Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61884

⸱

27 października 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Division, Instituto Nacional de Perinatologia, 2Department of Immunobiochemistry, Instituto Nacional de Perinatologia, 3Department of Obstetrics, Instituto Nacional de Perinatologia, 4Department of Academic Programs and Continuing Education, Instituto Nacional de Perinatologia, 5Department of Infectology and Immunology, Instituto Nacional de Perinatologia, 6Clinical Research Branch, Instituto Nacional de Perinatologia, 7Department of Nutrition and Bioprogramming, Instituto Nacional de Perinatologia, 8Department of Human Genetics and Genomics, Instituto Nacional de Perinatologia, Mexico City, Mexico

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia efektywną metodę trawienia kolagenazy do izolacji żywotnych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu - SVF z ludzkiego tłuszczu trzewnego w jednym procesie, w tym metodologię uzyskiwania wysokiej jakości RNA z adipocytów i fenotypyfikację makrofagów SVF poprzez barwienie wielu markerów związanych z błoną do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Trzewna tkanka tłuszczowa (VAT) to aktywny narząd metaboliczny złożony głównie z dojrzałych adipocytów i komórek zrębu frakcji naczyniowej (SVF), które uwalniają różne bioaktywne cząsteczki, które kontrolują procesy metaboliczne, hormonalne i odpornościowe; obecnie nie jest jasne, jak te procesy są regulowane w tkance tłuszczowej. Dlatego kluczowe jest opracowanie metod oceniających udział każdej populacji komórek w patofizjologii tkanki tłuszczowej. Protokół ten opisuje etapy izolacji i zawiera niezbędne wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów w celu skutecznej izolacji żywotnych dojrzałych adipocytów i SVF z ludzkich biopsji VAT w jednym procesie, przy użyciu techniki trawienia enzymatycznego kolagenazy. Co więcej, protokół jest również zoptymalizowany pod kątem identyfikacji podzbiorów makrofagów i izolacji dojrzałego RNA adipocytów do badań ekspresji genów, co pozwala na przeprowadzenie badań analizujących interakcje między tymi populacjami komórek. Krótko mówiąc, biopsje VAT są myte, mielone mechanicznie i trawione w celu wytworzenia zawiesiny jednokomórkowej. Po odwirowaniu dojrzałe adipocyty są izolowane przez flotację z osadu SVF. Protokół ekstrakcji RNA zapewnia wysoką wydajność całkowitego RNA (w tym miRNA) z adipocytów do dalszych testów ekspresji. Jednocześnie komórki SVF są wykorzystywane do charakteryzowania podzbiorów makrofagów (fenotyp pro- i przeciwzapalny) poprzez analizę cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

Biała tkanka tłuszczowa składa się nie tylko z komórek tłuszczowych lub adipocytów, ale także z frakcji komórek beztłuszczowych znanej jako frakcja naczyniowa zrębu (SVF), która zawiera heterogeniczną populację komórek składającą się z makrofagów, innych komórek odpornościowych jako regulatorowych limfocytów T (Treg) oraz eozynofili, preadipocytów i fibroblastów, otoczonych tkanką naczyniową i łączną1,2. Tkanka tłuszczowa (AT) jest obecnie uważana za narząd, który reguluje procesy fizjologiczne związane z metabolizmem i stanem zapalnym poprzez adipokiny, cytokiny i mikroRNA wytwarzane i uwalniane przez różne komórki do tkanki, z efektem autokrynnym, parakrynnym i endokrynologicznym3,4. U ludzi biała tkanka tłuszczowa składa się z podskórnej tkanki tłuszczowej (SAT) i trzewnej tkanki tłuszczowej (VAT), z istotnymi różnicami anatomicznymi, molekularnymi, komórkowymi i fizjologicznymi między nimi2,5. SAT stanowi do 80% ludzkiego AT, podczas gdy VAT znajduje się w jamie brzusznej, głównie w krezce i sieci komórkowej, będąc metabolicznie bardziej aktywnym6. Ponadto VAT jest narządem endokrynnym, który wydziela mediatory mające istotny wpływ na masę ciała, wrażliwość na insulinę, metabolizm lipidów i stan zapalny. W związku z tym akumulacja podatku VAT prowadzi do otyłości brzusznej i chorób związanych z otyłością, takich jak cukrzyca typu 2, zespół metaboliczny, nadciśnienie i ryzyko chorób sercowo-naczyniowych, co stanowi lepszy predyktor śmiertelności związanej z otyłością6,7,8,9.

