Artykuł metodologiczny

Procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej

DOI:

10.3791/61875

⸱

26 maja 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Army Medical University, 3Department of Cardiology, Osaka City University Graduate School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy trzy metody przeszczepu szpiku kostnego (BMT): BMT z napromienianiem całego ciała, BMT z napromienianiem ekranowanym oraz metoda BMT bez wstępnego kondycjonowania (adoptywna BMT) do badania hematopoezy klonalnej w modelach mysich.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonalna hematopoeza jest powszechnym stanem związanym z wiekiem, który wynika z nagromadzenia mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC). Mutacje w genach sterujących, które nadają sprawność komórkową, mogą prowadzić do rozwoju rozszerzających się klonów HSPC, które w coraz większym stopniu powodują powstawanie leukocytów potomnych zawierających mutację somatyczną. Ponieważ hematopoeza klonalna jest związana z chorobami serca, udarem mózgu i śmiertelnością, opracowanie systemów eksperymentalnych, które modelują te procesy, jest kluczem do zrozumienia mechanizmów, które leżą u podstaw tego nowego czynnika ryzyka. Procedury przeszczepu szpiku kostnego obejmujące kondycjonowanie mieloablacyjne u myszy, takie jak napromienianie całego ciała (TBI), są powszechnie stosowane do badania roli komórek odpornościowych w chorobach sercowo-naczyniowych. Jednak jednoczesne uszkodzenie niszy szpiku kostnego i innych miejsc zainteresowania, takich jak serce i mózg, jest nieuniknione w przypadku tych procedur. W związku z tym nasze laboratorium opracowało dwie alternatywne metody minimalizacji lub uniknięcia możliwych skutków ubocznych spowodowanych przez TBI: 1) przeszczep szpiku kostnego z osłoną przed napromienianiem oraz 2) adoptywne BMT dla myszy niekondycjonowanych. W narządach osłoniętych lokalne środowisko jest zachowane, co pozwala na analizę hematopoezy klonalnej, podczas gdy funkcja rezydentnych komórek odpornościowych jest niezakłócona. W przeciwieństwie do tego, adoptywne BMT dla myszy niekondycjonowanych ma dodatkową zaletę, że zachowane są zarówno lokalne środowiska narządów, jak i nisza krwiotwórcze. W tym miejscu porównujemy trzy różne podejścia do rekonstytucji komórek krwiotwórczych i omawiamy ich mocne i słabe strony w badaniach hematopoezy klonalnej w chorobach sercowo-naczyniowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonalna hematopoeza (CH) to stan, który często obserwuje się u osób starszych i występuje w wyniku rozszerzonego klonu hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) z mutacją genetyczną1. Sugeruje się, że w wieku 50 lat większość osób nabędzie średnio pięć mutacji egzonicznych w każdej klasie HSPC2, ale większość z tych mutacji spowoduje niewielkie lub żadne konsekwencje fenotypowe dla danej osoby. Jeśli jednak przez przypadek jedna z tych mutacji daje przewagę konkurencyjną HSPC – na przykład poprzez promowanie jego proliferacji, samoodnawiania, przetrwania lub jakiejś kombinacji tych zjawisk – może to prowadzić do preferencyjnej ekspansji zmutowanego klonu w stosunku do innych HSPC. W rezultacie mutacja będzie się coraz bardziej rozprzestrzeniać w układzie krwiotwórczym, ponieważ zmutowany HSPC daje początek dojrzałym komórkom krwi, prowadząc do odrębnej populacji zmutowanych komórek we krwi obwodowej. Podczas gdy mutacje w dziesiątkach różnych genów kandydujących są związane ze zdarzeniami klonalnymi w układzie krwiotwórczym, wśród nich mutacje w metylotransferazie DNA 3 alfa (DNMT3A) i translokacji dziesięciu jedenastu 2 (TET2) są najbardziej rozpowszechnione3. Kilka badań epidemiologicznych wykazało, że osoby, które są nosicielami tych mutacji genetycznych, mają znacznie wyższe ryzyko chorób sercowo-naczyniowych (CVD), udaru mózgu i śmiertelności z jakiejkolwiek przyczyny3,4,5,6,7. Chociaż badania te wykazały, że istnieje związek między CH a zwiększoną częstością występowania chorób sercowo-naczyniowych i udaru mózgu, nie wiemy, czy związek ten jest przyczynowy, czy też jest wspólnym epifenomenem związanym z procesem starzenia. Aby lepiej zrozumieć ten związek, potrzebne są odpowiednie modele zwierzęce, które prawidłowo odwzorowują ludzką kondycję CH.

