Artykuł metodologiczny

Optymalizacja wzrostu kryształów endotiapepsyny do eksperymentów krystalografii seryjnej

DOI:

10.3791/61896

⸱

4 lutego 2021

 , 
1Swiss Light Source, Paul Scherrer Institut

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego artykułu jest dać widzowi solidne zrozumienie, jak przekształcić ich protokół małej objętości dyfuzji parowej, do hodowli dużych, pojedynczych kryształów białka, w metodę mikrokrystalizacji wsadowej o dużej objętości dla krystalografii szeregowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentowany jest protokół ułatwiający tworzenie dużych ilości (> 100 μL) mikrokrystalicznych zawiesin odpowiednich do eksperymentów krystalograficznych w synchrotronach i XFEL-ach. Metoda opiera się na zrozumieniu diagramu faz kryształów białka i tego, jak można wykorzystać tę wiedzę. Metoda jest podzielona na trzy etapy: (1) optymalizacja morfologii kryształów, (2) przejście do partii oraz (3) skalowanie. Etap 1 polega na znalezieniu dobrze dyfrakcyjnych monokryształów, miejmy nadzieję, ale niekoniecznie, prezentujących się w morfologii przypominającej sześcian. W Etapie 2 warunek Etapu 1 jest optymalizowany przez czas wzrostu kryształów. Ta strategia może przekształcić kryształy wyhodowane przez dyfuzję pary w partię. Gdy wzrost kryształów może nastąpić w ciągu około 24 godzin, można wykreślić morfogram mieszaniny białka i osadu i wykorzystać go jako podstawę strategii skalowania (etap 3). Gdy kryształy mogą być hodowane partiami, można podjąć próbę skalowania, a rozmiar i stężenie kryształów optymalizować wraz ze wzrostem objętości. Endotiapepsyna została wykorzystana jako białko demonstracyjne w tym protokole. Niektóre z przedstawionych decyzji są specyficzne dla endotiapepsyny. Jest jednak nadzieja, że sposób, w jaki zostały zastosowane, zainspiruje sposób myślenia o tej procedurze, który inni będą mogli dostosować do własnych projektów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krystalografia makromolekularna w temperaturze pokojowej (RT) jest ponownie popularna w społeczności biologii strukturalnej. Rozwój źródeł światła rentgenowskiego z laserem na swobodnych elektronach (XFEL) pobudził rozwój metod dostarczania próbek RT 1,2,3,4, a te metody zostały teraz zastosowane do synchrotronów5,6,7,8. Metody RT nie tylko otwierają możliwość eksperymentalnych prób z pompą9,10,11,12, ale istnieje również coraz więcej dowodów na to, że promują one alternatywne stany konformacyjne w obrębie białek13,14,15,16, 17.

Jednak głównym powodem, dla którego metody kriogeniczne zyskały na popularności w porównaniu z metodami RT pod koniec lat 90., było spowolnienie uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem przez ujemne temperatury kryształów18. Cryo-methods19 zaczął umożliwiać zbieranie kompletnego zestawu danych z pojedynczego kryształu białka. Nowoczesne metody RT w XFEL i synchrotronach rozwiązały problem uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem monokryształów poprzez opracowanie szybkich (> 100 Hz) strategii dostarczania kryształów1,2,3,4. Metody te pozwalają na zebranie kompletnego zestawu danych z tysięcy indywidualnie naświetlonych kryształów. Te podejścia do dostarczania RT wymagają zatem produkcji dużych ilości roztworów zawierających jednorodne mikrokryształy (> 100 μl < 50 μm kryształów). Ponieważ jednak metody kriogeniczne zwykle wymagają tylko monokryształów, metody tworzenia takich mikrokrystalicznych zawiesin nie są obecnie wszechobecne w laboratoriach krystalografii białek.

W literaturze można znaleźć przykłady, jak przeprowadzić część procedury optymalizacji mikrokrystalizacji dla próbek krystalografii szeregowej. W tym miejscu należy dokonać rozróżnienia między białkami błonowymi i rozpuszczalnymi. Protokoły optymalizujące wzrost mikrobłonowych kryształów białkowych hodowanych w monooleinie (lub innym lipidie) dla lipidowej fazy sześciennej (LCP) zostały dobrze opisane20,21,22. Jednak na ogół brakuje metod mikrokrystalizacji rozpuszczalnych białek, w tym białek błonowych hodowanych w warunkach innych niż LCP. Wcześniejsze badania koncentrowały się na konkretnych częściach procesu, takich jak przesiewanie mikrokryształów23,24, zwiększanie zarodkowania24 i skalowanie za pomocą dyfuzji swobodnego interfejsu25, ale nie jest to metoda kompletna.

Jednak niedawno opisano metodę26, która próbuje zaoferować kompletny protokół. Podobnie jak wiele aspektów krystalografii białek, nie jest ona nowa. Wiele z zaproponowanych pomysłów zostało już opisanych przez Rayment (2002)27. Metoda ma na celu pokazanie krystalografom, jak przeprowadzić konwersję z pojedynczego kryształu wyhodowanego za pomocą dyfuzji pary wodnej do metody wsadowej w celu wyhodowania tysięcy mikrokryształów. Metoda koncentruje się na dyfuzji pary wodnej jako wspólnym punkcie wyjścia, ponieważ 95% wszystkich depozycji w Banku Danych Białkowych (PDB) pochodzi z kryształów wyhodowanych na płytkach dyfuzyjnych pary26. Dyfuzja pary wodnej nie jest jednak idealną metodą mikrokrystalizacji26, dlatego opisano metodologię konwersji dyfuzji parowej na krystalizację wsadową. Gdy kryształy mogą być hodowane wsadowo, skalowanie tras do większych objętości staje się bardziej praktyczne. Biorąc pod uwagę kaprysy krystalizacji białek, autorzy podkreślają, że metoda ta nie jest bezpieczna. Jednak protokół powinien przynajmniej zapewniać wgląd w "przestrzeń krystalizacji" białka.

Ta metoda opiera się na schemacie faz krystalizacji białek i na tym, jak zrozumienie tego diagramu może służyć jako przewodnik podczas optymalizacji mikrokrystalizacji. Diagram fazowy białka jest zwykle przedstawiany jako wykres x/y ze stężeniami strącania i białka odpowiednio na osiach x i y (Rysunek 1A). Od punktu czystej wody (lewy dolny róg - Rysunek 1A), stężenie zarówno białka, jak i środka strącającego wzrasta, aż do osiągnięcia linii rozpuszczalności. Linia rozpuszczalności wyznacza punkt przesycenia (fioletowa linia - Rysunek 1A). Kiedy białko jest przesycone, roztwór staje się niestabilny termodynamicznie i zaczyna rozdzielać się na dwie fazy: "bogaty w białko" i stabilny nasycony roztwór. Separacja ta może nastąpić w dowolnym miejscu poza linią rozpuszczalności, a jej kinetyka zależy od właściwości białka i składników roztworu.

Gdy stężenie białka i precypitentu jest zbyt duże, białko rozkłada się niestabilnie z roztworu i powoduje powstanie amorficznego osadu (różowy obszar - Rysunek 1A). Jednak uporządkowana separacja faz może zachodzić w obszarze zarodkowania [patrz Garcia-Ruiz (2003)28 dla szczegółowego opisu], a nukleanty krystaliczne mają skłonność do tworzenia (zielony obszar - Rysunek 1A). Zarodkowanie i wzrost usuwa białko z roztworu i przenosi kroplę do obszaru metastabilnego, gdzie wzrost może być kontynuowany, aż do osiągnięcia linii rozpuszczalności [patrz McPherson i Kuznetsov (2014)29 w celu szczegółowego omówienia]. Diagram jest, dla zdecydowanej większości warunków krystalizacji, dużym uproszczeniem30. Niezależnie jednak od tego, diagram jest nadal bardzo przydatny dla mikrokrystalografów, ponieważ odwzorowanie diagramu pozwala na określenie linii rozpuszczalności i kinetyki zarodkowania.

Jeśli chodzi o tworzenie mikrokryształów, dwa czynniki podczas krystalizacji, które muszą być zoptymalizowane, to liczba kryształów (Xn) i ich średni, najdłuższy wymiar (Xs). Xn będzie proporcjonalne do liczby zdarzeń zarodkowania (n) (równanie 1).

figure-introduction-1 Równanie 1

Xs jest proporcjonalne do stężenia wolnego białka powyżej linii rozpuszczalności (Ps) podzielonego przez Xn (Równanie 2).

figure-introduction-2 Równanie 2

W idealnej sytuacji, każde zdarzenie zarodkowania dałoby możliwy kryształ i każdy z tych kryształów miałby równy dostęp do dostępnego białka w roztworze. Rysunek 2 to graficzna reprezentacja z idealnego scenariusza relacji między Xn i Xs. W praktyce główną kontrolą, jaką krystalograf ma nad Xn i Xs, jest wpływanie na ilość zarodkowania lub dodawanie kryształów zarodkowych. Mikrokrystalograf musi ocenić, w jaki sposób zwiększyć Xn, tak aby można było uzyskać odpowiednie stężenie kryształów i ich rozmiar

.

Większość technik krystalizacji wymaga 'okresu przejściowego' (Rysunek 1B). Na przykład w eksperymencie dyfuzji pary, po zmieszaniu białka i roztworów strącających, stężenia każdego z nich zmienią się, gdy kropla zrównoważy się z roztworem studzienki. Można mieć nadzieję, że zmiany te stopniowo przejdą kroplę do strefy zarodkowania, w której wzrośnie skłonność do krystalizacji. Gdy kryształy zaczną się nukleować i rosnąć, ilość białka w roztworze zacznie spadać, zmniejszając prawdopodobieństwo dalszego zarodkowania. Ostateczna ilość zarodkowania będzie zależna od białka i warunków, a także zależy od głębokości penetracji strefy zarodkowania. Biorąc pod uwagę ograniczoną penetrację strefy zarodkowania metodami, które wymagają etapu przejściowego, poziom zarodkowania będzie ostatecznie ograniczony do szybkości zarodkowania na granicy regionu zarodkowania metastabilnego.

Ze względu na znaczenie możliwości zwiększenia poziomu zarodkowania dla mikrokrystalografa, ważne jest, aby przejść na metodologię krystalizacji wsadowej. Partia może w większym stopniu wykorzystać cały region zarodkowania (Rysunek 1C). W metodach wsadowych chodzi o to, aby wymieszać ze sobą białko i osad w taki sposób, aby uzyskać przesycony roztwór bez konieczności jakichkolwiek zmian stężeń składników. Zarodkowanie powinno być możliwe natychmiast po wymieszaniu. Metody wsadowe pozwalają zatem na teoretyczne dotarcie do całej strefy zarodkowania. Każdy wzrost kinetyki zarodkowania poza granicę zarodkowania metastabilnego może być następnie wykorzystany.

