Artykuł metodologiczny

Wczesne wykrywanie zakwitów sinic i związanych z nimi cyjanotoksyn przy użyciu strategii szybkiego wykrywania

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61889

⸱

25 lutego 2021

 ,  ,  ,  , 
1TheBlueChemistryLab, Department of Pharmacy, University of Naples Federico II, 2Department of Public Health, University of Naples Federico II, 3Department of Engineering, University Parthenope

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Szybka multidyscyplinarna strategia wczesnego wykrywania zakwitów sinic i związanych z nimi cyjanotoksyn jest opisana tutaj. Pozwala na wykrycie cyjanobakterii i pokrewnych sinic w próbkach wody oraz w matrycach organicznych, takich jak próbki małży, w ciągu 24 godzin.

Streszczenie

Szybkie wykrywanie cyjanobakterii i cyjanotoksyn osiąga się za pomocą strategii szybkiego wykrywania (FDS). Tylko 24 godziny są potrzebne do rozwikłania informacji o obecności sinic i pokrewnych cyjanotoksyn w próbkach wody i w matrycy organicznej, takiej jak ekstrakty z małży. FDS łączy techniki detekcji zdalnej/proksymalnej z analizami analitycznymi/bioinformatycznymi. Miejsca pobierania próbek są wybierane na podstawie wielodyscyplinarnego, wieloskalowego i wieloparametrycznego monitoringu w trójwymiarowej przestrzeni fizycznej, w tym teledetekcji. Obserwacja mikroskopowa i analiza taksonomiczna próbek odbywa się w warunkach laboratoryjnych, co pozwala na identyfikację gatunków sinic. Próbki są następnie ekstrahowane rozpuszczalnikami organicznymi i przetwarzane za pomocą LC-MS/MS. Dane uzyskane przez MS/MS są analizowane przy użyciu podejścia bioinformatycznego z wykorzystaniem platformy internetowej Global Natural Products Social (GNPS) w celu stworzenia sieci cząsteczek. Sieci te są analizowane w celu wykrywania i identyfikacji toksyn, porównując dane widm fragmentacji uzyskane za pomocą spektrometrii mas z biblioteką GNPS. Pozwala to na wykrycie znanych toksyn i nieznanych analogów, które wydają się być powiązane w tej samej sieci molekularnej.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich 15 lat zakwity sinic stały się problemem środowiskowym na całym świecie1,2. Zakwity te są spowodowane nadmiernym wzrostem mikroorganizmów nazywanych sinicami. Stanowią one wyraźną grupę mikroorganizmów fotosyntetyzujących, które przystosowały się do życia w szerokim zakresie środowisk, w tym w obszarach tropikalnych i ekstremalnie zimnych wodach. Są znane z tworzenia dużych zakwitów pokrywających powierzchnie wód, szczególnie w odpowiedzi na masywne wzbogacenie w składniki odżywcze, czyli tak zwany proces eutrofizacji3.

W związku z tym sinice stanowią doskonałe bioindykatory zanieczyszczenia wód4,5,6. Mogą one również wytwarzać szeroką gamę naturalnych związków o interesujących właściwościach farmakologicznych7,8. Problemem środowiskowym związanym z sinicami są same zakwity. Zakwity mogą blokować dostęp światła słonecznego do roślin podwodnych, zużywać tlen w wodzie, co prowadzi do śnięcia ryb, wytwarzać kożuchy powierzchniowe i nieprzyjemne zapachy oraz zakłócać żerowanie organizmów filtrujących9.

Ponadto, co jest jeszcze bardziej niepokojące, w określonej kombinacji czynników, takich jak temperatura, składniki odżywcze (fosfor i azot), światło słoneczne (niezbędne do fotosyntezy) oraz pH wody, zakwity sinic indukują produkcję toksyn, przez co stają się one szkodliwe dla ludzi i zwierząt. Najlepiej poznana klasa cyjanotoksyn jest produkowana przez rodzaj Microcystis. Są to peptydy cykliczne znane pod ogólną nazwą mikrocystyn (MCs), z których mikrocystyna-LR jest najdokładniej zbadana ze względu na zdolność do wywoływania silnej hepatotoksyczności.10Zwierzęta i ludzie mogą być narażone na kontakt z mikrocystynami (MCs) poprzez spożycie zanieczyszczonej wody pitnej lub żywności. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zasugerowała całkowitą wartość mikrocystyny-LR na poziomie 0,001 mg/L jako wartość wytyczną.11Jednak dotyczy to tylko jednego wariantu (tj. MC-LR) spośród ponad 100 mikrocystyn wyizolowanych do tej pory.

