Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Summary

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Abstract

Receptory i białka enzymatyczne to ważne biomolekuły, które działają jako cele wiążące dla małych cząsteczek bioaktywnych. W związku z tym szybka i globalna walidacja interakcji lek-białko jest wysoce pożądana nie tylko dla zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw skuteczności terapeutycznej, ale także dla oceny cech leku, takich jak adsorpcja, dystrybucja, metabolizm, wydalanie i toksyczność (ADMET) do zastosowań klinicznych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na biosensorach strategię wysokiej przepustowości do biopanowania krótkich peptydów wyświetlanych za pomocą fagów T7, które można łatwo wyświetlić na kapsydzie faga. Pokazano również późniejszą analizę sekwencji aminokwasowych peptydów zawierających krótkie segmenty, jako "uszkodzone relikty", miejsc wiązania leków za pomocą programów bioinformatycznych w zestawie kontaktów ligandów receptorowych (RELIC). Stosując tę metodę do dwóch klinicznie zatwierdzonych leków, przeciwnowotworowego irynotekanu i przeciwgrypowego oseltamiwiru, w niniejszym artykule wyjaśniono szczegółowy proces zbierania sekwencji peptydowych rozpoznających lek i podkreślania miejsc wiązania leków przez białka docelowe. Opisaną tutaj strategię można zastosować do dowolnych małych cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania.

Introduction

Identyfikacja celów wiążących leki jest niezbędna do rozwoju leków, jak również do zrozumienia molekularnych mechanizmów chorób. W szczególności białka receptorowe i enzymatyczne są najważniejszymi celami molekularnymi bioaktywnych małych cząsteczek¹. Chociaż wychwytywanie powinowactwa jest dobrze znaną techniką identyfikacji białek wiążących leki², ograniczenia techniczne, takie jak niska rozpuszczalność białek, często utrudniają walidację celów leków². Co najważniejsze, unieruchomione małe cząsteczki tracą stopień swobody niezbędny do dokowania i mogą być niedostępne dla wewnętrznie zlokalizowanych miejsc wiązania na większych białkach docelowych. Co więcej, nieprawidłowe fałdowanie białek, niemożność analizy warunków kokrystalizacji i ograniczenia wynikające z wielkości cząsteczki często utrudniają stosowanie krystalografii rentgenowskiej, magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i innych tego typu analiz eksperymentalnych do badania interakcji lek-białko.

Użycie biopanoramowania wyświetlacza fagów T7 jest skutecznym sposobem na określenie miejsca wiązania białek dla przynęt małocząsteczkowych³. W szczególności skuteczna jest losowa biblioteka peptydów wyświetlana przez fagi T7, którą można skonstruować poprzez wstawienie syntetycznego DNA do miejsca wielokrotnego klonowania. W porównaniu z biblioteką fagów T7 wyświetlającą białka, krótkie peptydy można łatwo zaprojektować tak, aby były wyświetlane na kapsydzie faga T7 bez ograniczeń fizycznych, który może sterycznie kontaktować się z dowolnym lekiem drobnocząsteczkowym umocowanym na stałym podłożu². Co więcej, wprowadzenie biosensora mikrowagi kwarcowej (QCM) do platformy biopanoramowania z wyświetlaczem fagów T7 pozwala na identyfikację takich słabych, ale specyficznych interakcji krótkich peptydów z lekami poprzez monitorowanie zmniejszenia częstotliwości QCM^4,5. Związany T7 jest następnie bezpośrednio odzyskiwany przez zakażenie gospodarza Escherichia coli (BLT5615), a następnie określa się sekwencję DNA regionu, który koduje wybrany peptyd o powinowactwie, zawierający krótkie segmenty rozpoznające lek. Dalsza analiza sekwencji aminokwasów w populacji peptydów dostarcza informacji na temat rozpoznawania leków. Wyrównanie parami in silico uratowanych sekwencji aminokwasów może być wykorzystane do uzyskania informacji na temat celu biologicznego leku w obrębie wybranego proteomu. Ta wysokoprzepustowa identyfikacja fragmentów białek o powinowactwie do leku może być wykorzystana do heurystycznej rekonstrukcji miejsca wiązania leku w sposób podobny do rekonstrukcji starożytnego artefaktu z odłamków ceramiki⁶. W szczególności to unikalne podejście może być przydatne, gdy konwencjonalne podejścia proteomiczne zawodzą .

