Artykuł metodologiczny

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

DOI:

10.3791/61890

⸱

22 grudnia 2020

 ,  , 
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, Goettingen, Germany, 2DZHK (German Center for Cardiovascular Research), Partner Site Goettingen, Germany, 3Cairn Research Ltd, Faversham, United Kingdom, 4Cluster of Excellence "Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells" (MBExC), University of Goettingen, Germany

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalne techniki wewnątrzkomórkowych mikroelektrod do ilościowego określania elektrofizjologii kardiomiocytów są niezwykle złożone, pracochłonne i zazwyczaj przeprowadzane z niską przepustowością. Szybki i ciągły rozwój technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) stanowi nowy standard w badaniach sercowo-naczyniowych, a alternatywne metody są obecnie niezbędne do zwiększenia przepustowości danych elektrofizjologicznych na poziomie pojedynczej komórki. VF2.1Cl to niedawno uzyskany barwnik wrażliwy na napięcie, który zapewnia szybką, jednokanałową, wysoką reakcję na wahania potencjału błony. Posiada kinetykę lepszą niż inne istniejące wskaźniki napięcia i udostępnia dane funkcjonalne równoważne z tradycyjnymi technikami mikroelektrodowymi. W tym miejscu demonstrujemy uproszczoną, nieinwazyjną charakterystykę potencjału czynnościowego w zewnętrznie stymulowanych ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu modułowego i bardzo przystępnego cenowo systemu fotometrycznego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrofizjologiczne modelowanie kardiomiocytów i budowa efektywnych platform do badań przesiewowych leków nasercowych jest niezbędne do opracowania strategii terapeutycznych dla różnych zaburzeń arytmii. Szybki rozwój technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przyniósł obiecujące postępy w modelowaniu chorób u ludzi i badaniach farmakologicznych z wykorzystaniem izolowanych kardiomiocytów pochodzących od pacjenta (iPSC-CM). "Złoty standard" technik elektrofizjologicznej charakterystyki tych komórek za pomocą patch-clamp (current-clamp) może określić ilościowo morfologię i czas trwania potencjału czynnościowego (AP), jednak ta metoda jest niezwykle złożona i powolna, a także nie nadaje się do akwizycji danych o wysokiej przepustowości1. Regularnie zgłasza się, że iPSC-CM mają zwiększony rozkurczowy potencjał błonowy i zwiększony prąd upływowy w porównaniu z dorosłymi natywnymi kardiomiocytami2. Sugeruje się, że mniejszy rozmiar komórki i zmniejszona pojemność błony obserwowane w iPSC-CM mogą powodować pewien błąd systematyczny podczas korzystania z techniki cęgów prądowych, co być może wyjaśnia te odchylenia3. Aby zmaksymalizować użyteczność platformy iPSC-CM, cenna jest dodatkowa metoda zwiększająca przepustowość i zapewniająca dokładność danych podczas charakteryzowania transbłonowych zmian napięcia na poziomie pojedynczej komórki w iPSC-CM.

Barwniki wrażliwe na napięcie (VSD) od dawna są proponowaną metodą zapewniającą szybszą, nieinwazyjną i równoważną analizę kinetyki AP serca w porównaniu do tradycyjnych technik4. Niedawne badanie wykazało przydatność ratiometrycznej fotometrii sondy wrażliwej na napięcie do dokładnego ilościowego określenia serca AP5. Co więcej, możliwość łatwego zwiększania skali podejść do fotometrii optycznej nadaje tę technikę do badań przesiewowych kardiotoksyczności na dużą skalę, które mają kluczowe znaczenie w opracowywaniu leków terapeutycznych (np.). Opracowanie standaryzowanych protokołów kardiotoksyczności w zaślepionym badaniu wieloośrodkowym z wykorzystaniem układu mikroelektrod i technik optycznych wykrywania napięcia wykazało kluczową wartość tego podejścia6.