Kilka modeli zwierzęcych CH zostało stworzonych przez naszą grupę i inne przy użyciu danio pręgowanych, myszy i naczelnych innych niż ludzie8,9,10,11,12,13,14. Modele te często wykorzystują metody rekonstytucji układu krwiotwórczego poprzez przeszczepienie komórek zmodyfikowanych genetycznie, czasami przy użyciu rekombinacji Cre-lox lub systemu CRISPR. Podejście to pozwala na analizę specyficznej mutacji genu w komórkach krwiotwórczych w celu oceny, w jaki sposób przyczynia się ona do rozwoju choroby. Ponadto modele te często wykorzystują komórki kongeniczne lub reporterowe do odróżnienia działania komórek zmutowanych od komórek normalnych lub typu dzikiego. W wielu przypadkach do pomyślnego wszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych dawcy wymagany jest schemat kondycjonowania

wstępnego.

Obecnie, przeszczep szpiku kostnego myszom biorcom można podzielić na dwie główne kategorie: 1) kondycjonowanie mieloablacyjne i 2) przeszczep bezwarunkowy. Kondycjonowanie mieloablacyjne można osiągnąć za pomocą jednej z dwóch metod, a mianowicie napromieniania całego ciała (TBI) lub chemioterapii15. TBI przeprowadza się poprzez poddanie biorcy śmiertelnej dawce promieniowania gamma lub rentgenowskiego, generując pęknięcia DNA lub wiązania krzyżowe w szybko dzielących się komórkach, czyniąc je nieodwracalnymi16. Busulfanan i cyklofosfamid to dwa powszechnie stosowane leki chemioterapeutyczne, które zaburzają niszę krwiotwórczą i podobnie powodują uszkodzenie DNA szybko dzielących się komórek. Wynikiem netto wstępnego kondycjonowania mieloablacyjnego jest apoptoza komórek krwiotwórczych, która niszczy układ krwiotwórczy biorcy. Strategia ta nie tylko pozwala na pomyślne wszczepienie HSPC dawcy, ale może również zapobiec odrzuceniu przeszczepu poprzez tłumienie układu odpornościowego biorcy. Jednak wstępne kondycjonowanie mieloablacyjne ma poważne skutki uboczne, takie jak uszkodzenie tkanek i narządów oraz ich rezydujących komórek odpornościowych, a także zniszczenie natywnej niszy szpiku kostnego17. W związku z tym zaproponowano alternatywne metody przezwyciężenia tych niepożądanych skutków ubocznych, szczególnie w odniesieniu do uszkodzenia narządów będących przedmiotem zainteresowania. Metody te obejmują ekranowane napromienianie myszy biorców i adoptywne BMT na myszy niekondycjonowane9,17. Osłona klatki piersiowej, jamy brzusznej, głowy lub innych obszarów przed napromieniowaniem poprzez umieszczenie ołowianej bariery chroni tkanki będące przedmiotem zainteresowania przed szkodliwymi skutkami napromieniowania i utrzymuje ich rezydującą populację komórek odpornościowych. Z drugiej strony, adoptywne BMT HSPC dla myszy niekondycjonowanych ma dodatkową zaletę, ponieważ zachowuje rodzimą niszę krwiotwórczą. W tym manuskrypcie opisujemy protokoły i wyniki wszczepienia HSPC po kilku schematach przeszczepu u myszy, w szczególności po dostarczeniu HSPC myszom TBI, myszom częściowo osłoniętym przed napromienianiem oraz myszom niekondycjonowanym. Ogólnym celem jest pomoc naukowcom w zrozumieniu różnych efektów fizjologicznych każdej metody, a także ich wpływu na wyniki eksperymentalne w warunkach CH i chorób sercowo-naczyniowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Wirginii.