Jeśli podstawowy poziom zarodkowania kryształów nie jest wystarczający do wygenerowania dużego Xn, można zastosować metody mikro-seedingu. W mikrosiewie wstępnie wyhodowane kryształy są rozbijane, aby utworzyć zawiesinę z krystalicznych fragmentów, która może działać jako rusztowanie dla wzrostu świeżych kryształów31,32. Mikrozasiewanie jest szeroko stosowane w seryjnym przygotowywaniu próbek krystalograficznych jako sposób na zwiększenie Xn bez potrzeby zwiększania zarodkowania kryształów (Rysunek 1C).

Przejście od dyfuzji pary do fazy można zobrazować na diagramie fazowym jako przeniesienie punktu początkowego eksperymentu z regionów nieprzesyconych lub metastabilnych do strefy zarodkowania. Można to osiągnąć poprzez zwiększenie stężenia białka i/lub środka strącającego i/lub stosunku tych dwóch składników w kropli (Rysunek 1D) i obserwację, w jakich warunkach kryształy pojawiają się szybko (< 24 h)26. Pełna równowaga kropli dyfuzji pary może zająć dni lub tygodnie33. W związku z tym, szukając warunków, które pokazują szybko pojawiające się kryształy, warunki wsadowe można znaleźć bez konieczności przechodzenia do alternatywnych formatów przesiewowych krystalizacji, takich jak microbatch34,35,36,37.

Po znalezieniu strefy zarodkowania, można ustalić warunek partii i utworzyć morfogram - tutaj, przybliżony diagram fazowy. Morfogram jest bardzo przydatny podczas rozważania, czy użyć protokołu partii zasiewanej, czy prostej. Wykreślając Xn jako funkcję stężenia białka i strącacza, można dokonać oceny kinetyki zarodkowania26. Jeśli Xn pozostaje niskie w całym obszarze zarodkowania, może być wymagana partia zasiana, aby Xn było wystarczająco duże, aby ograniczyć wzrost kryształów. Ocena ta jest pierwszym krokiem w procesie skalowania do większych objętości (> 100 μL).

Ta metoda została zaprojektowana tak, aby mogła być przeprowadzana w większości laboratoriów krystalizacji przy użyciu standardowego sprzętu do krystalizacji dyfuzji parowej. Przeprowadzono również wiele badań, które opisują techniki ułatwiające wiele części tego procesu, jeśli sprzęt jest dostępny. Należą do nich między innymi dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)25,27, obrazowanie nieliniowe20,24,25, dyfrakcja proszkowa20,24,27 oraz mikroskopia elektronowa26 [patrz Cheng et al. (2020)40 za miłą recenzję].

Celem tej pracy jest wizualne pokazanie metody przejścia od krystalizacji dyfuzyjnej w małej objętości (< 500 nL) do krystalizacji wsadowej o dużej objętości (> 100 μL). Endotiapepsyna z Cryphonectria parasitica została użyta jako przykładowy system do zademonstrowania tej translacji. Rodzaj eksperymentu i metoda dostarczania próbki, do której potrzebne są mikrokryształy, będą miały wpływ na idealny wynik Xs26. W przypadku eksperymentów mieszających wymagających milisekundowej rozdzielczości czasowej41 lub gas-dynamic virtual nozzles42, końcowe Xs < 5 μm może być pożądane. W tym przypadku celem było wyprodukowanie kryształów białka, które ulegają dyfrakcji do około 1,5 A, na potrzeby eksperymentu z pompą-sondą aktywowaną fotonami i przy użyciu podejścia opartego na dostarczaniu stałego celu.

Aby zilustrować wymagania dotyczące próbek w takim seryjnym eksperymencie krystalograficznym z użyciem endotiapepsyny, Tabela 1 pokazuje parametry eksperymentalne hipotetycznego eksperymentu. Przykładowe informacje zostały oparte na protokole opisanym poniżej. Biorąc pod uwagę pewne konserwatywne szacunki dotyczące współczynników trafień i wymagań dotyczących gromadzenia danych, 50 mg to całkowite oszacowanie zużycia próbki dla całego eksperymentu.

Rysunek 3 pokazuje schemat blokowy całego procesu optymalizacji od początkowej krystalizacji dyfuzji par o małej objętości do dużej partii. W przypadku większości projektów krystalografii seryjnej protokół ten rozpoczyna się od kroku 2: "przejście do partii", ponieważ białko docelowe zostanie już skrystalizowane. Jednak Krok 1 został uwzględniony w celu uzupełnienia i przypomnienia czytelnikom o jego znaczeniu. Znalezienie stanu, w którym powstaje dobrze dyfrakcyjny, pojedynczy, duży kryształ, jest najlepszym punktem wyjścia do optymalizacji mikrokryształów. W kroku 2 warunek ten można następnie zoptymalizować od dyfuzji pary do wsadu, a także wykreślić morfogram regionów zarodkowania i metastabilnych. Po wykonaniu tej czynności można przeskalować warunek wsadowy do większych woluminów w kroku 3. Pod koniec schematu blokowego krystalograf stworzy powtarzalny, wielkoobjętościowy (> 100 μl), mikrokrystalizacyjny protokół wsadowy dla endotiapepsy. Metodę tę można następnie zastosować do ich konkretnego białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie 96-dołkowe eksperymenty z krystalizacją w kropli siedzącej były przeprowadzane przy użyciu płytek z 2 lub 3 kroplami. Wykorzystano robota do obsługi cieczy oraz kamerę krystalizacyjną/hotelową, aby ułatwić przygotowanie i monitorowanie wszystkich 96-dołkowych ekranów. Wszystkie stężenia odczynników do eksperymentów krystalizacji są podawane w ich stężeniach wyjściowych przed zmieszaniem.

1. Optymalizacja morfologii kryształów

UWAGA: Kroki 1.1.1. i 1.1.6. opisują, jak znaleziono warunki krystalizacji endotiapepsyny i jak te warunki zostały zoptymalizowane, aby znaleźć pojedynczy warunek, który dawał pojedyncze, dobrze dyfrakcyjne kryształy.

  1. Optymalizacja macierzy rzadkich
    1. Przygotować świeży roztwór endotiapepsyny.
      UWAGA: Endotiapepsyna, gdy jest otrzymywana jako Superan 600, musi zostać przeniesiona buforowo z roztworu do przechowywania i skoncentrowana.
      1. Przygotować 3 l 0,1 M octanu o pH 4,6 w temperaturze 4 °C.
      2. Przeciąć 20 cm rurki do dializy i krótko umyć w buforze. Uszczelnij jeden koniec rurki za pomocą klipsa, umieść 50 ml roztworu endotiapepsyny w rurce, a następnie uszczelnij drugi koniec.
      3. Pozostawić roztwór do dializy przez co najmniej 4 godziny (lub na noc) w temperaturze 4 °C w 1 l buforu z octanu Na. Ze względu na składniki bufora do przechowywania, roztwór w worku do dializy będzie teraz wynosił około 100 ml.
      4. Przenieść worek dializacyjny zawierający endotiapepsynę do świeżego litra o temperaturze 4 °C i temperaturze 0,1 M Na Acetate pH 4,6. Powtórz ten krok jeszcze raz, tak aby oryginalny bufor został rozcieńczony 2000x w stosunku do octanu Na.
      5. Endotiapepsyna będzie teraz miała stężenie około 10 mg/ml. Zagęścić do 100 mg/ml za pomocą koncentratora odśrodkowego 10 kDa i wirówki.
      6. Błyskawicznie schłodzić roztwór endotiapepsyny w ciekłym azocie w 50 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    2. Przygotuj 96-dołkowe sito z matrycą rzadką PACT Premier (PACT Premier 96-dołkowe).
      1. Za pomocą robota do obsługi cieczy dozować 100 nL endotiapepsyny o stężeniu 70 mg/ml i 100 nl roztworu studzienki do jednego dołka na studzienkę. Wymieszać białko i dobrze rozpuścić 3 razy po dodaniu buforu krystalizacyjnego.
      2. Uszczelnić płytkę i pozostawić na 28 dni w temperaturze 20 °C, wykonując zdjęcia codziennie przez pierwszy tydzień, a następnie co tydzień przez 4 tygodnie.
    3. Analiza macierzy rzadkich
      1. Zidentyfikuj trafienia, które wytwarzają pojedyncze kryształy endotiapepsyny. Z badania przesiewowego PACT wynika, że warunki zawierające MgCl2 rosły jako pojedyncze tony, a nie klastry igieł.
    4. Optymalizacja macierzy rzadkich
      1. Z warunków zawierających MgCl2 określonych w kroku 1.1.3.1 utwórz 96-dołkowe badanie przesiewowe, losowo łącząc i zmieniając różne składniki studzienki.
      2. Za pomocą robota do obsługi cieczy dozować 100 nL endotiapepsyny o stężeniu 70 mg/ml i 100 nl roztworu studzienki do jednego dołka na studzienkę. Wymieszać białko i dobrze rozpuścić 3 razy po dodaniu buforu krystalizacyjnego.
      3. Uszczelnić płytkę i pozostawić na 28 dni w temperaturze 20 °C, wykonując zdjęcia codziennie przez pierwszy tydzień, a następnie co tydzień przez 4 tygodnie.
    5. Analiza optymalizacyjna
      1. Korzystając z odpowiedniego oprogramowania arkusza kalkulacyjnego, uszereguj warunki krystalizacji, które powodują powstawanie kryształów, na podstawie jakości kryształów i poziomu wytrącenia, od braku kryształów (0) do ideału (5) i od niskiego (0) do wysokiego (5). Jeśli chodzi o jakość kryształów, szerokim kryterium są monokryształy o pudełkowej morfologii.
      2. Wykonaj analizę korelacji Pearsona między zawartością warunków krystalizacji a ilością kryształów i poziomem wytrącania.
      3. Wykreśl te dane jako mapę cieplną. Poszukaj składników i warunków, które były skorelowane z preferowanymi wynikami.
    6. Analiza dyfrakcyjna.
      1. Potwierdzić, że kryształy wyhodowane z warunków zidentyfikowanych w kroku 1.1.5 nadają się do krystalografii szeregowej, wykonując eksperyment dyfrakcji rentgenowskiej.
      2. Załaduj próbkę kryształów endotiapepsyny z każdego ze zidentyfikowanych warunków na nośniki, które pozwalają na zbieranie danych w temperaturze 100 lub 293 K i przeprowadź eksperyment dyfrakcji rentgenowskiej. W przypadku pracy w krioterapii należy użyć 25% glikolu etylenowego jako krio-protektoru.
      3. Przetwarzaj te dane za pomocą odpowiedniego pakietu oprogramowania. Kryształy endotiapepsyny powinny ulegać dyfrakcji powyżej 1,5 A. Sprawdź, czy nie ma bliźniaków, ponieważ bliźniacze kryształy mogą znacznie skomplikować szeregowe przetwarzanie danych krystalograficznych.
      4. Jeśli kryształy są singletonami i ulegają dyfrakcji do 1,5 A, przejdź do kroku 2. Jeśli nie, wróć do kroku 1.1.2 i wypróbuj bardziej rzadkie ekrany matrycowe, aby zidentyfikować obiecujące warunki. Po przeprowadzeniu analiz w krokach 1.1.5. i 1.1.6., jako przybliżony ideał należało uznać stan krystalizacji wynoszący 25% (w/v) PEG 6,000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 i 0,15 M MgCl2.