Wiele barwników potencjometrycznych jest dostępnych na rynku, a ciągły rozwój nowych sond syntetycznych wykazuje ekscytujący potencjał do usprawnienia ich skuteczności w różnych konstruktach sercowych i neuronowych. Idealny VSD będzie miał zwiększoną kinetykę i czułość, jednocześnie wykazując zmniejszone obciążenie pojemnościowe, fotobielenie i cytotoksyczność. Niedawno zsyntetyzowany VF2.1Cl (FluoVolt) wyraża wiele z tych korzystnych właściwości, głównie dzięki swojej nowatorskiej strukturze molekularnej opartej na drutach, wspólnej dla innych członków nowej rodziny VoltageFluor (VF)7. W przeciwieństwie do zwykłych elektrochromowych VSD, w których proste sondy molekularnie i elektrycznie sprzęgają się z błoną plazmatyczną, barwnik ten składa się z pasywnie wstawionego, rozciągającego się na błonę syntetycznego drutu, który łączy bogaty w elektrony donor ze zmodyfikowanym fluoroforem fluoresceinowym (FITC). Szczegóły mechanistyczne znajdują się w Rysunek 1. Barwnik ten wykazuje doskonałą wrażliwość na wahania napięcia membrany, wykazując 27% zmianę intensywności emisji na 100 mV, w przeciwieństwie do ~10% obserwowanej w innych popularnych sondach przy porównywalnych prędkościach7. Ponadto przewodowe systemy PeT nie oddziałują bezpośrednio z komórkowym polem elektrycznym, co powoduje minimalne zakłócenia elektryczne i znikome zmiany w obciążeniu pojemnościowym komórek.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Parametry chemiczne, spektralne i mechanistyczne barwnika VF2.1Cl. (A) Struktura chemiczna VF2.1Cl. Cechy molekularne, na które należy zwrócić uwagę, obejmują wiele grup alkilowych w przewodzie molekularnym fenylenu winylenu, które ułatwiają wprowadzenie do błony plazmatycznej. Ujemnie naładowana grupa kwasu sulfonowego sprzężona z sondą FITC zapewnia stabilizację fluoroforu na powierzchni zewnątrzkomórkowej i pomaga w prawie prostopadłym wstawieniu względem pola elektrycznego dwuwarstwy lipidowej. (B) Uproszczony schemat prostopadłego osadzania VF2.1Cl w błonie plazmatycznej komórki docelowej. (C) Widma absorpcyjne i emisyjne barwnika VF2.1Cl. Widma są identyczne jak w przypadku standardowych sond FITC i GFP. (D) Przedstawienie mechanistycznego sposobu działania VF2.1Cl. W warunkach spoczynku (hiperpolaryzacja) ujemne napięcia wewnątrzkomórkowe kierują wolne elektrony w kierunku fluoroforu rostralnego. Obfitość elektronów zapewnia, że fotoindukowany transfer elektronów (PeT) jest faworyzowany jako ścieżka wyjścia ze stanu wzbudzonego po wzbudzeniu optycznym, skutecznie wygaszając fluorescencję. W przeciwieństwie do tego, zdepolaryzowany potencjał błonowy wpływa na ruch elektronów w dół, sprzyjając fluorescencji przy wzbudzeniu optycznym. Uzyskana w ten sposób odpowiedź fluorescencyjna jest liniowo związana z napięciem membrany i może być precyzyjnie wykorzystana do zebrania szczegółowych informacji czasowych na temat elektrofizjologicznej kinetyki komórkowej. (E) Reprezentatywne jasne pole (górne) i fluorescencja przy 470 nm (dolne) obrazy kardiomiocytów leporyny obciążonych VF2.1Cl. (F) Stos Z pojedynczego załadowanego kardiomiocytu. Strzałki wskazują obszary wyraźnej lokalizacji VF2.1Cl do błony komórkowej. Obrazy uzyskano za pomocą systemu konfokalnego z wirującym dyskiem, składającego się z głowicy konfokalnej X-lightv3 z wirującym dyskiem o układzie otworkowym 50 μm; Oświetlacz LDI-7; Aparat Prime95B i obiektyw PlanApo Lambda 100x. Podziałka skali: 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Sonda FITC sprzężona z VF2.1Cl zapewnia, że może być efektywnie używana w standardowych konfiguracjach filtrów i GFP, a wymaga tylko jednokanałowego systemu akwizycji, co jest wspólną cechą platform obrazowania fluorescencyjnego. Niedawno opublikowano analizę gęstych ludzkich monowarstw iPSC-CM z tym barwnikiem8,9,10,11. Nasz protokół różni się od tych badań ze względu na to, że badamy pojedyncze, izolowane iPSC-CM, niezakłócone elektrycznymi i parakrynnymi wpływami gęstych monowarstw syncytialnych, oraz używamy niedrogiego i konfigurowalnego systemu fotometrycznego, w przeciwieństwie do złożonych układów obrazowania konfokalnego lub szerokokątnego.