1. Przed kondycjonowaniem wstępnym

  1. Umieść myszy biorcy w wodzie uzupełnionej antybiotykiem (5 mM sulfametoksazolu, 0,86 mM trimetoprimu) ~24 godziny przed napromienianiem. Jest to konieczne, aby zapobiec zakażeniu, ponieważ układ odpornościowy zostanie stłumiony po napromieniowaniu i utrzyma się przez 2 tygodnie po napromieniowaniu. W tym momencie uzupełnij myszy żelem odżywczym/nawadniającym, aby zachęcić do karmienia i zapobiec utracie wagi i odwodnieniu po napromienianiu.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Obrazy przedstawiające różne ustawienia kondycjonowania wstępnego. (A) Układ naświetlania całego ciała w klatce kołowej za pomocą promieniowania gamma (cez-137): Wiązka promieniowania pochodzi z tyłu promiennika w kierunku osi y (promieniowanie poziome). (B) Zestaw naświetlania całego ciała w klatce myszy za pomocą promieniowania rentgenowskiego: Klatkę myszy umieszcza się w komorze refleksyjnej. Wiązka promieniowania pochodzi z górnej części promiennika w kształcie stożka (promieniowanie pionowe). Odległość od źródła promieniowania do klatki wynosi 530 mm. (C) Regulowana taca w promienniku rentgenowskim: Ta konfiguracja służy do częściowo ekranowanego napromieniania za pomocą promieniowania rentgenowskiego. Wiązka promieniowania pochodzi z górnej części promiennika w kształcie stożka (promieniowanie pionowe). Odległość od źródła promieniowania do tacki wynosi 373 mm, a promień 250 mm. (D) Osłona klatki piersiowej: Znieczulone myszy umieszcza się na tacy. Myszy są umieszczane odwrócone do siebie w pozycji leżącej na plecach z całkowicie wyprostowanymi rękami i nogami. Dolny koniec ołowianej tarczy jest wyrównany z kością mieczykowo-mostkową, a górny koniec z grasicą. (E) Osłona brzucha: Znieczulone myszy umieszcza się tak, jak w ustawieniu osłaniającym klatkę piersiową, przy czym dolny koniec ołowianej osłony jest wyrównany z odbytem, a górny koniec poniżej przepony. (F) Ustawienie napromieniania osłaniającego głowę za pomocą promieniowania gamma (cez-137): Przednie łapy znieczulonej myszy są przyklejane taśmą, a mysz umieszcza się w stożkowym ograniczniku. ołowiana tarcza (oznaczona) zakrywa głowę i uszy myszy. Wiązka promieniowania pochodzi z tyłu promiennika w kierunku osi Y (promieniowanie poziome). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Wstępne kondycjonowanie myszy biorców (opcjonalnie)

