Charakterystyka i przewidywanie funkcjonalne bakterii w tkankach jajnika

Summary

Przeprowadzono barwienie immunohistochemiczne i sekwencjonowanie genu 16S rybosomalnego RNA (genu 16S rRNA) w celu odkrycia i rozróżnienia bakterii w nowotworowych i nienowotworowych tkankach jajnika in situ. Różnice składowe i funkcjonalne bakterii przewidywano za pomocą BugBase i Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).

Abstract

Teoria "sterylnego" górnego układu rozrodczego kobiety spotyka się z rosnącym sprzeciwem ze względu na postęp w wykrywaniu bakterii. Jednak to, czy jajniki zawierają bakterie, nie zostało jeszcze potwierdzone. W tym miejscu przeprowadzono eksperyment mający na celu wykrycie bakterii w tkankach jajnika. Wybraliśmy pacjentki z rakiem jajnika w grupie nowotworowej oraz pacjentki nienowotworowe w grupie kontrolnej. Sekwencjonowanie genu 16S rRNA wykorzystano do odróżnienia bakterii w tkankach jajnika od grupy nowotworowej i kontrolnej. Ponadto przewidzieliśmy skład funkcjonalny zidentyfikowanych bakterii za pomocą BugBase i PICRUSt. Metoda ta może być również stosowana w innych wnętrznościach i tkankach, ponieważ w ostatnich latach udowodniono, że wiele narządów jest siedliskiem bakterii. Obecność bakterii w wnętrznościach i tkankach może pomóc naukowcom w ocenie tkanek nowotworowych i prawidłowych oraz może być pomocna w leczeniu raka.

Introduction

Ostatnio opublikowano coraz więcej artykułów dowodzących istnienia bakterii w litych wnętrznościach jamy brzusznej, takich jak nerki, śledziona, wątroba i jajniki^1,2. Geller i wsp. znaleźli bakterie w guzach trzustki, a bakterie te były oporne na gemcytabinę, lek chemioterapeutyczny². S. Manfredo Vieira i wsp. doszli do wniosku, że Enterococcus gallinarum przenosi się do węzłów chłonnych, wątroby i śledziony i może napędzać autoimmunizację³.

Ponieważ szyjka macicy pełni rolę obrońcy, bakterie w górnym żeńskim układzie rozrodczym, który zawiera macicę, jajowody i jajniki, zostały minimalnie zbadane. Jednak w ostatnich latach powstało kilka nowych teorii. Bakterie mogą mieć dostęp do jamy macicy podczas cyklu miesiączkowego z powodu zmian w mucynach^4,5. Ponadto Zervomanolakis i wsp. potwierdzili, że macica, wraz z jajowodami, jest pompą perystaltyczną kontrolowaną przez układ hormonalny jajników, a taki układ umożliwia bakteriom przedostanie się do błony śluzowej macicy, jajowodów i jajników⁶.

Górny układ rozrodczy nie jest już tajemnicą dzięki rozwojowi metod wykrywania bakterii. Verstraelen i in. zastosowali metodę sekwencjonowania sparowanych końców z kodem kreskowym do wykrycia bakterii macicy, celując w hiperzmienny region V1-2 genu 16S RNA⁷. Fang i wsp. zastosowali sekwencjonowanie z kodami kreskowymi u pacjentek z polipami endometrium i ujawnili obecność różnych bakterii wewnątrzmacicznych⁸. Dodatkowo, wykorzystując gen 16S RNA, Miles i wsp. oraz Chen i wsp. znaleźli bakterie w układzie płciowym kobiet, które przeszły odpowiednio resekcję jajników i histerektomię^5,9.

Bakterie w tkankach nowotworowych zyskują coraz większą uwagę w ostatnich latach. Banerjee i wsp. odkryli, że sygnatura mikrobiomu różniła się między pacjentkami z rakiem jajnika a pacjentkami z grupy kontrolnej¹⁰. Noxynatronum sibiricum był związany ze stadium nowotworu, a Methanosarcina vacuolata może być stosowana do diagnozowania raka jajnika¹¹. Oprócz raka jajnika udowodniono, że inne nowotwory, takie jak rak żołądka, płuc, prostaty, piersi, szyjki macicy i endometrium, są związane z bakteriami^{12,13,14,15,16,17,18}. Poore i wsp. zaproponowali nową klasę diagnostyki onkologicznej opartej na drobnoustrojach, przewidując badania przesiewowe we wczesnym stadium raka¹⁹. W tym protokole zbadaliśmy różnice między nowotworowymi a normalnymi tkankami jajnika, porównując skład i funkcję bakterii w tych dwóch tkankach.