Połączone metody opisane we wcześniejszych publikacjach, takie jak teledetekcja z analizą MALDI-TOF MS12,13,14,15, koncentrowały się na wykrywaniu stężenia MC. Najnowsze metody wykorzystują czujniki o niskiej rozdzielczości, które są skuteczne jedynie w wykrywaniu rozległych obszarów zakwitu; mogą one również wykryć tylko te toksyny, dla których dostępne są wzorce. Co więcej, większość tych procedur jest czasochłonna, a czas jest kluczowym czynnikiem wczesnego wykrywania zakwitu w celu zapobiegania problemom z bezpieczeństwem lub ich minimalizacji. Zaproponowana tutaj strategia multidyscyplinarna umożliwia szybkie wykrycie zakwitu cyjanobakterii oraz cyjanotoksyn już po 24 h16.

W ramach programu MuM3, „Multi-disciplinary, Multi-scale and Multi-parametric Monitoring in the three-dimensional (3D) physical space”17,18, strategia szybkiego wykrywania (Fast Detection Strategy, FDS) łączy zalety kilku technik: 1) teledetekcji w celu wykrycia zakwitu; 2) obserwacji mikroskopowej w celu zidentyfikowania gatunków sinic; oraz 3) analiz analitycznych i bioinformatycznych, a mianowicie sieciowania molekularnego opartego na LC-HRMS, w celu wykrycia cyjanotoksyn. Wyniki są uzyskiwane w ciągu 24 h.

Nowe podejście jest przydatne do monitorowania rozległych obszarów przybrzeżnych w krótkim czasie, co pozwala uniknąć licznych pobrań próbek i analiz oraz skraca czas detekcji i obniża koszty. Strategia ta jest wynikiem badań i zastosowania różnych podejść do monitorowania cyjanobakterii oraz ich toksyn i łączy zalety każdego z nich. W szczególności analiza wyników uzyskanych z wykorzystania różnych platform (satelity, samoloty, drony) i czujników (MODIS, podczerwień termiczna) do analizy teledetekcyjnej, a także różnorodnych podejść metodologicznych do identyfikacji gatunków cyjanobakterii (mikroskop, spektroskopia UV-Vis, analiza 16S) i toksyn (analiza LC-MS, sieci molekularne), pozwoliła na wybór najodpowiedniejszej metody zarówno do celów szczegółowych, jak i ogólnych. Nową metodologię przetestowano i zwalidowano w kolejnych kampaniach monitorujących wybrzeża Kampanii (Włochy) w ramach programu monitoringu agencji ochrony środowiska Kampanii.

Schemat teledetekcji przedstawiający analizę danych satelitarnych, lotniczych i przybrzeżnych na potrzeby badań środowiskowych.
Rysunek 1: Strategia FDS. Przegląd strategii szybkiego wykrywania (Fast Detection Strategy) sinic i cyjanotoksyn. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

1. Teledetekcja i pomiary zbliżeniowe: pozyskiwanie i analiza danych

UWAGA: W tym przypadku dane z teledetekcji zdalnej/bliskiej są wykorzystywane do wstępnego przeglądu makroobszaru oraz do wyboru konkretnych punktów obszarów nadbrzeżnych do pobrania próbek. W schemacie ramowym MuM317 przepływ logiczny opiera się na hierarchicznym modelu monitoringu, który obejmuje kilka poziomów nazwanych warstwami informacji. Informacje na każdym poziomie opierają się na danych pozyskanych za pomocą jednego lub większej liczby czujników przenoszonych przez platformy rozmieszczone na różnych wysokościach. Każdy poziom definiuje skalę przestrzenną w zależności od wysokości pomiaru19. Istnieje możliwość zastosowania wielu czujników na każdym poziomie. Przykłady obejmują: obrazowanie w zakresie widzialnym i bliskiej podczerwieni (VNIR) oraz podczerwieni termicznej (TIR)20 za pomocą satelitów, samolotów, helikopterów, UAV21 oraz przy powierzchni; analizy fizykochemiczne i biologiczne itp.22 przy powierzchni oraz w ramach szybkiej odpowiedzi z wykorzystaniem laboratorium mobilnego. Dane pozyskane przez każdy czujnik są przetwarzane i łączone w celu obliczenia indeksów wielospektralnych (np. znormalizowanego różnicowego wskaźnika wegetacji (NDVI), znormalizowanego różnicowego wskaźnika wody (NDWI), indeksu chlorofilu itp.), dzięki czemu surowe dane są konwertowane na bardziej użyteczne parametry i formaty (np. mapy tematyczne).