W warunkach homeostazy adipocyty, makrofagi i inne komórki odpornościowe współpracują w celu utrzymania metabolizmu VAT poprzez wydzielanie mediatorów przeciwzapalnych10. Jednak nadmierna ekspansja VAT sprzyja rekrutacji aktywowanych limfocytów T, komórek NK i makrofagów. W rzeczywistości w szczupłym podatku VAT stosunek makrofagów wynosi 5%, podczas gdy stosunek ten wzrasta do 50% w otyłości, z polaryzacją makrofagów od fenotypu przeciwzapalnego do prozapalnego, generując przewlekłe środowisko zapalne10,11.

W wyniku pandemii otyłości, pojawiła się zdumiewająca liczba raportów dotyczących różnych tematów badawczych związanych z podatkiem VAT, w tym między innymi biologii adipocytów, epigenetyki, stanów zapalnych, właściwości endokrynologicznych i pojawiających się obszarów, takich jak pęcherzyki zewnątrzkomórkowe10,12,13. Jednakże, chociaż środowisko VAT jest definiowane przez przesłuch między adipocytami a makrofagami rezydentnymi lub przybywającymi, większość badań koncentrowała się tylko na jednej populacji komórek i istnieje niewiele informacji na temat interakcji tych komórek w VAT i ich patofizjologicznych konsekwencjach11,14. Co więcej, przeprowadzono cenne badania dotyczące interakcji adipocytów-makrofagów w AT przy użyciu linii komórkowych, w których nie występowały warunki wstępowania in vivo11,14,15. Właściwa strategia analizy interakcji lub szczególnego udziału tych komórek w podatku VAT wymaga izolacji obu typów komórek z tej samej biopsji tłuszczu w celu przeprowadzenia testów in vitro, które jak najbardziej odzwierciedlają właściwości in vivo, które regulują metabolizm oparty na podatku VAT.

Chociaż metody dysocjacji nieenzymatycznej, oparte na siłach mechanicznych do rozbijania AT, zapewniają minimalną manipulację, te metody nie mogą być używane, jeśli celem jest badanie komórek SVF, ponieważ mają one niższą wydajność w odzyskiwaniu komórek i niską żywotność komórek w porównaniu do metod enzymatycznych, a potrzebna jest większa objętość tkanki16,17. Trawienie enzymatyczne przy użyciu kolagenazy jest łagodną metodą, która umożliwia odpowiednie trawienie kolagenu i białek macierzy zewnątrzkomórkowej tkanek włóknistych, takich jak WAT18 i jest często stosowana, gdy trypsyna jest nieskuteczna lub szkodliwa19. Protokół zawiera podstawowe wytyczne dotyczące rozwiązywania problemów w celu skutecznej izolacji żywotnych dojrzałych adipocytów i komórek SVF z ludzkich biopsji VAT w jednym procesie, przy użyciu techniki trawienia enzymatycznego kolagenazy, dostarczając informacji zapewniających wysoką wydajność (ilość, czystość i integralność) całkowitego RNA z dojrzałych adipocytów, w tym mikroRNA, do dalszych zastosowań ekspresyjnych. Jednocześnie protokół jest zoptymalizowany pod kątem identyfikacji podzbiorów makrofagów z komórek SVF poprzez barwienie wielu markerów związanych z błoną w celu dalszej analizy za pomocą cytometrii przepływowej20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez IRB Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). Udział był dobrowolny, a wszystkie zarejestrowane kobiety podpisały formularz świadomej zgody.

1. Pobieranie trzewnej tkanki tłuszczowej

  1. Uzyskaj biopsje VAT poprzez częściową omentektomię podczas cesarskiego cięcia od zdrowych dorosłych kobiet z ciążą pojedynczą w terminie bez porodu.
  2. Po zamknięciu macicy i hemostazie przystąp do identyfikacji sieci większej i przedłuż ją na mokrym kompresie. Wystawiony podatek VAT to podatek VAT.
  3. Zlokalizuj największe naczynie krwionośne i prześledź wyimaginowaną linię o wymiarach 7 x 5 cm do większej podstawy sieci komórkowej.
  4. Zidentyfikuj strefę beznaczyniową i użyj kleszczy Kelly'ego, aby wywiercić zewnętrzną stronę VAT.
  5. Za pomocą kleszczy Ochsnera zaciśnij bliższą i dalszą stronę w strefie, w której wiercono VAT, a do przecięcia tkanki użyj nożyczek Metzenbaum.
  6. Zawiąż większą sieć z czarnym jedwabiem numer 1.
  7. Usuń kleszcze Ochsnera i oceń hemostazę.
  8. Umieść biopsję VAT w sterylnym pojemniku i natychmiast przetransportuj ją do laboratorium.

