Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej

13.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61875

⸱

26 maja 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Army Medical University, 3Department of Cardiology, Osaka City University Graduate School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy trzy metody przeszczepu szpiku kostnego (BMT): BMT z napromienianiem całego ciała, BMT z napromienianiem ekranowanym oraz metoda BMT bez wstępnego kondycjonowania (adoptywna BMT) do badania hematopoezy klonalnej w modelach mysich.

Streszczenie

Klonalna hematopoeza jest powszechnym stanem związanym z wiekiem, który wynika z nagromadzenia mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC). Mutacje w genach sterujących, które nadają sprawność komórkową, mogą prowadzić do rozwoju rozszerzających się klonów HSPC, które w coraz większym stopniu powodują powstawanie leukocytów potomnych zawierających mutację somatyczną. Ponieważ hematopoeza klonalna jest związana z chorobami serca, udarem mózgu i śmiertelnością, opracowanie systemów eksperymentalnych, które modelują te procesy, jest kluczem do zrozumienia mechanizmów, które leżą u podstaw tego nowego czynnika ryzyka. Procedury przeszczepu szpiku kostnego obejmujące kondycjonowanie mieloablacyjne u myszy, takie jak napromienianie całego ciała (TBI), są powszechnie stosowane do badania roli komórek odpornościowych w chorobach sercowo-naczyniowych. Jednak jednoczesne uszkodzenie niszy szpiku kostnego i innych miejsc zainteresowania, takich jak serce i mózg, jest nieuniknione w przypadku tych procedur. W związku z tym nasze laboratorium opracowało dwie alternatywne metody minimalizacji lub uniknięcia możliwych skutków ubocznych spowodowanych przez TBI: 1) przeszczep szpiku kostnego z osłoną przed napromienianiem oraz 2) adoptywne BMT dla myszy niekondycjonowanych. W narządach osłoniętych lokalne środowisko jest zachowane, co pozwala na analizę hematopoezy klonalnej, podczas gdy funkcja rezydentnych komórek odpornościowych jest niezakłócona. W przeciwieństwie do tego, adoptywne BMT dla myszy niekondycjonowanych ma dodatkową zaletę, że zachowane są zarówno lokalne środowiska narządów, jak i nisza krwiotwórcze. W tym miejscu porównujemy trzy różne podejścia do rekonstytucji komórek krwiotwórczych i omawiamy ich mocne i słabe strony w badaniach hematopoezy klonalnej w chorobach sercowo-naczyniowych.

Wprowadzenie

Klonalna hematopoeza (CH) to stan, który często obserwuje się u osób starszych i występuje w wyniku rozszerzonego klonu hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) z mutacją genetyczną1. Sugeruje się, że w wieku 50 lat większość osób nabędzie średnio pięć mutacji egzonicznych w każdej klasie HSPC2, ale większość z tych mutacji spowoduje niewielkie lub żadne konsekwencje fenotypowe dla danej osoby. Jeśli jednak przez przypadek jedna z tych mutacji daje przewagę konkurencyjną HSPC – na przykład poprzez promowanie jego proliferacji, samoodnawiania, przetrwania lub jakiejś kombinacji tych zjawisk – może to prowadzić do preferencyjnej ekspansji zmutowanego klonu w stosunku do innych HSPC. W rezultacie mutacja będzie się coraz bardziej rozprzestrzeniać w układzie krwiotwórczym, ponieważ zmutowany HSPC daje początek dojrzałym komórkom krwi, prowadząc do odrębnej populacji zmutowanych komórek we krwi obwodowej. Podczas gdy mutacje w dziesiątkach różnych genów kandydujących są związane ze zdarzeniami klonalnymi w układzie krwiotwórczym, wśród nich mutacje w metylotransferazie DNA 3 alfa (DNMT3A) i translokacji dziesięciu jedenastu 2 (TET2) są najbardziej rozpowszechnione3. Kilka badań epidemiologicznych wykazało, że osoby, które są nosicielami tych mutacji genetycznych, mają znacznie wyższe ryzyko chorób sercowo-naczyniowych (CVD), udaru mózgu i śmiertelności z jakiejkolwiek przyczyny3,4,5,6,7. Chociaż badania te wykazały, że istnieje związek między CH a zwiększoną częstością występowania chorób sercowo-naczyniowych i udaru mózgu, nie wiemy, czy związek ten jest przyczynowy, czy też jest wspólnym epifenomenem związanym z procesem starzenia. Aby lepiej zrozumieć ten związek, potrzebne są odpowiednie modele zwierzęce, które prawidłowo odwzorowują ludzką kondycję CH.