Proces gromadzenia danych z teledetekcji z wykorzystaniem satelity, samolotu i pojazdu naziemnego w mapowaniu wybrzeża.
Rycina 2: Analizy teledetekcyjne/proksymalne dla poboru próbek (kroki 1-2).Wielopoziomowe podejście z wykorzystaniem wielu czujników do detekcji zakwitu cyjanobakterii. Pozyskiwanie danych odbywa się za pomocą satelity (A), samolotu (B) i/lub drona (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Pozyskiwanie danych teledetekcyjnych i sensingowych
    1. Pobierz dane z różnych publicznych i prywatnych zbiorów danych teledetekcyjnych, przygotowanych specjalnie do wyszukiwania treści i klasyfikacji scen. Typowe źródła zbiorów danych wykorzystywane w tym kroku obejmują: produkty Landsat udostępniane przez U.S. Geological Survey23, produkty Sentinel-2,3 udostępniane przez NASA24 oraz Copernicus Open Access Hub25, a także MODIS-Aqua26.
    2. Zidentyfikuj produkty dostępne dla konkretnego obszaru i zakresu dat, uwzględniając ograniczenia wynikające z zachmurzenia. Zdefiniuj: A) obszar zainteresowania za pomocą graficznego interfejsu użytkownika i wyboru wielokąta; B) zakres dat oraz stopień zachmurzenia za pomocą pól filtrów zapytań tekstowych.
      UWAGA: Nawet jeśli wiele raportów naukowych podaje, że dopuszczalna wartość zachmurzenia wynosi <20%, w tego typu badaniach ważne jest zwrócenie uwagi na rzeczywiste zachmurzenie wyłącznie nad powierzchnią wody, zatem wartość efektywności dla tego regionu wynosi <5%.
    3. Wybierz produkty pochodzące z platform najlepiej dopasowanych do konkretnych potrzeb misji. Z każdej kombinacji specyfikacji technicznych satelity i ładunku użytecznego można uzyskać kilka kolekcji produktów. Na przykład produkty danych NASA EOSDIS24 są przetwarzane na różnych poziomach, od Poziomu 0 do Poziomu 4: produkty Poziomu 0 to surowe dane w pełnej rozdzielczości instrumentu, natomiast na wyższych poziomach dane są przekształcane w bardziej użyteczne parametry i formaty. Zazwyczaj dostępne są Poziomy 0-1, podczas gdy produkty z Poziomów 2-4 wymagają specyficznego przetwarzania związanego z konkretnymi celami badawczymi, dlatego ich dostępność w czasie i w zakresie objętego regionu jest ograniczona.
    4. Pobierz wybrany zbiór danych obserwacji satelitarnych. Szczegółowo, wybierając z listy wyników z poprzedniej operacji, pobierz kompletny produkt zbioru danych (np. grupę plików geo-tiff, jeden dla każdego pasma, wraz z informacjami i innymi metadanymi) lub tylko konkretne pojedyncze pasmo.
      UWAGA: Szczegółowy opis każdej podstawowej czynności zawartej w procedurze kroku 1 znajduje się również w pracy Huan-Huan Chen et al. 202027.
  2. Wstępne przetwarzanie i przetwarzanie danych na potrzeby analizy oraz transformacja w bardziej użyteczne parametry i formaty, aby umożliwić wstępny przegląd obszaru makro.
    ​UWAGA: Następujące czynności (krok 1.2) są poświęcone przetwarzaniu danych ukierunkowanemu na przekształcenie surowych danych z poziomów niższych w informacje, a następnie w informacje użyteczne (poziomy wyższe). Krok ten polega na przetwarzaniu surowych danych z każdego czujnika (np. produkty Poziomów 0-1) i transformacji w produkty wyższego poziomu (np. Poziomy 2-4), a następnie w warstwy informacyjne w celu wygenerowania bardziej użytecznych parametrów i formatów (np. mapa tematyczna).
    1. Przeprowadź wstępne przetwarzanie surowych danych obejmujące kalibrację geometryczną i radiometryczną. Czynność tę można wykonać przy użyciu specjalistycznego oprogramowania, które w sposób automatyczny lub półautomatyczny (nienadzorowany lub nadzorowany) zapewnia zestaw powiązanych narzędzi do przetwarzania rastrów w celu łatwej klasyfikacji z zachowaniem prawidłowego przepływu pracy.
      UWAGA: W niniejszych badaniach wykorzystano dwa bezpłatne narzędzia open source: Q-GIS 3.1428 w połączeniu z wtyczką Semi-Automatic Classification Plugin (SCP). Wtyczka SCP29 umożliwia półautomatyczną klasyfikację obrazów teledetekcyjnych, zapewniając kompletny zestaw narzędzi do pobierania bezpłatnych obrazów, wstępnego przetwarzania, postprocesingu oraz obliczeń rastrowych.
    2. Przetwórz skalibrowane dane, obliczając indeksy wielospektralne. Typowo czynność ta jest wykonywana za pomocą narzędzia kalkulatora rastrowego. Obliczenie indeksu wielospektralnego definiuje korelację między różnymi pasmami/warstwami, co w rezultacie generuje nową warstwę, którą można zarządzać na platformie GIS. Na przykład, bazując na czujnikach Sentinel oraz Landsat Operational Land Imager (OLI), można obliczyć indeksy wielospektralne, takie jak Znormalizowany Różnicowy Indeks Wegetacji (NDVI). Indeks wegetacji jest następnie wykorzystywany do szacowania zawartości chlorofilu30,31.
    3. Przeanalizuj wyniki uzyskane z szacowania indeksu zawartości chlorofilu przedstawione na tematycznych mapach w fałszywych kolorach i zdefiniuj obszary krytyczne o wysokim stężeniu chlorofilu. W niniejszym badaniu mapa chlorofilu-a została wygenerowana przy użyciu zbioru danych z czujnika MODIS32, zamontowanego na platformach satelitarnych Terra i Aqua. Punkty poboru próbek są lokalizowane tam, gdzie zarejestrowano wartości anormalne.
      UWAGA: W domenie teledetekcji flagę zakwitu glonów (definiującą każdy konkretny punkt) podnosi się, gdy stężenie Chl-a przekracza 20 mg/L33.