  1. Napromienianie całego ciała
    1. Umieść myszy biorców w jednolicie pokrojonej klatce kołowej lub klatce mysiej w komorze refleksyjnej w promieniu obliczonym, aby otrzymać taką samą dawkę napromieniowania; jednak zaleca się maksymalnie 8 myszy na klatkę kołową i 5 myszy na klatkę dla myszy, aby zapewnić równomierne napromienianie (Rysunek 1A,B).
    2. Aby osiągnąć całkowitą mieloablację, należy upewnić się, że myszy biorcy otrzymują całkowitą dawkę promieniowania 11 Gy w dwóch frakcjach 5,5 Gy oddzielonych odstępem 4–24 godzin.
      UWAGA: Podczas gdy optymalne wszczepienie można uzyskać, stosując 4-godzinny odstęp między frakcjami, można go wydłużyć do 24-godzinnego odstępu, co może być pomocne, gdy poród i/lub promiennik jest niedostępny.
  2. Częściowo ekranowane napromieniowanie
    1. Znieczulić myszy biorcę przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (80-100 mg / kg) i ksylazyny (5-10 mg / kg). Ograniczenie ruchów myszy ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia równomiernego napromieniowania i skutecznej ochrony narządów docelowych podczas procesu ekranowania.
    2. W celu osłony klatki piersiowej i brzucha, skieruj wiązkę promieniowania promiennika promieniowania rentgenowskiego pionowo do myszy (Rysunek 1C).
      1. Umieść znieczulone myszy na płaskiej płycie, centrując źródło promieniowania od góry. Umieść myszy odwrócone do siebie w pozycji leżącej na plecach z całkowicie wyprostowanymi rękami i nogami (Rysunek 1D,E).
        UWAGA: Urządzenie do naświetlania promieniowania rentgenowskiego, w tym eksperymencie, pozwala na umieszczenie dwóch myszy jednocześnie w efektywnym promieniu, który umożliwia równomierne napromieniowanie. Podczas gdy efektywny promień jest obliczany na podstawie odległości między źródłem promieniowania a tacą, liczba zwierząt, które mogą być jednocześnie napromieniowane, będzie zależeć od konkretnego promiennika.
      2. Przymocuj łapy myszy do płytki za pomocą taśmy, aby upewnić się, że myszy są unieruchomione podczas procedury napromieniania. Umieść osłonę ołowiu tak, aby zakrywała obszary wymagające ochrony.
      3. Do ekranowania klatki piersiowej należy przygotować osłonę ołowianą, mierząc długość od kości mieczykowo-piersiowej myszy do grasicy i obliczając grubość, która zapewni wystarczającą ochronę przed źródłem promieniowania. Umieść osłonę ołowiu tak, aby dolny koniec zrównał się z kością mieczykowo-mostkową. Górny koniec bariery ołowianej zmieści się w pobliżu grasicy (Rysunek 1D).
      4. Do ekranowania brzucha należy przygotować osłonę ołowianą, mierząc długość od odbytu myszy do membrany i obliczając grubość, która zapewni wystarczającą ochronę przed źródłem promieniowania. Umieść osłonę przewodu tak, aby dolny koniec zrównał się z odbytem. Górny koniec osłony ołowianej zmieści się poniżej membrany (Rysunek 1E).
        UWAGA: Zlokalizowanie ołowianej tarczy tak, aby była spójna wśród kohort, może zmniejszyć pewne różnice w odniesieniu do wielkości myszy.
    3. W celu osłony głowy skieruj wiązkę promieniowania promiennika cezu poziomo na mysz.
      1. Ostrożnie przyklej przednie łapy znieczulonej myszy do brzucha. Dzięki temu ramiona otrzymują pełną dawkę napromieniowania i nie są zasłaniane przez osłonę.
      2. Aby osłonić głowę, umieść mysz w stożkowym ograniczniku, który mieści się w ołowianej osłonie. Gdy mysz znajdzie się w stożkowym ograniczniku, wsuń ogranicznik w szczelinę w osłonie ołowianej (Rysunek 1F). Ołowiana osłona powinna całkowicie zakrywać głowę i uszy myszy (~3,2 cm), pozostawiając resztę ciała myszy wystawioną na napromieniowanie. Położenie ogranicznika wewnątrz tarczy można dostosować do zwierząt różnej wielkości, przesuwając go dalej do środka lub na zewnątrz tarczy.
      3. Umieść myszy wewnątrz promiennika, prostopadle do źródła napromieniowania.
    4. Wystaw myszy na dwie frakcje napromieniowania 5,5 Gy (całkowita dawka 11 Gy) oddzielone odstępem 4-24 godzin.
    5. Po każdej frakcji napromieniania umieść klatki ze znieczulonymi myszami na podgrzewanych matach lub pod czerwonymi lampami grzewczymi, aby zapobiec hipotermii i pomóc w powrocie do zdrowia po znieczuleniu.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nie przegrzać znieczulonej myszy podczas korzystania z lampy, ponieważ nie mogą one uciec przed ciepłem. Jak opisano powyżej, ułożenie zwierząt i grubość osłony ołowianej mogą się różnić w zależności od badań w zależności od specyficznych cech promiennika (rodzaj promieniowania/kierunek wiązki itp.). Naukowcy będą musieli odpowiednio dostosować swoje eksperymenty.