Kilka modeli zwierzęcych CH zostało stworzonych przez naszą grupę i inne przy użyciu danio pręgowanych, myszy i naczelnych innych niż ludzie8,9,10,11,12,13,14. Modele te często wykorzystują metody rekonstytucji układu krwiotwórczego poprzez przeszczepienie komórek zmodyfikowanych genetycznie, czasami przy użyciu rekombinacji Cre-lox lub systemu CRISPR. Podejście to pozwala na analizę specyficznej mutacji genu w komórkach krwiotwórczych w celu oceny, w jaki sposób przyczynia się ona do rozwoju choroby. Ponadto modele te często wykorzystują komórki kongeniczne lub reporterowe do odróżnienia działania komórek zmutowanych od komórek normalnych lub typu dzikiego. W wielu przypadkach do pomyślnego wszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych dawcy wymagany jest schemat kondycjonowania

wstępnego.

Obecnie, przeszczep szpiku kostnego myszom biorcom można podzielić na dwie główne kategorie: 1) kondycjonowanie mieloablacyjne i 2) przeszczep bezwarunkowy. Kondycjonowanie mieloablacyjne można osiągnąć za pomocą jednej z dwóch metod, a mianowicie napromieniania całego ciała (TBI) lub chemioterapii15. TBI przeprowadza się poprzez poddanie biorcy śmiertelnej dawce promieniowania gamma lub rentgenowskiego, generując pęknięcia DNA lub wiązania krzyżowe w szybko dzielących się komórkach, czyniąc je nieodwracalnymi16. Busulfanan i cyklofosfamid to dwa powszechnie stosowane leki chemioterapeutyczne, które zaburzają niszę krwiotwórczą i podobnie powodują uszkodzenie DNA szybko dzielących się komórek. Wynikiem netto wstępnego kondycjonowania mieloablacyjnego jest apoptoza komórek krwiotwórczych, która niszczy układ krwiotwórczy biorcy. Strategia ta nie tylko pozwala na pomyślne wszczepienie HSPC dawcy, ale może również zapobiec odrzuceniu przeszczepu poprzez tłumienie układu odpornościowego biorcy. Jednak wstępne kondycjonowanie mieloablacyjne ma poważne skutki uboczne, takie jak uszkodzenie tkanek i narządów oraz ich rezydujących komórek odpornościowych, a także zniszczenie natywnej niszy szpiku kostnego17. W związku z tym zaproponowano alternatywne metody przezwyciężenia tych niepożądanych skutków ubocznych, szczególnie w odniesieniu do uszkodzenia narządów będących przedmiotem zainteresowania. Metody te obejmują ekranowane napromienianie myszy biorców i adoptywne BMT na myszy niekondycjonowane9,17. Osłona klatki piersiowej, jamy brzusznej, głowy lub innych obszarów przed napromieniowaniem poprzez umieszczenie ołowianej bariery chroni tkanki będące przedmiotem zainteresowania przed szkodliwymi skutkami napromieniowania i utrzymuje ich rezydującą populację komórek odpornościowych. Z drugiej strony, adoptywne BMT HSPC dla myszy niekondycjonowanych ma dodatkową zaletę, ponieważ zachowuje rodzimą niszę krwiotwórczą. W tym manuskrypcie opisujemy protokoły i wyniki wszczepienia HSPC po kilku schematach przeszczepu u myszy, w szczególności po dostarczeniu HSPC myszom TBI, myszom częściowo osłoniętym przed napromienianiem oraz myszom niekondycjonowanym. Ogólnym celem jest pomoc naukowcom w zrozumieniu różnych efektów fizjologicznych każdej metody, a także ich wpływu na wyniki eksperymentalne w warunkach CH i chorób sercowo-naczyniowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Wirginijskim.

