Artykuł metodologiczny

Optymalizacja wzrostu kryształów endotiapepsyny do eksperymentów krystalografii seryjnej

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61896

⸱

4 lutego 2021

 , 
1Swiss Light Source, Paul Scherrer Institut

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego artykułu jest dać widzowi solidne zrozumienie, jak przekształcić ich protokół małej objętości dyfuzji parowej, do hodowli dużych, pojedynczych kryształów białka, w metodę mikrokrystalizacji wsadowej o dużej objętości dla krystalografii szeregowej.

Streszczenie

Tutaj prezentowany jest protokół ułatwiający tworzenie dużych ilości (> 100 μL) mikrokrystalicznych zawiesin odpowiednich do eksperymentów krystalograficznych w synchrotronach i XFEL-ach. Metoda opiera się na zrozumieniu diagramu faz kryształów białka i tego, jak można wykorzystać tę wiedzę. Metoda jest podzielona na trzy etapy: (1) optymalizacja morfologii kryształów, (2) przejście do partii oraz (3) skalowanie. Etap 1 polega na znalezieniu dobrze dyfrakcyjnych monokryształów, miejmy nadzieję, ale niekoniecznie, prezentujących się w morfologii przypominającej sześcian. W Etapie 2 warunek Etapu 1 jest optymalizowany przez czas wzrostu kryształów. Ta strategia może przekształcić kryształy wyhodowane przez dyfuzję pary w partię. Gdy wzrost kryształów może nastąpić w ciągu około 24 godzin, można wykreślić morfogram mieszaniny białka i osadu i wykorzystać go jako podstawę strategii skalowania (etap 3). Gdy kryształy mogą być hodowane partiami, można podjąć próbę skalowania, a rozmiar i stężenie kryształów optymalizować wraz ze wzrostem objętości. Endotiapepsyna została wykorzystana jako białko demonstracyjne w tym protokole. Niektóre z przedstawionych decyzji są specyficzne dla endotiapepsyny. Jest jednak nadzieja, że sposób, w jaki zostały zastosowane, zainspiruje sposób myślenia o tej procedurze, który inni będą mogli dostosować do własnych projektów.

Wprowadzenie

Krystalografia makrocząsteczkowa w temperaturze pokojowej (RT) ponownie zyskuje popularność w środowisku biologii strukturalnej. Rozwój źródeł światła opartych na wolnoelektronowych laserach rentgenowskich (XFEL) stymulował opracowanie metod dostarczania próbek w RT1,2,3,4, a metody te zostały obecnie zastosowane w synchrotronach5,6,7,8. Metody RT nie tylko otwierają możliwość zastosowania strategii eksperymentalnych typu pompa-sonda9,10,11,12, ale istnieją również rosnące dowody na to, że sprzyjają one występowaniu alternatywnych stanów konformacyjnych białek13,14,15,16,17.

Głównym powodem, dla którego pod koniec lat 90. XX wieku metody kriogeniczne zyskały popularność w porównaniu do podejść w temperaturze pokojowej (RT), było spowolnienie uszkodzeń radiacyjnych dzięki utrzymywaniu kryształów w temperaturach poniżej zera18. Metody kriogeniczne19 zaczęły umożliwiać gromadzenie pełnego zestawu danych z jednego kryształu białka. Nowoczesne metody RT stosowane w XFEL i synchrotronach rozwiązały problem uszkodzeń radiacyjnych pojedynczych kryształów poprzez opracowanie strategii szybkiego (> 100 Hz) dostarczania kryształów1,2,3,4. Metody te pozwalają na zebranie pełnego zestawu danych z tysięcy indywidualnie naświetlanych kryształów. Te podejścia do dostarczania próbek w RT wymagają zatem wytworzenia dużych ilości roztworów zawierających jednorodne mikrokryształy (> 100 µL kryształów o rozmiarze < 50 µm). Ponieważ jednak metody kriogeniczne zazwyczaj wymagają jedynie pojedynczych kryształów, metody tworzenia takich zawiesin mikrokrystalicznych nie są obecnie powszechnie stosowane we wszystkich laboratoriach krystalografii białek.

W literaturze istnieją przykłady dotyczące realizacji poszczególnych etapów procedury optymalizacji mikrokrystalizacji dla próbek do krystalografii seryjnej. Należy tutaj wprowadzić rozróżnienie pomiędzy białkami błonowymi a rozpuszczalnymi. Protokoły optymalizacji wzrostu mikrokryształów białek błonowych hodowanych w monooleinie (lub innym lipidzie) dla fazy kubicznej lipidów (LCP) zostały dobrze opisane20,21,22. Brakuje jednak metod mikrokrystalizacji białek rozpuszczalnych, w tym białek błonowych hodowanych w warunkach innych niż LCP. Poprzednie badania koncentrowały się na konkretnych fragmentach procesu, takich jak screening mikrokryształów23,24, wspomaganie nukleacji24 oraz skalowanie z wykorzystaniem dyfuzji przez swobodny interfejs25, lecz nie obejmowały one kompletnej metody.