2. Próbkowania sterowane

UWAGA: Wybór punktów poboru próbek opiera się na analizie warstwy teledetekcyjnej/czujników zbliżeniowych, która umożliwia wyznaczenie punktów w rozległych obszarach przybrzeżnych. Biorąc pod uwagę, że pobieranie próbek może być niebezpieczne dla operatorów ze względu na toksyczność mikrocystyn, niezbędne jest zastosowanie bezpiecznych procedur poboru. W szczególności konieczne jest zabezpieczenie operatorów przed wdychaniem aerozoli oraz kontaktem ze skórą. Następnie należy przeprowadzić pobieranie próbek zgodnie z procedurą szczegółowo opisaną poniżej.

  1. Należy założyć okulary ochronne, maskę FFP2 zapobiegającą wdychaniu aerozoli oraz rękawice ochronne, aby uniknąć kontaktu z skórą.
  2. Pobrać 0.5 L wody w trzech powtórzeniach w każdym punkcie pomiarowym.
  3. Zmierzyć zasolenie każdej próbki za pomocą refraktometru. Nanieść kroplę próbki na refraktometr i odczytać wartość zasolenia w częściach na tysiąc (ppt - ‰).
  4. Po zakończeniu pobierania próbek najpierw umyć ręce, a następnie kolejno zdjąć rękawice, maskę i okulary, dbając o to, aby nie dotykać zewnętrznej powierzchni środków ochrony osobistej.
  5. Przenieść próbkę do laboratorium w temperaturze pokojowej.

3. Identyfikacja gatunków sinic na podstawie obserwacji mikroskopowych i identyfikacji taksonomicznej

  1. Odwiruj każdą próbkę (≈0.5 L) przy 11,200 x g przez 5 min.
  2. Wyodręb nadsączone w następujący sposób: wlej 500 mL butanolu do każdej próbki, a następnie za pomocą lejka przelej mieszaninę do ekstrakcji do rozdzielacza. Umieść rozdzielacz pionowo w uchwycie pierścieniowym, aby umożliwić rozdzielenie się obu warstw. Pozwól fazie wodnej spłynąć do kolby Erlenmeyera. Powtórz ten krok trzy razy. Następnie zagęść fazy organiczne pod próżnią i je zważ.
  3. Zbierz osady z kroku 3.1 i przeanalizuj je przy powiększeniu 400x i 1,000x za pomocą mikroskopu optycznego wyposażonego w cyfrową kamerę do mikroskopów o rozdzielczości 18 MP. Poszukaj obecności cyjanobakterii na podstawie ich cech morfologicznych: niebiesko-zielony kolor, kształt i rozmiar komórek pozwalają rozpoznać cyjanobakterie wśród innych mikroorganizmów.
  4. Zidentyfikuj gatunki poprzez analizę taksonomiczną za pomocą obserwacji mikroskopowej, zgodnie z procedurą opisaną przez Komarék et al. 201434.
    UWAGA: W celu identyfikacji taksonów cyjanobakterii można przeprowadzić uzupełniającą metagenomiczną analizę 16S3.
  5. Rozcieńcz porcję osadu w 10 mL wody morskiej lub słodkiej w pożywce BG11, zależnie od zasolenia, w celu przeprowadzenia hodowli.

