Ultradźwięki o wysokiej rozdzielczości mogą pomóc usprawnić eksperymenty wymagające myszy w ciąży w czasie, określając stan ciąży, wiek ciążowy i straty ciąży. Przedstawiono tutaj protokół ilustrujący metody oceny ciąż myszy, a także potencjalne pułapki (artefakty obrazu), które mogą naśladować ciążę.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Czy moja mysz jest w ciąży? Ocena ultrasonograficzna o wysokiej częstotliwości
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mysz jest zwierzęcym modelem ssaków wybieranym przez wiele ludzkich chorób i procesów biologicznych. Biologia rozwojowa często wymaga od myszy w ciąży w stadium określenia procesów ewoluujących w różnych punktach czasowych. Co więcej, optymalna i wydajna hodowla myszy modelowych wymaga oceny ciąż w czasie. Najczęściej myszy są kojarzone przez noc i określa się obecność czopa dopochwowego; Jednak pozytywna wartość predykcyjna tej techniki jest nieoptymalna i trzeba poczekać, aby dowiedzieć się, czy mysz naprawdę jest w ciąży. Biomikroskopia ultrasonograficzna o wysokiej rozdzielczości jest skutecznym i wydajnym narzędziem do obrazowania: 1) Czy mysz jest w ciąży; 2) Do jakiego etapu ciąży osiągnęła mysz; oraz 3) czy występują ubytki wewnątrzmaciczne. Oprócz zarodków i płodów badacz musi również rozpoznać typowe artefakty w jamie brzusznej, aby nie pomylić ich z ciężką macicą. W tym artykule przedstawiono protokół obrazowania wraz z przykładami ilustracyjnymi.
Wprowadzenie
Mysz jest preferowanym modelem ssaków dla wielu ludzkich chorób i procesów biologicznych1,2,3,4. Badania w dziedzinie biologii rozwojowej często wymagają od myszy w ciąży w fazie etapu określania procesów ewoluujących w różnych punktach czasowych5,6,7,8. Co więcej, optymalna i skuteczna hodowla myszy modelowych wymaga oceny ciąż w czasie, szczególnie gdy badacze badają wpływ mutacji genu na rozwój. Zazwyczaj badacze kojarzą heterozygotyczne myszy z nocą, szukają czopa dopochwowego wcześnie następnego ranka i mają nadzieję, że dojdzie do ciąży9. Określenie utraty wewnątrzmacicznej zazwyczaj rozpoczyna się od sprawdzenia noworodka pod kątem mendlowskich proporcji genotypów, a następnie pracy wstecz poprzez poświęcenie ciężarnych myszy na różnych etapach ciąży i odzyskanie zarodków. Badacze mogą określić przyrost masy ciała jako wskaźnik dodatniego wyniku ciąży10,11; jednakże, szczególnie w przypadku myszy modyfikowanych genetycznie, mioty mogą być bardzo małe, a następnie resorbowane, gdy dochodzi do utraty wewnątrzmacicznej, z powodu której przyrost masy ciała może nie być oczywisty (szczególnie we wczesnej ciąży, ~E6,5–8,5). Mysz może wydawać się fałszywie ciężarna, na przykład z powodu łagodnego guza jamy brzusznej. W gruncie rzeczy pracuje się "na ślepo".
Biomikroskopia ultrasonograficzna o wysokiej rozdzielczości pozwala na bezpośrednią wizualizację ciężaru macicy i rozwijających się zarodków myszy12,13,14,15,16. Chociaż początkowo opracowaliśmy metody oceny fizjologii układu sercowo-naczyniowego embrionalnej myszy16,17, dostrzegliśmy użyteczność tej metody obrazowania w usprawnieniu naszej hodowli myszy. W szczególności nie musieliśmy już czekać, aby "zobaczyć", czy mysz jest w ciąży, na podstawie oczywistego przyrostu masy ciała lub porodu miotu; Mogliśmy określić stan ciężaru i szybko ponownie kojarzyć myszy, jeśli matka nie była w ciąży. Co więcej, ubytki wewnątrzmaciczne można również łatwo zobrazować, a oś czasu utraty można określić bez poświęcania myszy (patrz Rysunek 1 dla schematu). W ten sposób można zaoszczędzić czas, cenne modele myszy i fundusze.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie kroki w tym protokole są zgodne z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych opublikowanym przez National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Grossman School of Medicine Uniwersytetu Nowojorskiego.
1. Krycie myszy w przypadku ciąży w określonym czasie
- Sparuj odpowiednią samicę myszy (zwykle heterozygotę) w klatce z odpowiednim samcem myszy (zwykle heterozygotą) w celu krycia przez noc.
- Oddziel myszy następnego ranka. Alternatywnie, stale kojarz samice i samce myszy, zwiększając w ten sposób szanse na ciążę.