Przeprowadzono barwienie immunohistochemiczne i sekwencjonowanie genu 16S rRNA, aby potwierdzić obecność bakterii w jajnikach. Badano różnice i przewidywane funkcje bakterii jajnika w nowotworowych i nienowotworowych tkankach jajnika. Wyniki wykazały obecność bakterii w tkankach jajnika. Anoxynatronum sibiricum i Methanosarcina vacuolata były związane odpowiednio ze stopniem zaawansowania i rozpoznaniem raka jajnika. Porównano czterdzieści sześć znacząco różniących się ścieżek KEGG, które były obecne w obu grupach.

Protocol

To badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Instytucji Medycznej Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Xi'an Jiaotong (No. XJTUIAF2018LSK-139). Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich pacjentów włączonych do badania.

1. Kryteria wejścia do grupy nowotworowej i grupy kontrolnej

1. Do grupy nowotworowej należy zapisać pacjentki, u których zdiagnozowano przede wszystkim raka jajnika, a po laparotomii udowodniono u nich surowiczego raka jajnika na podstawie zmian patologicznych.
2. Do grupy kontrolnej należy włączyć pacjentki, u których zdiagnozowano przede wszystkim mięśniaka macicy lub adenomiozę macicy, u których nie występują żadne choroby jajników, oraz które przeszły histerektomię i resekcję jajników.
   UWAGA: Ten standard nie jest ostateczny. Do badania mogą również zostać włączone pacjentki z chorobami niewpływającymi na jajniki, które przechodzą histerektomię i resekcję jajników.
3. Wykluczyć pacjentów z co najmniej jednym z następujących kryteriów:
   Kobiety w ciąży lub karmiące piersią.
   Przyjmowanie antybiotyków na 2 miesiące przed zabiegiem.
   Gorączka lub podwyższone markery stanu zapalnego.
   Posiadanie jakiegokolwiek rodzaju stanu zapalnego.
   Po przejściu chemioterapii neoadjuwantowej.

2. Zbierz próbki

1. Podczas zabiegu należy umieścić wycięte jajniki w sterylnej probówce i umieścić rurkę w ciekłym azocie do transportu. Unikaj dotykania czegokolwiek innego przez cały czas trwania procedury.
2. Podziel jajniki na próbki tkanek o grubości około 1 cm za pomocą nowej sterylnej pęsety pod komorą o przepływie laminarnym. Po rozdzieleniu próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Wszystkie procedury pobierania próbek są aseptyczne, w tym oddzielanie jajników.

3. Sekwencjonowanie genu 16S rRNA

1. Ekstrakcja DNA.
   1. Dodać 1,2 ml buforu inhibit EX do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. Następnie dodaj 180-220 mg próbek do probówki. Pozostawić próbkę do całkowitego wymieszania (łaźnia wodna w temperaturze 70 °C przez 5 minut, a następnie wirować przez 15 sekund).
   2. Wirować probówkę przez 1 minutę przy 600 x g.
   3. Umieścić 550 μl supernatantu w nowej probówce o pojemności 1,5 ml i odwirowywać przez 1 minutę przy 600 x g.
   4. Przenieść 400 μl supernatantu z 30 μl proteinazy K do innej probówki o pojemności 1,5 ml.
   5. Dodać 400 μl buforu AL i używać mieszalnika wirowego przez 15 s.
   6. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
   7. Dodaj 400 μl 96-100% alkoholu. Użyj miksera wirowego przez 15 sekund.
   8. Przenieść 600 μl mieszaniny do kolumny absorpcyjnej i wirować przez 1 minutę przy 13700 g. Wymień dolną probówkę. Powtórz ten krok 11 razy.
   9. Dodać 500 μl buforu AW1, odwirowywać przez 1 minutę przy 13 700 x g i wymienić dolną probówkę.
   10. Dodać 500 μl buforu AW2, odwirowywać przez 3 minuty przy 13 700 x g i wymienić dolną probówkę.
   11. Wirować przez 3 minuty przy 13 700 x g.
   12. Przenieść mieszaninę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, dodać 200 μl buforu ATE, inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i wirować przez 1 minutę przy 13 700 x g.
2. Testowanie jakości. Użyj 1% elektroforezy w żelu Sepharose, aby przetestować jakość. Dodać 400 ng próbki, 120 V, 30 minut. Idealny wynik: stężenie DNA: ≥ 10 ng/μL, czystość DNA: A260/A280 = 1,8-2,0, zawartość DNA brutto: ≥ 300 ng.
3. Przygotuj biblioteki za pomocą zestawu do sekwencjonowania metagenomicznego 16S zgodnie z protokołem producenta.
   1. Wykonaj PCR. Krótko mówiąc, każda reakcja PCR o pojemności 25 μl zawiera 12,5 ng próbki DNA jako dane wejściowe, 12,5 μl 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix i 5 μl każdego startera przy 1 μM.
   2. Przeprowadzić PCR przy użyciu następującego protokołu: początkowy etap denaturacji wykonywany w temperaturze 95°C przez 3 minuty, następnie 25 cykli denaturacji (95°C, 30 s), wyżarzania (55°C, 30 s) i przedłużania (72°C, 30 s) oraz końcowe wydłużenie trwające 5 minut w temperaturze 72°C.
   3. Oczyść produkt PCR z mieszaniny reakcyjnej za pomocą kulek magnetycznych, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
   4. Powtórz kroki 3.3.1 i 3.3.2.
   5. Testowanie jakości. Zapoznaj się z krokiem 3.2.
   6. Powtórz krok 3.3.3.
   7. Testowanie jakości. Użyj 1% elektroforezy w żelu sefarozy do zbadania zanieczyszczeń, spektrofotometru do sprawdzenia czystości, fluorometru do zbadania stężenia oraz zestawu do oznaczania RNA do sprawdzenia integralności. Postępuj zgodnie z protokołem producenta. Normalizacja i pulowanie bibliotek; Następnie sekwencjonuj (ustawienie odczytu sparowanego końca 2 x 300 bp) przy użyciu standardowych komórek przepływowych V3 z 600 cyklami, wytwarzając około 100 000 sparowanych odczytów 2 x 300 podstawowych.
      UWAGA: Sekwencje starterów o pełnej długości: 16S Amplicon reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) Starter do przodu: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGA GACAG-[CCTACGGGGGGCWGCAG] i 16S Amplicon PCR Reverse starter: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].