2. Przejście do partii

  1. Eksperyment z morfogramem
    1. Stwórz mikrokrystaliczny materiał zalążkowy.
      UWAGA: Najlepszą praktyką podczas tworzenia zapasów nasiennych jest wytwarzanie nasion z kryształów wyhodowanych specjalnie do tego zadania. To bardzo pomaga w odtwarzalności. Inne pomysły przedstawione w krokach od 2.1.1.1 do 2.1.1.11 polegają na tym, aby zawsze używać kryształów wyhodowanych ze standardowej liczby studzienek - tutaj 5 - i dzielić zapasy po ich wykonaniu, aby zanegować cykle zamrażania i rozmrażania.
      1. Przygotować 96-dołkową płytkę krystalizacyjną z dołkami zawierającymi bufor krystalizacyjny: 25% (w/v) PEG 6,000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 i 0,15 M MgCl2.
      2. Za pomocą robota do obsługi cieczy dozować 200 nl rozmrożonej endotiapepsyny o stężeniu 70 mg/ml i 200 ml roztworu studzienki do jednego dołka na studzienkę. Wymieszać białko i dobrze rozpuścić 3 razy po dodaniu buforu krystalizacyjnego.
      3. Uszczelnij płytkę i pozostaw na 24 godziny.
      4. Napełnij probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml 250 μl buforu krystalizacyjnego i 10-15 szklanych kulek o średnicy 1 mm. Pozostaw probówkę wirówkową na lodzie do ostygnięcia na 5-10 minut.
      5. Wybierz 5 dołków z kryształami, otwórz dołki skalpelem i za pomocą końcówki pipety zmiażdż kryształy w dołkach.
      6. Odessać 1 μl buforu z zamrożonej probówki wirówkowej i użyć do homogenizacji rozdrobnionej zawiesiny krystalicznej. Po uzyskaniu jednorodności odessać całą gnojowicę i zebrać ją w schłodzonej probówce wirówkowej.
      7. Powtórz krok 2.1.2.6 dla każdej z 5 studzienek podstudziennych.
      8. Wirować probówkę wirówkową zawierającą bufor, zebrane zawiesiny i kulki z prędkością 1000 obr./min przez 30 s.
      9. Umieść probówkę wirówkową z lodem na 30 sekund.
      10. Powtórz kroki 2.1.2.8 i 2.1.2.9 jeszcze dwa razy.
      11. Materiał siewny jest teraz gotowy i może być podzielony na partie o pojemności 10 μl i przechowywany w temperaturze -20 °C.
    2. Wykonaj eksperyment z morfogramem.
      1. Przygotuj 2-kroplowe 96-dołkowe sito siatkowe. Zmieniaj stężenie PEG 6,000 od 5 do 40% (w/v) wzdłuż kolumn płytowych, utrzymując bufor i sól na poziomie odpowiednio 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 i 0,15 M MgCl2.
      2. Przygotować sekwencyjne rozcieńczenie endotiapepsyny w 0,1 M octanu Na pH 4,6 od 100 do 12,5 mg/ml w 8 krokach. Dla każdego rzędu płytki zostanie użyta inna koncentracja endotiapepsyny.
      3. Za pomocą robota do obsługi cieczy dozuj 150 nL endotiapepsyny do obu studzienek 1 i 2. W dołku 1 należy dozować 150 ml roztworu studzienki. W basenie 2 należy zasysać jednocześnie 50 ml rozmrożonego materiału siewnego i 100 ml roztworu studzienki, a następnie dozować oba do roztworu białkowego. Wymieszaj roztwory 3 razy po dodaniu buforu krystalizacyjnego.
      4. Uszczelnij płytkę i pozostaw w temperaturze 20 °C, wykonując zdjęcia co 0, 3, 6, 12, 18, 24 godziny, a następnie codziennie przez pierwszy tydzień i co tydzień przez następne cztery. Jeśli automatyczne obrazowanie nie jest możliwe, nie martw się o obrazowanie godzinowe w 1. dniu.
  2. Analiza morfogramu
    1. Patrząc na zdjęcia wykonane po 24 godzinach, oszacuj liczbę kryształów, które są obecne w każdym dołku i zapisz te szacunki w dostarczonym arkuszu "generator morfogramów". Szacunki te nie muszą być precyzyjne; Indywidualne liczenie tysięcy mikrokryształów, jeśli są obecne, nie jest ani praktyczne, ani konieczne. Przede wszystkim staraj się, aby szacunki były spójne na całej płycie.
      UWAGA: Reguła 24 godzin została oparta na obserwacjach poczynionych w Beale et al. (2019)26. Warunki krystalizacji dyfuzji parowej mogą trwać dni lub tygodnie, aby się zrównoważyć. Kryształy, które pojawiają się szybko, są bardziej prawdopodobne, że rosły w procesie wsadowym, a nie w wyniku stopniowej równoważenia składników kropli. Kryterium 24 godzin jest zatem nieco arbitralne, a dokładny czas graniczny między eksperymentem z partią a dyfuzją pary będzie zależał od konkretnej mieszaniny danego stanu [patrz Beale i wsp. (2019)26 aby uzyskać szczegółowe informacje].
    2. Wprowadzić początkowe stężenia endotiapepsyny i PEG 6 000 we wskazanych polach.
    3. Arkusz roboczy automatycznie wykreśli wyniki w tradycyjnym formacie diagramu fazowego ze stężeniem strącania i białka odpowiednio na osiach x i y. Cóż, warunki, które powodują powstawanie kryształów tylko w ich zasianych kroplach, wskazują metastabilny obszar diagramu (przezroczysty niebieski), podczas gdy warunki, w których kryształy występują zarówno w zaszczepionych, jak i niezaszczepionych kroplach, wskazują na strefę zarodkowania (stałe zielone).
      UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby większość strefy zarodkowania była obecna na schemacie (tj. na dole schematu znajdują się czyste studzienki, a część osadu powinna być widoczna przy wysokich stężeniach białka i strącacza). Jeśli tak nie jest, być może powtórz eksperyment, ale zwiększ stężenie białka i/lub strącającego się (jeśli to możliwe).
    4. Jeśli kryształ pojawił się w czasie krótszym niż 24 godziny, przejdź do kroku 2.3.1. Jeśli nie, przejdź do kroku 2.4 i kontynuuj optymalizację w kierunku partii.
  3. Analiza krystaliczna
    1. Jak wspomniano na końcu kroku 1, przed przejściem do następnego kroku upewnij się, że kryształy te mają pożądaną morfologię i jakość dyfrakcji. Jeśli chodzi o morfologię, czy kryształy są obserwowalnie niesplątane i tworzą się jako singletony, a nie struktury przypominające kule igłowe lub wachlarzowe? Jeśli chodzi o dyfrakcję, jeśli to możliwe, zbierz dane dyfrakcyjne z kryształów. Jeśli te kryształy nie ulegną dyfrakcji, jest mało prawdopodobne, że kryształy wyhodowane w większej objętości ulegną dyfrakcji.
    2. Załaduj próbkę kryształów endotiapepsyny z eksperymentu morfogramu na nośniki, które umożliwiają zbieranie danych w temperaturze 100 lub 293 K i wykonaj eksperyment dyfrakcji rentgenowskiej. W przypadku pracy w krioterapii należy użyć 25% glikolu etylenowego jako krio-protektoru.
    3. Przetwarzaj te dane za pomocą odpowiedniego pakietu oprogramowania. Kryształy endotiapepsyny powinny ulegać dyfrakcji powyżej 1,5 A. W poprzek próbki kryształów obserwuj rozmiar komórki, całkowitą liczbę obserwacji i mozaikowatość; Pomiary te dadzą wskazówkę co do jednorodności kryształów dyfrakcyjnych.
    4. Jeśli morfologia kryształów i jakość dyfrakcji są wystarczające, przejdź do kroku 3.
  4. Zoptymalizuj czas wzrostu kryształów.
    UWAGA: Analiza morfogramu (krok 2.2) wskaże punkt początkowy krystalizacji (tj. obszar diagramu fazowego, w którym znajduje się kropla po zmieszaniu roztworów strącających i białkowych). Czy spadek znajduje się w obszarze metastabilnym czy poniżej linii rozpuszczalności? Krystalizacja wsadowa rozpoczyna się w strefie zarodkowania (Rysunek 1C). Celem tego kroku jest przeniesienie tego punktu początkowego z poniżej linii rozpuszczalności lub obszaru metastabilnego do strefy zarodkowania (Rysunek 1D). Jeśli seeded-spadnie z kroku 2.2. szybko dały kryształy, co wskazuje, że mieszanina kropli znajduje się już w obszarze metastabilnym, jeśli nie, to prawdopodobnie kropla nie jest przesycona.
    1. Optymalizacja czasu wzrostu kryształów.
      1. Korzystając z tego samego sita, co w kroku 2.1.3, przygotuj 96-dołkowy eksperyment krystalizacji dyfuzji parowej na płytce 3-kroplowej.
      2. Zwiększyć początkowe stężenie białka endotiapepsyny na osi y (tj. zagęścić białko dalej, być może 120 mg/ml dla endotiapepsyny).
      3. Przeprowadzić rozcieńczanie seryjne, jak w kroku 2.1.3.2, tak aby każdy rząd płytki zawierał kolejno niższe stężenie białka.
      4. Użyj różnych proporcji kropli w każdej z trzech kropli na płytce: 1:1, 1:2 i 2:1, białko:strącacz.
      5. Przeglądaj lub zobrazuj płytkę pierwszego dnia o godzinie 0, 3, 6, 12, 18, 24 godzin, a następnie codziennie przez pierwszy tydzień i co tydzień przez następne cztery. Jeśli automatyczne obrazowanie nie jest możliwe, nie martw się o obrazowanie godzinowe w 1. dniu.
      6. Zidentyfikuj krople, które wytwarzają najszybciej pojawiające się kryształy i uczyń je punktami wyjścia do wielokrotnych optymalizacji, aż wzrost kryształów nastąpi w ciągu 24 godzin.
      7. Po zidentyfikowaniu szybko pojawiającego się stanu krystalicznego wróć do Kroku 2.1, aby ponownie wykreślić morfogram jako preludium do rozpoczęcia skalowania.