UWAGA: Jednak alternatywa nie może zapewnić dokładnie zaplanowanej ciąży, a ocena stopnia zaawansowania zarodków myszy za pomocą ultradźwięków nie jest jasna, zwłaszcza gdy proces chorobowy powoduje wewnątrzmaciczne opóźnienie wzrostu. Jeśli zakłada się, że zarodki będące nosicielami wariantu genu są małe, poszukaj większych rodzeństwa z miotu typu dzikiego, aby ocenić wiek ciążowy.- Opcjonalnie: Poszukaj korka dopochwowego. Jeśli nie ma zatyczki dopochwowej, oznacza to, że samica myszy nie została pokryta. Jeśli istnieje zatyczka dopochwowa, nadal jest prawdopodobne, że samica myszy nie zajdzie w ciążę.
- Czas dzień po nocnym kryciu jako E0,5.
- Wykonaj obrazowanie w E6.5–E.8.5, aby określić ciążę, i ponownie połącz myszy, jeśli mysz nie jest w ciąży (patrz krok 1.1).
UWAGA: Na tym etapie samica matki nie jest w oczywisty sposób w ciąży dla oka; W związku z tym obrazowanie ultrasonograficzne umożliwia wczesne określenie i ponowne krycie.
2. Znieczulenie i przygotowanie myszy
- Umieść ciężarną mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia.
- Zmieszać izofluran z powietrzem w pomieszczeniu lub tlenem medycznym w stężeniu 2%–3% przy natężeniu przepływu 1 l/min, aby wywołać sedację ciężarnej myszy w komorze indukcyjnej.
UWAGA: Sedacja zwykle następuje w ciągu 1–2 minut. Mysz będzie leżeć nieruchomo, a jej oddech zwolni. - Szybko przenieś mysz na platformę obrazowania. Platforma obrazowania zazwyczaj ma również elementy grzewcze, które mogą pomóc w utrzymaniu ciepła myszy.
- Umieść nos myszy w znieczulającym nosku.
- Szybko przekieruj mieszaninę izofluranu i tlenu do nosecone platformy obrazowania. Utrzymuj izofluran na poziomie 2%–3% przy przepływie 1 l/min.
- Określ poziom sedacji przez uszczypnięcie łapy, odruch rogówki, poziom oddychania i dowolny ruch.
UWAGA: Odruch rogówkowy można początkowo określić, nakładając na oczy maść nawilżającą, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas znieczulenia myszy (mysz nie zamyka oczu). - Gdy mysz leży na wznak (na plecach), przyklej łapy do elektrokardiogramu (EKG) platformy obrazowania.
UWAGA: Jednak EKG nie jest konieczne do tego rodzaju obrazowania. - Usuń sierść z brzucha ciężarnej matki w następujący sposób:
- Dokładnie zwilż sierść na brzuchu 70% etanolem, w tym do bocznych krawędzi. Nie nakładaj tak dużo, aby nie spływał na platformę.
UWAGA: Etanol działa lepiej jako smar do golenia niż woda. - Użyj żyletki, aby ostrożnie ogolić brzuch. Uważaj, aby nie przeciąć sutków.
- Wytrzyj ogolone futro z brzucha gazą lub chusteczkami.
- Alternatywnie, po użyciu maszynki do strzyżenia futra użyj kremu do depilacji, aby usunąć większość sierści.
- Dokładnie zwilż sierść na brzuchu 70% etanolem, w tym do bocznych krawędzi. Nie nakładaj tak dużo, aby nie spływał na platformę.
3. Przezbrzuszne obrazowanie (przypuszczalnie) ciężarnej myszy
- Po ogoleniu brzucha zmniejsz dawkę izofluranu do 1%–1,5%, nadal utrzymując szybkość przepływu 1 l/min. Monitoruj poziom sedacji na podstawie poziomu oddechu i wszelkich ruchów, a także szczypania łap i/lub odruchu rogówkowego.
UWAGA: Tętno znieczulonej myszy zwykle wynosi 400–500/min, w zależności od temperatury rdzenia (odbytu). W celu szybkiego sprawdzenia ciąży nie należy ogrzewać myszy do fizjologicznej temperatury wewnętrznej; Tętno będzie bliższe 400–450/min, ale może dalej spadać przy nieregularnym rytmie, jeśli mysz zmarznie przy długotrwałym obrazowaniu.- Co ważne, upewnij się, że oddechy są umiarkowane pod względem głębokości i regularności, nie są nieregularne ani agonalne (sapanie: głębokie, powolne i niekonsekwentne, z głębokimi retrakcjami międzyżebrowymi i podżebrowymi).
UWAGA: Częstość oddechów niewentylowanej, znieczulonej myszy wynosi zwykle 60–100/min. Zobacz https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html i https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice.