1. Przed wstępnym warunkowaniem

  1. Około 24 h przed napromienianiem należy zapewnić myszom biorcom wodę z dodatkiem antybiotyków (5 mM sulfametoksazolu, 0.86 mM trimetoprimu). Jest to niezbędne w celu zapobiegania infekcjom, ponieważ układ odpornościowy zostanie stłumiony po napromienianiu; suplementację tę należy kontynuować przez 2 tygodnie po zabiegu. Na tym etapie należy dodatkowo podawać myszom żel odżywczo-nawadniający, aby zachęcić je do jedzenia oraz zapobiec utracie masy ciała i odwodnieniu po napromienianiu.

Schemat układu MRI przedstawiający rozmieszczenie szczura, osłonę głowy oraz pomiary odległości dla zapewnienia precyzji obrazowania.
Rycina 1: Zdjęcia przedstawiające różne układy do kondycjonowania wstępnego.(A) Układ do napromieniowania całego ciała w klatce typu pie-cage z użyciem promieni gamma (Ceź-137): Wiązka promieniowania pada z tyłu irradiatora w kierunku osi y (promieniowanie poziome). (B) Układ do napromieniowania całego ciała myszy w klatce z użyciem promieni X: Klatka z myszą jest umieszczona w komorze refleksyjnej. Wiązka promieniowania pada z góry irradiatora w kształcie stożka (promieniowanie pionowe). Odległość od źródła promieniowania do klatki wynosi 530 mm. (C) Regulowana taca w irradiatorze promieni X: Układ ten jest stosowany do napromieniowania z częściowym osłanianiem przy użyciu promieni X. Wiązka promieniowania pada z góry irradiatora w kształcie stożka (promieniowanie pionowe). Odległość od źródła promieniowania do tacy wynosi 373 mm, a promień wynosi 250 mm. (D) Osłanianie klatki piersiowej: Zznieczulone myszy są umieszczane na tacy. Myszy są ułożone naprzeciw siebie w pozycji grzbietnej z całkowicie wyprostowanymi kończynami. Dolna krawędź osłony ołowianej jest wyrównana z wyrostkiem mieczowatym, a górna z grasicą. (E) Osłanianie jamy brzusznej: Zznieczulone myszy są rozmieszczone tak samo jak w układzie do osłaniania klatki piersiowej, przy czym dolna krawędź osłony ołowianej jest wyrównana z odbytem, a górna znajduje się poniżej przepony. (F) Układ do napromieniowania z osłoną głowy z użyciem promieni gamma (Ceź-137): Przednie łapy znieczulonej myszy są przytaśmowane, a mysz jest umieszczona w stożkowym stabilizatorze. Czarna osłona ołowiana (zaznaczona) zakrywa głowę i uszy myszy. Wiązka promieniowania pada z tyłu irradiatora w kierunku osi Y (promieniowanie poziome). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

