzony inkubatorZakres temperatury od 0 do 40 ° C lub szerszy.
Kinaza kreatynowaRoche Diagnostics04524977190
kubek do dializy (0,1 ml)Thermo Fisher Scientific69570Slide-A-Lyzer MINI urządzenie do dializy, 10K MWCO, 0,1 ml
kubek dializacyjny (2 ml)Thermo Fisher Scientific88404Slide-A-Lyzer MINI urządzenie do dializy, 10K MWCO, 2 ml
marker drabinkowy DNAThermo Fisher ScientificSM0311GeneLiner 1 kb DNA Drabinka
DpnIThermo Fisher ScientificFD1703FastDigest DpnI
Szczep E. coli JM109
Komora do elektroforezyATTO
Etanol (99,5%)Nakalai tesque14713-95
Bromek
Kolba do odparowywania, 100 ml
Skaner
żelowy SkanerJako substytut używamy skanera dokumentów i immunizatora LED.
Rosół
Interesujące lipidyAvanti Polar Lipids
MikrowirówkaTOMYMX-307
NTP mixCellFree SciencesCFS-TSC-NTPMieszanina ATP, GTP, CTP, UTP, po 25 mM każda
Probówka 25 ml bez nukleazIWAKI362-025-MYP
Probówki z tworzywa sztucznego bez nukrówekWatson bio labsNie sterylizować w autoklawie. Używaj ich oddzielnie od innych eksperymentów.
Końcówki bez nudziWatson bio labsNie sterylizować w autoklawie. Używaj ich oddzielnie od innych eksperymentów.
Zestaw do oczyszczania
PBS
wektor pEU-E01-MCSCellFree SciencesCFS-11
Fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Zestaw Midi do przygotowania plazmiduMACHEREY-NAGEL740410NucleoBond Xtra Midi
Podkład 1Thermo Fisher ScientificNiestandardowa synteza oligo5'-CCAAGATATCACTAGnnnn
Starter specyficzny dla genu, do przodu. Wielkie litery pokazują sekwencję nakładania się, która ma zostać dodana w celu bezproblemowego klonowania. Małe litery nnnn…. (20-30 pz) pokazuje sekwencję specyficzną dla genu.
Primer 2Thermo Fisher ScientificNiestandardowa synteza oligo5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnn-3'
Starter specyficzny dla genu, odwrócony. Wielkie litery pokazują sekwencję nakładania się, która ma zostać dodana w celu bezproblemowego klonowania. Małe litery nnnn…. (20-30 pz) pokazuje sekwencję specyficzną dla genu.
Primer 3Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Forward starter do linearyzacji wektorowej. Podkreślenie działa jako nakładanie się w bezproblemowym klonowaniu.
Primer 4Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Odwrócony starter do linearyzacji wektorowej. Podkreślenie działa jako nakładanie się w bezproblemowym klonowaniu.
Podkład 5Thermo Fisher ScientificNiestandardowa synteza oligo5'-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3'
Starter sekwencjonujący, forward
Primer 6Thermo Fisher ScientificCustom synteza oligo5'- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3'
Starter sekwencjonowania, odwrócony
Marker wielkości białkaBio-Rad1610394Precision Plus Protein Standard
Bezszwowa mieszanina enzymów klonującychparownik
Polimeraza RNA SP6 i Inhibitor RNazyCellFree SciencesCFS-TSC-ENZ
System elektroforezy
Bufor
Bufor transkrypcyjny LMCellFree SciencesCFS-TSC-5TB-LM
Bufor translacyjnyCellFree SciencesCFS-SUB-SGCSUB-AMIX SGC (&czasy; 40) roztwór podstawowy (S1, S2, S3, S4).
Przygotowanie i czasy; 1 bufor translacyjny przed użyciem przez zmieszanie bulionu S1, S2, S3, S4 i ultraczystej wody.
ultraczystaZalecamy przygotowanie wody ultraczystej przy użyciu systemu produkcji wody ultraczystej za każdym razem, gdy przeprowadzasz eksperyment. Nie sterylizować w autoklawie.
Przygotowaliśmy wodę ultraczystą przy użyciu systemu Milli-Q Reference i Elix10.
Jako substytut można użyć dostępnej na rynku wody wolnej od nukleaz (nie wody uzdatnionej DEPC). Zadbaj o zanieczyszczenie po otwarciu butelki.
homogenizator ultradźwiękowyBransonSONIFIER model 450D-AdvancedMyjka ultradźwiękowa.
Oświetlacz
Eksykator
Ekstrakt z kiełków pszenicyCellFree SciencesCFS-WGE-7240WEPRO7240
do próbek SDS-PAGE BSA etydyny żelowy LB buforu MACHEREY-NAGEL 740609 NucleoSpin Żel i PCR Clean-up obrotowy New England BioLabs E2611L Gibson Assembly Master Mix Dostępne są również inne odczynniki do klonowania bezszwowego.podwodnejTAEWoda Jako substytut może być stosowany UVpróżniowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  2. Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
  3. Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
  4. Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
  5. Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
  6. Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
  7. Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
  8. Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
  9. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  10. Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569(2020).
  11. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  12. Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524(2020).
  13. Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
  14. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
  15. Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
  16. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  17. Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
  18. Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
  19. Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
  20. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
  21. Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
  22. Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243(2017).
  23. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744(2019).
  24. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  25. Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
  26. Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
  27. Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
  28. Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38(2018).
  29. Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
  30. Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
  31. Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383(2018).
  32. Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
  33. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
  34. Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
  35. Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
  36. Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718(2016).
  37. Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
  38. Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
  39. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35(2011).
  40. Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
  41. Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
  42. Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
  43. David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138(2019).
  44. Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
  45. Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333(2015).
  46. Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, Clifton, N.J. 49-67 (2018).
  47. Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
  48. Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
  49. Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bezkom rkowa synteza bia ekprodukcja bia ek b onowychprzygotowanie proteoliposom wmetoda dializy dwuwarstwowejsystem zarodk w pszenicyformowanie liposom wanaliza SDS PAGEoczyszczanie przez wirowanie

Powiązane artykuły