4. Analizuj dane sekwencjonowania genu 16S rRNA

1. Filtruj surowe odczyty każdej próbki w oparciu o jakość sekwencjonowania za pomocą pakietu oprogramowania QIIME 2-201802²⁰.
   1. Skopiuj trzy pliki do katalogu: emp-paired-end-sequences_01
      Jeden plik forward.fastq.gz zawierający sekwencję przekazywania ma następującą postać:
      Jeden plik reverse.fastq.gz, który zawiera odwrotną sekwencję, brzmi
      Jeden plik barcodes.fastq.gz, który zawiera skojarzony kod kreskowy, odczytuje
   2. Wykonaj
      qiime tools import \
      --type EMPPairedEndSequences \
      --ścieżka-wejściowa emp-sparowany-koniec-sequences_01 \--ścieżka-wyjściowa emp-sparowany-koniec-sequences_02.qza
2. Usuń sekwencje podkładu i adaptera.
   Qime CutAdapt Trim-Pair \
   --i-demultiplexed-sequences demultiplexed-seqs_02.qza \
   --p-front-f GCTACGGGGGG \
   --p-front-r GCTACGGGGGG \
   --p-stopa-błędów 0 \
   --odcięcie jakości 25 \
   --o-trimmed-sequences przycięte-seqs_03.qza \
   --gadatliwy
3. Skróć odczyty sekwencji, w których obie jakości sparowanego końca są niższe niż 25. Patrz wyżej --quality-cutoff 25
4. Przeanalizuj dane sekwencjonowania.
   1. Zbierz sekwencje, aby utworzyć operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) z punktem odcięcia podobieństwa na poziomie 97%.
      qiime vsearch dereplicate-sequences \
      --i-sekwencje przycięte-seqs_03.qza \
      --o-dereplicated-table table_04.qza \
      --o-dereplicated-sequences rep-seqs_04.qza
      
      qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
      --i-table table_04.qza \
      --i-sekwencje rep-seqs_04.qza \
      --i-sekwencje-referencyjne 97_otus.qza \
      --p-perc-identity 0.97 \
      --o-tabela-klastrowa tabela-cr-97.qza \
      --o-clustered-sequences rep-seqs-cr-97.qza \
      --o-niedopasowane-sekwencje niedopasowane-cr-97.qza
   2. W przypadku OTU należy obliczyć względną liczebność w każdej próbce. Informacje o obfitości znajdują się w table-cr-97.qza
5. Zastosuj natywny klasyfikator bayesowski, który ma na celu zestaw treningowy RDP (wersja 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), aby posortować wszystkie sekwencje. Mapowane informacje o taksonach znajdują się w table-cr-97.qza
6. W ramach danej OTU przypisz klasyfikację, która odzwierciedla główną spójność sekwencji do OTU. Następnie wyrównaj OTU. Patrz tabela-cr-97.qza i rep-seqs-cr-97.qza
7. Na podstawie informacji o grupie próbki wykonaj analizę różnorodności alfa (w tym indeksy Chao 1, ACE, Shannona, Simpsona i Evenness) oraz analizę głównych współrzędnych (PCoA) opartą na UniFrac.
   Eksport narzędzi qiime \
   --ścieżka-wejściowa tabela-cr-97.qza \
   --ścieżka-wyjściowa tabela-funkcji-eksportu
   tabela-funkcji-eksportu
   