- Co ważne, upewnij się, że oddechy są umiarkowane pod względem głębokości i regularności, nie są nieregularne ani agonalne (sapanie: głębokie, powolne i niekonsekwentne, z głębokimi retrakcjami międzyżebrowymi i podżebrowymi).
- Obficie nałóż żel ultradźwiękowy (sprzężenie akustyczne) na brzuch.
- Umieść przetwornik obrazowania na brzuchu, aby ustawić go w płaszczyźnie poziomej: ustaw sondę tak, aby uzyskać orientację lewo-prawo w systemie obrazowania; "kropka" lub grzbiet wskazany z boku sondy obrazującej powinien być skierowany w prawo.
UWAGA: Przesunięcie sondy obrazującej w prawo myszy powinno przesunąć odpowiedni obraz w systemie ultrasonograficznym w prawo myszy (wyobraź sobie, że patrzysz "w górę" z ogona myszy - prawa strona myszy będzie po lewej stronie monitora).- Zazwyczaj należy używać mocowania przetwornika systemu obrazowania i systemu manipulatora szynowego. W tym przypadku zastosowano obrazowanie "wolnej ręki", w którym głowica obrazująca jest trzymana w ręku (dwie ręce są stabilniejsze niż jedna) i co pozwala na szybsze ruchy w okolicy brzucha. Ruchy te, jak zostanie to opisane poniżej, obejmują zarówno ruchy rotacyjne, jak i translacyjne. Wymaga to jednak większej wprawy.
- Zidentyfikuj pęcherz moczowy na ekranie (Wideo 1).
- Skanując doogonowo z pęcherza, zidentyfikuj pochwę. Następnie, skanując powoli i płynnie w kierunku czaszki, zidentyfikuj rozwidlenie pochwy na lewy i prawy róg macicy (Rysunek 2; Wideo 1).
- Rozpocznij badanie macicy (lewy i prawy róg macicy)13 (Rysunek 3; Wideo 2).
UWAGA: Do połowy ciąży (E10.5 lub E11.5) zarodki myszy zostaną umieszczone wzdłuż prawego i lewego obwodu. W miarę wzrostu bardziej dystalne części macicy i odpowiadające im zarodki będą obracać się na zewnątrz i do tyłu. W miarę dalszego wzrostu zarodków (E15.5 i późniejsze, na ogół), płody myszy będą ustawiane prawie losowo w różnych kierunkach i trudno jest "śledzić" macicę od bliższego do dystalnego.- Skanuj szybko, aby sprawdzić, czy mysz jest w ciąży, czy nie. Ta szybka metoda wymaga jedynie rozpoznania ciążącej macicy i zarodków myszy.
- Alternatywnie, poświęć więcej czasu na wyliczenie zarodków (żywych, martwych, resorbowanych) w każdym rogu macicy.
UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, żywy zarodek będzie wykazywał odrębne narządy, takie jak serce, kończyny, głowa z komorami i oczy. Martwy zarodek nabiera jednorodnego, "papkowatego" wyglądu, chyba że jest po prostu martwy. Zresorbowane zarodki mają punktową echogeniczną plamkę w środku macicy wyglądającej na grawitacyjną (Rysunek 4, Rycina 5, Rycina 6, Rycina 7, Rycina 8). - Aby ustalić, czy zarodek jest naprawdę żywy, należy zwrócić uwagę na bicie serca i/lub przepływ krwi.
UWAGA: Mapowanie przepływu metodą kolorowego Dopplera może pomóc w określeniu obecności przepływu krwi, zarówno w zarodku, jak iw pępowinie. Ogólnie rzecz biorąc, może to dotyczyć zarodków starszych niż E8,5. - Rozpoznaj potencjalne artefakty, które mogą naśladować ciążącą macicę (Rysunek 9, Rysunek 10). Ponadto, ponieważ gaz jelitowy i inne artefakty "cienia" ultrasonograficznego mogą zasłaniać segmenty rogu macicy, należy wykonać obrazowanie z wielu punktów obserwacyjnych, aby zapewnić odpowiednią wizualizację macicy.
- Po zakończeniu badania wytrzyj żel z brzucha gazą lub chusteczkami. Staraj się usunąć jak najwięcej, ponieważ żel ma tendencję do chłodzienia myszy.
- Odklej łapy taśmą i wyjmij mysz z nosa znieczulającego.
- Delikatnie przenieś mysz z powrotem do jej klatki. Powinna się obudzić i zacząć się poruszać w ciągu około minuty.