3. Izolacja kości

UWAGA: Idealnie, myszy dawcy i biorcy powinny być w podobnym wieku i mieć około 8-12 tygodni. Preferowane jest użycie co najmniej 3 myszy jako dawców (zamiast jednego dawcy) w celu zminimalizowania heterogeniczności (nawet w przypadku korzystania z myszy o tym samym genotypie). Około 40 milionów niefrakcjonowanych komórek szpiku kostnego można uzyskać z sześciu kości (dwóch kości udowych, dwóch piszczeli i dwóch kości ramiennych) jednej myszy. Przeszczepienie 5 milionów komórek szpiku kostnego każdej myszy biorcy zazwyczaj zapewnia wszczepienie.

  1. Poddaj eutanazji myszy dawcom przez zwichnięcie szyjki macicy bez znieczulenia (preferowana metoda w celu uniknięcia chemicznego zanieczyszczenia komórek) i umieść każdą mysz na podkładce chłonnej.
  2. Zdezynfekuj skórę za pomocą sprayu z 70% etanolem.
  3. Wykonaj małe poprzeczne nacięcie w skórze poniżej klatki piersiowej i mocno trzymaj skórę po obu stronach nacięcia, rozerwij w przeciwnych kierunkach w kierunku głowy i stóp. Zdejmij skórę ze wszystkich kończyn.
  4. Przeciąć ramiona i stawy łokciowe i usunąć przyczepione mięśnie i tkanki łączne za pomocą Kimwipe, aby uzyskać kamifa
    5. .
  5. Ostrożnie zwichnij stawy biodrowe między kością udową a kośćmi biodrowymi. Użyj nożyczek, aby przeciąć wzdłuż głowy kości udowej i odczepić nogi. Przeciąć staw kolanowy, aby oddzielić kość udową i piszczelową, a następnie ostrożnie usunąć przyczepione mięśnie i tkanki łączne za pomocą Kimwipe, aby pobrać kość udową i piszczelową.
    UWAGA: Na tym etapie należy zwrócić szczególną uwagę, aby nasada kości pozostała nienaruszona. Wyrzuć wszelkie złamane kości z powodu utraty sterylności. Oprócz kości udowej, piszczelowej i ramiennej można zbierać kości biodrowe i kości kręgosłupa. Aby zebrać kości kręgosłupa, można użyć moździerza i tłuczka, aby zmiażdżyć kości na kawałki i zebrać komórki szpiku kostnego.
  6. Umieść wyizolowane kości myszy o tym samym genotypie w stożkowej probówce o pojemności odpowiednio 50 ml zawierającej 20 ml lodowato zimnego sterylnego PBS i trzymaj ją na lodzie do dalszego użycia. Zwróć szczególną uwagę, aby prawidłowo umieścić kości w rurkach o dopasowanych genotypach.
  7. Powtórz powyższe kroki dla każdego zwierzęcia dawcy zmieniającego rękawiczki pomiędzy każdą myszką. Ponadto wyczyść nożyczki i inne instrumenty z 70% etanolem między każdą myszką.

4. Izolacja komórek szpiku kostnego

UWAGA: Wykonaj następujące kroki w szafie bezpieczeństwa biologicznego klasy II.