   qiime różnorodność alfa \
   --i-table table-cr-97.qza \
   --p-metric observed_otus \
   --o-alpha-różnorodność observed_otus_vector.qza
   
   qiime różnorodność beta \
   --i-table table-cr-97.qza \
   --p-metric braycurtis \
   --o-matryca-odległości unweighted_unifrac_distance_matrix.qza

5. Przewidywanie funkcji bakterii

1. Aby przewidzieć powiązaną reprezentację cech bakterii, użyj BugBase²¹. Wejściowa tabela OTU dla BugBase jest przygotowywana za pomocą następujących poleceń.
   biom convert -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
   biom convert -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="Tabela OTU" --to-json
   UWAGA: Prognoza opiera się na sześciu kategoriach fenotypu (Ward i wsp. niepublikowane) (https://bugbase.cs.umn.edu/): barwienie metodą Grama, tolerancja tlenu, zdolność do tworzenia biofilmów, zawartość pierwiastków ruchomych, patogenność i tolerancja stresu oksydacyjnego.
2. Przewidywanie składu funkcjonalnego metagenomu za pomocą PICRUSt przy użyciu danych genów markerowych i bazy danych zawierającej genomy referencyjne²².
   make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
   normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
   predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
   categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
   categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1.txt
3. Przeanalizuj różnice w funkcjach między każdą grupą za pomocą STAMP^23,24. Zapoznaj się z cytatami, aby zapoznać się z oprogramowaniem.

6. Dane

1. Użyj oprogramowania statystycznego, aby obliczyć istotność wyników. Wskazanie istotności statystycznej powinno być ustalone jako P < 0,05.
2. Oceń różnice w wieku i parytecie za pomocą testu t-Studenta. Oceń różnice w stanie menopauzy, historii nadciśnienia tętniczego i cukrzycy za pomocą testu chi-kwadrat. Oceń różnice w liczbie taksonów bakteryjnych jajników za pomocą testu U Manna-Whitneya.

Results

Pacjenci
Do badania włączono łącznie 16 zakwalifikowanych pacjentów. Grupą kontrolną objęto 10 kobiet z rozpoznaniem łagodnego guza macicy (wśród nich u 3 pacjentek rozpoznano mięśniaka macicy, a u 7 pacjentek rozpoznano adenomiozę macicy). Z kolei w grupie onkologicznej znalazło się 6 kobiet z rozpoznaniem surowiczego raka jajnika (wśród nich u 2 pacjentek rozpoznano II stopień zaawansowania, a u 2 III stopnia). Następujące cechy nie wykazały różnic między pacjentkami w grupie kontrolnej i grupie no...

Discussion

Rak jajnika ma znaczący wpływ na płodność kobiet²⁵. Większość pacjentek z rakiem jajnika jest diagnozowana w późnym stadium, a wskaźnik 5-letniego przeżycia wynosi mniej niż 30%¹⁸. Opublikowano potwierdzenie obecności bakterii w litych wnętrznościach jamy brzusznej, w tym w wątrobie, trzustce i śledzionie. Istnienie bakterii w górnych drogach rodnych kobiet występuje, ponieważ szyjka macicy nie jest zamknięta 2,3,4,5.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oprogramowanie 2200 TapeStation	Agilgent Stany Zjednoczone
AmpliSeq do przygotowywania, indeksowania i akcesoriów do biblioteki Illumina
Image-pro plus 7	Media Cybernetyka
Leica ASP 300S	Dział Leica Biosystems firmy Leica Microsystems
Leica EG 1150	Leica Biosystems Oddział Leica Microsystems
Leica RM2235	Leica Biosystems Division of Leica Microsystems
LPS Core przeciwciało monoklonalne, klon WN1 222-5	Kulki magnetyczne Hycult Biotech
Mag-Bind RxnPure Plus	Zestaw Omega Biotek	M1386-00
Mag-Bind Universal Pathogen 96	Omega Biotek	M4029-01
MiSeq	Illumina	SY-410-1003
Silva baza danych Instytut	Mikrobiologii Morskiej im. Maxa Plancka i Uniwersytet
System dsDNA QuantiFluor	Promega	E2670
Trimmomatic	Bjö rn Usadel
ZytoChem Plus (HRP) Zestaw przeciw królikom (DAB)	Zytomed Systems	HRP008DAB-RB