Tutaj prezentujemy opartą na biosensorach strategię biopanowania peptydów wyświetlanych przez fagi T7 oraz analizę bioinformatyczną w celu walidacji docelowych małych cząsteczek. Poza ograniczeniami technicznymi stosowanymi w metodach konwencjonalnych, strategia ta umożliwia identyfikację miejsc wiązania leków na białkach docelowych dla dowolnej małej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania w ramach identycznego protokołu.

Protocol

UWAGA: Poniżej przedstawiono kroki do badania przesiewowego fagów T7 rozpoznających leki za pomocą biosensora QCM i odzyskiwania przesianych fagów poprzez zakażenie E. coli (BLT5615). Protokoły syntezy pochodnej małej cząsteczki, która tworzy samoorganizującą się monowarstwę (SAM) oraz budowy 15-merowej biblioteki losowych peptydów wyświetlanych przez fagi T7 można znaleźć gdzie indziej^6,7.

1. Przygotowanie układu czujnika QCM

1. Podłącz ceramiczny chip czujnika do oscylatora aparatu QCM 27 MHz i zarejestruj częstotliwość wewnętrzną (Hz) w fazie powietrznej przed unieruchomieniem małych cząsteczek.
2. Odłącz chip i upuść 20 μl roztworu (1 mM w 70% etanolu) pochodnej małocząsteczkowej, która tworzy SAM, na złotą elektrodę chipa czujnika za pomocą pipety.
   UWAGA: Kryształ chipa czujnika, w którym znajduje się złota elektroda (Au, grubość 0,1 mm, średnica wewnętrzna 2,5 mm, 4,9 mm²) jest niezwykle cienki i może łatwo pękać (SiO₂, grubość 0,06 mm, średnica wewnętrzna 9 mm). Dlatego należy ostrożnie pipetować.
3. Pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (około 20 °C) na szalce Petriego z wilgotną chusteczką i osłoną przed światłem w pomieszczeniu.
4. Delikatnie umyj powierzchnię elektrody ultraczystą wodą, a następnie usuń krople wody, przedmuchując powietrze strzykawką lub miotełką do kurzu.
5. Skonfiguruj chip czujnika dla aparatu QCM i zarejestruj zmniejszenie częstotliwości w fazie powietrznej, aby zmierzyć ilość małej cząsteczki, która została unieruchomiona.
   UWAGA: Co najmniej 100 Hz wewnętrznej częstotliwości jest niezbędne do udanego unieruchomienia małych cząsteczek (1 Hz unieruchamia 30 pg).