  1. Przygotowanie zestawów probówek: Za pomocą igły 18 G wykonać mały otwór w dnie sterylnej probówki do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml i umieścić ją w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, która zawiera na dnie 100 μl lodowatego sterylnego PBS.
    UWAGA: Ponieważ w probówce do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml może zmieścić się tylko sześć kości, zaleca się przygotowanie wystarczającej liczby zestawów probówek do obróbki wszystkich kości w tym samym czasie.
  2. Odessać PBS i przenieść wyizolowane kości na sterylne naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm. Trzymając każdą kość za pomocą cienkich kleszczy, ostrożnie odetnij nasady z każdego końca za pomocą małych nożyczek, które zostały wysterylizowane w autoklawie. Umieść pocięte kości w przygotowanych zestawach probówek.
  3. Odwirować probówki o stężeniu 10 000 x g przez 35 s w temperaturze 4 °C.
  4. Po odwirowaniu potwierdzić, że szpik kostny został pomyślnie usunięty z kości. Kości powinny wydawać się białe i półprzezroczyste ze stosunkowo dużą czerwoną osadką na dnie probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wyrzuć probówkę do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml.
    UWAGA: Jeśli oględziny nie wykryją szpiku kostnego na dnie probówki o pojemności 1.5 ml, ponownie przetnij kość i powtórz krok 4.3.
  5. Ponownie zawiesić szpik kostny w 1 ml lodowatego PBS, a następnie przenieść zawiesinę komórkową z tego samego genotypu do dopasowanej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  6. Oddziel komórki, przepuszczając je przez igłę 18 G ze strzykawką 10 ml 10 razy.
  7. Zawiesiny pojedynczych komórek należy przefiltrować przez sitko o średnicy 70 μm. Dodać dodatkowy lodowaty PBS do końcowej objętości 10 ml i ponownie zawiesić komórki za pomocą delikatnego użycia pipety.
  8. Wirować przy 310 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 10 ml pożywki RPMI bez surowicy. Oszczędź 30 μl tego materiału do zliczania komórek.
  10. Określ stężenie komórek za pomocą licznika komórek i oblicz objętość zawiesiny komórek wymaganą do przeszczepu. W przykładzie 100% BMT wymagane jest 5 x 106 komórek szpiku kostnego dla każdej myszy biorcy.
    UWAGA: W przypadku konkurencyjnego BMT przygotuj łącznie 5 x 106 komórek szpiku kostnego zawierających mieszaninę komórek dawcy (np. CD45.2+) i komórek konkurencyjnych (np. CD45.1+). Zdecydowanie zaleca się przygotowanie dodatkowych komórek szpiku kostnego. Na przykład, jeśli w grupie eksperymentalnej jest 10 myszy biorców, zazwyczaj przygotowujemy wystarczającą ilość komórek dla 12 myszy biorców.
  11. Przenieść obliczoną objętość zawiesiny komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 310 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki przy użyciu obliczonej ilości pożywki RPMI bez surowicy, aby uzyskać odpowiednią gęstość i objętość komórek. Zazwyczaj 200 μl jest optymalną objętością do iniekcji retroorbitalnej.

5. Przeszczep komórek szpiku kostnego napromieniowanym myszom

  1. Znieczulij myszy biorcę 5% izofluranem.
  2. Podczas gdy myszy są znieczulane, powoli wstrzyknij 200 μl komórek szpiku kostnego do żyły zaoczodołowej za pomocą igły 28-30 G ze strzykawką insulinową.
    1. Alternatywnie można wykonać dostarczenie komórek dawcy za pomocą iniekcji dożylnej do żyły ogonowej i wstrzyknięcia śródszpikowego kości udowej, o maksymalnej objętości odpowiednio 0,2 ml i 25 μl.
  3. Po wstrzyknięciu komórek umieść kroplę kropli do oczu zawierających proparakainę na powierzchni oka, aby złagodzić ból. Zwierzę może wtedy odzyskać przytomność.