Tutaj opisujemy nasz protokół szybkiego pozyskiwania i analizy wytrzymałych optycznych punktów dostępowych z izolowanych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC i natywnych kardiomiocytów (zobacz Plik uzupełniający). Używamy VF2.1Cl w połączeniu z konfigurowalną, najnowocześniejszą platformą do pomiarów fotometrycznych pojedynczych komórek. Te protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Getyndze (nr 10/9/15).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparaty komórkowe

UWAGA: Ludzkie iPSC użyte w tym protokole pochodziły od zdrowych dawców i zostały zróżnicowane w monowarstwy przy użyciu w pełni zdefiniowanej modulacji małych cząsteczek sygnalizacji WNT i technik oczyszczania mleczanu, jak wcześniej opisano12,13,14. iPSC-CM utrzymywano co 2-3 dni za pomocą pożywki hodowlanej opisanej poniżej.

  1. Przygotować pożywkę z pożywką podstawową (RPMI 1640) i 2% suplementem (B27). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Stosować w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Przygotować pożywkę galwaniczną składającą się z podłoża podstawowego (RPMI 1640), 2% suplementu (B27) i inhibitora ROCK w skali 1:2000. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Stosować w temperaturze pokojowej.
  3. Pokryj wysterylizowane szkiełka nakrywkowe ze szkła okrągłego o średnicy 10 mm #0 w 150 μl matrycy membrany podstawnej w skali 1:60 i inkubuj w temperaturze 4 °C przez 4 godziny
    UWAGA: Optymalizacja objętości szkiełka nakrywkowego jest konieczna, aby zapewnić pokrycie całej szklanki przy zachowaniu odpowiedniego napięcia powierzchniowego, aby zapobiec rozlaniu. 150 μl jest zalecane dla szkiełek nakrywkowych okrągłych 10 mm. Wielkość partii, rodzaj szkiełka nakrywkowego, objętość szkiełka nakrywkowego i typ płytki hodowlanej mogą być dostosowane do potrzeb eksperymentatorów.
  4. Rozpocznij dysocjację iPSC-CM za pomocą odczynnika do dysocjacji komórek na bazie EDTA. Upewnij się, że monowarstwa została całkowicie odłączona, delikatnie przepłukując ją pipetą o pojemności 1 000 μl.
  5. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml i dodać pożywkę galwaniczną o podwójnej objętości. Wirować przez 10 minut przy 100 x g.
  6. Zawiesić osad z żądaną objętością (objętość do reprodukcji) podłoża galwanicznego. Policz komórki ręcznie lub elektronicznie.
  7. Wybierz optymalną gęstość na szkiełko nakrywkowe (15 000), co pozwoli na późniejszą izolowaną analizę komórkową.
  8. Obliczyć objętość "aktywnej" zawiesiny komórkowej (A) potrzebnej do pokrycia wszystkich szkiełek nakrywkowych w tej pożądanej gęstości. Zastosuj następującą formułę i wyjmij do osobnej tuby:
    figure-protocol-1
  9. Obliczyć objętość dodatkowego podłoża galwanicznego (B) potrzebnego do umieszczenia każdego szkiełka nakrywkowego w żądanej objętości. Zastosuj następującą formułę i dodaj powstałą objętość do probówki z aktywną zawiesiną:
    figure-protocol-2
  10. Usunąć matrycę z szkiełek nakrywkowych i nałożyć "objętość szkiełka nakrywkowego" zawiesiny komórek (A+B) na każde szkiełko nakrywkowe. Regularne zawieszanie w probówce, aby zapewnić równomierne rozprowadzanie komórkowe.
  11. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Delikatnie napełnić studzienkę podłożem galwanicznym.
  12. Po 24 godzinach wymienić pożywkę na normalną pożywkę hodowlaną i utrzymywać co 2-3 dni.

