Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Konwencjonalne techniki wewnątrzkomórkowych mikroelektrod do ilościowego określania elektrofizjologii kardiomiocytów są niezwykle złożone, pracochłonne i zazwyczaj przeprowadzane z niską przepustowością. Szybki i ciągły rozwój technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) stanowi nowy standard w badaniach sercowo-naczyniowych, a alternatywne metody są obecnie niezbędne do zwiększenia przepustowości danych elektrofizjologicznych na poziomie pojedynczej komórki. VF2.1Cl to niedawno uzyskany barwnik wrażliwy na napięcie, który zapewnia szybką, jednokanałową, wysoką reakcję na wahania potencjału błony. Posiada kinetykę lepszą niż inne istniejące wskaźniki napięcia i udostępnia dane funkcjonalne równoważne z tradycyjnymi technikami mikroelektrodowymi. W tym miejscu demonstrujemy uproszczoną, nieinwazyjną charakterystykę potencjału czynnościowego w zewnętrznie stymulowanych ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu modułowego i bardzo przystępnego cenowo systemu fotometrycznego.
Wprowadzenie
Modelowanie elektrofizjologiczne kardiomiocytów oraz budowa wydajnych platform do przesiewania leków kardiologicznych są niezbędne dla opracowania strategii terapeutycznych w przypadku wielu zaburzeń arytmicznych. Szybki rozwój technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przyniósł obiecujące postępy w modelowaniu ludzkich chorób i badaniach farmakologicznych z wykorzystaniem wyizolowanych kardiomiocytów pochodzących od pacjentów (iPSC-CM). Techniki „złotego standardu” w charakteryzacji elektrofizjologicznej tych komórek za pomocą metody patch-clamp (clamp prądowy) pozwalają na ilościowe określenie morfologii i czasu trwania potencjału czyn....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie komórek
UWAGA: Ludzkie iPSC użyte w tym protokole zostały pozyskane od zdrowych dawców i zróżnicowane w monowarstwach przy użyciu w pełni zdefiniowanej modulacji sygnałowej WNT za pomocą małych cząsteczek oraz technik oczyszczania mleczanem, zgodnie z wcześniejszymi opisami12,13,14. iPSC-CM utrzymywano co 2-3 dni w pożywce hodowlanej opisanej poniżej.
- Przygotować pożywkę hodowlaną składającą się z pożywki podstawowej (RPMI 1640) oraz 2% dodatku (B27). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Używać w temperaturze pokojowej (RT....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 3: Profile optycznego potencjału czynnościowego (AP) izolowanych natywnych kardiomiocytów oraz kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-CM). (A) Repreze.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu opisujemy podstawowy protokół umożliwiający łatwe pozyskiwanie szczegółowych profili AP z izolowanych iPSC-CM odpowiednich do modelowania elektrofizjologicznego i badań przesiewowych leków sercowych. Wykrywamy regularne, solidne AP z naszych słabo rozsianych iPSC-CM, co sugeruje zarówno funkcjonalność wskaźnika, jak i wierność metodologiczną.
Ze względu na szerokie spektrum komercyjnych metodologii przeprogramowania iPSC i brak standaryzacji protokołów różnicowania serca, modele .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Firma Cairn Research Ltd wsparła tę publikację, pokrywając koszty produkcji pliku wideo.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Cairn Research Ltd. za ich wkład finansowy, który pokrył koszty produkcji tej publikacji. Ponadto dziękujemy Pani Ines Mueller i Pani Stefanie Kestel za ich doskonałe wsparcie techniczne.
Badania autorów są wspierane przez Niemieckie Centrum Badań nad Układem Sercowo-Naczyniowym (DZHK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 oraz w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości - EXC 2067/1- 390729940) oraz Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| odczynniki | |||
| 0,25 Trypsyna EDTA | Gibco | ||
| Suplement B27 | Gibco | ||
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glukoza bezwodna BioChemica | ITW Odczynniki | A1422 | |
| Surowica bydlęca płodu | Gibco | 10270-106 | |
| Zestaw potencjału membranowego FluoVolt | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedypina | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicylina/Streptomycyna | Invitrogen | 15140 | |
| Inhibitor ROCK Y27632 | Stemolekuła | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Średni | Gibco | ||
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Sprzęt | |||
| 495LP Dichroiczny rozdzielacz wiązki | Wzmacniacz Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B | molekularne | ||
| Okrągłe szkiełka nakrywkowe, grubość 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Urządzenia molekularne | ||
| Podwójny zasilacz OptoLED | Badania Cairn | ||
| Filtr wzbudzenia ET470/40x | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| Wytrawiony hemacytometr Neubauera | Hausser Scientific | ||
| Kostki filtracyjne | Badania Cairn | ||
| Mikroskop odwrócony IX73 | Olimpia | ||
| MonoLED | Cairn | ||
| Adaptery wieloportowe | Badania Cairn | ||
| Stymulator komórek mięśniobójczych | Migawka IonOptix | ||
| Optomask | Badania Cairn | ||
| Kontroler systemu Optoscan | Cairn Research | ||
| Platforma z kontrolowaną temperaturą PH-1 | Instrumenty Warnera | ||
| Detektor fotopowielaczy | Badania Cairn | ||
| Wkładka wzmacniacza PMT | Cairn Research | ||
| Wkładka zasilająca PMT | Cairn Research | ||
| RC-26G Otwarta komora kąpielowa | Instrumenty Warnera | ||
| Adapter sceniczny SA-OLY/2AL | Olimpia | ||
| T565lpxr Dichroiczny rozdzielacz wiązki | Chroma Technology | ||
| T660lpxr Dichroiczny rozdzielacz wiązki | Chroma Technology | ||
| TC-20 Dwukanałowy regulator temperatury | npi Elektroniczny | ||
| obiektyw UPLFLN 40X | Olympus | ||
| Kolorowa kamera USB 3.0 | Źródło | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Urządzenia molekularne | ||
| Urządzenia molekularne | Clampfit 11.1 | ||
| Przechwytywanie IC 2.4 | Źródło obrazowania | ||
| Pryzmat 8 | Graphpad |
Bibliografia
- Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
- Liang, P., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