2. Biopanoramowanie biblioteki fagów T7 za pomocą biosensora QCM (Rysunek 1)

1. Ustaw kuwetę z dedykowanym mieszadłem magnetycznym na biosensorze QCM i wlej 8 ml buforu reakcyjnego (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) do kuwety.
2. Przymocuj układ czujnika QCM do oscylatora i pociągnij w dół ramię oscylatora, aby zanurzyć chip w mieszanym buforze z prędkością 1000 obr./min.
3. Rozpocznij monitorowanie częstotliwości QCM na komputerze osobistym (PC) i poczekaj, aż sensorgram zrównoważy się do około 3 Hz/min dryftu częstotliwości.
4. Wstrzyknąć 8 μl biblioteki fagów T7 (1-2 × 10^pfu/ml) do kuwety (stężenie końcowe: 1-2 × 10⁷ pfu/ml) i zaznaczyć punkt wstrzyknięcia na czujniku.
5. Monitoruj zmniejszenie częstotliwości spowodowane wiązaniem fagów T7 z małą cząsteczką unieruchomioną na powierzchni złotej elektrody przez 10 minut.
6. Zatrzymaj monitor częstotliwości QCM, wyjmij chip czujnika z oscylatora i usuń bufor, przedmuchując powietrze i/lub odprowadzając chusteczkami.
7. Umieścić chip czujnika na wilgotnej szalce Petriego i wrzucić 20 μl zawiesiny E. coli (BLT5615) (OD₆₀₀ = 0,5—1,0 po wstrząsaniu w temperaturze 37 °C przez dodanie IPTG do 1 mM) komórek gospodarza w fazie logarytmicznej na złotą elektrodę.
8. Zamknij pokrywkę naczynia i przykryj ją folią aluminiową, aby zablokować światło.
9. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 30 minut na 96-dołkowym mieszalniku do mikropłytek (1000-1500 obr./min) w celu zwiększenia odzysku związanych fagów T7.
10. Odzyskać 20 μl roztworu i zawiesić go w 200 μl pożywki LB.
    UWAGA: Próbki otrzymane na tym etapie mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez jeden tydzień.
11. Przygotować serię rozcieńczeń roztworu faga do izolacji płytki nazębnej i sekwencjonowania DNA zgodnie z ogólną procedurą opisaną w instrukcjach producenta^8,9.
12. Przetrzyj powierzchnię złotej elektrody bawełnianym wacikiem nasączonym 1% roztworem dodecylosiarczanu sodu.
13. Umyj złotą powierzchnię ultraczystą wodą z butelki do mycia, a następnie usuń krople wody, przedmuchując powietrze strzykawką lub miotełką do kurzu.
14. Upuść 5 μl roztworu piranii (Conc. H₂SO₄: 30% H₂O₂ = 3:1) na powierzchnię złota i pozostaw na 5 minut.
15. Ponownie umyj złotą powierzchnię wodą, a następnie wysusz, przedmuchując powietrze i/lub odprowadzając chusteczkami.
16. Powtórz kroki 2.14 i 2.15.
    UWAGA: Roztwór piranii należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Używaj tego płynu ostrożnie, ponieważ jest to bardzo mocny kwas. Obróbka trwająca dłużej niż 5 minut powoduje erozję chipa czujnika.

3. Analiza bioinformatyczna przy użyciu zestawu programów Receptor Ligand Contact (RELIC) (Rysunek 2)^10,11

1. Rozpakuj samodzielny program RELIC na komputerze z systemem operacyjnym MS Windows.
2. Dopasuj sekwencje aminokwasowe 15-merowych peptydów o powinowactwie wybranym za pomocą leku lub losowo wybranym z nieprzesiewowej biblioteki rodzicielskiej w każdym pliku w formacie tekstowym (name.txt).
3. Wpisz sekwencję aminokwasową pojedynczego lub wielu białek w każdym pliku tekstowym w formacie FASTA lub pobierz pliki tekstowe bazy danych w formacie FASTA z dowolnej bazy danych białek (np. UniProt (http://www.uniprot.org/) lub DrugBank (https://www.drugbank.ca/).
4. Umieść pliki tekstowe (i pliki PDB dla HETEROalign) w folderze niezbędnym do uruchomienia każdego programu RELIC.
5. Kliknij plik wykonywalny (program.exe) dla plików AADIV, INFO, MOTIF, MATCH, HETEROalign, FASTAcon i FASTAskan w folderze niezależnym, aby otworzyć osobistą wersję FTN95.
6. Wpisz odpowiednią nazwę pliku wraz z rozszerzeniem (name.txt) w komunikacie polecenia, aby uruchomić każdy program i uzyskać wymagany plik w formacie tekstowym.
7. Wyeksportuj wynikowy plik tekstowy do arkusza kalkulacyjnego (np. Excel), aby wygenerować wykres zawartości informacji (INFO) lub skumulowane wyniki podobieństwa obliczone za pomocą BLOSUM62 (DOPASUJ, HETEROalign).
   UWAGA: Oryginalny serwer RELIC (http://relic.bio.anl.gov) nie jest już dostępny, a niektóre autonomiczne programy RELIC, które działają na komputerach z platformą Windows, można pobrać od odpowiedniego autora (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).