2. Konfiguracja eksperymentalna

  1. Wyposaż odwrócony mikroskop epifluorescencyjny w obiektyw o powiększeniu 40x i dużej aperturze numerycznej (NA: > 0,75) do przeprowadzania eksperymentów.
  2. Sprzęgnij szybko przełączającą się ciepłą białą diodę LED z portem transmitowanego oświetlenia mikroskopu. Włóż prosty czerwony filtr 660 nm do ścieżki światła przechodzącego.
    UWAGA: Światło to może być aktywowane podczas eksperymentów fotometrycznych w celu obserwacji próbki bez zanieczyszczania zielonego sygnału fluorescencyjnego.
  3. Zamontuj szybko przełączającą głowicę LED 470 nm do rejestracji fotometrycznej. Umieść filtr wzbudzenia 470/40 w epifluorescencyjnym porcie mikroskopu, aby oczyścić światło generowane przez diodę LED.
    UWAGA: W celu optymalnej kwantyfikacji sygnału zalecany jest system oświetlenia z szybkim sterowaniem wyjściem optycznym ze sprzężeniem zwrotnym.
  4. Włóż kostkę mikroskopu zawierającą rozdzielacz wiązki o długości 495 nm do karuzeli lustrzanej w mikroskopie.
  5. Zamontuj ramię detekcyjne zawierające regulowaną membranę polową do portu C-mount mikroskopu, aby umożliwić wybór obszaru zainteresowania.
  6. Oddzielnie podłącz detektor fotopowielacza (PMT) i kamerę USB do mikroskopu. Będzie to stanowić podstawę systemu wykrywania emisji.
  7. Włóż kostkę filtracyjną zawierającą rozdzielacz wiązki długiego przepustu 565 nm i filtr emisji 535/50 do portu PMT. Powoduje to rozszczepienie światła emisyjnego między dwoma detektorami.
    UWAGA: Kamera podłączona do portu nadawczego systemu detekcji emisji może wykrywać światło przepuszczane w jasnym polu we wszystkich eksperymentach.
  8. Podłącz PMT do zasilacza i wzmacniacza PMT. Podłącz PMT amplifier wyjście do analogowego pinu wejściowego systemu akwizycji danych.
  9. Filtruj dane analogowe z PMT przy 1 kHz lub wyższym.
  10. Digitalizuj dane z częstotliwością, która jest co najmniej dwukrotnie wyższa niż najwyższa częstotliwość obecna w sygnale analogowym (2 kHz lub więcej), aby spełnić kryteria Nyquista i zapobiec aliasowaniu.

3. Ładowanie komórkowe za pomocą VF2.1Cl

UWAGA: Wszystkie kroki związane z tym barwnikiem muszą być wykonywane w warunkach słabego oświetlenia.

  1. Przygotować roztwór do kąpieli Tyrode'a o stężeniu (w mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glukoza, 4 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, pH = 7,35 i ogrzać do 37 °C.
  2. Przygotować porcję roztworu ładującego w probówce mikrowirówki, mieszając 5 μL 1,000x VF2,1Cl i 50 μL 20% solubilizującego roztworu poloksamera.
  3. Nałożyć 5 μl roztworu nasycającego na 5 ml podgrzanego roztworu Tyrode'a (całkowite stężenie barwnika 0,1x) na szalce Petriego o średnicy 20 mm.
    UWAGA: Końcowe stężenie barwnika wynosi 0,1x. Jest to 1/10tego, co sugeruje producent. Oszczędza to zasoby, zapewnia znikomą cytotoksyczność i, co ważne, nadal zachowuje wyraźne sygnały optyczne z obciążonych komórek o wysokim stosunku sygnału do szumu.
  4. Dodać do naczynia pojedyncze szkiełko nakrywkowe iPSC-CM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
  5. Zamontuj podgrzewaną komorę obrazowania żywych komórek. Zamontuj na stoliku mikroskopu i napełnij 500 μl świeżego roztworu Tyrode.
  6. Szkiełko nakrywkowe umyć świeżym roztworem Tyrode'a w temperaturze 37 °C.
  7. Ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe iPSC-CM na wstępnie ogrzaną komorę kąpieli za pomocą cienkich kleszczyków punktowych.
    UWAGA: Upewnij się, że komora i jej zawartość są zawsze podgrzewane w temperaturach fizjologicznych. W razie potrzeby należy rozpocząć od ciągłej perfuzji podgrzanego roztworu Tyrode.