2. Trawienie enzymatyczne trzewnej tkanki tłuszczowej oraz izolacja dojrzałych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu

  1. Zważ biopsję VAT i spłucz 1x PBS pH 7,4.
  2. Pokrój 4 g VAT i użyj nożyczek, aby zmielić tkankę na małe kawałki na tacy do sekcji.
  3. Przenieś zmielony podatek VAT do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, dodaj 20 ml PBS i delikatnie wstrząśnij, aby usunąć nadmiar czerwonych krwinek.
  4. Odrzuć PBS i powtórz procedurę dwukrotnie.
  5. Przenieś podatek VAT do nowej sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodaj 25 ml roztworu wytrawiającego (0,25% kolagenazy typu II, 5 mM glukozy, 1,5% albuminy w PBS).
  6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 125 obr./min.
  7. Przefiltruj strawioną tkankę przez trzy warstwy gazy do nowej sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  8. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Uzyskuje się dwie fazy, górną fazę, która odpowiada dojrzałym adipocytom, podczas gdy komórki SFV pozostają w osadzie. Delikatnie przenieś dojrzałe adipocyty do nowej sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą pipety do przenoszenia.
  10. Dodać 20 ml zimnego PBS, delikatnie wstrząsnąć i odwirować w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Odrzuć PBS i powtórz procedurę dwukrotnie.
  12. Użyj pipety transferowej, aby delikatnie przenieść dojrzałe adipocyty do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej wolnej od DNazy-RNazy.
  13. Wirować przy 200 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i usunąć nadmiar PBS za pomocą mikropipety P200. Powtórz ten krok, jeśli jest to konieczne.
  14. Delikatnie przenieś 300 μl dojrzałej zawiesiny adipocytów do 1,5 ml probówek mikrowirówkowych wolnych od DNazy-RNaz. Dojrzałe adipocyty należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu ekstrakcji RNA.
    UWAGA: Adipocyty nie tworzą osadu.
  15. Po oddzieleniu adipocytów (krok 2.9) odessać większość roztworu wytrawiającego za pomocą pipety transferowej, trzymając granulki SVF na dnie probówki.
  16. Przenieś osad z komórkami SVF do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą pipety transferowej.
  17. Delikatnie przemyć granulki komórek, ponownie zanurzając je w 20 ml zimnego 1x PBS, pipetując w górę iw dół.
  18. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i szybko odrzucić supernatant przez dekantację.
  19. Wykonaj drugie pranie, powtarzając kroki 2.17 i 2.18.
  20. Dodać 5 ml buforu do lizy czerwonych krwinek o temperaturze pokojowej (RT) do osadu SVF i zawiesić przez wielokrotne pipetowanie. Nie wirować.
  21. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odwirowywać przez 5 minut przy 800 x g. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety transferowej i odpowiednio zutylizować.
  22. Aby zneutralizować bufor do lizy, dodaj 10 ml zimnego 1x PBS i delikatnie mieszaj, aż osad komórkowy ulegnie delegacji.
  23. Wirować przy 800 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad SVF i wyrzucić PBS. Na dnie rurki powinien być widoczny biały granulek.
  24. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej przez wielokrotne pipetowanie i przefiltrować przez trzy warstwy gazy do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie komórki te zostaną wykorzystane do scharakteryzowania subpopulacji makrofagów za pomocą cytometrii przepływowej.

3. Ekstrakcja RNA z dojrzałych adipocytów

  1. Przygotuj czysty obszar, używając sprayu do odkażania RNazy, aby uniknąć degradacji RNA. Użyj zestawu pipet zarezerwowanych do zabiegów RNA. Wszystkie zastosowane rurki i końcówki powinny być wolne od RNaz.
  2. Rozmrozić dojrzałą zawiesinę adipocytów (sekcja 2.14) w temperaturze 4 °C, jeśli była przechowywana w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
  3. Poddać lizie komórki, dodając 1,000 μl odczynnika na bazie kwasu, guanidyny-fenolu i dokładnie wymieszać za pomocą mikropipety P1000 w celu homogenizacji.
  4. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby zwiększyć dysocjację kompleksów nukleoproteinowych.
  5. Odwirować lizat komórkowy przez 5 minut przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej. Otrzymane zostaną trzy fazy: faza górna (żółta) odpowiadająca lipidom adipocytów, faza środkowa (różowa) odpowiadająca kwasom nukleinowym oraz osadka (szczątki komórkowe).
  6. Ostrożnie usuń warstwę lipidową za pomocą mikropipety P200.
  7. Przenieś środkową fazę do nowej probówki o pojemności 2 ml, unikając zaburzania pozostałości lipidów i osadów (około 700 μl).

