Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica

Summary

Udostępniamy szczegółowy protokół hodowli, mikroiniekcji jaj i efektywnego krycia ognika Thermobia domestica w celu wytworzenia i utrzymania zmutowanych szczepów po edycji genomu.

Abstract

Ognisty Thermobia domestica to ametaboliczny, bezskrzydły gatunek, który nadaje się do badania mechanizmów rozwojowych owadów, które doprowadziły do ich udanej ewolucji na Ziemi. Zastosowanie narzędzi genetycznych, takich jak edycja genomu, jest kluczem do zrozumienia zmian genetycznych, które są odpowiedzialne za przejścia ewolucyjne w podejściu Evo-Devo. W tym artykule opisujemy nasz obecny protokół generowania i utrzymywania zmutowanych szczepów T. domestica. Opisujemy metodę iniekcji na sucho, jako alternatywę dla zgłaszanej metody iniekcji na mokro, która pozwala nam uzyskać stabilnie wysokie wskaźniki przeżywalności w zarodkach, którym wstrzyknięto implanty. Raportujemy również zoptymalizowane ustawienie środowiska, aby kojarzyć dorosłe osobniki i uzyskiwać kolejne pokolenia z wysoką wydajnością. Nasza metoda podkreśla znaczenie uwzględnienia unikalnej biologii każdego gatunku dla pomyślnego zastosowania metod edycji genomu do nietradycyjnych organizmów modelowych. Przewidujemy, że te protokoły edycji genomu pomogą we wdrożeniu T. domestica jako modelu laboratoryjnego i jeszcze bardziej przyspieszą rozwój i zastosowanie użytecznych narzędzi genetycznych u tego gatunku.

Introduction

Thermobia domestica należy do jednego z najbardziej podstawowych rzędów owadów, Zygentoma, który zachowuje rodowy ametaboliczny i bezskrzydły cykl życiowy. Tak podstawowa pozycja filogenetyczna i cechy przodków sprawiają, że gatunek ten jest atrakcyjnym modelem do badania mechanizmów leżących u podstaw sukcesu owadów na Ziemi, które obejmują ponad 70% opisanych gatunków zwierząt¹. T. domestica od dawna jest wykorzystywana głównie do badania cech przodków fizjologii owadów ze względu na jego odpowiednie cechy jako modelu laboratoryjnego, takie jak stosunkowo krótki cykl życia (2,5–3,0 miesięcy od zarodka do dorosłego osobnika reprodukcyjnego; Rysunek 1A) i łatwa hodowla. W ciągu ostatnich trzech dekad jego zastosowanie zostało rozszerzone o badanie cech przodków różnych cech, takich jak budowa ciała, różnicowanie neuronalne i rytmy okołodobowe^2,3,4.

Zastosowanie zaawansowanych narzędzi genetycznych u T. domestica mogłoby jeszcze bardziej przyspieszyć takie działania w szerokim obszarze badawczym. Pomyślne knockdown genu za pośrednictwem interferencji RNA (RNAi) u embrionów, nimf i dorosłych został zgłoszony w T. domestica^4,5,6. Wydajność ogólnoustrojowego RNAi jest nadal wysoce zależna od gatunku - na przykład jest ogólnie wysoka u Coleoptera, podczas gdy jest niska w rzędzie lepidoptera⁷. Skuteczność i czas trwania knockdown RNAi u T. domestica nie zostały jeszcze ocenione. Oprócz RNAi, wcześniej informowaliśmy o udanym nokaucie genu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u T. domestica⁸. System CRISPR/Cas jest szeroko stosowany do edycji genomu u owadów, w szczególności do celowanego nokautu genów. Jego zastosowanie można rozszerzyć do innych zastosowań, takich jak test reporterowy genów, śledzenie linii komórkowych i manipulowanie aktywnością transkrypcyjną poprzez wbijanie egzogennych konstruktów po ustanowieniu protokołu dostarczania komponentów systemu CRISPR/Cas do jąder⁹. W połączeniu z opublikowanym genomem assembly¹⁰, szerokie zastosowanie i dalszy rozwój edycji genomu T. domestica opartej na CRISPR/Cas ułatwiłoby badania koncentrujące się na mechanizmach ewolucyjnych stojących za wyjątkowym sukcesem adaptacyjnym owadów. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół mikroiniekcji zarodka i krycia dorosłych T. domestica w celu wygenerowania zmutowanego szczepu przy użyciu CRISPR/Cas9. Biorąc pod uwagę tę nowatorską metodę, omawiamy znaczenie uwzględnienia unikalnej biologii nietradycyjnych gatunków modelowych dla pomyślnego zastosowania tych technik.