2. Przygotowanie myszy biorców (opcjonalnie)

  1. Całociałowe napromienianie
    1. Umieść myszy biorców w klatce typu „pie-cage” z jednolitymi przegrodami lub w klatce dla myszy w komorze refleksyjnej w obliczonym promieniu, aby otrzymały taką samą dawkę napromieniania; zaleca się jednak maksymalnie 8 myszy na klatkę „pie-cage” i 5 myszy na zwykłą klatkę, aby zapewnić jednorodne napromienianie (Rysunek 1A,B).
    2. Aby uzyskać całkowitą mieloablację, należy zapewnić, aby myszy biorcy otrzymały całkowitą dawkę promieniowania 11 Gy w dwóch frakcjach po 5.5 Gy, oddzielonych odstępem 4–24 h.
      UWAGA: Chociaż optymalne przyjęcie przeszczepu można uzyskać stosując 4 h odstępu między frakcjami, można go wydłużyć do 24 h, co może być pomocne w przypadku braku personelu i/lub niedostępności irradiatora.
  2. Napromienianie z częściowym osłanianiem
    1. Zanurz myszy biorców w znieczuleniu poprzez dożylne wstrzyknięcie ketaminy (80–100 mg/kg) i ksylazyny (5–10 mg/kg). Unieruchomienie myszy jest kluczowe dla zapewnienia jednorodnego napromieniania i skutecznej ochrony narządów docelowych podczas procesu osłaniania.
    2. W przypadku osłaniania klatki piersiowej i jamy brzusznej skieruj wiązkę promieniowania irradiatora rentgenowskiego pionowo względem myszy (Rysunek 1C).
      1. Umieść znieczulone myszy na płaskiej płycie, centrując źródło promieniowania od góry. Ustaw myszy w pozycji grzbietnej, przeciwlegle do siebie, z całkowicie wyprostowanymi kończynami przednimi i tylnymi (Rysunek 1D,E).
        UWAGA: Wykorzystywana w tym eksperymencie instalacja irradiatora rentgenowskiego pozwala na umieszczenie dwóch myszy jednocześnie w promieniu efektywnym, który zapewnia jednorodne napromienianie. Chociaż promień efektywny oblicza się na podstawie odległości między źródłem promieniowania a taca, liczba zwierząt, które mogą być napromieniane jednocześnie, zależy od konkretnego irradiatora.
      2. Przymocuj łapy myszy do płyty za pomocą taśmy, aby zapewnić ich unieruchomienie podczas procedury napromieniania. Umieść osłony ołowiane tak, aby zakrywały obszary wymagające ochrony.
      3. Aby osłonić klatkę piersiową, przygotuj osłonę ołowianą, mierząc odległość od wyrostka mieczowatego myszy do grasicy i obliczając grubość, która zapewni wystarczającą ochronę przed źródłem promieniowania. Umieść osłonę ołowianą tak, aby jej dolna krawędź pokrywała się z wyrostkiem mieczowatym. Górna krawędź bariery ołowianej powinna znajdować się w pobliżu grasicy (Rysunek 1D).
      4. Aby osłonić jamę brzuszną, przygotuj osłonę ołowianą, mierząc odległość od odbytu myszy do przepony i obliczając grubość, która zapewni wystarczającą ochronę przed źródłem promieniowania. Umieść osłonę ołowianą tak, aby jej dolna krawędź pokrywała się z odbytem. Górna krawędź osłony ołowianej powinna znajdować się poniżej przepony (Rysunek 1E).
        UWAGA: Ujednolicenie rozmieszczenia osłony ołowianej pomiędzy kohortami może zmniejszyć zmienność wynikającą z wielkości myszy.
    3. W przypadku osłaniania głowy skieruj wiązkę promieniowania irradiatora cezowego poziomo względem myszy.
      1. Ostrożnie przymocuj taśmą przednie łapy znieczulonej myszy do brzucha. Zapewnia to otrzymanie pełnej dawki promieniowania przez kończyny przednie i zapobiega ich zakryciu przez osłonę.
      2. Aby osłonić głowę, umieść mysz w stożkowym unieruchamiaczu, który pasuje do osłony ołowianej. Po umieszczeniu myszy w stożkowym unieruchamiaczu, wsuń go w szczelinę w osłonie ołowianej (Rysunek 1F). Osłona ołowiana powinna całkowicie zakrywać głowę i uszy myszy (~3.2 cm), pozostawiając resztę ciała myszy odsłoniętą do napromieniania. Pozycję unieruchamiacza wewnątrz osłony można dostosować do zwierząt o różnej wielkości, przesuwając go głębiej do wewnątrz lub na zewnątrz osłony.
      3. Umieść myszy w irradiatorze, prostopadle do źródła promieniowania.
    4. Poddaj myszy działaniu dwóch frakcji promieniowania po 5.5 Gy (całkowita dawka 11 Gy) oddzielonych odstępem 4–24 h.
    5. Po każdej frakcji napromieniania umieść klatki ze znieczulonymi myszami na matach grzewczych lub pod czerwonymi lampami grzewczymi, aby zapobiec hipotermii i wspomóc wybudzanie z znieczulenia.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nie przegrzać znieczulonej myszy podczas korzystania z lampy, ponieważ zwierzę nie może uciec przed ciepłem. Jak opisano powyżej, rozmieszczenie zwierząt i grubość osłony ołowianej mogą różnić się między badaniami w zależności od specyficznych cech irradiatora (typ promieniowania/kierunek wiązki itp.). Badacze będą musieli odpowiednio dostosować swoje eksperymenty.