4. Oczyszczanie całkowitego RNA, w tym mikroRNA

UWAGA: Metoda oczyszczania całkowitego RNA oparta na kolumnach jest używana do uzyskania wysokiej jakości całkowitego RNA.

  1. Dodać równą objętość etanolu (95%–100%) do próbki z sekcji 3.7, około 700 μl, i mieszać ręcznie, odwracając probówkę przez 10 sekund.
  2. Przenieść 700 μl mieszaniny do kolumny umieszczonej w probówce zbiorczej, odwirować i odrzucić przepływ.
  3. Załaduj ponownie kolumnę i powtórz krok 4.2.
  4. Przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej.
  5. Dodać 400 μl buforu do płukania wstępnego do kolumny i odwirować. Odrzuć przepływ i powtórz ten krok.
  6. Dodać 700 μl buforu do przemywania do kolumny i wirować przez 2 minuty.
  7. Ostrożnie przenieść kolumnę do probówki wolnej od nukleazy.
  8. Dodaj 50 μl wody wolnej od nukleaz bezpośrednio do matrycy kolumny i eluuj RNA przez odwirowanie. Przygotować porcje po 10 μl za pomocą probówek do mikrofuge o pojemności 200 μl.
  9. Natychmiast umieść podwielokrotności na lodzie i użyj jednego z nich do określenia stężenia i czystości RNA.
  10. Przygotować porcję 5 μl całkowitego RNA dostosowaną do 100 ng/μl w celu zmierzenia integralności RNA i stężenia mikroRNA.
  11. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

5. Oznaczanie koncentracji, czystości i integralności RNA dojrzałych adipocytów; test kwantyfikacji mikroRNA

UWAGA: Oznaczanie stężenia i czystości RNA odbywa się za pomocą spektrofotometru UV-Vis; Integralność RNA i kwantyfikacja miRNA są przeprowadzane za pomocą analizatora kontroli jakości RNA.

  1. Umyj czytnik próbek wodą molekularną i wytrzyj.
  2. Załaduj 2 μl wody elucyjnej (ślepej), zmień ustawienie na RNA i kliknij przycisk Blank.
  3. Załaduj 2 μl próbki i kliknij przycisk Zmierz.
  4. Po zakończeniu odczytu zapisz proporcje A260/A280 i A260/A230, a także ilość RNA (ng/μL) (Rysunek 1A).
    UWAGA: RNA o stosunku OD260/OD280 i OD260/OD230 około 2,0 jest uważane za czyste.
  5. Zmierz liczbę integralności RNA (RIN) za pomocą zestawu do integralności RNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (Rysunek 1B).
    UWAGA: RIN = 10 odpowiada nienaruszonemu RNA, podczas gdy RIN ≤ 3.0 wskazuje na silnie zdegradowany RNA. W przypadku mikromacierzy ekspresyjnych lub RT-qPCR należy użyć RNA z RIN ≥ 6.0.
  6. Użyj małego zestawu RNA, aby określić stężenie i procent mikroRNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (Rysunek 1C).
    UWAGA: Aby uniknąć przeszacowania małych i mikro RNA, należy używać próbek RNA o RIN ≥ 6.0.

6. Liczba i żywotność komórek frakcji zrębu naczyniowego

  1. Rozcieńczyć 10 μl zawiesiny komórek SVF (sekcja 2.24) w 90 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego (końcowe rozcieńczenie 1:10) i nałożyć 10 μl na standardowy hemocytometr.
  2. Dokładnie policz żywe komórki, z wyłączeniem martwych komórek, w czterech kwadratach w rogu komory liczącej.
  3. Określ stężenie komórek obecnych w oryginalnej zawiesinie: Stężenie komórek = Całkowita liczba komórek/4 x współczynnik rozcieńczenia (10) x 10 000 = Komórki/ml
  4. Aby obliczyć uzyskaną wydajność komórkową (komórki na gram tkanki), należy pomnożyć stężenie komórkowe przez pierwotną całkowitą objętość próbki (w ml) i podzielić przez masę strawionej tkanki (w gramach).
  5. Oceń żywotność komórek jako procent żywych komórek w następujący sposób: % żywotności = (liczba żywotnych komórek / całkowita liczba komórek) x 100.