3. Skalowanie

  1. Skalowanie tras rangi. Na tym etapie nie trzeba decydować się na jedną ścieżkę skalowania, wystarczy zidentyfikować i uszeregować opcje, aby można je było po kolei eksplorować. Wraz ze wzrostem objętości mieszaniny wsadowej podczas procedury skalowania, nastąpią zmiany w szybkości zarodkowania i zakresie rozmiarów kryształów. Można je jednak przezwyciężyć poprzez staranne dostosowywanie stężeń składników w miarę zwiększania objętości skalowanej.
    UWAGA: Kroki 3.1.1 i 3.1.2 opisują, jak na podstawie morfogramu odróżnić, czy bardziej odpowiedni jest protokół partii czy partii zasianej.
    1. Prosty protokół wsadowy
      1. Czy Xn w strefie zarodkowania jest proporcjonalne do stężenia białka i/lub środka strącającego? Tj. czy Xn wzrasta w zależności od stężenia środka strącającego i/lub białka? -Tak? Przejdź do kroku 3.1.1.2. Nie? Przejdź do kroku 3.1.2.
      2. Zlokalizuj warunki, w których powstają kryształy o wymaganej wielkości i przejdź do kroku 3.2.
    2. Protokół partii zasiewnej
      1. Czy Xn jest płaskie w poprzek strefy zarodkowania? Oznacza to, że Xn nie wzrasta ani w funkcji stężenia strącacza, ani stężenia białka.
      2. Zlokalizuj warunki zasiane, w których powstają kryształy o wymaganej wielkości i przejdź do kroku 3.2. Jeśli wszystkie kryształy są zbyt duże - przejdź do kroku 3.1.2.3.
      3. Powtórzyć doświadczenie z morfogramem (krok 2.1), ale tym razem zwiększyć stężenie materiału siewnego użytego w dołkach z nasionami. Zapas nasion można zwiększyć, używając więcej kryształów do jego stworzenia. Na przykład zamiast 5 dołków w kroku 2.1.1.5 użyj 10 dołków.
      4. Wyświetl lub zobrazuj płytkę w ciągu pierwszych 0, 3, 6, 12, 18, 24 godzin.
      5. Xn powinno było wzrosnąć, a Xs zmniejszyć się w rozstawionych kroplach. Powtórz ten cykl, jeśli potrzebne są mniejsze kryształy, a następnie postępuj zgodnie z protokołem partii zasianej.
  2. Stopniowe skalowanie
    1. Skalowanie w płytkach 96-dołkowych. Na podstawie morfogramu endotiapepsyny początkowo wybrano do skalowania prostą metodę wsadową wykorzystującą warunki krystalizacji 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 30% (w/v) PEG 6 000. 100 mg/ml endotiapepsyny zmieszanej z buforem krystalizacyjnym w stosunku 1:1.
      1. Przygotuj 2-3 dołki w 2-dołkowej 96-dołkowej płytce z kroplami do siedzenia ze 100 μl 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 30% (w/v) PEG 6,000.
      2. Używając świeżo rozmrożonego roztworu endotiapepsyny o stężeniu 100 mg/ml, dozować 0,5 μl białka i 0,5 μl środka strącającego do dołka, zamknąć i przechowywać w temperaturze 20°C.
      3. Wyświetl lub zobrazuj płytkę w ciągu pierwszych 0, 3, 6, 12, 18, 24 godzin. Zwróć uwagę na wszelkie zmiany w zakresie Xs i Xn.
      4. Jeśli wystąpiły zmiany, powtórzyć kroki 3.2.1.1 do 3.2.1.2, ale zwiększyć lub zmniejszyć stężenie białka, środka strącającego i/lub nasion, aby przywrócić wszelkie zmiany w zakresie Xs i Xn.
      5. Gdy zakres Xs i Xn jest dopuszczalny, przejdź do kroku 3.2.2.
    2. Skaling w 24-dołkowych płytkach wiszących
      1. Przygotuj pojedynczą studzienkę z 24-dołkową wiszącą płytą, smarując krawędzie studzienki smarem próżniowym.
      2. Przygotuj 0,5 ml 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 30% (w/v) PEG 6,000 i dobrze napełnij natłuszczony.
      3. Używając świeżo rozmrożonego roztworu endotiapepsyny, odpipetować 1 μl białka na powierzchnię szklanego szkiełka nakrywkowego. Odpipetować 1 μl buforu krystalizacyjnego na kroplę białka i wymieszać za pomocą pipety.
      4. Wyświetl lub zobrazuj płytkę w ciągu pierwszych 0, 3, 6, 12, 24 godzin. Zwróć uwagę na wszelkie zmiany w zakresie Xs i Xn.
      5. Jeżeli nastąpiły zmiany, powtórzyć kroki 3.2.2.1 do 3.2.2.4, ale zwiększyć lub zmniejszyć stężenie białka, środka strącającego i/lub nasion, aby przywrócić wszelkie zmiany w zakresie Xs i Xn.
      6. Kiedy/jeśli zakres Xs i Xn jest dopuszczalny, przejdź do kroku 3.2.2.7.
      7. Powtórzyć kroki 3.2.2.1 do 3.2.2.5, stopniowo zwiększając całkowitą objętość doświadczenia do 10 μl.
      8. Gdy osiągnie objętość 10 μl lub większą, przystąpić do odwirowania probówek w kroku 3.2.3.
    3. Skalowanie w probówkach wirówkowych
      UWAGA: Udoskonalenie stanu partii endotiapepsyny nastąpiło zasadniczo w punkcie objętości 200 μl (patrz Wyniki, skalowanie). Proces rozpoczął się od warunków krystalizacji 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 30% (w/v) PEG 6,000. Jednak stężenie PEG ostatecznie zmieniło się na 40% (w/v). Nasiona były również potrzebne do kontrolowania Xn, a aby zapobiec zbyt dużemu wzrostowi kryształów, wzrost kryształów musiał zostać wygaszony. Kroki od 3.2.3.1 do 3.2.3.7 szczegółowo opisują proces optymalizacji warunków. Krok 3.2.4. Opisz końcowy protokół partii.
      1. Przygotuj 1 ml buforu krystalizacyjnego: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 30% (w/v) PEG 6,000.
      2. Używając świeżo rozmrożonej 100 mg/ml endotiapepsyny, dodaj 25 μl białka do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      3. Dokładnie wymieszać bufor krystalizacyjny z roztworem białka w stosunku 1:1 za pomocą końcówki pipety. Umieścić rurkę w rewolwerze/rotatorze z dużym mieszaniem w temperaturze 20 °C.
      4. Weź regularne (5, 10, 30, 60 min, 2, 5, 10, 24 godziny) podwielokrotności 2,5 μl i wyświetl w hemocytometrze. Zapisz zakres Xn i Xs.
      5. Jeżeli nastąpiły zmiany, należy powtórzyć kroki 3.2.3.1 do 3.2.3.4, ale zwiększyć lub zmniejszyć stężenie białka, środka strącającego i/lub nasion, aby przywrócić wszelkie zmiany w zakresie Xs i Xn
      6. Gdy zakres Xs i Xn jest akceptowalny, przejdź do kroku 3.2.3.7.
      7. Powtórzyć kroki 3.2.2.1-3.2.2.5, stopniowo zwiększając całkowitą objętość doświadczenia do 200 μl lub większej, w zależności od potrzeb.
    4. Ostateczny protokół partii rozstawionej
      1. Przygotować materiał siewny.
        1. Przygotuj 2 ml buforu krystalizacyjnego: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 40% (w/v) PEG 6,000.
        2. Używając świeżo rozmrożonej 100 mg/ml endotiapepsyny, dodaj 100 μl białka do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
        3. Dokładnie wymieszać bufor krystalizacyjny z roztworem białka w stosunku 1:1 za pomocą końcówki pipety. Umieścić rurkę w rewolwerze/rotatorze z dużym mieszaniem w temperaturze 20 °C na 24 godziny, aby umożliwić wzrost kryształów o wielkości 50 μm.
        4. Dodać 10-15 kulek szklanych o średnicy 1 mm do zawiesiny krystalicznej o grubości 50 μm.
        5. Wirować probówkę wirówkową zawierającą gnojowicę i kulki z prędkością 1000 obr./min przez 30 s.
        6. Umieść probówkę wirówkową z lodem na 30 sekund.
        7. Powtórz kroki 3.2.4.1.5 i 3.2.4.1.6 jeszcze 10 razy.
        8. Jest to teraz 200 μL 1x wywaru siewnego. Rozcieńczyć materiał siewny 10x przez dodanie 1,8 ml buforu krystalizacyjnego. Podwielokrotnić 10x materiał siewny w partiach po 50 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      2. Protokół partii zasiewanej.
        1. Przygotuj bufor krystalizacyjny: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 40% (w/v) PEG 6,000.
        2. W probówce wirówkowej wymieszać 100 μl buforu krystalizacyjnego z 50 μl świeżo rozmrożonego 10-krotnego wywaru siewnego.
        3. Używając świeżo rozmrożonej 100 mg/ml endotiapepsyny, dodaj 150 μl białka do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
        4. Dokładnie wymieszać mieszaninę buforu krystalizacyjnego/nasion z roztworem endotiapepsyny za pomocą końcówki pipety i umieścić probówkę w rewolwerze/rotatorze z dużym mieszaniem w temperaturze 20 °C.
        5. Monitoruj krystalizację, pobierając regularne podwielokrotności o pojemności 2,5 μl i przeglądaj kryształy w hemocytometrze. Zapisz zakres Xn i Xs.
        6. Po około 80 minutach, gdy kryształy osiągną Xs wynoszące 15 μm, wygasić reakcję przez dodanie 150 μl 0,05 M Na Acetate pH 4,6, 0,05 M Tris-HCl pH 7,0, 0,075 M MgCl2 i 20% (w/v) PEG 6,000 (roztwór złożony z buforu endotiapepsyny i buforu krystalizacyjnego), mieszane 1:1).
        7. Przechowywać kryształy w temperaturze 20 °C.
      3. Czy protokół ustalił dopuszczalny zakres rozmiarów i liczbę kryształów dla planowanego eksperymentu? Tak - GOTOWE - Nie - wróć do kroku 3.1. i spróbuj użyć alternatywnej opcji skalowania. Na przykład możliwy może być inny stosunek białka do strącania lub dodanie nasion, jeśli nie zostało to zrobione wcześniej. Kiedy wszystkie te elementy zostaną wyczerpane, może być konieczne znalezienie nowego warunku w kroku 1.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalizacja morfologii kryształów
Krok 1, optymalizacja morfologii kryształów, został uwzględniony, aby przypomnieć czytelnikowi o jego znaczeniu. Możliwe jest stworzenie doskonałych mikrokryształów ze słabo dyfrakcyjnych kulek igłowych; Autorzy sugerują jednak, że lepiej jest zoptymalizować te dwa osobno. Najpierw znajdź warunki, które powodują powstanie dobrze dyfrakcyjnego monokryształu poprzez dyfuzję pary, a następnie przekształć te warunki w partię, zamiast próbować połączyć te dwa etapy razem. Odkrywanie warunków silnie zarodkujących na tym etapie nie jest konieczne; Morfologia i jakość dyfrakcji to główne cele.