Results

Reprezentatywne wyniki dla dwóch klinicznie zatwierdzonych leków są pokazane w Rysunek 3. Irynotekan (Rycina 3A), rozpuszczalny w wodzie prolek naturalnej kamptotecyny stosowanej w leczeniu zaawansowanego raka jelita grubego i niedrobnokomórkowego raka płuc, jest przekształcany w SN-38 w wątrobie, który hamuje topoizomerazę I w komórkach rakowych¹². Ponadto związek ten bezpośrednio hamuje acetylocholinoesterazy (AChE)^13,14. Dzięki tej strategii 29 peptydów, które rozpoznały Iri unieruchomioną jako SAM, zidentyfikowano za pomocą podzbiorów biopanacji opartych na biosensorach QCM. Późniejsze wyrównanie parami 29 peptydów i AChE dało maksymalne wyniki dla Y121, Q225, F290, E327, H440 i Y442 oraz podkreśliło część w trójwymiarowej strukturze. Te reszty aminokwasowe były zgodne z tymi, które tworzą miejsce wiązania Iri AChE. Ten sam podzbiór peptydów z powodzeniem zidentyfikował E99, L100, L252, L305, I387 i V474 w pobliżu triady katalitycznej (S221, E353 i H467) w karboksyloesterazie (CE), co wskazuje, że aminokwasy te tworzą rusztowanie do rozpoznawania Iri podczas deestryfikacji Iri¹⁵. Takich reszt aminokwasowych w miejscu katalitycznym nie można zidentyfikować bezpośrednio za pomocą konwencjonalnej krystalografii rentgenowskiej lub analizy NMR, ponieważ reakcja enzymatyczna przebiega płynnie i nie tworzy stabilnie kompleksu statycznego w ogólnych warunkach eksperymentalnych. W związku z tym to kombinatoryczne wykrywanie miejsc wiązania leków przez wiele białek, w tym tych w kompleksach pośrednich, które mogą być utworzone z enzymami podczas reakcji metabolicznych dla danego leku, jest możliwe przy użyciu peptydów wyselekcjonowanych pod kątem powinowactwa określonych dla jednego leku.

Rysunek 3B pokazuje inne wyniki uzyskane dla oseltamiwiru (Osel), leku przeciwgrypowego, który jest aktywowany przez karboksylan oseltamiwiru, który z kolei hamuje neuraminidazę (NA) wirusa grypy¹⁶. 27 peptydów, które rozpoznały Osel pokrywający powierzchnię złotej elektrody chipa czujnika QCM, z powodzeniem wykryło miejsce wiązania Osel w NA¹⁶. To miejsce wiązania składa się z nieustrukturyzowanych pętli peptydowych, które potencjalnie ulegają dynamicznemu ruchowi podczas dokowania z Osel. Peptydy rozpoznające Osel na kapsydzie faga T7 mogą naśladować to dynamiczne dokowanie podczas wiązania się z Osel zamocowanym na powierzchni złotej elektrody chipa czujnika QCM. U młodych pacjentów z grypą zidentyfikowano neuropsychiatryczne zdarzenia niepożądane (NPAE), których wpływ na pacjentów jest prawdopodobnie związany z samą chorobą, a nie z lekiem. Badania wykazały, że Osel jest aktywnie eksportowany z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) gryzoni za pośrednictwem białka oporności wielolekowej (MDR) w barierze krew-mózg (BBB)¹⁷. Rzeczywiście, jedno z białek z klasy tego MDR wykazało wysoki wynik (górne 5% z 4 396 w bazie danych białek DrugBank 1.0¹⁸), oprócz innych transporterów, enzymów i receptorów związanych z neuroprzekaźnikami w naszym badaniu. Znaczenie farmakologiczne tych białek w odniesieniu do występowania działań niepożądanych produktu Osel jest obecnie badane.