7. Charakterystyka podzbiorów makrofagów z frakcji naczyniowej zrębu

  1. Przenieść łącznie 1 x 106 komórek SVF/ml do okrągłodennej probówki testowej z polipropylenu o pojemności 5 ml do cytometrii przepływowej i komórek osadkowych przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Ostrożnie wymieszać, aby poluzować osad i ponownie zawiesić komórki w 100 μl 1x PBS w temperaturze pokojowej.
  3. Dodać wstępnie miareczkowane optymalne stężenie każdego przeciwciała monoklonalnego sprzężonego z fluorochromem specyficznego dla antygenu powierzchniowego komórki; delikatnie wymieszać i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać nadmiar zimnego 1x PBS (≈ 1 ml) i odwirować SVF przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Supernatanty należy szybko odrzucić przez dekantację. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu.
  6. Dodać 500 μl 1x roztworu lizującego i inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc probówki przed bezpośrednim światłem.
  7. Usunąć roztwór po odwirowaniu w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i przechowywać w temperaturze 2–8 °C w ciemności do czasu uzyskania danych.
  8. Dokładnie wymieszaj komórki z niską prędkością, aby zmniejszyć agregację przed uzyskaniem.
  9. Ponownie zawiesić osad SVF w 5 ml płynu osłonowego w temperaturze pokojowej, a następnie przefiltrować przez trzy warstwy gazy do nowej 5 ml okrągłodennej probówki polipropylenowej przed analizą za pomocą cytometrii przepływowej, aby zmniejszyć zatykanie linii sortera komórek.
  10. Krótko wymieszaj każdą rurkę przed analizą.
  11. Pozyskaj dane z interesujących Cię próbek. W przypadku analizy przepływu policz co najmniej 10 000 zdarzeń.
    UWAGA: Jeśli używasz cytometru przepływowego do sortowania komórek, oddziel makrofagi do zastosowania w kolejnych badaniach.

8. Strategia bramkowania

  1. Wykreśl wysokość lub szerokość w stosunku do obszaru dla Forward Scatter (FSC), aby określić populację singletów (Rysunek 2A).
  2. Wybierz komórki, które wykreślają obszar do rozproszenia bocznego (SSC) w stosunku do FSC, odrzucając resztki komórkowe (Rysunek 2B).
  3. Z wybranych komórek zidentyfikuj populacje wyrażające CD45 jako komórki krwiotwórcze (Figura 2C) i podwójnie dodatnie komórki CD45 / CD14 jako makrofagi ( Figura 2D).
  4. Z makrofagów CD45 + / CD14 + wykryj ujemne i dodatnie komórki HLA-DR ( Rysunek 2E).
    UWAGA: Dołącz elementy sterujące kompensacją dla panelu przeciwciał i dostosuj nakładanie się widma na wielokolorowym cytometrze przepływowym odpowiednim dla panelu. Analizę cytometrii przepływowej wykonujemy za pomocą cytometru wyposażonego w trzy lasery (laser fioletowy 405 nm, laser niebieski 488 nm i laser czerwony 640 nm) oraz detektory dla wskazanych fluorochromów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje enzymatyczną metodę wykorzystującą trawienie kolagenazą, a następnie wirowanie różnicowe w celu jednoczesnego wyizolowania żywych dojrzałych adipocytów oraz komórek SVF z biopsji VAT pobranych od zdrowych kobiet w ciąży po częściowej omentektomii. W tym przypadku adipocyty wykorzystujemy do ekstrakcji RNA, a SVF do fenotypowania makrofagów.

Protokół ekstrakcji RNA umożliwił uzyskanie RNA o odpowiedniej czystości i wysokiej integralności oraz mikroRNA z dojrzałych ady...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