6. Przeszczep komórek szpiku kostnego myszom niekondycjonowanym

  1. Znieczulić myszy biorcę przez inhalację 5% izofluranu.
  2. Wstrzyknąć 5 x 106 niefrakcjonowanych komórek szpiku kostnego z dowolnego genotypu zaoczodoliście nienapromieniowanym myszom biorcom za pomocą strzykawki insulinowej 28-30 G.
  3. Powtórz kroki 6.1 i 6.2 przez 3 kolejne dni, tak aby myszom biorcom przeszczepiono łącznie 1,5 x 107 komórek szpiku kostnego.
    UWAGA: Ponieważ adopcyjne BMT bez procedury kondycjonowania wstępnego wymaga przeszczepu szpiku kostnego przez 3 kolejne dni, należy starać się zmieniać oczy przy każdym wstrzyknięciu.
  4. Po wstrzyknięciu należy podać kroplę kropli do oczu zawierających proparakainę do chorego oka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby porównać wpływ trzech metod BMT/pre-conditioningu na wszczepienie komórek dawcy, frakcje komórek dawcy we krwi obwodowej i tkance serca zostały przeanalizowane za pomocą cytometrii przepływowej w 1 miesiąc po BMT. Wyizolowane komórki wybarwiono pod kątem określonych markerów leukocytów w celu zidentyfikowania różnych podzbiorów leukocytów. W tych eksperymentach komórki szpiku kostnego dawcy typu dzikiego (WT) C57BL/6 (CD45.2) dostarczono do WT B6. SJL-Ptprc a myszy b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W badaniach hematopoezy klonalnej opisaliśmy trzy metody BMT: BMT z napromienianiem całego ciała, BMT z napromienianiem z częściowym ekranowaniem oraz rzadziej stosowaną metodę BMT, która nie obejmuje kondycjonowania wstępnego (adoptywne BMT). Metody te zostały wykorzystane do oceny wpływu hematopoezy klonalnej na choroby sercowo-naczyniowe. Badacze mogą odpowiednio modyfikować te metody, aby dopasować je do konkretnego celu swojego badania.

Modele hematopoezy klonalnej
H...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty US National Institutes of Health dla K. Walsha (HL131006, HL138014, and HL132564), dla S. Sano (HL152174), grant American Heart Association dla M. A. Evansa (20POST35210098) oraz grant Japan Heart Foundation dla H. Ogawy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikrowirówka 0,5 mlFisher Scientific05-408-121zapasy ogólne
Mikrowirówka 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
zapasy ogólne 1/2 cc STRZYKAWKA INSULINOWA O NISKIEJ DAWCEEXELINT26028ogólne
Alkohol etylowy absolutny (200 prfof)Fisher chemical200559zaopatrzenie ogólne
BD 1 ml Tuberkulina Strzykawki 25G 5/8 cala IgłaBecton Dickinson309626ogólne zaopatrzenie
Igła BD PrecisionGlide 18G (1,22 mm X 25 mm)Becton Dickinson395195ogólna dostawa
Grzejnik cezowy-137 J. L. Shepherd Sprzęt Mark IV
DietGel 76AClear H2O70-01-5022zaopatrzenie ogólne
Naczynie do hodowli komórkowych Falcon 100 mmNauki przyrodnicze353003zaopatrzenie ogólne
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 mlFisher Scientific352098ogólne zaopatrzenie
Sterylne sitka komórkowe Fisherbrand, 70 μ mFisher Scientific22363548ogólne zaopatrzenie
Graefe KleszczeFine Science Tools11051-10ogólne zaopatrzenie
Hartowane drobne nożyczkiFine Science Tools14090-09ogólne zaopatrzenie
Roztwór izotezji (izofluranu)Henry Schein29404roztwór
KetaminaZoetis043-304wtrysk
Wycieraczki Kimwipes Delicate TaskKimtech ScienceKCC34155ogólne zaopatrzenie
PBS pH7.4 (1X)Gibco10010023Solution
RadDisk – Dysk natchnienia gryzoniBraintree ScientificIRD-P M zaopatrzenieogólne
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093Medium
Sulfametoksazol i trimetoprimTEVA0703-9526-01iniekcja
KsylazynaAkorn139-236iniekcja
promiennik rentgenowskiŹródło Rad SprzętRS-2000
zaopatrzenie TC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
  2. Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
  3. Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
  4. Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25(2019).
  5. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
  6. Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
  7. Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
  8. Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
  9. Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204(2020).
  10. Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
  11. Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
  12. Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
  13. Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
  14. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
  15. Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
  16. Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
  17. Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
  18. Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
  19. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  20. Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079(2016).
  21. Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202(2019).
  22. Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
  23. Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
  24. Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
  25. Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
  26. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  27. Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
  28. Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
  29. Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
  30. Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
  31. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  32. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ca ocia a irradiacjaos ona radiacyjnaadopcyjny przeszczep szpiku kostnegocytometria przep yewowakom rki z deficytem Tet2przyjmowanie kom rek dawcyhematopoetyczne kom rki macierzystechoroby uk adu sercowo naczyniowego

Powiązane artykuły