Do tej pory, pojedyncze i wielokrotne miejsca wiązania małych cząsteczek na docelowych białkach zostały pomyślnie zidentyfikowane dla sześciu leków małocząsteczkowych, które stosują naszą strategię (Rysunek 4). Dla Brz2001 i roksytromycyny (RXM) identyczne miejsca wiązania leku na białku docelowym zostały zidentyfikowane przy użyciu różnych pul peptydów, których liczby i sekwencje aminokwasów różniły się całkowicie^7,19. Co więcej, pojedyncze pule peptydów uzyskane dla Iri, RXM i Osel doprowadziły do identyfikacji wielu miejsc wiązania na różnych białkach dla każdego leku, takich jak AChE i CE dla Iri (Rysunek 3A)²⁰, angiomotyna i CYP3A4 dla RXM^19,21 oraz białko związane z NA i MDR dla Osel. Zidentyfikowano nieznany cel molekularny dla związku przeciwnowotworowego doksorubicyny (FANCF)²² oraz antyangiogennego antybiotyku makrolidowego RXM (angiomotyna)¹⁹.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie biopanowania biblioteki peptydów wyświetlanych przez fagi T7 za pomocą biosensora QCM. Biblioteka fagów T7, która wyświetla losowe peptydy, jest wstrzykiwana do kuwety zawierającej bufor (podczas mieszania), w której zanurzony jest chip biosensora QCM, a częstotliwość jest stabilizowana. Po monitorowaniu redukcji częstotliwości spowodowanej wiązaniem fagów T7 z małymi cząsteczkami unieruchomionymi na powierzchni złotej elektrody chipa czujnika, chip czujnika jest odłączany od oscylatora. DNA ze związanego faga T7 jest następnie bezpośrednio odzyskiwane po zakażeniu E. coli (BLT5615) gospodarza. Powstałe fagi T7 są izolowane poprzez tworzenie płytki nazębnej, a na koniec sekwencja aminokwasowa peptydu wybranego pod kątem powinowactwa do leku wyświetlanego na kapsydzie faga T7 jest określana zgodnie z ogólną metodą wyświetlania fagów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie ilościowej oceny porównania sekwencji między peptydami wybranymi do wyboru leków a pojedynczymi lub wieloma białkami. Sekwencje peptydowe wybrane przez lek są odpowiednio wyrównane z pierwszorzędowymi sekwencjami aminokwasów pojedynczych i wielokrotnych białek, a podobieństwo w każdym 3-5 zestawach aminokwasów jest kumulatywnie oceniane poprzez wyrównanie parami zgodnie ze zmodyfikowaną matrycą BLOSUM62. Otrzymany wykres lub wykres wskazuje pozostałości lub części, które stanowią potencjalne miejsce wiązania leku na białku. Dalsza analiza przy użyciu odpowiedniego programu RELIC uwidacznia miejsce wiązania na strukturze trójwymiarowej (jeśli plik PDB jest dostępny) lub klasyfikuje całe białka, które mogą być celem wiązania (program HETEROalign jest obecnie niedostępny). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki zbierania peptydów i późniejszej analizy bioinformatycznej. (A) Irynotekan (prolek przeciwnowotworowy, inhibitor topoizomerazy I). Interakcja z fagiem T7 była monitorowana przez 10 minut jako zmniejszenie częstości QCM. DNA związanego faga T7 odzyskano i zsekwencjonowano w celu określenia odpowiedniej sekwencji aminokwasów. Sekwencje aminokwasowe 29 15-merowych peptydów, zebrane przy użyciu podzbioru jednocyklowego biopanowania, uwydatniły aminokwasy, które tworzą miejsce wiązania Iri przez AChE [PDB ID 1U65]. Dalsza ocena przy użyciu tych samych 29 peptydów uwypukliła sąsiednie reszty aminokwasowe (reszty rusztowania do deestryfikacji) triady katalitycznej w CE, enzymie wątrobowym, który przekształca Iri w SN-38 (aktywna forma) [PDB ID: 1K4Y]. Wyniki podobieństwa 103 losowo wybranych peptydów z nieprzebadanej biblioteki rodzicielskiej^7,19 zostały odjęte od tych wyników, aby usunąć stronniczość biblioteki. Rysunki te zostały przedrukowane z Ref. 20, za zgodą Elsevier. (B) Oseltamiwir (lek przeciwgrypowy). 27 peptydów zawierających aminokwasy rozpoznające Osel uwypukliło nieuporządkowane części miejsca wiązania Osel dla neuraminidazy (NA) (enzymu wirusa) [PDB ID: 2HT7]. Globalna walidacja podobieństwa sekwencji między 27 peptydami i 4396 białkami w DrugBank 1.0¹⁸ ujawniła, że NA znajduje się w górnym zakresie 5%, oprócz ludzkich białek gospodarza związanych z funkcjami ośrodkowego układu nerwowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Podsumowanie małych cząsteczek, których cele wiązania zostały zidentyfikowane przy użyciu tej strategii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W tym artykule przedstawiono strategię biopanowania peptydów rozpoznających leki w oparciu o biosensory QCM, a następnie analizę bioinformatyczną w celu walidacji interakcji lek-białko przy użyciu zidentyfikowanych peptydów. Projektowanie małocząsteczkowych pochodnych do immobilizacji na złotej elektrodzie biosensora jest ważnym krokiem, ponieważ wprowadzony łącznik może utrudniać wiązanie i zbieranie peptydu rozpoznającego lek. Aby tego uniknąć, przygotowuje się pochodne o różnych pozycjach wprowadzonego linkera²³. Alternatywnie, w celu unieruchomienia hydrofobowych małych cząsteczek, chip czujnika zanurza się w wodzie objętościowej na 10-centymetrowej szalce Petriego, a roztwór 20 μl małej cząsteczki (10 mM roztwór w dimetylosulfotlenku) upuszcza się na złotą elektrodę bioczujnika, aby pokryć jego powierzchnię i inkubuje przez 5 minut. Pozwala to na zachowanie częstotliwości wewnętrznej małych cząsteczek poniżej stu herców, która jest utrzymywana przez co najmniej 10 minut podczas biopanowania. Rzeczywiście, korzystając z takiej immobilizacji, peptydy wybrane przez powinowactwo Osel wyraźnie podkreśliły miejsce wiązania Osel w NA (Figura 3).