Przed rozpoczęciem mikrokrystalizacji endotiapepsyny, przeprowadzono analizę warunków krystalizacji zdeponowanej struktury z PDB. Warunki krystalizacji i przybliżone protokoły można uzyskać dla 47 z 48 depozycji entotiopepsyny. Zasadniczo wszystkie one opierały się na pierwszej krystalizacji endotiapepsyny przeprowadzonej przez Moewsa i Bunna (1970)46. Biorąc pod uwagę podobieństwa tych warunków i ich "klasyczne" pochodzenie, przeprowadzono 96-dołkowe badanie przesiewowe z dyfuzją pary wodnej w celu zbadania szerszego zakresu warunków krystalizacji. Endotiapepsynę stężono do 70 mg/ml i przeprowadzono badanie przesiewowe PACT z rzadką matrycą47 na 96-dołkowej płytce do kropli siedzącej w temperaturze 20 °C, mieszając 100 nl białka ze 100 nl roztworu studzienki. Każdy warunek z tego eksperymentu po 36 godzinach powodował powstanie kryształów. Jednak analiza morfologii kryształów wykazała, że niektóre warunki mogą okazać się lepsze dla optymalizacji mikrokrystalizacji.

Rysunek 4A pokazuje spadek z ekranu PACT, który był zasadniczo reprezentatywny dla tych zaobserwowanych na większości płyty. Na pierwszy rzut oka kuszące może być myślenie, że kryształy te mogą być warte dalszej optymalizacji pod kątem mikrokrystalizacji. Kryształy są duże i wydaje się, że występuje znaczne zarodkowanie. Jednak ogólna morfologia kryształów nie jest idealna. Po pierwsze, kryształy nie są obserwowalnymi singletonami, ponieważ wydaje się, że wiele kryształów wyrasta z pojedynczych punktów zarodkowania. Po drugie, rozmiar kryształu jest wysoce asymetryczny, a wzrost odbywa się głównie wzdłuż jednej osi. Takie kryształy mają teoretycznie większe szanse na preferencyjne wyrównanie po dostarczeniu do wiązki promieniowania rentgenowskiego. Obie cechy stwarzają problemy podczas gromadzenia i przetwarzania szeregowych danych krystalograficznych.

Rysunek 4B pokazuje jednak kryształy endotiapepsyny wyhodowane w obecności MgCl2. Ta morfologia była spójna we wszystkich warunkach, które zawierały MgCl2 i dlatego sugerowały, że ich morfologia była spowodowana MgCl2. Warunki MgCl2 wytworzyły pojedyncze, bardziej pudełkowe kryształy, które stanowiły lepszy cel dla ostatecznych eksperymentów seryjnych.

Na ekranie PACT były cztery warunki, które zawierały MgCl2. Aby lepiej zrozumieć wpływ wszystkich różnych składników tych warunków na krystalizację endotiapepsyny, przeprowadzono losową optymalizację. Stworzono sito zawierające losową kombinację i środków strącających w zakresie stężeń i pH. Stężenie MgCl2 również było zróżnicowane, a następnie powstałe krople były arbitralnie oceniane w zakresie od 0 do 5 (0 oznaczało brak kryształów lub wytrąceń) pod względem ich wizualnej jakości kryształów i poziomu wytrącenia.

Rysunek 5A pokazuje mapę cieplną wyników analizy korelacji Pearsona między poziomem opadów a jakością kryształów oraz zmiennymi ekranowymi (przykłady spadków z tego eksperymentu są pokazane w Rysunek 5B, C i D). Wyniki wskazały, że pH roztworu było silnie skorelowane z poziomem wytrącenia, przy czym alkaliczne powodowały większe opady. Stężenie MgCl2 było nieznacznie skorelowane z poziomem wytrącenia, podobnie jak pH i stężenie strącania z jakością kryształów.

Na podstawie tych wyników, podjęto decyzję o przeniesieniu kryształów hodowanych w 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2, 20% (w/v) PEG 6,000 do następnego kroku protokołu - przejścia do partii. Morfologia kryształów była akceptowalna, a analiza dyfrakcji rentgenowskiej i wskaźników jakości danych z tych kryształów sugerowała, że nie było znaczącej różnicy między kryształami wyhodowanymi w obecności Mg2+ i poza obecnością Mg 2+ (Rysunek 9).

Przejście do batch
W przypadku wielu optymalizacji mikrokrystalizacji krystalografii szeregowej punktem wyjścia będzie Krok 2. Białko będące przedmiotem zainteresowania zostanie już skrystalizowane do kriokrystalografii, a protokół krystalizacji będzie teraz wymagał transformacji, aby wytworzyć zawiesiny mikrokryształów. W tym protokole użyto tylko 96-dołkowych płytek dyfuzyjnych do przeprowadzenia transformacji do partii, ponieważ dyfuzja parowa jest metodą krystalizacji używaną przez 95% wpisów PDB26. W protokole uniknięto przejścia do microbatch34,35,37, ponieważ to przejście może nadal wymagać podobnej optymalizacji. Nie oznacza to, że protokół ten można wykonać tylko w płytach dyfuzyjnych. Wszystkie przedstawione kroki działałyby również w mikropartii, gdyby była to oryginalna metoda krystalizacji.

Aby ocenić krystalizację endotiapepsyny w wybranym stanie, stworzono morfogram - lub przybliżony diagram fazowy. Cel eksperymentu z morfogramem jest trojaki. Po pierwsze, analiza morfogramu jest bardzo przydatna przy ocenie tras skalowania w Kroku 3 - Skalowanie. Po drugie, morfogram działa jako narzędzie optymalizacyjne, pomagając odkryć warunki dyfuzji pary, które powodują powstawanie kryształów poprzez partię [tj. szybko pojawiające się kryształy (< 24 h)]. Po trzecie, jeśli kryształy nie pojawiły się szybko, analiza zasianych kropli może dać krystalografowi wyobrażenie o przybliżonym położeniu aktualnego stanu na diagramie fazowym. Na przykład, jeśli warunki zasiane dają kryształy, ale niezasiane nie, warunki te prawdopodobnie znajdują się w regionie metastabilnym.

Eksperyment morfogramu endotiapepsyny został przeprowadzony na podstawie 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2, 20% (w/v) PEG 6,000. Stężenia białka i PEG wahały się odpowiednio od 100 do 12,5 mg/ml i od 5 do 40% (w/v). Krople zostały przeanalizowane, a wyniki wykreślone za pomocą dostarczonego arkusza roboczego (Rysunek 6A).

Już na etapie optymalizacji morfologii kryształów było jasne, że wzrost kryształów endotiapepsyny w tym stanie i przy tych stężeniach białka spowoduje wzrost kryształów w czasie krótszym niż 24 godziny. Wskazywało to, że krystalizacja zachodziła w partii, a nie w procesie napędzanym dyfuzją pary. Kryształy wyhodowane w tych warunkach nadawały się zatem do skalowania do większych objętości.

Gdyby kryształy nie były widoczne w niezaszczepionych kroplach po 24 godzinach, to prawdopodobnie krystalizacja nadal zależała od przejścia (Rysunek 1B), a zatem nie od partii. W tym przypadku wyniki eksperymentu z morfogramem są nadal interesujące. Wskazują one prawdopodobny punkt początkowy krystalizacji na diagramie fazowym, a tym samym, jak powinna przebiegać późniejsza optymalizacja. Spójrz na wysiane krople. Nasiona pozwolą na wzrost kryształów w regionie metastabilnym niezależnie od zarodkowania. Na przykład, jeśli kryształy pojawią się w ciągu 24 godzin w kroplach zaszczepionych, ale nie w kroplach niezaszczepionych, oznacza to, że można zaobserwować część obszaru metastabilnego. Jeśli nie zaobserwuje się żadnych kryształów ani w kroplach z nasionami, ani bez nasion, wszystkie studzienki pozostają nienasycone.

Skalowanie
Patrząc na morfogram (Rysunek 6A), można poczynić szereg obserwacji. Wydaje się, że na ilość zarodkowania miały wpływ zarówno stężenia białka, jak i strącania. Istniało również bardzo wyraźne rozgraniczenie kropli, które prowadzą do wytrącania się białka, przy czym krople zawierały: nic, kryształy lub osad (Rysunek 6B). Dodanie nasion (Rysunek 6D) również znacznie zwiększyło Xn w porównaniu do kropli bez nasion (Rysunek 6C). Biorąc pod uwagę wszystkie te wyniki, zdecydowano się spróbować przeskalować zarówno protokół partii, jak i serii z nasionami przy 30% (w/v) PEG 6,000 i 100 mg/ml endotiapepsyny.

Początkowe skalowanie testowe zostało przeprowadzone na 24-dołkowych wiszących płytkach. Objętość kropli była stopniowo zwiększana, tak aby można było zaobserwować wszelkie zmiany w zachowaniu krystalizacji (Rysunek 7). Jak widać, zarówno w kroplach niezasianych, jak i zasianych nastąpił wzrost kryształów. Wszystkie niezasiane krople wyrosły z kryształów o różnych rozmiarach, ale głównie dużych kryształów (100-200 μm - najdłuższy wymiar). Zasiane krople wytworzyły jednak mniejsze kryształy (5 - 50 μm - najdłuższy wymiar). Te wstępne testy sugerowały, że nasiona będą musiały zmniejszyć Xs, ale także, że ten warunek powinien być odpowiedni dla większych objętości.

Gdy objętość została zwiększona o 200 μL, objętość krystalizacji była stale poruszana podczas wzrostu kryształu. Głównym powodem tego mieszania było zapewnienie, że roztwór krystalizacyjny pozostaje jednorodny i że rosnące kryształy nie osadzają się na dnie lub bokach probówek. Osiadanie kryształów może prowadzić do niejednorodnej populacji kryształów zarówno z bardzo dużymi, jak i małymi kryształami. Mieszanie roztworu krystalizacyjnego może również sprzyjać zarodkowaniu44,45.

Niestety, nieobsiane 30% (w/v) PEG 6,000 nie wytwarzało kryształów, więc stężenie PEG zostało zwiększone do 35% (w/v). Ten wzrost znacznie poprawił krystalizację, z końcowym zakresem Xn i Xs wynoszącym odpowiednio 3,6 ± 1,2 x 106 kryształów · mL-1 i 42 ± 4,1 μm (Rysunek 8A i B -). Pomimo znacznej poprawy i akceptowalnego stężenia kryształów, końcowe kryształy były zbyt duże dla planowanego eksperymentu, więc podjęto dalsze optymalizacje. Aby zmniejszyć rozmiar końcowych kryształów, zbadano dwie drogi (Rysunek 1E): zmniejszenie stężenia białka, aby spróbować ograniczyć końcowy wzrost kryształów (Rysunek 8A i B - gorący róż), oraz zwiększenie stężenia PEG, aby spróbować zwiększyć zarodkowanie (Rysunek 8A i B - zielony).

Zmniejszenie stężenia białka niestety również drastycznie zmniejszyło Xn, co ostatecznie doprowadziło do powstania jeszcze większych kryształów. Zwiększenie stężenia PEG do 40% dało końcowy zakres Xn i Xs wynoszący odpowiednio 3,1 ± 0,7 x 106 kryształów·mL-1 i 39 ± 2,3 μm. Nie różniły się one znacząco od 35%, ale ponieważ ostateczny rozmiar kryształu został zmniejszony, warunek ten był kontynuowany z dalszymi optymalizacjami.