3. Izolacja kości

UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby myszy donora i biorcy były w podobnym wieku, mieszczących się w przedziale 8–12 tygodni. W celu zminimalizowania heterogeniczności (nawet przy użyciu myszy o tym samym genotypie) zaleca się wykorzystanie co najmniej 3 myszy jako donorów (zamiast jednego donora). Z sześciu kości (dwóch kości udowych, dwóch piszczelowych i dwóch ramiennych) jednej myszy można uzyskać około 40 milionów niefrakcjonowanych komórek szpiku kostnego. Przeszczepienie 5 milionów komórek szpiku kostnego do każdej myszy biorcy zazwyczaj zapewnia prawidłowe przyjęcie przeszczepu.

  1. Uśmierć myszy dawców poprzez zwichnięcie szyi bez znieczulenia (preferowana metoda w celu uniknięcia kontaminacji chemicznej komórek), a następnie umieść każdą mysz na chłonnym podkładzie.
  2. Zdezynfekuj skórę, używając sprayu z 70% etanolem.
  3. Wykonaj niewielkie cięcie poprzeczne skóry poniżej klatki piersiowej i mocno chwyć skórę po obu stronach nacięcia, rozrywając ją w przeciwnych kierunkach w stronę głowy i stóp. Odwarstw skórę ze wszystkich kończyn.
  4. Przetnij tkanki w obrębie barków i stawów łokciowych, a następnie usuń przylegające mięśnie i tkanki łączną za pomocą chusteczki Kimwipe, aby odsłonić kości ramienne.
  5. Ostrożnie zwichnij stawy biodrowe między kością udową a miednicą. Używając tępych nożyczek, przetnij tkanki wzdłuż głowy kości udowej i oddziel nogi. Przetnij w obrębie stawu kolanowego, aby rozdzielić kość udową od piszczelowej, a następnie ostrożnie usuń przylegające mięśnie i tkanki łączną za pomocą chusteczki Kimwipe, aby pobrać kość udową i piszczelową.
    UWAGA: Na tym etapie należy zwrócić szczególną uwagę, aby nie uszkodzić nasad kości. Kości złamane należy odrzucić ze względu na utratę sterylności. Oprócz kości udowych, piszczelowych i ramiennych można zebrać również kości miednicy oraz kręgi. W celu pobrania komórek szpiku z kręgów można użyć moździerza i tłuczka do rozkruszenia kości na mniejsze fragmenty.
  6. Umieść wyizolowane kości od myszy o tym samym genotypie w odpowiednich probówkach stożkowych o pojemności 50 mL zawierających 20 mL lodowatego, sterylnego PBS i przechowuj je w lodzie do czasu dalszego użycia. Zwróć szczególną uwagę na to, aby umieścić kości w probówkach odpowiadających właściwym genotypom.
  7. Powtórz powyższe kroki dla każdego zwierzęcia dawcy, zmieniając rękawiczki pomiędzy każdą myszą. Nożyczki i inne narzędzia należy również oczyszczać 70% etanolem po każdym zwierzęciu.

4. Izolacja komórek szpiku kostnego

UWAGA: Poniższe kroki należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II.