VAT odgrywa kluczową rolę w regulacji metabolizmu i stanach zapalnych. Rosnące zainteresowanie rolą adipocytów i komórek odpornościowych w przewlekłym zapaleniu związanym z otyłością doprowadziło do opracowania różnych technik oddzielania SVF i komórek tłuszczowych obecnych w AT. Jednak większość technik nie pozwala na uzyskanie tych dwóch różnych zestawów komórek nadających się do dalszych zastosowań z tej samej biopsji VAT w jednej procedurze, co może mieć kluczowe znaczenie dla badań nad interakcjami między adipocytam...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Instituto Nacional de Perinatologia (numery grantów: 3300-11402-01-575-17 i 212250-3210-21002-06-15) oraz CONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (numer grantu 2015-3-2-61661).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do PCR 0,2 mlRNaza AxygenPCR-02-C, wolne od DNaz i niepirogenne
1,5 ml mikroprobówki wirówkoweAxygenMCT-150-C, wolne od DNaz i niepirogenne
Pipety serologiczne 10 mlCorningCLS4101-50EAIndywidualnie pakowane z tworzywa sztucznego
10 i mikro; L uniwersalna końcówka do pipetyAxygenT-300-L-RRNaza, wolna od DNaz i niepirogenna
10 & mikro; L uniwersalna końcówka do pipetyAxygenT-300-R-SRNaza, wolna od DNaz i niepirogenna
1000 µ L uniwersalna końcówka do pipetyAxygenT-1000-B-RRNaza, beztlenkowa i niepirogenna
probówka mikrowirówkowa 2,0 mlAxygenMCT-200-C, RNaza bez DNaz i niepirogenna
200 &mikro; L uniwersalna końcówka do pipetAxygenT-200-Y-RRNaza, wolna od DNaz i niepirogenna
2100 BioanalizatorAgilent
G2939BA-2101 Bioanalizator PCAgilentG2953CA2100 Expert Oprogramowanie zainstalowane fabrycznie w komputerze
5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnemCorning352003 Zatyczka zatrzaskowa, sterylna
Probówki wirówkowe 50 mlCorningCLS430828-100EAPolipropylen, stożkowy dno i sterylny
odczynnik na bazie kwasu, guanidyny i fenoluOdczynnik TRIZymo ResearchR2050-1-200
Zestaw Agilent RNA 6000 Nano ZestawAgilent5067-1511-Agilent
Mały zestaw RNAAgilent5067-1548-APC
/Cy7 przeciwciało anty-ludzkie CD14BioLegend3256200,4 mg/106 komórek, obecnych na monocytach/makrofagach, klon HCD14
Baker-250 ml, niesterylna
albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA3912-100G Frakcjaszoku cieplnego, pH 5,2, ≥ 96%
Stacja do zalewaniawiórów Agilent5065-9951-Kolagenaza
typ IIGibco17101-015Proszek
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG8270-100GProszek
Direct-zol RNA MiniprepZymo ResearchR2051Dostarczany z 50 ml reagenu TRI
Kleszcze preparacyjne-stalowe, ząbkowane szczęki i okrągłe kończy się
taca preparacyjna--Stal nierdzewna
Alkohol etylowySigma-AldrichE7023-500ML200  dowód dla biologii molekularnej
FACS Flow Sheath FluidBD Biosciences342003-FACS
Roztwór lizującyBD Biosciences
349202-FACSAria III Cytometr przepływowy/sorter komórekBD Biosciences
648282-FASCDiva OprogramowanieBD Biosciences642868v6.0 preinstalowany
hemacytometrSigmaZ359629-1EA-
Ręczny licznik komórek---
Nożyczki preparacyjne Mayo--Mikrowirówka ze stali nierdzewnej
--Regulowana temperatura
SpektrofotometrNanodrop Thermo ScientificND2000LAPTOP-Wytrząsarka
orbitalna-Regulowana temperatura i prędkość
P10  Zmienna objętość  Mikropipeta Pipeta Thermo Scientific-Finnpipette46420401 do 10 μ L
P1000  Zmienna objętość  Mikropipeta Pipeta Thermo Scientific-Finnpipette4642090100 do 1000 μ L
P2  Zmienna objętość  Mikropipeta Pipeta Thermo Scientific-Finnpipette46420100,2 do 2 μn; L
P200  Zmienna objętość  Mikropipeta Pipeta Thermo Scientific-Finnpipette464208020 do 200 μ L
Stojak do przechowywania probówek do PCRAxygenR96PCRFSP-PE
/Cy5 anty-ludzkie przeciwciało HLA-DRBioLegend3076080,0625 mg/106 komórek, obecnych na makrofagach, klon L243
PE/Cy7 anty-ludzkie przeciwciało CD45BioLegend3040160,1 mg/106 komórek, obecne na leukocytach, klon H130
Sól fizjologicznabuforowana fosforanemSigma-AldrichP3813-10PAKProszek, pH 7,4, do przygotowania roztworów 1 l
Kontroler pipet---
Bufor do lizy czerwonych krwinekRoche11 814 389 001Do preferencyjnej lizy czerwonych krwinek z ludzkiej krwi pełnej
Wirówka z chłodzeniem-Adapter Whit do stożkowych probówek 50 ml
Sterylny pojemnik na próbki---
Pipeta transferowaThermo Scientific-Samco204-1SSterylny
trypan niebieskiGibco15250-0610,4% roztwór
Stojaki na probówki-Do różnych rozmiarów probówek
Vortex Mini ShakerCientifica SENNABV101-
lub podobny-