T7 używany do przygotowania biblioteki peptydów jest genetycznie modyfikowany przy użyciu kasety NNK₁₅, która koduje 32 kodony dla wszystkich 20 standardowych aminokwasów i hamuje pojawianie się kodonów 2 stop (UAA, UGA) i pojawia się tylko UAG (Figura 1) ^6,7. Jest to ważne dla prezentacji 15-merowych peptydów o pełnej długości i zwiększenia różnorodności biblioteki. System wyświetlania fagów T7 ma techniczny limit wyświetlania wynoszący 10⁷—10⁹ fagów T7. Jednak różnorodność biblioteki 15-merowych peptydów wynosi teoretycznie 20¹⁵ (3,27 × 10¹⁹); W związku z tym nie można go wykorzystać do kompletnej budowy biblioteki. Niemniej jednak, wyszukiwanie podobieństw lub eksploracja zachowanych motywów pozwala na wykrycie aminokwasów składających się na miejsca wiązania leków w białkach, nawet przy tak ograniczonej różnorodności peptydów w bibliotece. Ponadto 3-5 rozciągnięć aminokwasów w peptydzie bibliotecznym (szybkość pojawiania się wynosi od 1/20³ do 1/20⁵, co można zrealizować za pomocą systemu wyświetlania fagów T7) bierze udział w rozpoznawaniu leków małocząsteczkowych; W związku z tym nie jest wymagane 100% dopasowanie sekwencji peptydowych do sekwencji aminokwasów 15-merowych stanowiących miejsce wiązania leku białka docelowego. Rzeczywiście, około 30 peptydów wybranych pod kątem powinowactwa z powodzeniem podkreśliło miejsce wiązania białka docelowego dla każdego testowanego leku (Figura 4). W ten sposób różnorodność użytej macierzystej biblioteki fagów T7 (1,7 × 10⁷ pfu / ml) może być wykorzystana do heurystycznej rekonstrukcji miejsca wiązania leku.