Protocol

1. Utrzymanie kolonii laboratoryjnych

1. Do utrzymania populacji dzikich i zmutowanych należy użyć dużego plastikowego pojemnika (460 mm x 360 mm x 170 mm) ze zwykłym sztucznym pokarmem dla ryb, wodą w plastikowych kubkach z otworem wentylacyjnym na górze, składanym papierem do ukrywania owadów i warstwową bawełną do składania jaj (Rysunek 2A). Trzymaj wszystkie kultury T. domestica w inkubatorach o temperaturze 37 °C i ustaw wilgotność względną (RH) wewnątrz każdego pojemnika na 60%–80%.
   UWAGA: Ponieważ T. domestica absorbuje parę wodną z atmosfery¹¹, bezpośrednie zaopatrzenie w wodę nie jest potrzebne. Odpowiednia wilgotność względna jest utrzymywana dzięki obecności pary wodnej z plastikowych kubków zawierających otwór wentylacyjny na górze lub z kubków bez pokrywki wewnątrz każdego pojemnika. Nie ma potrzeby nawilżania wnętrza całego inkubatora, w którym znajdują się kultury. Przybliżony czas trwania każdego etapu rozwojowego w warunkach opisanych w tym protokole jest pokazany na Rysunek 1. Prędkość rozwoju można regulować, zmieniając temperaturę i/lub klasę RH12.
2. Od czasu do czasu dodawaj jedzenie. Dodaj wodę, zanim wyschnie.
3. Przenieś populacje do nowego czystego pojemnika co najmniej co 3 miesiące, biorąc pod uwagę, że dorosłe osobniki przestają składać jaja w brudnym środowisku i/lub gęstej populacji (patrz Dyskusja).