UWAGA: Genetycznie zmodyfikowane myszy mogą potrzebować nieco więcej czasu, aby dojść do siebie po znieczuleniu i muszą być uważniej obserwowane.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół pozwoli badaczowi na pewne ustalenie, czy mysz jest w ciąży, w tym na wczesnych etapach, oraz na określenie, czy wystąpiły oczywiste prenatalne straty embrionalne lub płodowe bez konieczności uśmiercania ciężarnej samicy. Protokół ten jest szczególnie przydatny podczas hodowli myszy modyfikowanych genetycznie; zazwyczaj krzyżowanie osobników heterozygotycznych x heterozygotycznych w celu uzyskania potomstwa homozygotycznego prowadzi do zaburzeń prawidłowego rozwoju, co skutkuje letalnością prenatalną. ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Najważniejszym pierwszym krokiem w obrazowaniu jest identyfikacja pochwy, a następnie określenie rozwidlenia rogu macicy w lewo i w prawo. Podążając za każdym rogiem macicy, osoba wykonująca obrazowanie jest mniej skłonna do błędnej identyfikacji pętli jelita jako macicy. Co więcej, zrozumienie różnic w wyglądzie jelit (z kałem lub bez) jest ważne, aby odróżnić je od macicy; Czasami "kulki" kałowe w pętlach jelitowych mogą naśladować ciężką (ciężarną) macicę. Chociaż inni autorzy opisali diagnostykę ciąży i stopień zaawa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| depilacji | |||
| Etanol, 70% | |||
| Maszynki | |||
| futra Gaza lub KimWipes | |||
| Isofluran Tlen medyczny | |||
| (opcjonalnie) | |||
| Taśma medyczna | |||
| System obrazowania myszy (w tym konfiguracja anestezjologii i platforma obrazowania) | Fujifilm Visual Sonics | Różne | Dowolny system z sondą przetwornika ultradźwiękowego o środkowej częstotliwości 40 MHz |
| Żyletka (nie maszynka do golenia) | |||
| Waga (do ważenia myszy) | |||
| Żel |
Bibliografia
- Bogue, M. A., et al. Mouse Phenome Database: an integrative database and analysis suite for curated empirical phenotype data from laboratory mice. Nucleic Acids Research. 46, 843-850 (2018).
- Ito, R., Takahashi, T., Ito, M. Humanized mouse models: Application to human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3723-3728 (2018).
- Law, M., Shaw, D. R. Mouse Genome Informatics (MGI) is the international resource for information on the laboratory mouse. Methods in Molecular Biology. 1757, 141-161 (2018).
- Rydell-Törmänen, K., Johnson, J. R. The applicability of mouse models to the study of human disease. Methods in Molecular Biology. 1940, 3-22 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Reviews of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
- Tam, P. P. L., et al. Formation of the embryonic head in the mouse: attributes of a gene regulatory network. Current Topics in Developmental Biology. 117, 497-521 (2016).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Letters. 590 (22), 3965-3974 (2016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Selecting female mice in estrus and checking plugs. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (8), (2016).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- Finlay, J. B., Liu, X., Ermel, R. W., Adamson, T. W. Maternal weight gain as a predictor of litter size in Swiss Webster, C57BL/6J, and BALB/cJ mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 694-699 (2015).
- Zhou, Y. Q., et al. Applications for multifrequency ultrasound biomicroscopy in mice from implantation to adulthood. Physiological Genomics. 10 (2), 113-126 (2002).
- Ji, R. P., Phoon, C. K. L. Noninvasive localization of nuclear factor of activated T cells c1-/- mouse embryos by ultrasound biomicroscopy-Doppler allows genotype-phenotype correlation. Journal of the American Society of Echocardiography. 18 (12), 1415-1421 (2005).
- Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-117 (2006).
- Mu, J., Slevin, J. C., Qu, D., McCormick, S., Adamson, S. L. In vivo quantification of embryonic and placental growth during gestation in mice using micro-ultrasound. Reproductive Biology and Endocrinology. 6, 34(2008).
- Phoon, C. K. L., Turnbull, D. H. Cardiovascular imaging in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 15-38 (2016).
- Phoon, C. K. L., Turnbull, D. H. Ultrasound biomicroscopy-Doppler in mouse cardiovascular development. Physiological Genomics. 14 (1), 3-15 (2003).
- Peavey, M. C., et al. A novel use of three-dimensional high-frequency ultrasonography for early pregnancy characterization in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (128), e56207(2017).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), 77205(2013).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kühl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38(2014).
- Norton, W. B., et al. Refinements for embryo implantation surgery in the mouse: comparison of injectable and inhalant anesthesias - tribromoethanol, ketamine and isoflurane - on pregnancy and pup survival. Laboratory Animal. 50 (5), 335-343 (2016).
- Thaete, L. G., Levin, S. I., Dudley, A. T. Impact of anaesthetics and analgesics on fetal growth in the mouse. Laboratory Animal. 47 (3), 175-183 (2013).
- Phoon, C. K. L., et al. Tafazzin knockdown in mice leads to a developmental cardiomyopathy with early diastolic dysfunction preceding myocardial noncompaction. Journal of the American Heart Association. 1 (2), (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