4. Identyfikacja cyjanotoksyn

  1. Ekstrakcja próbek rozpuszczalnikami organicznymi
    1. Każdą próbkę osadu umieścić w kolbie i poddać sonikacji przez 5 min w kąpieli lodowej. Następnie dodać 50 mL świeżego MeOH i delikatnie wstrząsnąć. Roztwór przefiltrować przez filtr papierowy, a filtrat zebrać w kolbie okrągło-dennej. Powtórzyć ten krok dwukrotnie. Następnie ekstrahować osady, dodając dwukrotnie 50 mL mieszaniny MeOH/DCM (1:1, 50 mL) oraz dwukrotnie 100% DCM (x2, 50 mL)35. Oznaczyć każdą kolbę okrągło-denną odpowiednio jako „ekstrakt MeOH”, „ekstrakt MeOH/DCM” oraz „ekstrakt DCM”, a następnie odparować pod próżnią.
    2. Każdy ekstrakt organiczny (MeOH, MeOH/DCM, DCM) poddać analizie LC-HRMS/MS.
  2. Analiza LC-HRMS/MS
    1. Przygotowanie próbek do analizy LC-HRMS i LC-HRMS/MS: każdą próbkę rozpuścić w MeOH ≥ 99,9% do uzyskania końcowego stężenia 10 mg/mL.
    2. Każdą próbkę przeanalizować za pomocą wysokorozdzielczego spektrometru mas ESI sprzężonego z systemem HPLC (system LC-HRMS/MS). HPLC pracować z kolumną C18 5-µm (100 x 2,10 mm) w temperaturze pokojowej. Zastosować elucję gradientową z H2O (z dodatkiem 0,1% HCOOH) i MeOH przy przepływie 200 µL min-1. Program gradientu: 10% MeOH przez 3 min, wzrost od 10% do 100% MeOH przez 30 min, 100% MeOH przez 7 min. Jako próbę kontrolną zastosować MeOH.
    3. Akwizycja danych. Zbierać dane w trybie akwizycji zależnej od danych (DDA): 10 najintensywniejszych jonów z pełnego skanu widma masowego musi zostać poddanych analizie wysokorozdzielczej tandemowej spektrometrii mas (HRMS/MS). Rejestrować skany HRMS/MS dla wybranych jonów z fragmentacją CID, szerokością izolacji 2,0, znormalizowaną energią kolizyjną 35, Activation Q 0,250 oraz czasem aktywacji 30 ms.
  3. Analizy bioinformatyczne i sieciowanie molekularne
    1. Analizować wzory fragmentacji dla każdego intensywnego jonu przy użyciu specjalistycznego oprogramowania MS.
    2. Użyć programu MS-Cluster do klastrowania danych (tolerancja masy jonu macierzystego 1,0 Da i tolerancja jonu fragmentacyjnego MS/MS 0,5 Da). Widma konsensusowe zawierające mniej niż 2 widma są eliminowane.
    3. Dane MS/MS przeanalizować za pomocą GNPS (Global Natural Products Social36) w celu stworzenia sieci molekularnych.
    4. Porównać parami widma konsensusowe oraz zestawić je z widmami raportowanymi w bibliotekach GNPS-Mass-Ive.
    5. Zwizualizować uzyskaną sieć37.
      UWAGA: W kwestii sieciowania molekularnego należy odnieść się do publikacji Sigrist et al. 202038.

Schemat procesu identyfikacji taksonomicznej; obejmuje analizę 16S, LC-HRMS/MS, sieciowanie molekularne.
Rysunek 3: Etapy laboratoryjne FDS (3-4). Przedstawienie wizualne głównych działań prowadzonych w laboratorium po pobraniu próbek (etapy 3 i 4). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

W pierwszej badaniu3 cztery obszary poddane wpływowi antropogenicznemu wzdłuż wybrzeża Kampanii w południowo-zachodnich Włoszech były obserwowane przy użyciu satelity Landsat 8 oraz samolotu podczas lata 2015 roku. Operacyjny obrazownik lądowy (OLI) satelity Landsat 8 oraz multispektralna kamera lotnicza pozwoliły na stworzenie obrazów z wykorzystaniem znormalizowanego różnicowego wskaźnika wody (NDWI) dla tych obszarów, co umożliwiło wykrycie obecności społeczności cyjanobakterii. Skład społeczności cyjanobakterii określono za pomocą analiz spektrofotometrycznych w celu wykrycia pigmentu cyjanobakterii – fikocyjaniny (PC). Następnie uzupełniająca analiza metagenomiczna 16S pozwoliła na identyfikację taksonów cyjanobakterii. Uproszczone indeksowanie i klasyfikacja obrazów multispektralnych za pomocą platform satelitarnych i lotniczych w połączeniu z analizami metagenomicznymi okazały się skuteczne w wykrywaniu obecności cyjanobakterii należących do rodzajów związanych z silną eutrofizacją (takich jak Leptolyngbya sp., Pseudooscillatoria sp.) na wczesnym etapie zakwitu.

W drugim badaniu14 podejście FDS przetestowano wiosną i latem 2017 roku. Dane satelitarne posłużyły jako jedyny poziom teledetekcji. Szczegółowo, dane pozyskane za pomocą czujnika MODerate Image Spectroradiometer (MODIS), zamontowanego na platformach satelitarnych Terra i Aqua, pozwoliły na ilościowe określenie zawartości chlorofilu-a (Chl-a) w zbiornikach wodnych wzdłuż wybrzeży Kampanii i posłużyły do wyboru dziesięciu punktów poboru prób. Próbki poddano obróbce laboratoryjnej poprzez obserwacje mikroskopowe i identyfikację taksonomiczną, a następnie przeprowadzono ekstrakcję rozpuszczalnikami organicznymi. Ekstrakty organiczne przeanalizowano metodą LC-MS-MS. Dane uzyskane metodą MS-MS przeanalizowano bioinformatycznie, wykorzystując platformę GNPS do stworzenia sieci cząsteczek. Sieć przeanalizowano w celu wykrycia i identyfikacji toksyn, porównując dane widm fragmentacyjnych uzyskanych metodą spektrometrii mas z biblioteką GNPS. Pozwoliło to na wykrycie znanych toksyn oraz nieznanych analogów, które pojawiały się jako powiązane w tej samej sieci molekularnej. W szczególności we wszystkich próbkach wody oraz próbkach małż dwudławców wykryto lyngbyatoksynę A, która jest lipofilną dermatotoksyną; w klastrze molekularnym lyngbyatoksyny A obecne były również węzły niezwiązane z żadnymi znanymi związkami z rodziny lyngbyatoksyn, co sugeruje obecność nieznanych analogów lyngbyatoksyny. W próbkach nie wykryto mikrocystyn ani innych toksyn. Wszystkie wyniki uzyskano w ciągu 24 roboczogodzin.