4. Stymulacja polem elektrycznym

UWAGA: Zewnętrzne wyzwalanie iPSC-CM jest opcjonalne, ale przydatne do standaryzacji dynamiki komórkowej i parametrów eksperymentalnych. Zwiększa to łatwość analizy i pozwala na badanie efektów zależnych od częstotliwości.

  1. Podłącz wkładkę stymulacyjną z dwiema platynowymi elektrodami oddalonymi od siebie o 5 mm do komory nagrywania.
  2. Podłącz zewnętrzny stymulator do wkładki stymulacyjnej. Ustawione na 5 ms impulsy pola bipolarnego przy 0,5 Hz.
  3. Określ optymalne napięcie stymulacji, zwiększając bodziec od 1 V w górę. Bodziec progowy definiuje się jako najniższe napięcie, przy którym komórki zaczynają się kurczyć. Zastosuj napięcia około 25% powyżej tego progu. Normalny zakres wynosi od 1 V do 30 V.
  4. Ustal częstotliwość stymulacji za pomocą zewnętrznego stymulatora lub wyzwól ją za pomocą oprogramowania do akwizycji.

5. Akwizycja optycznego potencjału czynnościowego

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje komercyjne oprogramowanie do akwizycji i analizy.

  1. Wizualizuj miocyty w widoku jasnego pola za pomocą ścieżki światła przechodzącego i kamery USB.
  2. Wybierz izolowaną komórkę i ciasno przytnij jej ścieżkę optyczną za pomocą membrany polowej, upewniając się, że monitorowane jest tylko światło z komórki będącej przedmiotem zainteresowania.
  3. Aktywuj wzmacniacz PMT i ustaw zasilanie PMT na 750 V.
  4. Uruchom protokół stymulacji (patrz krok 4) wraz z oprogramowaniem akwizycyjnym i jednocześnie aktywuj światło wzbudzenia 470 nm. To ostatnie może odbywać się za pomocą zdalnego panelu lub automatycznie ze stałym natężeniem (sygnał TTL).
  5. Dostosuj wzmocnienie i przesunięcie wzmacniacza PMT, aby upewnić się, że sygnał nie jest nasycony i jest zoptymalizowany pod kątem zasięgu wykrywania systemu nagrywania.
  6. Rejestruj 10 przemiatania zapewniających wykrywanie stabilnych potencjałów czynnościowych.
  7. Kontynuuj nagrywanie i natychmiast przesuń stolik mikroskopu, aby na krótko uzyskać sygnał tła z obszaru pozbawionego komórek. Wyłącz lampkę wzbudzenia.
    UWAGA: Ta wartość tła (przesunięcie F ) zostanie użyta do uwzględnienia fluorescencji tła.
  8. W razie potrzeby należy przeprowadzić perfuzję miejscową leków referencyjnych, takich jak nifedypina 1 μM, w celu identyfikacji odpowiedzi komórkowych na manipulację farmakologiczną.
  9. Sekwencyjnie powtarzaj kroki 5.2–5.7, za każdym razem zaznaczając nową komórkę. W razie potrzeby należy wymienić szkiełka nakrywkowe, aby zapewnić wysoką obroty eksperymentalne za jednym razem.
    UWAGA: Protokoły ładowania i akwizycji obrazu są opisane w Rysunek 2.

6. Analiza danych

  1. Otwórz zapisane nagranie za pomocą oprogramowania analitycznego i uśrednij 10 przebiegów zawierających wymuszone potencjały czynnościowe z pojedynczej komórki.
  2. Weź średnią sygnału linii podstawowej reprezentującegoprzesunięcie F i odejmij ją od uśrednionej ścieżki.
  3. Obliczać ∆F/F0 według następującego wzoru (gdzie F oznacza fluorescencję, a F0 fluorescencję rozkurczową):
    figure-protocol-3
  4. Zidentyfikuj śladową linię wyjściową (rozkurczową) i obszar zainteresowania (AP) i zmierz pożądane parametry potencjału czynnościowego serca. Obejmuje to między innymi czas rozpadu dla 50% (APD50) i 90% (APD90) repolaryzacji.
  5. Wyeksportuj dane z tej pojedynczej komórki do oprogramowania do arkusza kalkulacyjnego.
  6. Powtórz kroki 6.1 – 6.5 dla wszystkich nagrań. Oceń wyniki za pomocą odpowiednich testów niesparowanych lub analizy wariancji.