2. Pobieranie komórek jajowych i mikroiniekcja

1. Projektowanie przewodnika RNA (gRNA)
   1. Zaprojektuj sekwencję gRNA dla każdego wymaganego celu i porównaj sekwencje gRNA z zespołem genomu, aby sprawdzić możliwe miejsca rozpoznawania poza celem.
   2. Zsyntetyzuj i oczyść gRNA zgodnie z instrukcjami producenta⁸.
      UWAGA: Na przykład, w przypadku celowania w biały gen transportera kasety wiążącego ATP, zaprojektowano sekwencję docelową 20 pz i zamówiono dwa zsyntetyzowane oligonukleotydy DNA 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGGGAC-3' i 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3'. Matrycę DNA przygotowano przez wyżarzanie tych dwóch oligonukleotydów, a następnie amplifikację PCR, a następnie gRNA jest następnie transkrybowane in vitro z matrycy za pomocą polimerazy RNA T7.
2. Przygotuj kolonie do zbierania jaj
   1. Przenieś około 20 dorosłych samców i 20 samic do średniej wielkości pojemnika (200 mm x 150 mm x 90 mm) z jedzeniem, zapasem wody, złożonym papierem i małym kawałkiem warstwowej bawełny do składania jaj (Ryc. 2B).
   2. Stwórz kilka kolonii, aby uzyskać dużą liczbę zarodków w krótkim czasie, które zostaną wykorzystane do edycji genomu.
      UWAGA: Oczekuje się, że około 20–40 jaj zostanie zebranych z kolonii po 8 godzinach w temperaturze 37 °C. Zwykle potrzeba kilku dni, aby przeniesione dorosłe osobniki zaczęły składać jaja, prawdopodobnie z powodu adaptacji do nowego środowiska.
3. W dniu wstrzyknięcia należy wymienić bawełnę znajdującą się wewnątrz pojemników na nową.
4. Umieść taśmę dwustronną o wymiarach 76 mm x 5 mm na zwykłym szkiełku podstawowym o wymiarach 76 mm x 26 mm.
5. Osiem godzin później zbierz jaja z warstwowej bawełny, oddzielając warstwy za pomocą kleszczy.
6. Wyrównaj jajka na taśmie dwustronnej za pomocą mokrego pędzla i zachowaj odległość 2 mm między jajkami. Wszystkie jaja powinny być ustawione tak, aby oś podłużna jaja była skierowana w stronę iniekcji (Rysunek 3A). Delikatnie dociśnij jaja pędzlem, aby zapewnić mocne trzymanie podczas wstrzykiwania.
   UWAGA: W tym protokole grzyb rośnie szybko w uszkodzonych wstrzykniętych jajach w mokrych i ciepłych warunkach. Ważne jest, aby zachować odległość między jajami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu i ekspansji grzyba.
7. Wymieszaj gRNA i białko Cas9 do końcowego stężenia odpowiednio 100 ng/μL i 500 ng/μL. Do rozcieńczenia użyj wody destylowanej. Inkubuj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby pobudzić tworzenie kompleksu rybonukleoproteinowego, a następnie trzymaj mieszaninę na lodzie.
   UWAGA: Do roztworu do wstrzykiwań można dodać neutralną czerwień o końcowym stężeniu 1% w celu monitorowania wstrzykiwanej ilości.
8. Załadować 2 μl roztworu gRNA/Cas9 do szklanej kapilary iniekcyjnej za pomocą mikroładowarki. Przed wstrzyknięciem należy upewnić się, że w roztworze nie ma pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby postukaj w igłę, aby usunąć bąbelki.
   UWAGA: W tym eksperymencie używana jest gotowa igła do uzyskania cienkiej końcówki igły (Rysunek 3B). Zamiast tego można użyć domowej roboty igły o podobnym kształcie.
9. Przymocować szklaną kapilarnę iniekcyjną, uprzednio załadowaną roztworem gRNA/Cas9, do uchwytu wyposażonego w manipulator i podłączyć uchwyt do elektronicznego mikrowtryskiwacza.
10. Zoptymalizuj kształt końcówki igły, łamiąc ją lekko kleszkami, aby zapobiec zatykaniu się i uzyskać lepszą trwałość podczas serii wstrzyknięć (przykład odpowiedniej igły pokazano w Rysunek 3C).
    UWAGA: Zaleca się wymianę igły, gdy jest zatkana. Możliwe jest kontynuowanie wstrzykiwania tą samą igłą, jeśli zostanie ona ponownie złamana kleszczami, ale szersza końcówka prowadzi do większego uszkodzenia jaj i obniża ich przeżywalność. Ponieważ jaja T. domestica są miękkie i kruche, utrzymanie cienkiej końcówki igły jest kluczem do uzyskania wysokiego wskaźnika przeżywalności po wstrzyknięciu.
11. Wprowadzić igłę w środku osi podłużnej jaja i wstrzyknąć niewielką ilość roztworu (patrz Rysunek 3D–H w celu odniesienia do ilości wstrzyknięcia). Dostosuj konfigurację elektronicznego mikrowtryskiwacza podczas wstrzykiwania, w zależności od kształtu końcówki igły.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie stałego ciśnienia podczas wstrzykiwania, w przeciwnym razie lepka zawartość jaj może łatwo wpłynąć do szklanej igły i ją zatkać. Rozwiązaniem może być wstrzyknięcie z krótkim impulsem ciśnienia lub ze stałym ciśnieniem, w zależności od ilości wstrzykiwanej cieczy. Należy pamiętać, że gdy końcówka igły ma szeroki otwór, do jajka wstrzykuje się zbyt dużo roztworu, co powoduje śmiertelność (Ryc. 3F–H). W takim przypadku utrzymuj stały przepływ płynu pod stałym ciśnieniem, a następnie włóż igłę do jajka i natychmiast ją wyciągnij. Jeśli spowoduje to zbyt duże przepełnienie lub jajko pęknie, zmień igłę.
12. Przechowywać wstrzyknięte jaja w pojemniku o wielkości odpowiedniej do liczby wstrzykiwanych jaj (<20 jaj: małe naczynie; >20 jaj: pojemnik średniej wielkości) o wilgotności względnej 60–80% i temperaturze 37 °C.