Teledetekcja jakości wody; schemat; analiza danych satelitarnych, monitoring wybrzeża, wpływ ekologiczny.
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki FDS. Przykład zastosowania strategii FDS na wybrzeżu Kampanii (Włochy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W ciągu ostatnich lat nasz zespół przetestował i zwalidował kilka różnych podejść, które pozwoliły na rozwikłanie zagadki obecności cyjanobakterii i cyjanotoksyn w zbiornikach wodnych i małżach. Nowo opracowana strategia stanowi wynik tych badań. Optymalne techniki i technologie, które mieszczą się w zakresie szybkiego wykrywania, są zebrane pod kapeluszem unikalnej procedury, która maksymalizuje skuteczność każdego pojedynczego kroku. Obszar docelowy, przedłużenie kwitnienia i faza wzrostu są siłą napędową wyboru odpowiednich metod i technologii do zastosowania.

Gdy priorytetem jest szybkie wykrywanie sinic i sinic, strategia jest usprawniana, redukując całkowitą liczbę do czterech głównych kroków: (1) Zdalne i proksymalne wykrywanie oraz analiza danych do pierwszego badania, lokalizacja miejsc oraz określenie wzorca i zasięgu zakwitu; (2) Kontrolowane pobieranie próbek; (3) Obserwacja mikroskopowa i analiza taksonomiczna; (4) Analiza chemiczna i sieć molekularna danych LC-MS w celu dereplikacji próbek wody i szybkiego wykrywania cyjanotoksyn.

Jeśli chodzi o pierwszy krok, nawet jeśli dostępność danych pozyskanych przez kompletny łańcuch platform, które obejmują wszystkie warstwy hierarchicznego podejścia do monitorowania, byłaby najlepszym rozwiązaniem w celu przywrócenia pełnej wizji analizowanego scenariusza, często tylko jedna warstwa informacyjna może napędzać działania związane z badaniem obszaru i skutecznie koncentrować się na gorących punktach w celu wykonania działań związanych z próbkowaniem in-situ. Zgodnie z raportowanymi doświadczeniami, w których dane zostały pozyskane za pomocą satelitów, samolotów, helikopterów, UAV, rozwiązaniem, które całkowicie odpowiada potrzebom wymaganym przez strategię szybkiego wykrywania, jest wykorzystanie samych produktów satelitarnych.

Ponadto warstwy informacyjne, które pochodzą z misji wykonywanych przez platformy, które latają na niższych wysokościach niż satelity (np. samoloty, helikoptery, UAV), przywracają informacje z dużą rozdzielczością, ale są one bardzo kosztowne i wymagają więcej czasu na ukończenie pełnego procesu pozyskiwania, który obejmuje również definiowanie i zatwierdzanie planu lotu.

Po wybraniu miejsc, które mają być próbkami (krok 2), analiza analityczna/bioinformatyczna (Molecular networking of LC-MS data) jest narzędziem do szybkiej dereplikacji próbek wody i szybkiego wykrywania cyjanotoksyn (kroki 3 i 4). Analiza metagenomiczna 16S zajmuje co najmniej 2 tygodnie pracy. Co więcej, nawet w przypadku zidentyfikowania gatunków sinic, które są ogólnie toksyczne, nie wykazano ich produkcji toksyn. Z tego samego powodu obserwacja mikroskopowa sama w sobie nie wystarcza do ujawnienia obecności toksycznych sinic. Oczywiście analiza stwardnienia rozsianego i sieci molekularne mają pewne ograniczenia; Są one dość skuteczne, jeśli interesujące związki (np. toksyny) są dobrze zjonizowane w stosowanych warunkach, jeśli są w wystarczającej ilości, aby można je było wykryć. Na potrzeby znanego wykrywania i monitorowania toksyn sinicowych, sieci molekularne oparte na stwardnieniu rozsianym stanowią w rzeczywistości jedną z bardziej niezawodnych i niezawodnych technologii.