figure-protocol-4
Rysunek 2: Protokoły ładowania i akwizycji obrazu. (A) Schemat blokowy kompletnego protokołu ładowania VF2.1Cl dla iPSC-CM i natywnych kardiomiocytów. (B) Uproszczony schemat rozdzielacza wiązki (BS) i konfiguracji filtrów stosowanych w tym protokole do wzbudzania i wykrywania emisji VF2.1Cl w odpowiedzi na zmiany napięcia transbłonowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rycina 3: Profile optycznego potencjału czynnościowego (AP) izolowanych natywnych kardiomiocytów i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (iPSC-CM). (A) Reprezentatywny optyczny AP pojedynczego mysiego kardiomiocytu (w środku) ze średnią ± SEM APD50 i APD90 (n = 7, po prawej). (B

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy podstawowy protokół umożliwiający łatwe pozyskiwanie szczegółowych profili AP z izolowanych iPSC-CM odpowiednich do modelowania elektrofizjologicznego i badań przesiewowych leków sercowych. Wykrywamy regularne, solidne AP z naszych słabo rozsianych iPSC-CM, co sugeruje zarówno funkcjonalność wskaźnika, jak i wierność metodologiczną.

Ze względu na szerokie spektrum komercyjnych metodologii przeprogramowania iPSC i brak standaryzacji protokołów różnicowania serca, modele ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Firma Cairn Research Ltd wsparła tę publikację, pokrywając koszty produkcji pliku wideo.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Cairn Research Ltd. za ich wkład finansowy, który pokrył koszty produkcji tej publikacji. Ponadto dziękujemy Pani Ines Mueller i Pani Stefanie Kestel za ich doskonałe wsparcie techniczne.