3. Krycie

1. Okresowo sprawdzaj wstrzyknięte jaja i wyrzucaj uszkodzone jaja kleszczami, aby uniknąć rozwoju grzybów (Rysunek 3I,J). W przypadku, gdy na jajku rośnie zbyt dużo grzyba, oczyść powierzchnię jajka za pomocą 70% EtOH.
2. Przed wykluciem (około 10 dni w temperaturze 37 °C po złożeniu jaj) zanurzyć szkiełko podstawowe z wstrzykniętymi jajami w talku w celu pokrycia powierzchni taśmy dwustronnej. Pozwoli to uniknąć układania wyklutych nimf. Przenieś szkiełka szklane malowane proszkowo do średniej wielkości pojemnika z jedzeniem, wodą i złożonym papierem do ukrywania owadów.
3. Usuń szkiełka po wykluciu się nimf. Okresowo dostarczaj pokarm aż do osiągnięcia dorosłości.
   UWAGA: Osiągnięcie dorosłości po wykluciu zajmuje osobnikom około 2,0–2,5 miesiąca (Rysunek 1A). Stadium dorosłe ocenia się na podstawie dobrze rozwiniętego pokładełka u samic (Ryc. 1B).
4. Aby skopulować osobniki, przenieś tyle dorosłych samic, ile potrzeba, z kolonii laboratoryjnej do średniej wielkości pojemnika i wysiaduj je przez co najmniej 14 dni w temperaturze 37 °C, aby upewnić się, że są dziewicze.
   UWAGA: Nie jest konieczne zbieranie dziewiczych samic z kolonii laboratoryjnej, ponieważ dorosłe T. domestica mają powtarzający się cykl linienia i krycia zwany "cyklem reprodukcyjnym i linienia", podczas którego samice wyrzucają plemniki przy każdym linieniu i ponownie łączą się w pary w następnym cyklu zapłodnienia¹³.
5. Przenieś dorosłego samca lub samicę G0, który rozwinął się z wstrzykniętego jaja i dorosłego osobnika (osobników) typu dzikiego, do małego plastikowego naczynia (Ø 100 mm x 40 mm) z jedzeniem, złożonym papierem i małym kawałkiem bawełny do składania jaj G1 (Rysunek 2C'; naczynie godowe). Trzymaj naczynia do łączenia w większym pojemniku z wilgotnością względną 60%–80% (Rysunek 2C).
   UWAGA: W naczyniu można umieścić wiele dorosłych osobników typu dzikiego, aby zwiększyć szansę na udane krycie, chociaż wysokie wskaźniki sukcesu osiągnięto w przypadku parowania jeden do jednego.