Dlatego podejście to okazuje się bardzo przydatne, gdy potrzebne jest szybkie wykrycie cyjanobakterii i pokrewnych cyjanotoksyn; Co więcej, dzięki tej strategii możliwe jest również ilościowe określenie zarówno zakwitu sinic, jak i toksyn w przestrzeni i czasie, aby zapobiec problemom społeczności zdrowotnych, które mogą powstać w wyniku dużych toksycznych zakwitów sinic.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez "Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)" w ramach projektu "Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella fascia costiera della regione Campania" i przeprowadzone we współpracy z Agencją Ochrony Środowiska Regionu Kampania, Włochy (ARPAC), "Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno/Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare" (IZSM/ORSA), Uniwersytet w Neapolu "Federico II" - Wydział Medycyny Weterynaryjnej i Produkcji Zwierzęcej, zob. prof. A. Anastasio).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10X MieszankaKwas nikotynowy 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 ml; Biotyna 1 mg/100 ml; Tiamina 200 mg/100 ml; B12 1 mg/100 ml; Kwas foliowy 1 mg/100 ml; inozytol 1 mg/100 ml; Ca-pantotenian 100 mg/100 ml
1-BuOHSigma-Aldrich33065.2.5L-R
BG11 roztwórNa2EDTA 20 mg/L; Cytrynian żelazowo-amonowy 120 mg/l; Kwas cytrynowy i middot; 1H2O 120 mg/L; CaCl2· 2H2O 700 mg/L, MgSO4· 7H2O 1,5 g/L, K2HPO4· 3H2O 800 mg/L, NiSO4(NH4)2SO4· 6H2O (0,1 mM zapasy) 5 ml; Na2SeO4 (0,1 mM zapasu) 2 ml, roztwór Nitscha 20 ml
WirówkaHermleZ36HK
CHCl3Honeywell32211.2.5L
H2OSigma-Aldrich34877.2.5L
Kinetex C18 cloumnPhenomenex
Spektrometr masowy ESI o wysokiej rozdzielczości LTQ Orbitrap XL sprzężony z systemem HPLC U3000Thermo
MeOHHoneywell32213.2.5L
wyposażony w kamerę OMAX 18 MP CMOS Kamera wielopasmowa OptechBiostar B3
Intergraph DMC
RozwiązanieH3BO3 0,5 g/L
MnSO4· H2O 2,28 g/L
ZnSO4· 7H2O 0,5 g/L
CuSO4· 5H2O 0,025 g/L
COCl2· 6H2O 0,135 g/L
Na2MoO4· 2H2O 0,025 g/L
Refraktomer mr 100 ATCAQL
SWBG11 podłożeBG11 roztwór podstawowy 50 ml/l; Instant Ocean 33 g/L; Woda 950 mL/L 10X; Mieszanka witaminowa 100 &mikro; L/L
witamin podstawowy Mikroskop Nitscha