Zazwyczaj 3-5 kopii fagów T7, które wykazywały te same sekwencje, co sekwencje 15-merowych aminokwasów zawierających odcinki aminokwasów rozpoznających leki, pojawiało się w 16 arbitralnie izolowanych płytkach, co wskazuje na sukces selekcji powinowactwa zgodnie z naszym protokołem. Oznacza to, że w 96 wyizolowanych płytkach (liczba ta jest związana z formatem mikropłytki) zebrano 18-30 różnych sekwencji peptydowych rozpoznających leki, które są następnie identyfikowane za pomocą sekwencjonowania DNA i uzyskiwania odpowiedniej sekwencji aminokwasów. W obecnej strategii wstrzyknięcie 8 μl biblioteki fagów T7 do kuwety zawierającej 8 ml buforu (1000-krotne rozcieńczenie biblioteki) jest odpowiednie do zmniejszenia niespecyficznego wiązania fagów T7. Aby zwiększyć różnorodność peptydów wyselekcjonowanych pod kątem powinowactwa, kilkukrotne powtórzenie selekcji jednocyklowej i zastosowanie 16 lub 32 izolacji płytek na badanie przesiewowe okazało się bardziej skuteczne niż izolacja z pojedynczego roztworu na raz. Na przykład, aby skutecznie zebrać około 30 różnie sekwencjonowanych peptydów wyselekcjonowanych pod kątem powinowactwa, przeprowadzono 3-6 zestawów selekcji jednocyklowej, w każdym eksperymencie wyizolowano 16 lub 32 płytki. Pojawienie się identycznych sekwencji we wszystkich 16 lub 32 blaszkach fagowych T7 wskazuje na przypadkowe wykrycie tła lub może spowodować zanieczyszczenie jako przeniesienie. Natomiast brak fagów T7 o tej samej sekwencji lub wyglądzie wielu fagów T7 z peptydami krótszymi niż długość 15 merów wskazuje, że fagi T7 w populacji pojawiły się niespecyficznie z dużym prawdopodobieństwem. Ponieważ redukcja częstości QCM zachodzi w tym samym stopniu nawet w takich przypadkach, powodzenie selekcji powinno być kompleksowo ocenione poprzez sekwencjonowanie DNA wyizolowanego faga T7, a następnie analizę bioinformatyczną sekwencji aminokwasowych peptydów. Ponadto, w przeciwieństwie do konwencjonalnego protokołu wyświetlania fagów T7, powtarzanie rund selekcji jest mniej skuteczne, ponieważ zmienność i liczba fagów T7 są małe i nie są skoncentrowane nawet po powtórzeniu etapów amplifikacji i selekcji²³.

Co ważne, metoda ta ma zastosowanie do eksploracji miejsc wiążących małe cząsteczki w proteomach ludzi, wirusów chorobotwórczych, a nawet roślin. Co ciekawe, prawdopodobnie nieustrukturyzowana krótka długość wyświetlania peptydów na kapsydzie faga T7 może naśladować dynamikę molekularną peptydów białek podczas dokowania z małą cząsteczką; Może to odzwierciedlać dynamiczne wiązanie²⁴. Poza ograniczeniami technicznymi metod konwencjonalnych, strategia ta, mająca zastosowanie do identycznych protokołów dla małych cząsteczek, może rozszerzyć proteom leku, a także zapewnić większą szczegółowość analizy interakcji lek-białko.

Należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia techniczne tego podejścia. Synteza organiczna jest niezbędna do immobilizacji małych cząsteczek na powierzchni złotej elektrody chipa biosensora. Dla osób, które nie są ekspertami w dziedzinie chemii organicznej, niektóre odczynniki do immobilizacji są dostępne na rynku do mechanicznego utrwalania małej cząsteczki przez sprzężenie. Co więcej, pewne bezsensowne fragmenty peptydów mogą skutkować wykryciem części białka nieistotnej dla dokowania leku jako wyników fałszywie dodatnich. Odpowiada to empirycznie domenom bogatym w arkusze beta lub leucynę bogatym w reszty leucyny lub waliny, które są kodowane przez więcej kodonów niż inne standardowe aminokwasy, gdy wytwarzane są kopie faga T7. Kontrolowanie długości peptydu bibliotecznego może kontrolować występowanie wyników fałszywie dodatnich. W przeciwieństwie do tego, mogą wystąpić przypadki, w których reszty aminokwasowe w miejscu wiązania leku, które są zaangażowane w dokowanie, jak wykazano za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub analizy NMR, nie są wykrywane. Można to rozwiązać, zbierając większą liczbę peptydów rozpoznających leki lub zmieniając kierunek mocowania małych cząsteczek na złotej elektrodzie.