  1. Przygotowanie zestawów probówek: Za pomocą igły 18 G wykonaj mały otwór w dnie sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 mL i umieść ją w sterylnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL, która zawiera na dnie 100 μL lodowatego, sterylnego PBS.
    UWAGA: Ponieważ w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 mL zmieści się tylko sześć kości, zaleca się przygotowanie wystarczającej liczby zestawów probówek, aby przetworzyć wszystkie kości jednocześnie.
  2. Odsącz PBS i przenieś wyizolowane kości na sterylną szalkę hodowlaną o średnicy 100 mm. Trzymając każdą kość za pomocą precyzyjnej pęsety, ostrożnie odetnij nasady z obu końców, używając małych nożyczek wysterylizowanych w autoklawie. Umieść odcięte kości w przygotowanych zestawach probówek.
  3. Wiruj probówki z prędkością 10,000 x g przez 35 s w temperaturze 4 °C.
  4. Po wirowaniu potwierdź, że szpik kostny został pomyślnie usunięty z kości. Kości powinny być białe i półprzezroczyste, a na dnie probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL powinien znajdować się stosunkowo duży czerwony osad (pellet). Usuń probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 mL.
    UWAGA: Jeśli podczas inspekcji wizualnej nie stwierdzono obecności szpiku na dnie probówki 1.5 mL, należy ponownie odciąć fragment kości i powtórzyć krok 4.3.
  5. Resuspenduj szpik kostny w 1 mL lodowatego PBS, a następnie przenieś zawiesinę komórkową tego samego genotypu do dopasowanej probówki stożkowej o pojemności 50 mL.
  6. Dysocjuj komórki, przepuszczając je 10 razy przez igłę 18 G za pomocą strzykawki 10 mL.
  7. Przefiltruj zawiesiny pojedynczych komórek przez sitko komórkowe 70 μm. Dodaj dodatkowy lodowaty PBS do uzyskania objętości końcowej 10 mL i resuspenduj komórki, delikatnie używając pipetora.
  8. Wiruj z prędkością 310 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  9. Odsącz nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 10 mL bezzserwatkowego medium RPMI. Odstaw 30 μL tego materiału do zliczenia komórek.
  10. Oznacz stężenie komórek za pomocą licznika komórek i oblicz objętość zawiesiny komórkowej wymaganą do transplantacji. W przypadku BMT 100% wymagane jest 5 x 106 komórek szpiku kostnego dla każdej myszy biorcy.
    UWAGA: W przypadku konkurencyjnego BMT przygotuj łącznie 5 x 106 komórek szpiku kostnego składających się z mieszaniny komórek donora (np. CD45.2+) i komórek konkurenta (np. CD45.1+). Zdecydowanie zaleca się przygotowanie nadmiarowych komórek szpiku kostnego. Na przykład, jeśli w grupie eksperymentalnej znajduje się 10 myszy biorców, zazwyczaj przygotowujemy komórki dla 12 myszy biorców.
  11. Przenieś obliczoną objętość zawiesiny komórkowej do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Wiruj z prędkością 310 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  12. Odsącz nadsącz i resuspenduj komórki, używając obliczonej ilości bezzserwatkowego medium RPMI, aby uzyskać odpowiednią gęstość i objętość komórek. Zazwyczaj optymalną objętością do iniekcji zaocznej (retro-orbitalnej) jest 200 μL.

5. Transplantacja komórek szpiku kostnego do napromieniowanych myszy

  1. Zanurz myszy biorców w narkozie, stosując 5% isofluranu.
  2. Podczas gdy myszy są w narkozie, powoli wstrzyknąć 200 μL komórek szpiku kostnego do żyły zakątka ocznego, używając igły 28–30 G i strzykawki insulinowej.
    1. Alternatywnie można przeprowadzić podanie komórek dawcy poprzez wstrzyknięcie dożylne do żyły ogonowej oraz wstrzyknięcie domięśniowe do jamistej kości udowej, przy maksymalnej objętości odpowiednio 0,2 mL i 25 μL.
  3. Po wstrzyknięciu komórek nanieść kroplę kropli do oczu zawierających proparakainę na powierzchnię oka w celu uśmierzenia bólu. Następnie można pozwolić zwierzęciu odzyskać przytomność.