4. Genotypowanie

1. Zaprojektuj pary starterów PCR dla każdego gRNA, aby amplifikować produkt o stężeniu 100–200 pz, który zawiera miejsce docelowe gRNA. Zetrzyj każdą sekwencję startera z zespołem genomu, aby sprawdzić jego specyficzność (przykład pokazano dla celowania w biały gen w Rysunek 4A).
2. Sprawdź transformację linii zarodkowej dorosłych G0.
   1. Pięć dni po złożeniu jaj należy zebrać pojedyncze jaja G1 z każdej dorosłej pary G0 do probówek o pojemności 0,2 ml (jedno jajko na probówkę; zebrane próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania). Oddziel warstwy bawełny, aby zebrać jaja.
      UWAGA: Zaleca się genotypowanie co najmniej 12 nimf G1 z każdej pary godowej w celu oceny powodzenia transmisji w linii zarodkowej (patrz Reprezentatywne wyniki).
   2. Dodać 15 μl 0,25 mg/ml roztworu proteinazy K (rozpuszczonego w buforze Tris-EDTA) do każdej probówki, krótko homogenizować próbki wykałaczkami i inkubować w temperaturze 55 °C przez 3 do 16 godzin.
   3. Dezaktywować proteinazę K, umieszczając próbki w temperaturze 95 °C na 10 minut.
   4. Dodaj 90 μl wody destylowanej do każdej probówki i dobrze wymieszaj. Użyć 2 μl supernatantu w 10 μl mieszaniny reakcyjnej PCR zawierającej startery zaprojektowane w kroku 4.1.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie polimerazy DNA zoptymalizowanej pod kątem prymitywnych matryc, aby osiągnąć wystarczającą amplifikację PCR.
   5. Aby przeanalizować produkty PCR, wykonaj test mobilności heterodupleksowej (HMA) za pomocą systemu elektroforezy mikroprocesorowej (Rysunek 3B; patrz Ohde i in., 2018)⁸.
      UWAGA: Mutacje można ocenić za pomocą dwóch alternatywnych metod: (1) HMA ze standardowymi polimerami żelowymi, takimi jak 8% poliakrylamid¹⁴; (2) trawienie produktów PCR endonukleazą T7, a następnie elektroforeza w żelu agarozowym15.
   6. Zachowaj tylko nimfy G1 powstałe z dorosłych G0, które zawierają mutacje w swojej linii zarodkowej i odrzuć pozostałe.
3. Indywidualne genotypowanie nimf/dorosłych osobników G1
   1. Wyizolować nimfy G1 na 24-dołkowych płytkach za pomocą aspiratora lub pędzla. Umieść płytki 24-dołkowe w większym pojemniku (np. średniej wielkości pojemniku używanym w tym protokole) z dopływem wody, jak opisano powyżej, aby utrzymać wilgotność względną na poziomie 60%–80% (Rysunek 1D). Utrzymuj zapasy sztucznego regularnego pokarmu dla ryb (Rysunek 1D').
      UWAGA: Chociaż ten krok można wykonać w dowolnym momencie nimfalnego i dorosłego stadium, zaleca się wykonanie go po osiągnięciu dorosłości i tuż przed parowaniem (>2,5 miesiąca po wstrzyknięciu; Rysunek 1B) Ponieważ łatwiej jest utrzymać firebrats w dużym pojemniku. Wymagana jest indywidualna hodowla w celu śledzenia genotypu każdej nimfy G1 na następujących etapach. Nimfy G1 od tego samego dorosłego G0 mogą mieć różne mutacje.
   2. Uszczypnij i wyciągnij cerci i włókno ogonowe od nimfy/dorosłego osobnika za pomocą kleszczy i zbierz je do probówki o pojemności 0,2 ml zawierającej 50 μl EtOH (zebrane próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania).
      UWAGA: Próbki tkanek są zbierane w EtOH, ponieważ zapobiega to utracie tych małych próbek z powodu elektryczności statycznej. Jeśli trzeba zatrzymać ruch owadów, znieczulenie nimfy/dorosłego osobnika na lodzie podczas pobierania próbek tkanek. Ponieważ T. domestica nie może przetrwać po długotrwałym chłodzeniu na lodzie, nie znieczulaj ich dłużej niż minutę i natychmiast przenieś je z powrotem do temperatury pokojowej. Ablacja cerci i włókna ogonowego nie powoduje wzrostu śmiertelności.
   3. Umieścić probówki z próbkami z otwartymi pokrywkami na bloku termicznym na 15 minut w temperaturze 70 °C w celu odparowania EtOH.
   4. Powtórz kroki 4.2.2–4.2.5 dla genotypowania.
   5. Prześlij produkty PCR, w których zaobserwowano zmutowany wzór prążka, do standardowej usługi sekwencjonowania Sangera.
   6. Zachowaj nimfy/dorosłe osobniki G1 z pożądanymi mutacjami i odrzuć pozostałe (patrz Rysunek 4C, aby uzyskać reprezentatywny wynik sekwencjonowania).
4. Krzyżuj dorosłe osobniki zawierające pożądane mutacje w naczyniu godowym i uzyskaj kolejne pokolenia, aby stworzyć homozygotyczny zmutowany szczep.