Wiele interakcji lek-białko, które są związane z głównymi i wtórnymi skutkami zażywania narkotyków, może być jeszcze niezidentyfikowanych w proteomie; Ponadto enzymy i transportery odpowiedzialne za wchłanianie, dystrybucję, metabolizm, wydalanie i toksyczność leków mogą być nadal niezidentyfikowane. Wiązanie z białkami nie zawsze jest odpowiedzialne za bioaktywność leku. W związku z tym połączenie innych informacji z testów biologicznych poprawi identyfikację podstawowych celów leków odpowiedzialnych za główne i niepożądane skutki leków. Dalsze adaptacje tej zwięzłej techniki zwiększą praktyczność i przepustowość eksploracji miejsc wiązania białek w szerokiej gamie leków małocząsteczkowych. Przedstawiona w niniejszym artykule metoda w znacznym stopniu przyczyni się nie tylko do prowadzenia badań podstawowych w dziedzinach pokrewnych, ale także do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw skuteczności terapeutycznej lub innych skutków biologicznych leków stosowanych klinicznie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFFINIXQN	ULVAC, Inc. (Tokio, Japonia)	QCM2008-STKIT	Zawiera szklaną kuwetę, magnes mieszający, oprogramowanie do obsługi i analizy z komputerem z systemem Windows
AADIV	Northeastern University (Lee Makowski)	AADIV.exe	Oblicza częstość występowania każdego z 20 aminokwasów w każdej pozycji rekombinowanej wstawki, a także ogólną częstotliwość niezależną od pozycji każdego aminokwasu w tym zestawie sekwencji peptydowych. Szacuje również z grubsza różnorodność sekwencji biblioteki wyświetlania za pomocą metody próbkowania statystycznego opartej na sekwencjach uzyskanych od ograniczonej liczby losowo próbkowanych członków biblioteki.
Ceramiczny chip czujnika	ULVAC, Inc. (Tokio, Japonia)	QCMST27C	4 chipy czujników/pakiet
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D8418
Etanol	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	09-0850
FASTAcon	Northeastern University (Lee Makowski)	FASTAcon.exe	Identyfikuje białka z populacji z krótkim sekwencje konsensusu.
FASTAskan	Northeastern University (Lee Makowski)	FASTAskan.exe	Wymienia białka o wysokim podobieństwie do populacji peptydów.
Zestaw do immiblizacji dla AFFINIX	ULVAC, Inc. (Tokio, Japonia)	Odczynnik QCMIMKT	SAM i odczynnik sprzęgający aminy
INFO Northeastern	University (Lee Makowski)	INFO.exe	Zapewnia matematyczną miarę prawdopodobieństwa zaobserwowania określonej sekwencji peptydowej przez losowy przypadek (tj. niespecyficzne wiązanie), a nie przez selekcję ze względu na określoną właściwość (powinowactwo do małej cząsteczki).
Płynna pożywka	LB Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	L3522	Autoklaw na 20 min
MECZ Northeastern	University (Lee Makowski)	MATCH.exe	Identyfikuje wszelkie odcinki reszt aminokwasowych w określonym białku, które wykazują znaczące podobieństwo do grupy peptydów wybranych pod kątem powinowactwa. Dane wyjściowe w postaci wykresu diagramu klastra i skumulowanego podobieństwa obliczone na podstawie zmodyfikowanej macierzy BLOSUM62 z krótkim oknem (5– 6 aminokwasów długości).
MOTIF1	Northeastern University (Lee Makowski)	MOTIF1.exe	Poszukuje trzech ciągłych motywów sekwencji aminokwasów w populacji peptydów.
MOTIF2	Northeastern University (Lee Makowski)	MOTIF2.exe	Wyszukuje wzorce trzech aminokwasów i nie zezwala na konserwatywne podstawiania aminokwasów, ale dopuszcza identyczne długości przerw.
NaCl	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	S3014
Kontakty ligandowe receptora (RELIC)	Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA)	https://www.relic.anl.gov	Obecnie niedostępne (Samodzielny program może być używany przez autora korespondencji na życzenie)
Tris	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	252859