Bibliografia

  1. Tamele, I. J., Silva, M., Vasconcelos, V. The incidence of marine toxins and the associated seafood poisoning episodes in the African countries of the Indian ocean and the Red sea. Toxins. 11 (1), 25-48 (2019).
  2. Lürling, M., Faassen, E. J. Dog poisonings associated with a Microcystis aeruginosa bloom in the Netherlands. Toxins. 5 (3), 556-567 (2013).
  3. O'Neil, J. M., Davis, T. W., Burford, M. A., Gobler, C. J. The rise of harmful cyanobacteria blooms: The potential roles of eutrophication and climate change. Harmful Algae. 14, 313-334 (2012).
  4. Teta, R., et al. Cyanobacteria as indicators of water quality in Campania coasts, Italy: A monitoring strategy combining remote/proximal sensing and in situ data. Environmental Research Letters. 12 (2), (2017).
  5. Teta, R. Bioindicators as a tool in environmental impact assessment: Cyanobacteria as a sentinel of pollution. International Journal of Sustainable Development and Planning. 14 (1), 1-8 (2019).
  6. Teta, R., Della Sala, G., Mangoni, A., Lega, M., Costantino, V. Tracing cyanobacterial blooms to assess the impact of wastewaters discharges on coastal areas and lakes. International Journal of Sustainable Development and Planning. 11 (5), 804-811 (2016).
  7. Teta, R., et al. A joint molecular networking study of a: Smenospongia sponge and a cyanobacterial bloom revealed new antiproliferative chlorinated polyketides. Organic Chemistry Frontiers. 6 (11), 1762-1774 (2019).
  8. Singh, R. K., Tiwari, S. P., Rai, A. K., Mohapatra, T. M. Cyanobacteria: an emerging source for drug discovery. Journal of Antibiotics. 64 (6), 401-412 (2011).
  9. Huisman, J., et al. Cyanobacterial blooms. Nature Reviews Microbiology. 16 (8), 471-483 (2018).
  10. Gupta, N., Pant, S. C., Vijayaraghavan, R., Rao, P. V. L. Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants (LR, RR, YR) in mice. Toxicology. 188 (2-3), 285-296 (2003).
  11. WHO. Cyanobacterial toxins: Microcystin-LR in drinking water. Background document for development of WHO Guidelines for Drinking-Water Quality. WHO. 2, (1998).
  12. Agha, R., Cirés, S., Wörmer, L., Domínguez, J. A., Quesada, A. Multi-scale strategies for the monitoring of freshwater cyanobacteria: Reducing the sources of uncertainty. Water Research. 46 (9), 3043-3053 (2012).
  13. Giménez-Campillo, C. Determination of cyanotoxins and phycotoxins in seawater and algae-based food supplements using ionic liquids and liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry. Toxins. 11 (10), 610(2019).
  14. Sanseverino, I., António, D. C., Loos, R., Lettieri, T. Cyanotoxins: methods and approaches for their analysis and detection. JRC Technical Reports. , (2017).
  15. Teta, R. Combined LC-MS/MS and molecular networking approach reveals new cyanotoxins from the 2014 cyanobacterial bloom in Green Lake, Seattle. Environmental Science and Technology. 49 (24), 14301-14310 (2015).
  16. Esposito, G., et al. A fast detection strategy for cyanobacterial blooms and associated cyanotoxins (FDSCC) reveals the occurrence of lyngbyatoxin A in campania (South Italy). Chemosphere. 225, 342-351 (2019).
  17. Lega, M., Casazza, M., Teta, R., Zappa, C. J. Environmental impact assessment: a multilevel, multi-parametric framework for coastal waters. International Journal of Sustainable Development and Planning. 13 (8), 1041-1049 (2018).
  18. Di Fiore, V. Integrated hierarchical geo-environmental survey strategy applied to the detection and investigation of an illegal landfill: A case study in the Campania Region (Southern Italy). Forensic Science International. 279, 96-105 (2017).
  19. Gargiulo, F., Persechino, G., Lega, M., Errico, A. IDES project: A new effective tool for safety and security in the environment. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , 8286 LNCS (PART 2) (2013).
  20. Ferrara, C., Lega, M., Fusco, G., Bishop, P., Endreny, T. Characterization of terrestrial discharges into coastal waters with thermal imagery from a hierarchical monitoring program. Water. 9 (7), Switzerland. (2017).
  21. Alfeo, A. L., Cimino, M. G. C. A., De Francesco, N., Lega, M., Vaglini, G. Design and simulation of the emergent behavior of small drones swarming for distributed target localization. Journal of Computational Science. 29, 19-33 (2018).
  22. Casazza, M., Lega, M., Liu, G., Ulgiati, S., Endreny, T. A. Aerosol pollution, including eroded soils, intensifies cloud growth, precipitation, and soil erosion: a review. Journal of Cleaner Production. 189, 135-144 (2018).
  23. U.S. Geological Survey. , Available from: https://ers.cr.usgs.gov (2020).
  24. NASA Earthdata. , Available from: https://urs.earthdata.nasa.gov (2020).
  25. Copernicus Opern Access Hub. , Available from: https://scihub.copernicus.eu/apihub (2020).
  26. MODerate Image Spectroradiometer (MODIS) Aqua. , Available from: podaac-tools.jpl.nasa.gov (2020).
  27. Chen, H. -H., Tang, R., Zhang, H. -R., Yu, Y., Wang, Y. Investigating the relationship between sea surface chlorophyll and major features of the south china sea with satellite information. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
  28. QGIS. , Available from: https://www.qgis.org/it/site/ (2020).
  29. Congedo, L. Semi-automatic classification plugin documentation release 4.8.0.1. , Available from: https://manualzz.com/doc/7130012/semi-automatic-classification-plugin-documentation (2016).
  30. Rouse, J. W., Hass, R. H., Schell, J. A., Deering, D. W. Monitoring vegetation systems in the great plains with ERTS. Third Earth Resources Technology Satellite (ERTS) Symposium. 1, 309-317 (1973).
  31. Carmona, F., Rivas, R., Fonnegra, D. C. Vegetation index to estimate chlorophyll content from multispectral remote sensing data. European Journal of Remote Sensing. 48 (1), 319-326 (2015).
  32. Savtchenko, A., et al. MODIS data from terra and aqua satellites. International Geoscience and Remote Sensing Symposium (IGARSS). 5, 3028-3030 (2003).
  33. Binding, C. E., Greenberg, T. A., McCullough, G., Watson, S. B., Page, E. An analysis of satellite-derived chlorophyll and algal bloom indices on Lake Winnipeg. Journal of Great Lakes Research. 44 (3), 436-446 (2018).
  34. Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86, 295-335 (2014).
  35. Esposito, G., et al. Chlorinated thiazole-containing polyketide-peptides from the caribbean sponge smenospongia conulosa: structure elucidation on microgram scale. European Journal of Organic Chemistry. 2016 (16), 2871-2875 (2016).
  36. UCSD Commputational Mass Spectrometer Website. , Available from: http://gnps.ucsd.edu/ (2020).
  37. Shannon, P. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  38. Sigrist, R., Paulo, B. S., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. Mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zakwity cyjanobakteriidetekcja cyjanotoksynteledetekcjanadz r dronowyanaliza LC MS MSsieciowanie molekularneplatforma GNPStaksonomia mikroskopowaekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi
Wczesne wykrywanie zakwitów sinic i związanych z nimi cyjanotoksyn przy użyciu strategii szybkiego wykrywania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.