Bibliografia

  1. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
  2. Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
  3. Barchetta, I., Cimini, F. A., Ciccarelli, G., Baroni, M. G., Cavallo, M. G. Sick fat: the good and the bad of old and new circulating markers of adipose tissue inflammation. Journal of Endocrinological Investigation. 42 (11), 1257-1272 (2019).
  4. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
  5. Ronquillo, M. D., et al. Different gene expression profiles in subcutaneous and visceral adipose tissues from Mexican patients with obesity. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 616-626 (2019).
  6. Mittal, B. Subcutaneous adipose tissue and visceral adipose tissue. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 571-573 (2019).
  7. West-Eberhard, M. J. Nutrition, the visceral immune system, and the evolutionary origins of pathogenic obesity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (3), 723-731 (2019).
  8. Kaminski, D. A., Randall, T. D. Adaptive immunity and adipose tissue biology. Trends in Immunology. 31 (10), 384-390 (2010).
  9. Elffers, T. W., et al. Body fat distribution, in particular visceral fat, is associated with cardiometabolic risk factors in obese women. PLoS One. 12 (9), 0185403(2017).
  10. Macdougall, C. E., et al. Visceral adipose tissue immune homeostasis is regulated by the crosstalk between adipocytes and dendritic cell subsets. Cell Metabolism. 27 (3), 588-601 (2018).
  11. Sarvari, A. K., et al. Interaction of differentiated human adipocytes with macrophages leads to trogocytosis and selective IL-6 secretion. Cell Death & Disease. 6 (1), 1613(2015).
  12. Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-A potential role in obesity and type 2 diabetes. Frontiers in Endocrinology. 8 (1), Lausanne. 202(2017).
  13. Crujeiras, A. B., et al. Genome-wide DNA methylation pattern in visceral adipose tissue differentiates insulin-resistant from insulin-sensitive obese subjects. Translational Research. 178 (1), 13-24 (2016).
  14. Surmi, B. K., Hasty, A. H. Macrophage infiltration into adipose tissue: initiation, propagation and remodeling. Future Lipidology. 3 (5), 545-556 (2008).
  15. Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 25 (10), 2062-2068 (2005).
  16. Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S., Picardo, M. Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery. Scientific Reports. 7 (1), 10015(2017).
  17. Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (1), 88(2019).
  18. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (2), 189-199 (2015).
  19. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2016).
  20. Bravo-Flores, E., et al. Macrophage populations in visceral adipose tissue from pregnant women: potential role of obesity in maternal inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 1074(2018).
  21. Conde-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017(2016).
  22. Oberbauer, E., et al. Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration. 4 (7), London, England. 1-14 (2015).
  23. van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
  24. Winnier, G. E., et al. Isolation of adipose tissue derived regenerative cells from human subcutaneous tissue with or without the use of an enzymatic reagent. PLoS One. 14 (9), 0221457(2019).
  25. Gentile, P., Piccinno, M. S., Calabrese, C. Characteristics and potentiality of human adipose-derived stem cells (hASCs) obtained from enzymatic digestion of fat graft. Cells. 8 (3), 282(2019).
  26. Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386 (1-2), 50-59 (2012).
  27. Lockhart, R., Hakakian, C., Aronowitz, J. Tissue dissociation enzymes for adipose stromal vascular fraction cell isolation: a review. Journal of Stem Cell Research & Therapy. 5 (12), 1000321(2015).
  28. Condé-Green, A., et al. Comparison between stromal vascular cells' isolation with enzymatic digestion and mechanical processing of aspirated adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 134 (4), 54(2014).
  29. Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
  30. Aguena, M., et al. Optimization of parameters for a more efficient use of adipose-derived stem cells in regenerative medicine therapies. Stem cells international. 2012 (1), 303610(2012).
  31. Yang, X. F., et al. High efficient isolation and systematic identification of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Science. 18 (1), 59(2011).
  32. Conde-Green, A., et al. Effects of centrifugation on cell composition and viability of aspirated adipose tissue processed for transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 30 (2), 249-255 (2010).
  33. Hoareau, L., et al. Effect of centrifugation and washing on adipose graft viability: a new method to improve graft efficiency. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (5), 712-719 (2013).
  34. Xie, Y., et al. The effect of centrifugation on viability of fat grafts: an evaluation with the glucose transport test. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (3), 482-487 (2010).
  35. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  36. Kanneganti, T. D., Dixit, V. D. Immunological complications of obesity. Nature Immunology. 13 (8), 707-712 (2012).