Aby zwiększyć Xn, dodano nasiona. To radykalnie zwiększyło Xn (1,1 ± 1,8 x 108 kryształów·mL-1) i doprowadziło do mniejszego Xs (4,2 ± 4,0 μm) (Rysunek 8A i B - przerywany fioletowy). Kryształy te, choć bardzo odpowiednie do niektórych seryjnych eksperymentów krystalograficznych, zostały uznane za zbyt małe, więc stężenie dodanych nasion zostało zmienione.

To dostrojenie dodanego materiału siewnego okazało się jednak trudne do niezawodnego powtórzenia; dlatego podjęto próbę hartowania. Po dodaniu materiału siewnego, wielkość kryształów była monitorowana, a po osiągnięciu odpowiedniej wielkości kryształu (około 10 - 20 μm), krystalizacja partii została wygaszona (Rysunek 8C i D). Hartowanie zostało zaproponowane, w odniesieniu do mikrokrystalizacji, w Kupitz et al. (2014)25. Chociaż być może nie jest to idealna metoda, ponieważ roztwór białka ostatecznie zostanie zmarnowany26, technika ta była bardzo przydatna w tej sytuacji, ponieważ wzrost kryształów był trudny do kontrolowania. Ideą hartowania jest szybki powrót mieszaniny krystalizacji do punktu tuż powyżej linii rozpuszczalności (Rysunek 1F). Gdy roztwór powróci do linii rozpuszczalności, roztwór powrócił do stabilnego nasyconego roztworu i nie nastąpi dalszy wzrost kryształów.

Próba stłumienia reakcji krystalizacji nie jest pozbawiona ryzyka. Jeśli doda się zbyt duży roztwór hartujący, białko w roztworze może zostać rozcieńczone tak bardzo, że linia rozpuszczalności zostanie przekroczona. W takim przypadku roztwór stanie się nienasycony, a kryształy zaczną się rozpuszczać. Aby temu zapobiec, możliwe jest oszacowanie ilości wymaganego roztworu hartowniczego na podstawie wyników morfogramu. W punkcie hartowania zmierz stężenie roztworu białka. Porównując stężenie białka na linii rozpuszczalności i stężenie białka w roztworze, można oszacować wymagane rozcieńczenie.

Eksperyment z hartowanym 40% (w/v) PEG 6,000, 10 x rozcieńczonym ziarnem dał końcowe stężenie kryształów i zakres wielkości odpowiednio 2,6 ± 3,1 x 106 kryształów·mL-1 i 15 ± 3,9 μm.

Podczas całego procesu, testowe zbiory danych rentgenowskich kryształów endotiapepsyny były zbierane na linii badawczej Swiss Light Source PXII przy użyciu ogniska 10 x 30 μm, energii 12,4 keV tłumionej o 80% i w warunkach kriogenicznych. Dane zostały przetworzone za pomocą tarcz i Rysunek 9 przedstawia porównanie CC1/2. W trakcie optymalizacji nie zaobserwowano żadnych dramatycznych zmian w CC1/2.

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd krystalizacji przejściowej i wsadowej oraz metod skalowania odwzorowanych na diagramie fazowym. A. Strefy i granice diagramu fazowego krystalizacji białka archetypicznego. Stężenia strącania i białka są wykreślane odpowiednio na osiach x i y, z punktem czystej wody w punkcie początkowym. Fioletowa linia wskazuje granicę przesycenia białka, a strefy metastabilne, zarodkowania i wytrącania są pokazane odpowiednio na niebiesko, zielono i różowo. Ur. Przykład granic penetracji strefy zarodkowania w metodzie krystalizacji "fazy przejściowej", takiej jak dyfuzja pary. W tym teoretycznym eksperymencie stężenie kropli i białka zaczyna się tuż poniżej linii rozpuszczalności - jeszcze nie przesyconej. Podczas gdy kropla równoważy się, stężenia składników kropli rosną tak, że kropla staje się przesycona i kontynuuje przemieszczanie się - lub przejście - do strefy zarodkowania. Po zarodkowaniu kryształów stężenie białka w roztworze zaczyna spadać. Stężenie nadal spada wraz ze wzrostem kryształów, aż w końcu zatrzymuje się na linii rozpuszczalności. Niebieska przerywana linia wyznacza teoretyczną granicę przejścia do strefy zarodkowania. Gdy tylko rozpocznie się zarodkowanie, stężenie białka spadnie, uniemożliwiając dalszą penetrację. C. Przykładowe trajektorie krystalizacji partii i partii zaszczepionej. W partii mieszanie białka i środka strącającego musi wytworzyć przesycony roztwór w strefie zarodkowania, aby mógł nastąpić wzrost kryształów. W partii zasiewanej nie jest bezwzględnie konieczne przebywanie w strefie zarodkowania ze względu na dodanie mikronasion, więc można również zbadać lokalizacje w regionie metastabilnym. D. Hipotetyczna optymalizacja eksperymentu krystalizacji pokazanego w B od dyfuzji pary do partii. Pierwotny punkt początkowy dyfuzji pary wodnej przeszedł, za pośrednictwem wynikowego wektora optymalizacji, do nowej pozycji początkowej; wewnątrz strefy zarodkowania. Wynikowy wektor jest produktem dwóch optymalizacji: wzrostu zarówno stężeń białka, jak i strącania. E. Przykładowe optymalizacje podczas skalowania warunków partii w celu dostosowania końcowych Xn i Xs. Fot. Wygaszanie doświadczenia krystalizacji przez dodanie buforu krystalizacyjnego. Istotne jest, aby hartowanie nie powodowało wyprowadzenia stężenia białka z obszaru metastabilnego, a zatem poniżej punktu przesycenia białkami. W przeciwnym razie kryształy zaczną rozpuszczać się z powrotem w roztworze. Ur. i C. zostały zaadaptowane z Beale et al. (2019)26 za zgodą autorów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Zwiększanie Xn i zmniejszanie Xs. Wyidealizowany związek między liczbą kryształów wytworzonych w eksperymencie krystalizacji a ich średnim najdłuższym wymiarem. Do stworzenia tego wykresu wykorzystano krystalizację hipotetycznego białka modelowego o masie 10 kDa. Białko krystalizowało w stężeniu 10 mg/ml i dawało kryształy P21212 1 o wymiarach 49x50x51 A. Zakładano, że każde zdarzenie zarodkowania daje kryształ. Zakładano, że wzrost kryształów jest jednorodny z każdej powierzchni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Schemat blokowy pokazujący kroki do optymalizacji kryształu wyhodowanego w eksperymencie dyfuzji pary o małej objętości (<500 nL) do eksperymentu wsadowego o dużej objętości (> 100 μL). Optymalizacja kryształów dzieli się na trzy etapy: (1) Optymalizacja morfologii kryształów. (2) Przejście do partii. (3) Skalowanie. W etapie 1 ważne jest, aby zidentyfikować odpowiednie kryształy do mikrokrystalizacji. Niektóre białka występują tylko w morfologii pojedynczego kryształu, niezależnie od warunków krystalizacji. Warto jednak szukać warunków, w których powstają pojedyncze, sześcienne kryształy, lub jak najbardziej zbliżone do nich. Pojedyncze, sześcienne kryształy, hipotetycznie i anegdotycznie, na ogół dają lepsze wyniki z eksperymentów krystalografii szeregowej. Po wybraniu morfologii kryształu i potwierdzeniu dyfrakcji konieczne jest przeniesienie eksperymentu krystalizacji z dyfuzji parowej do fazy (etap 2). W tym przypadku kryształy powinny być zoptymalizowane pod kątem czasu zarodkowania. Celem jest znalezienie warunków, w których powstają szybko pojawiające się kryształy (> 24 godzin), ponieważ warunki te prawdopodobnie natychmiast uderzą w strefę zarodkowania, a zatem są wsadowe. Po znalezieniu warunku w strefie zarodkowania można utworzyć morfogram. Morfogram pozwala na zmapowanie większości strefy zarodkowania i zidentyfikowanie potencjalnych tras skalowania dla etapu 3. Objętość zidentyfikowanego stanu partii może być następnie stopniowo lub szybko skalowana, aby uzyskać końcową objętość >100 μL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza warunków krystalizacji endotiapepsyny z ekranu rzadkiej matrycy PACT. A. i B. to zdjęcia po 24 godzinach studzienek A4 i C10, odpowiednio z ekranu PACT. Składniki bufora krystalizacyjnego są wyróżnione na rysunku. Bufor SPG składa się z kwasu bursztynowego, diwodorofosforanu sodu i glicyny zmieszanych w stosunku molowym 2:7:7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Analiza optymalizacji krystalizacji endotiapepsyny na podstawie warunków PACT MgCl2. A. Mapa cieplna wyników analizy korelacji Pearsona między pH bufora, stężeniem MgCl2 i stężeniem strącania a poziomem wytrącania i jakością kryształów. Poziom wytrącania i jakość kryształów oceniano arbitralnie w skali od 0 do 5 (gdzie 0 oznaczało brak kryształów lub opadów) po 24 godzinach p.n.e. i D. pokazują przykłady krystalizacji i wytrącania w trzech różnych kroplach. Przedstawiono również warunki krystalizacji oraz oceny poziomu wytrącenia i jakości kryształów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Morfosgram endotiapepsyny po krystalizacji w 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i PEG 6,000. A. Morfogram utworzony na podstawie dostarczonego arkusza kalkulacyjnego "generator diagramów faz". Względna liczba kryształów w każdej kropli jest oznaczona rozmiarem okręgów, a wyniki z kropli 1 (białko i strącacz) i kropli 2 (białko, strącacz i nasiona) są podświetlone odpowiednio na zielono i niebiesko. Wartości stężeń białka i strącacza, odpowiednio na osiach x i y, oznaczają wstępnie zmieszane wartości każdej objętości, a nie końcowe. Na podstawie wyników narysowano czarne linie i fioletową linię, aby pokazać granice odpowiednio strefy zarodkowania i strefy metastabilnej. B. C. i D. pokaż kilka przykładowych wyników eksperymentu. Czerwone i niebieskie kropki oznaczone na A. wskazują lokalizacje B. i C. i D. odpowiednio. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Wstępne próby skalowania endotiapepsyny w 24-dołkowych wiszących płytkach. Te same stężenia białka i strącacza zastosowano dla wszystkich ścieżek: odpowiednio 100 mg/ml endotiapepsyny w 0,1 M Na Acetate pH 4,6 i 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 30% (w/v) PEG 6,000. Wszystkie wyświetlane obrazy zostały wykonane po 24 godzinach, a końcowe objętości kropli są oznaczone na każdym obrazie. Lewy panel (A, D i G) to mieszanka białka i środka strącającego w proporcji 1:1, środkowy panel (B, E i H) to mieszanina nasion, środka strącającego i białka w proporcji 1:2:3, a prawy panel (C, F i I) to powiększone obrazy środkowego panelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Analiza mikrokrystalizacji endotiapepsyny w objętościach 200-300 μL. A. i C. pokazują, jak Xn zmieniało się w czasie eksperymentu. Ur. i D. pokazują, jak Xs (najdłuższy wymiar) zmieniał się w czasie. Wyniki eksperymentów zostały rozdzielone dla jasności. Czerwona przerywana linia na C. i D. pokazuje punkt, w którym zostało wykonane hartowanie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Wyniki CC1/2 i obrazy kryształów uzyskane na każdym etapie procesu mikrokrystalizacji w celu oceny jakości dyfrakcji. A. CC1/2 wykreślone w zależności od rozdzielczości z danych zebranych z hodowanych kryształów: z i bez Mg - część optymalizacji Etapu 1, w objętości 200 nL, objętości 10 μL i końcowej objętości 300 μL. BC i D. pokazują kryształy o objętości odpowiednio 200 nL, 10 μL i 300 μL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. szt. osób osób osób osób szt. pkt.
Informacje o białku
białkoEndotiapepsyna
Masa cząsteczkowa (kDa)33,8
Grupa kosmicznaP1211
a, b, c (A)45,2, 73,3, 52,7
α, β, ɣ (°)90,0, 109,2, 90,0
Parametry stałego celu
Objętość załadowana na chip (μL)150
Aperatury na chip25 600
Wymagane stężenie kryształów (kryształy/ml)500 000
Przykładowe informacje
Masa białkowa użyta do wytworzenia 200 μl próbki (mg)10
Najdłuższy wymiar kryształu (μm)15
Stężenie kryształów (kryształy/ml)2 500 000
Zmienne eksperymentalne
Liczba wymaganych punktów czasowych5
Liczba obrazów wymaganych na punkt czasowy50 000
Współczynnik trafień (zintegrowane wzorce/zebrane obrazy)0,3
Stałe cele wymagane na punkt czasowy (zaokrąglone w górę)7
Przykładowe wymagania
Wymagana objętość próbki na punkt czasowy (μl)1 050
Całkowita objętość próbki wymagana do eksperymentu (ml)Godzina 5,25
Całkowita masa wymaganego białka (mg)52,5