Badania autorów są wspierane przez Niemieckie Centrum Badań nad Układem Sercowo-Naczyniowym (DZHK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 oraz w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości - EXC 2067/1- 390729940) oraz Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynniki
0,25 Trypsyna EDTA Gibco 
Suplement B27 Gibco 
CaCl2Carl Roth HN04.2
D(+)-Glukoza bezwodna  BioChemicaITW OdczynnikiA1422
Surowica bydlęca płodu Gibco 10270-106
Zestaw potencjału membranowego FluoVolt Invitrogen F10488
HEPESCarl Roth HN77.4
KClSigma-Aldrich6781.1
LamaninSigma-Aldrich114956-81-9
Matrigel BD354230
NaCl Sigma-Aldrich9265.2
Nifedypina Sigma-Aldrich21829-25-4
Penicylina/StreptomycynaInvitrogen 15140
Inhibitor ROCK Y27632Stemolekuła04-0012-10
RPMI 1640 Średni Gibco 
Versene EDTA Gibco 15040033
Sprzęt
495LP Dichroiczny rozdzielacz wiązki Wzmacniacz Chroma Technology
Axopatch 200B molekularne
Okrągłe szkiełka nakrywkowe, grubość 0Thermo ScientificCB00100RA020MNT0
Digidata 1550BUrządzenia molekularne
Podwójny zasilacz OptoLED Badania Cairn 
Filtr wzbudzenia ET470/40x Chroma Technology
ET535/50mChroma Technology
Wytrawiony hemacytometr NeubaueraHausser Scientific
Kostki filtracyjne Badania Cairn 
Mikroskop odwrócony IX73 Olimpia 
MonoLEDCairn 
Adaptery wieloportowe Badania Cairn 
Stymulator komórek mięśniobójczych Migawka IonOptix
Optomask Badania Cairn 
Kontroler systemu OptoscanCairn Research 
Platforma z kontrolowaną temperaturą PH-1   Instrumenty Warnera 
Detektor fotopowielaczy Badania Cairn 
Wkładka wzmacniacza PMTCairn Research 
Wkładka zasilająca PMTCairn Research 
RC-26G Otwarta komora kąpielowa Instrumenty Warnera 
Adapter sceniczny SA-OLY/2AL Olimpia 
T565lpxr Dichroiczny rozdzielacz wiązki Chroma Technology
T660lpxr Dichroiczny rozdzielacz wiązkiChroma Technology
TC-20 Dwukanałowy regulator temperatury npi Elektroniczny
obiektyw UPLFLN 40XOlympus 
Kolorowa kamera USB 3.0 Źródło
Software
Clampex 11.1Urządzenia molekularne 
Urządzenia molekularneClampfit 11.1
Przechwytywanie IC 2.4 Źródło obrazowania 
Pryzmat 8Graphpad
252000561750404461870010Urządzenia Badania obrazowania 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
  2. Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
  3. Horváth, A., et al. Low resting membrane potential and low inward rectifier potassium currents are not inherent features of hiPSC-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 10 (3), 822-833 (2018).
  4. Salama, G., Morad, M. Merocyanine 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart. Science. 191 (4226), 485-487 (1976).
  5. Hortigon-Vinagre, M., et al. The use of ratiometric fluorescence measurements of the voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS to examine action potential characteristics and drug effects on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 154 (2), 320-331 (2016).
  6. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  7. Miller, E. W., et al. Optically monitoring voltage in neurons by photo-induced electron transfer through molecular wires. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (6), 2114-2119 (2012).
  8. Bedut, S., et al. High-throughput drug profiling with voltage- and calcium-sensitive fluorescent probes in human iPSC-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (1), 44-53 (2016).
  9. McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hiPSC-derived cardiomyocytes. Frontiers in Physiology. 8, 766(2017).
  10. Duncan, G., et al. Drug-mediated shortening of action potentials in LQTS2 human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 26 (23), 1695-1705 (2017).
  11. Asakura, K., Hayashi, S., Ojima, A., Taniguchi, T., Miyamoto, N. Improvement of acquisition and analysis methods in multi-electrode array experiments with iPS cell-derived cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 75, 17-26 (2015).
  12. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  13. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  14. Kleinsorge, M., Cyganek, L. Subtype-directed differentiation of human iPSCs into atrial and ventricular cardiomyocytes. STAR Protocols. , 100026(2020).
  15. Knollmann, B. C., Katchman, A. N., Franz, M. R. Monophasic action potential recordings from intact mouse heart: validation, regional heterogeneity, and relation to refractoriness. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 12 (11), 1286-1294 (2001).
  16. Leopold, J. A., Loscalzo, J. Emerging role of precision medicine in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (9), 1302-1315 (2018).
  17. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235(2013).
  18. Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ Leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
  19. Voigt, N., et al. Cellular and molecular mechanisms of atrial arrhythmogenesis in patients with paroxysmal atrial fibrillation. Circulation. 129 (2), 145-156 (2014).
  20. Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , doi: 10.1093/cvr/cvaa162. Online ahead of print 162(2020).
  21. Gross, E., Bedlack, R. S., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the membrane dipole potential. Biophysical Journal. 67 (1), 208-216 (1994).
  22. Matiukas, A., et al. Near-infrared voltage-sensitive fluorescent dyes optimized for optical mapping in blood-perfused myocardium. Heart Rhythm. 4 (11), 1441-1451 (2007).
  23. Mutoh, H., et al. Spectrally-resolved response properties of the three most advanced fret based fluorescent protein voltage probes. PLoS One. 4 (2), 4555(2009).
  24. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  25. Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. Journal of the American Chemical Society. 137 (33), 10767-10776 (2015).
  26. Deal, P. E., Kulkarni, R. U., Al-Abdullatif, S. H., Miller, E. W. Isomerically pure tetramethylrhodamine voltage reporters. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9085-9088 (2016).
  27. Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochemistry. 24 (21), 5749-5755 (1985).
  28. Fromherz, P., Muller, C. O. Voltage-sensitive fluorescence of amphiphilic hemicyanine dyes in neuron membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 1150 (2), 111-122 (1993).
  29. Salama, G., et al. Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart. Journal of Membrane Biology. 208 (2), 125-140 (2005).
  30. Jin, L., et al. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75 (5), 779-785 (2012).
  31. Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).
  32. Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
  33. Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knöpfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3 (6), 2514(2008).
  34. Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye. The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).
  35. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
  36. Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464(2020).
  37. Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).
  38. Képiró, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kardiomiocyty z ludzkich iPSCobrazowanie z u yciem barwnik w wra liwych na napi ciesystem fotometrycznydetekcja fluorescencjianaliza elektrofizjologicznaprzygotowanie hodowli kom rkowychkonfiguracja rejestracji optycznejzastosowanie w przesiewaniu lek wparametry repolaryzacji

Powiązane artykuły