  37. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. Adipose tissue heterogeneity: implication of depot differences in adipose tissue for obesity complications. Molecular Aspects of Medicine. 34 (1), 1-11 (2013).
  38. Raajendiran, A., Tsiloulis, T., Watt, M. J. Adipose tissue development and the molecular regulation of lipid metabolism. Essays in Biochemistry. 60 (5), 437-450 (2016).
  39. Rostam, H. M., et al. The impact of surface chemistry modification on macrophage polarisation. Immunobiology. 221 (11), 1237-1246 (2016).
  40. Chamberlain, L. M., Holt-Casper, D., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Extended culture of macrophages from different sources and maturation results in a common M2 phenotype. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2864-2874 (2015).
  41. Williams, M. R., Cauvi, D. M., Rivera, I., Hawisher, D., De Maio, A. Changes in macrophage function modulated by the lipid environment. Innate Immunity. 22 (3), 141-151 (2016).
  42. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012 (1), 812693(2012).
  43. Bajek, A., et al. Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00212(2015).
  44. van Harmelen, V., et al. Effect of BMI and age on adipose tissue cellularity and differentiation capacity in women. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 27 (8), 889-895 (2003).
  45. Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA isolation from adipose tissue: an optimized procedure for high RNA yield and integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
  46. Mendez, V., et al. A rapid protocol for purification of total RNA for tissues collected from pigs at a slaughterhouse. Genetics and Molecular Research. 10 (4), 3251-3255 (2011).
  47. Pena, R. N., Canovas, A., Estany, J. Technical note: Efficient protocol for isolation of total ribonucleic acid from lyophilized fat and muscle pig samples. Journal of Animal Science. 88 (2), 442-445 (2010).
  48. Pratt, S. L., Burns, T. A., Owens, M. D., Duckett, S. K. Isolation of total RNA and detection procedures for miRNA present in bovine-cultured adipocytes and adipose tissues. Methods in Molecular Biology. 936 (1), 181-194 (2013).
  49. Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Research Notes. 6 (1), 472(2013).
  50. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  51. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow cytometry analyses of adipose tissue macrophages. Methods in Enzymology. 537 (1), 297-314 (2014).
  52. Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
  53. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 142-150 (2015).
  54. Nicoletti, G. F., De Francesco, F., D'Andrea, F., Ferraro, G. A. Methods and procedures in adipose stem cells: state of the art and perspective for translation medicine. Journal of Cellular Physiology. 230 (3), 489-495 (2015).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): an overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897(2018).
  56. Raposio, E., Bertozzi, N. How to isolate a ready-to-use adipose-derived stem cells pellet for clinical application. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 21 (18), 4252-4260 (2017).
  57. Silva, K. R., et al. Characterization of stromal vascular fraction and adipose stem cells from subcutaneous, preperitoneal and visceral morbidly obese human adipose tissue depots. PLoS One. 12 (3), 0174115(2017).
  58. Wankhade, U. D., Shen, M., Kolhe, R., Fulzele, S. Advances in adipose-derived stem cells isolation, characterization, and application in regenerative tissue engineering. Stem Cells International. 2016 (1), 3206807(2016).
  59. Zavan, B., et al. Persistence of CD34 stem marker in human lipoma: searching for cancer stem cells. International Journal of Biological Sciences. 11 (10), 1127-1139 (2015).
  60. Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Frontiers in Immunology. 5 (1), 683(2014).
  61. Liddiard, K., Taylor, P. R. Understanding local macrophage phenotypes in disease: shape-shifting macrophages. Nature Medicine. 21 (2), 119-120 (2015).
  62. Prieur, X., et al. Differential lipid partitioning between adipocytes and tissue macrophages modulates macrophage lipotoxicity and M2/M1 polarization in obese mice. Diabetes. 60 (3), 797-809 (2011).
  63. Wang, H., et al. CD68(+)HLA-DR(+) M1-like macrophages promote motility of HCC cells via NF-kappaB/FAK pathway. Cancer Letters. 345 (1), 91-99 (2014).
  64. Yamamoto, Y., et al. Decreased human leukocyte antigen-DR expression in the lipid raft by peritoneal macrophages from women with endometriosis. Fertility and Sterility. 89 (1), 52-59 (2008).
  65. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: phenotypical vs. functional differentiation. Frontiers in Immunology. 5 (1), 514(2014).
  66. Perdiguero, E. G., Geissmann, F. The development and maintenance of resident macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 2-8 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja tkanki t uszczowejdojrza e adipocytytrawienie kolagenazekstrakcja RNAcytometria przep ywowatest ywotno ci kom rekprotok wirowanialudzka tkanka t uszczowa trzewna
Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.