6. Transplantacja komórek szpiku kostnego do myszy niepoddanych kondycjonowaniu

  1. Zanurz myszy biorców w znieczuleniu poprzez inhalację 5% izofluranu.
  2. Wstrzyknąć 5 x 106 niefrakcjonowane komórki szpiku kostnego od osobników o dowolnym genotypie do nienapromieniowanych myszy biorców drogą retroorbitalną, przy użyciu strzykawki insulinowej z igłą 28–30 G.
  3. Powtórzyć kroki 6.1 i 6.2 przez 3 kolejne dni, tak aby myszy biorcy otrzymały łącznie 1,5 x 107 komórki szpiku kostnego
    UWAGA: Ponieważ adopcyjne BMT bez procedury warunkowania wymaga przeszczepiania szpiku kostnego przez 3 kolejne dni, należy starać się naprzemiennie aplikować iniekcje do obu oczu.
  4. Po wstrzyknięciu należy podać do dotkniętego oka kroplę kropli do oczu zawierających proparakainę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby porównać wpływ trzech metod BMT/warunkowania wstępnego na przyjmowanie się komórek dawcy, za pomocą cytometrii przepływowej przeanalizowano frakcje komórek dawcy we krwi obwodowej i tkance serca w 1. miesiącu po BMT. Izolowane komórki barwiono na specyficzne markery leukocytarne w celu zidentyfikowania różnych podgrup leukocytów. W badaniach tych typy dzikie (typ dziki (WT) Komórki szpiku kostnego dawcy C57BL/6 (CD45.2) podano do typ dziki B6.SJL-PtprcaPrpc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W badaniach hematopoezy klonalnej opisaliśmy trzy metody BMT: BMT z napromienianiem całego ciała, BMT z napromienianiem z częściowym ekranowaniem oraz rzadziej stosowaną metodę BMT, która nie obejmuje kondycjonowania wstępnego (adoptywne BMT). Metody te zostały wykorzystane do oceny wpływu hematopoezy klonalnej na choroby sercowo-naczyniowe. Badacze mogą odpowiednio modyfikować te metody, aby dopasować je do konkretnego celu swojego badania.

Modele hematopoezy klonalnej
H...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty US National Institutes of Health dla K. Walsha (HL131006, HL138014, and HL132564), dla S. Sano (HL152174), grant American Heart Association dla M. A. Evansa (20POST35210098) oraz grant Japan Heart Foundation dla H. Ogawy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikrowirówka 0,5 mlFisher Scientific05-408-121zapasy ogólne
Mikrowirówka 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
zapasy ogólne 1/2 cc STRZYKAWKA INSULINOWA O NISKIEJ DAWCEEXELINT26028ogólne
Alkohol etylowy absolutny (200 prfof)Fisher chemical200559zaopatrzenie ogólne
BD 1 ml Tuberkulina Strzykawki 25G 5/8 cala IgłaBecton Dickinson309626ogólne zaopatrzenie
Igła BD PrecisionGlide 18G (1,22 mm X 25 mm)Becton Dickinson395195ogólna dostawa
Grzejnik cezowy-137 J. L. Shepherd Sprzęt Mark IV
DietGel 76AClear H2O70-01-5022zaopatrzenie ogólne
Naczynie do hodowli komórkowych Falcon 100 mmNauki przyrodnicze353003zaopatrzenie ogólne
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 mlFisher Scientific352098ogólne zaopatrzenie
Sterylne sitka komórkowe Fisherbrand, 70 μ mFisher Scientific22363548ogólne zaopatrzenie
Graefe KleszczeFine Science Tools11051-10ogólne zaopatrzenie
Hartowane drobne nożyczkiFine Science Tools14090-09ogólne zaopatrzenie
Roztwór izotezji (izofluranu)Henry Schein29404roztwór
KetaminaZoetis043-304wtrysk
Wycieraczki Kimwipes Delicate TaskKimtech ScienceKCC34155ogólne zaopatrzenie
PBS pH7.4 (1X)Gibco10010023Solution
RadDisk – Dysk natchnienia gryzoniBraintree ScientificIRD-P M zaopatrzenieogólne
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093Medium
Sulfametoksazol i trimetoprimTEVA0703-9526-01iniekcja
KsylazynaAkorn139-236iniekcja
promiennik rentgenowskiŹródło Rad SprzętRS-2000
zaopatrzenie TC

Bibliografia

  1. Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
  2. Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
  3. Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
  4. Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25(2019).
  5. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
  6. Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
  7. Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
  8. Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
  9. Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204(2020).
  10. Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
  11. Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
  12. Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
  13. Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
  14. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
  15. Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
  16. Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
  17. Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
  18. Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
  19. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  20. Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079(2016).
  21. Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202(2019).
  22. Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
  23. Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
  24. Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
  25. Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
  26. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  27. Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
  28. Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
  29. Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
  30. Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
  31. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  32. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ca ocia a irradiacjaos ona radiacyjnaadopcyjny przeszczep szpiku kostnegocytometria przep yewowakom rki z deficytem Tet2przyjmowanie kom rek dawcyhematopoetyczne kom rki macierzystechoroby uk adu sercowo naczyniowego
Procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.