Tabela 1: Przykład wymagań dotyczących próbki dla hipotetycznego eksperymentu z pompą optyczną i sondą przeprowadzonego przy użyciu stałych celów. Białkiem użytym w tym teoretycznym eksperymencie była endotiapepsyna. Parametry stałego celu oparto na eksperymentach opisanych w Ebrahim et al. (2019)48 i Davy et al. (2019)49. Przykładowe informacje pochodziły z protokołu opisanego w tym artykule wideo, a zmienne eksperymentalne były konserwatywnymi szacunkami opartymi na przeżytym doświadczeniu. Następujące wymogi dotyczące próby zostały następnie obliczone przy wcześniejszych założeniach.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona metoda pokazuje, w jaki sposób można zoptymalizować krystalizację endotiapepsyny z dużych kryształów (≥ najdłuższym wymiarze 100 μm), hodowanych w 96-dołkowych sitach o rzadkiej matrycy, do mikrokryształów, hodowanych w probówkach wirówkowych (objętość 300 μl) za pomocą partii. Ideą protokołu jest to, że kroki podjęte w celu optymalizacji endotiapepsyny mogą być również wykorzystane do innych białek. Ostatecznie odpowiedź na problem tworzenia dużych objętości (>100 μL) mikrokryształów (10-20 μm) do eksperymentów krystalografii szeregowej na XFELach i synchrotronach.

Protokół dzieli zadanie mikrokrystalizacji o dużej objętości na trzy etapy: (1) Optymalizacja morfologii kryształów, (2) Przejście do partii i (3) Skalowanie. W Kroku 1 należy zbadać zakres form krystalicznych, które może wytworzyć białko w płytkach dyfuzyjnych. Celem powinny być warunki, w których powstają pojedyncze, pudełkowe kryształy, które ulegają dyfrakcji z wymaganą rozdzielczością. W kroku 2 wybrane warunki można następnie przekształcić z dyfuzji pary w partię. W tym przypadku kryterium optymalizacji jest czas wzrostu kryształów i znalezienie warunków, w których w ciągu 24 godzin powstają kryształy białka. Można również wykreślić morfogram, który daje eksperymentatorowi wyobrażenie o położeniu linii rozpuszczalności i granic strefy zarodkowania. Ten morfogram jest bardzo przydatny w kroku 3, Skalowanie. Mornogram da wskazówkę, czy samo zarodkowanie może zwiększyć Xn i obniżyć Xs. Wraz ze wzrostem objętości eksperymentu, Xn i Xs mogą być stale oceniane jako kluczowe kryteria sukcesu skalowania.

W przypadku endotiapepsyny, Etap 1 odkrył coś, co potencjalnie było wcześniej nieznaną morfologią kryształów endotiapepsyny. Ta morfologia miała tę samą grupę przestrzenną, co wcześniej opisywane, ale, co ważne dla krystalografii szeregowej, bardziej pudełkowy kształt. Monokryształy również wydawały się rosnąć z pojedynczych punktów zarodkowania, w przeciwieństwie do wentylatorów powstałych w innych warunkach (ryc. 4). Dla wybranego warunku Krok 2 był już częściowo spełniony, ponieważ wzrost kryształów nastąpił w ciągu < 24 godzin. Mornogram wskazał, że zarówno protokół prosty, jak i wsadowy może być skuteczny podczas skalowania w kroku 3. Początkowe skalowanie w prostej partii stworzyło warunki, w których powstały kryształy o zakresie Xn i Xs wynoszącym odpowiednio 3,6 ± 1,2 x 106 kryształów · mL-1 i 42 ± 4,1 μm. Kryształy te, choć dopuszczalne w niektórych seryjnych eksperymentach krystalograficznych, zostały uznane za zbyt duże. Przeprowadzono więc dodatkowe optymalizacje. W końcowym protokole wyprodukowano kryształy o stężeniu i zakresie wielkości 3,1 x 106 kryształów·mL-1 i 15 ± 3,9 μm, odpowiednio. Było to więcej niż idealne rozwiązanie dla planowanych eksperymentów.

Metoda koncentruje się na przekształceniu "rozpuszczalnych" kryształów białek wyhodowanych na płytkach dyfuzyjnych do wsadu. Powodem tego skupienia jest to, że zdecydowana większość rozpuszczalnych kryształów białka jest hodowana poprzez dyfuzję pary26. Przedstawione koncepcje można jednak również zastosować do rozpuszczalnych kryształów białek hodowanych przy użyciu innych metod, takich jak mikropartie. Koncepcje te mogą być również stosowane do kryształów białek błonowych hodowanych w LCP; ponieważ jest to również proces krystalizacji wsadowej.

Kluczowym aspektem protokołu jest proces przekształcania warunków kryształów hodowanych na płytkach dyfuzyjnych w taki sposób, aby można je było hodować wsadowo. Do tej transformacji metoda wykorzystuje kryterium zaproponowane przez Beale'a i in. (2019)26. Kryształy wyhodowane w procesie wsadowym, nawet na płytkach dyfuzyjnych, tworzą się szybko (< 24 godzinach). Kryterium to jest przybliżeniem opartym na prędkości równoważenia kropli dyfuzji pary i jest najbardziej prawdziwe w przypadku warunków strącania opartych na PEG. Jednak warunki krystalizacji będą zawierały szeroką gamę związków, które będą miały wpływ na czas równowagi. Zrównoważenie warunków krystalizacji na bazie soli, np. wysoko stężonego chlorku amonu, może nastąpić w ciągu 1-2 dni. W związku z tym kryterium 24 godzin może nie być prawdziwe w przypadku warunków opartych na soli. Warunki oparte na soli mogą również mieć bardziej złożone diagramy fazowe26, 30 , które mogą nie być zgodne z archetypem przedstawionym w tym protokole. Skrócenie kryterium czasu dla warunków opartych na soli do 12 lub 6 godzin może być konieczne, jeśli skalowanie do większych objętości okaże się niemożliwe.

Kolejnym ograniczeniem tej metody jest jej pozorna złożoność. Protokół, który został zastosowany w celu optymalizacji mikrokrystalizacji endotiapepsyny, w rzeczywistości zmienił pierwotny stan z badania przesiewowego o rzadkiej matrycy stosunkowo nieznacznie. Pierwszym trafieniem zaobserwowanym w badaniu przesiewowym PACT było 0,1 HEPES, pH 7,0, 0,2 M MgCl2 i 20% (w/v) PEG 6,000. Końcowy skalowany bufor krystalizacyjny wynosił 0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 40% (w/v) PEG 6,000. Jest również bardzo możliwe, że zmiana stężenia buforu z HEPES na Tris-HCl i MgCl2 w niewielkim stopniu przyczyniła się do powodzenia procesu. Pozostawiając wzrost stężenia PEG 6,000 jako jedyną optymalizację, którą można było osiągnąć w dość prosty sposób.

Ocena ta jest jednak również zbyt uproszczona. Nie tylko pomija problemy napotkane podczas skalowania (tj. użycie nasion i hartowanie), ale także fakt, że tylko dlatego, że to białko okazało się proste, nie ma gwarancji, że następne również okaże się proste. Kroki zalecane w protokole zostały opracowane, ponieważ optymalizacja skalowania objętości krystalizacji białek może być bardzo kosztowna w zakresie białka. W siedmiu pokazanych próbach skalowania endotiapepsyny spożywano 100 mg białka. Trzeba przyznać, że niektóre z tych kroków zostały wykonane w celu ukazania ich konsekwencji w świetle tego protokołu. Mimo to 100 mg białka plus potencjalnie kolejne 50 mg białka spożywanego podczas eksperymentu (Tabela 1) może być znaczącą inwestycją zarówno czasu, jak i pieniędzy.

Na szczęście nie jest jasne, czy ta masa wymaganej próbki jest wszechobecna we wszystkich białkach. Endotiapepsyna była wysoce rozpuszczalna i dlatego wymagała dużego stężenia białka, aby osiągnąć przesycenie. W innych (obecnie optymalizowanych) przesycenie można osiągnąć na poziomie 10, a nawet 5 mg/ml. Takie zmienne są specyficzne dla białka i należy je uwzględnić, gdy się pojawią.

Inne ograniczenia tej metody obejmują jej poleganie na złożonym sprzęcie, takim jak roboty do obsługi cieczy do tworzenia przesiewów i płyt oraz imagery, które w razie potrzeby automatycznie naświetlają płyty. Zaproponowano alternatywne procedury, aby ograniczyć zapotrzebowanie na niektóre z tych elementów wyposażenia, ale przestrzeganie protokołu bez nich będzie bardziej czasochłonne. Protokół sugeruje również testowanie dyfrakcji zoptymalizowanych kryształów. Dla krystalografów, którzy nie mają regularnego dostępu do synchrotronu, testy te mogą okazać się wyzwaniem. Kontrole na każdym kroku mogą nie być konieczne, ale te testy są zdecydowanie zalecane po zidentyfikowaniu trafienia oraz przed i po skalowaniu. Niedyfrakcyjne kryształy w XFEL nie są niestety rzadkim zjawiskiem. Biorąc to pod uwagę, lepiej jest zachować ostrożność w odniesieniu do założeń dotyczących dyfrakcji kryształów.