Results

W naszych rękach około 100 jaj może być dobrze wstrzykniętych za pomocą pojedynczego kapilary iniekcyjnej, jeśli ma ona odpowiednią końcówkę (Rysunek 3C). Wstrzyknięcie kompleksu rybonukleoproteinowego gRNA/Cas9 do zarodków w ciągu pierwszych 8 godzin po złożeniu jaj powoduje powstanie indeli w miejscu docelowym gRNA. Powoduje to mutacje bialleliczne w niektórych komórkach wstrzykiwanego pokolenia (G0), a zatem zmutowane fenotypy mozaiki są zwykle uzyskiwane w G0. Na przykład, gdy ten protokół został ...

Discussion

Aby pomyślnie wygenerować pożądanego mutanta T. domestica z CRISPR/Cas9, najpierw ważne jest zebranie wystarczającej liczby zarodków w odpowiednim stadium do wstrzyknięcia. Aby uzyskać stałą zbieralność wystarczającej liczby jaj T. domestica , kluczem jest wybór odpowiedniego rozmiaru pojemnika, aby mieć mniejszą gęstość populacji, ponieważ pomogłoby to w pomyślnym zakończeniu serii złożonych zachowań godowych, które powtarzają się po każdym dorosłym linieniu¹³. Dorosły samiec

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Płytka 24-dołkowa	Corning	83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µ g	Integrated DNA Technologies	1081060
Antystatyczny środek czyszczący	Hozan	Z-292	do usuwania elektryczności statycznej z płytki 24-dołkowej
Barrier Box 20.7L	AS ONE	4-5606-01	Duży pojemnik
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000013	Mikroiniektor elektroniczny
Femtotip II, kapilara iniekcyjna	Eppendorf	5242957000	Kapilara szklana wtryskowa
High Pack 2440mL	AS ONE	5-068-25	Średniej wielkości
inkubator	Panasonic	MIR-554-PJ	do 37 stopni; C inkubacja. Nie ma potrzeby nawilżania wnętrza inkubatora.
KOD Fx Neo	Toyobo	KFX-101	Enzym PCR do genotypowania. Zoptymalizowany pod kątem wzmocnienia z prymitywnych szablonów.
Podstawka magnetyczna	Narishige	GJ-8	do trzymania mikromanipulatora
	Mikroładowarka Eppendorf	5242956003
Mikromanipulator	Narishige	MM-3
	Mikroskop Olympus	SZX12	do mikroiniekcji. Do mikroiniekcji wystarczy ponad 35-krotne powiększenie
MultiNA	Shimadzu	MCE-202	System elektroforezy mikroprocesorów
NiceTac	Nichiban	NW-5	Taśma dwustronna do umieszczania jaj na szkiełku
Pędzel (włosie końskie)	Pentel	ZBS1-0
Naczynie do kultur roślinnych	SPL Nauki Przyrodnicze	310100	Miska godowa i zapasy wody do dużych i średnich pojemników
Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCR Liofilizat z Pichia pastoris	Roche	3115836001
Mikroskop SZX 12	Olympus	SZX 12	Do mikroiniekcji wystarczy powiększenie ponad 35-krotne
Talk	Maruishi	877113
Tetra Goldfish Złote	spektrum wzrostu Marki		Sztuczny regularny pokarm dla ryb