Ostatecznie, ten protokół i przedstawione tutaj wyniki będą stanowić przewodnik, pomysły i przykład dla tych, którzy zmagają się z wytwarzaniem próbek do seryjnych eksperymentów krystalograficznych. Miejmy nadzieję, że wraz z dalszym rozwojem krystalografii seryjnej wymagania dotyczące próbek tej techniki zostaną zmniejszone, co zmniejszy potrzebę stosowania takich protokołów. Jednak nawet w tym przypadku przedstawione tutaj strategie będą nadal przydatne dla tych, którzy chcą zbadać przestrzeń krystalizacji swojego białka.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji w ramach umowy o grant nr 701647 Marie Skłodowska-Curie. Wielkie podziękowania za pomoc i wsparcie dla naukowców z linii badawczej Swiss Light Source X10SA-PXII.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Swissci 96-dołkowe płytki 2-kroploweWymiary molekularneMD11-00296-dołkowa 2-kroplowa płytka krystalizacyjna
Swissci 96-dołkowa 3-kroplowaWymiary molekularneMD11-00396-dołkowa 3-kroplowa płytka krystalizacyjna
komar LCP Robot do obsługi cieczysptlabtechmosquito LCPRobot krystalizacyjny
ClearVue Arkusze WymiarymolekularneMD6-01596-dołkowe uszczelki płytkowe do krystalizacji
Safe-Tube 1,5 mlEppendorf301200861,5 ml probówki wirówkowe
ScapleSwan i MortonNo. 3 i rękojeść nr 3Skalpel do cięcia otwartych uszczelek płytowych
MS 3 VortexIKA3319000Vortex do mieszania roztworu i wytwarzania zapasów nasion
24-dołkowa płytka XRLWymiary molekularneMD3-1124-dołkowe płytki wiszące
Rewolwer/rotator rurkowyThermo Fischer Scientific88881001Rewolwer rurkowy do mieszania roztworu podczas skalowania
Eppendorf Research plus pipetyEppendorfGama pipet ręcznych, 0,5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 i mikro; L
Końcówki do pipet EppendorfEppendorfZakres rozmiarów końcówek do pipet ręcznych
Suparen 600Prochem AGSuparen 600Endotiapepsyna roztwór
Octan soduSigma-Aldrich241245-1KGOctan sodu
TrisMerck8382T014Tris
Chlorek magnezuSigma-AldrichM2670-1kgChlorek magnezu
PEG 6,000Sigma-Aldrich81255-1kgPEG 6,000
Glikol ethelyenowySigma-Aldrich324558-1LGlikol ethelyenowy do cyroochrony kryształów
Ekran PACT Premier HTWymiary molekularneMD1-36PACT 96-dołkowy ekran kryształkowy
Smar wysokopróżniowy DOW CORNINGWymiary molekularneMD6-02 do uszczelniania płytek 24-dołkowych
Hirschmann 22 x 22 mm prowadnice osłonowe glaserHirschmann8000104Szkiełka pokrywowe do uszczelniania 24-dołkowych płytek opadowych do siedzenia
Kołki kryształowePSIProdukowane we własnym zakresieCienkowarstwowe nośniki do mikrokryształów.
1-1,3 mm SiLibeads Type SFaust6239547Koraliki szklane do robienia naczyń mikoziarnistych
Macbook ProAppleMacbook ProKomputer do analizy danych
Pakiet oprogramowania CCP4CCP4Oprogramowanie do przetwarzania danych o wzorcach dyfrakcyjnych
ExcelMicrosoftMicrosoft OfficeNarzędzie do kreślenia diagramu fazowego
Komora licząca Hausser Scientific Bright-LineThermo Fischer Scientific02-671-51BNarzędzie do obliczania stężenia kryształów
PACT PremierMolecular DimensionsMD1-29-ECOEkran krystalizacji w matrycy rzadkiej
Imager skałFormulatrixRock ImagerMagazyn i obrazowanie płyt kryształowych z kontrolowaną temperaturą
Rock MakerWebFormulatrixRock MakerWebOprogramowanie do tworzenia i przechowywania obrazów na płytkach kryształowych
FormulatorFormulatrixFormulator96-dołkowy robot do tworzenia ekranów kryształowych do obsługi cieczy
Mikroskop Leica MZ16LeicaLeica MZ16Mikroskop świetlny
LAS V4.6Oprogramowanie LeicaLAS V4.6do mikroskopów
Leica Rurki dializacyjne Spectra/Por 3,5 kDaSpectrumlabsSpectra/Por 3 Membrana dializacyjnaMembrana dializowa 3,5 kDa
Zamknięcia węży do dializySpectrumlabsSpectra/Por 3 Duniversal ZamknięciaZaciski do uszczelniania końcówek przewodów dializacyjnych Koncentrator
odśrodkowy Amicon 10 kDaMerck-MilliporeKoncentrator odśrodkowy Amicon Ultra-15 10 kDaFiltr odśrodkowy
5810 R Wirówka z kubełkiem obrotowymEppendorf5810 R WirówkaWirówka z kubełkiem obrotowym
Smar Mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. Journal of Physics D: Applied Physics. 41 (19), 195505(2008).
  2. Hunter, M. S., et al. Fixed-target protein serial microcrystallography with an x-ray free electron laser. Scientific Reports. 4 (1), 6026(2014).
  3. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5 (1), 1-6 (2014).
  4. Roessler, C. G. G., et al. Acoustic Injectors for Drop-On-Demand Serial Femtosecond Crystallography. Structure. 24 (4), 631-640 (2016).
  5. Sherrell, D. A., et al. A modular and compact portable mini-endstation for high-precision, high-speed fixed target serial crystallography at FEL and synchrotron sources. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1372-1378 (2015).
  6. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5 (1), 1-11 (2015).
  7. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  8. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542(2017).
  9. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  10. Nango, E., et al. A three-dimensionalmovie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  11. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  12. Mehrabi, P., et al. Liquid application method for time-resolved analyses by serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 16 (10), 979-982 (2019).
  13. Halle, B. Biomolecular cryocrystallography: structural changes during flash-cooling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4793-4798 (2004).
  14. Fraser, J. S., et al. Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis. Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).
  15. Fenwick, R. B., van den Bedem, H., Fraser, J. S., Wright, P. E. Integrated description of protein dynamics from room-temperature X-ray crystallography and NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (4), 445-454 (2014).
  16. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. Elife. 4, (2015).
  17. Thomaston, J. L., et al. XFEL structures of the influenza M2 proton channel: Room temperature water networks and insights into proton conduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 13357-13362 (2017).
  18. Haas, D. J., Rossmann, M. G. Crystallographic studies on lactate dehydrogenase at -75 °C. Acta Crystallographica Section B Structural Crystallography and Crystal Chemistry. 26 (7), 998-1004 (1970).
  19. Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
  20. Wu, W., et al. Batch crystallization of rhodopsin for structural dynamics using an X-ray free-electron laser. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 71 (7), 856-860 (2015).
  21. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and delivery of protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463(2016).
  22. Andersson, R., et al. Well-based crystallization of lipidic cubic phase microcrystals for serial X-ray crystallography experiments. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (10), 937-946 (2019).
  23. Luft, J. R., et al. The detection and subsequent volume optimization of biological nanocrystals. Structural Dynamics. 2 (4), 041710(2015).
  24. Lee, D. B., et al. Supersaturation-controlled microcrystallization and visualization analysis for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
  25. Kupitz, C., et al. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1647), 20130316(2014).
  26. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, Pt 6 1385-1396 (2019).
  27. Rayment, I. Small-scale batch crystallization of proteins revisited: An underutilized way to grow large protein crystals. Structure. 10 (2), 147-151 (2002).
  28. García-Ruiz, J. M. Nucleation of protein crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 22-31 (2003).
  29. McPherson, A., Kuznetsov, Y. G. Mechanisms, kinetics, impurities and defects: Consequences in macromolecular crystallization. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (4), 384-403 (2014).
  30. Rupp, B. Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71, Pt 3 247-260 (2015).
  31. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  32. Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 60 (3), 601-605 (2004).
  33. Forsythe, E. L., Maxwell, D. L., Pusey, M. Vapor diffusion, nucleation rates and the reservoir to crystallization volume ratio. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (10), 1601-1605 (2002).
  34. Chayen, N. E., Shaw Stewart, P. D., Maeder, D. L., Blow, D. M. IUCr An automated system for micro-batch protein crystallization and screening. Journal of Applied Crystallography. 23 (4), 297-302 (1990).
  35. Chayen, N. E., Shaw Stewart, P. D., Blow, D. M. Microbatch crystallization under oil - a new technique allowing many small-volume crystallization trials. Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).
  36. Chayen, N. E. Comparative studies of protein crystallization by vapour-diffusion and microbatch techniques. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54 (1), 8-15 (1998).
  37. D'Arcy, A., Mac Sweeney, A., Stihle, M., Haber, A. The advantages of using a modified microbatch method for rapid screening of protein crystallization conditions. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography. 59 (2), 396-399 (2003).
  38. Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345(2016).
  39. Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
  40. Cheng, R. K. Y. Towards an optimal sample delivery method for serial crystallography at XFEL. Crystals. 10 (3), 215(2020).
  41. Schmidt, M. Mix and Inject: Reaction Initiation by Diffusion for Time-Resolved Macromolecular Crystallography. Advances in Condensed Matter Physics. 2013, 1-10 (2013).
  42. Oberthuer, D., et al. Double-flow focused liquid injector for efficient serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 44628(2017).
  43. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, Pt 1 2-20 (2014).
  44. Yaoi, M., et al. Effect of stirring method on protein crystallization. Japanese Journal of Applied Physics, Part 2: Letters. 43 (10), 1318(2004).
  45. Castro, F., Ferreira, A., Teixeira, J. J., Rocha, F. Influence of Mixing Intensity on Lysozyme Crystallization in a Meso Oscillatory Flow Reactor. Crystal Growth & Design. 18 (10), 5940-5946 (2018).
  46. Moews, P. C., Bunn, C. W. An X-ray crystallographic study of the rennin-like enzyme of Endothia parasitica. Journal of Molecular Biology. 54 (2), 395-397 (1970).
  47. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta crystallographica. Section D, Biological. 61, Pt 10 1426-1431 (2005).
  48. Ebrahim, A., et al. Resolving polymorphs and radiation-driven effects in microcrystals using fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75, Pt 2 151-159 (2019).
  49. Davy, B., et al. Reducing sample consumption for serial crystallography using acoustic drop ejection. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (5), (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Morfologia kryszta wdyfuzja parkrystalizacja okresowaanaliza morfogramuPEG 6000szczepienie kryszta wliczenie w komorze countingowejdyfrakcja rentgenowska

Powiązane artykuły