Niedawno opisano jednak metodę26, która ma na celu przedstawienie kompletnego protokołu. Podobnie jak wiele aspektów krystalografii białek, nie jest ona nowa. Wiele z zaproponowanych koncepcji zostało już opisanych przez Raymenta (2002)27. Metoda ta ma na celu pokazanie krystalografom, jak dokonać przejścia od pojedynczego kryształu hodowanego metodą dyfuzji par do metodologii seryjnej (batch) w celu wyhodowania tysięcy mikrokryształów. Metoda koncentruje się na dyfuzji par jako powszechnym punkcie wyjścia, ponieważ 95% wszystkich depozycji w Protein Data Bank (PDB) pochodzi z kryształów hodowanych na płytkach do dyfuzji par26. Dyfuzja par nie jest jednak idealną metodą do mikrokrystalizacji26, dlatego opisano metodologię konwersji dyfuzji par na krystalizację seryjną. Gdy kryształy mogą być hodowane seryjnie, możliwe staje się praktyczne skalowanie do większych objętości. Biorąc pod uwagę nieprzewidywalność krystalizacji białek, autorzy podkreślają, że metoda ta nie jest niezawodna. Niemniej jednak protokół ten powinien co najmniej dostarczyć informacji na temat „przestrzeni krystalizacji” danego białka.

Metoda ta opiera się na wykresie fazowym krystalizacji białek oraz na tym, w jaki sposób zrozumienie tego wykresu może służyć jako wskazówka podczas optymalizacji mikrokrystalizacji. Wykres fazowy białka jest zazwyczaj przedstawiany jako wykres x/y, gdzie na osi x i y naniesiono odpowiednio stężenia wytrącającego i białka (Rysunek 1A). Od punktu czystej wody (lewy dolny róg – Rysunek 1A), stężenie zarówno białka, jak i wytrącającego rośnie, aż do osiągnięcia linii rozpuszczalności. Linia rozpuszczalności wyznacza punkt przesycenia (fioletowa linia – Rysunek 1A). Gdy białko jest przesycone, roztwór staje się termodynamicznie niestabilny i zaczyna rozdzielać się na dwie fazy: fazę „bogatą w białko” oraz stabilny roztwór nasycony. Rozdzielenie to może nastąpić w dowolnym punkcie poza linią rozpuszczalności, a jego kinetyka zależy od właściwości białka i składników roztworu.

Gdy stężenia białka i czynnika wytrącającego są zbyt wysokie, białko ulega niestabilnemu wytrąceniu z roztworu, co prowadzi do powstania osadu amorficznego (obszar różowy – Rysunek 1A). Jednak w obszarze nukleacji może dojść do uporządkowanego rozdziału faz [szczegółowy opis znajduje się w pracy Garcia-Ruiz (2003)28], a zarodki kryształów mają tendencję do formowania się (obszar zielony – Rysunek 1A). Nukleacja i wzrost powodują usunięcie białka z roztworu i przenoszą kroplę do obszaru metastabilnego, w którym wzrost może być kontynuowany aż do osiągnięcia linii rozpuszczalności [szczegółowa dyskusja w pracy McPherson i Kuznetsov (2014)29]. Dla zdecydowanej większości warunków krystalizacji powyższy schemat jest znacznym uproszczeniem30. Niemniej jednak, schemat ten pozostaje niezwykle użyteczny dla mikrokrystalografów, ponieważ jego mapowanie pozwala na wyznaczenie linii rozpuszczalności oraz kinetyki nukleacji.

W kontekście tworzenia mikrokryształów, dwoma czynnikami podczas krystalizacji, które wymagają optymalizacji, są liczba kryształów (Xn) oraz ich średni najdłuższy wymiar (Xs). Xn będzie proporcjonalna do liczby zdarzeń nukleacji (n) (Równanie 1).

Równowaga statyczna; równanie: Xₙ ∝ n; wyrażenie matematyczne; koncepcja proporcjonalności.     Równ. 1

Xs jest proporcjonalne do stężenia wolnego białka powyżej linii rozpuszczalności (Ps) podzielonego przez Xn (Eq. 2).

Wzór na równowagę statyczną, schemat z symbolem proporcjonalności, zastosowanie edukacyjne.     Równ. 2

W idealnych warunkach każde zdarzenie nukleacji prowadziłoby do powstania potencjalnego kryształu, a każdy z tych kryształów miałby równy dostęp do białka dostępnego w roztworze. Rysunek 2 stanowi graficzną reprezentację idealnego scenariusza relacji między Xn a Xs. W praktyce głównym sposobem kontrolowania Xn oraz Xs przez krystalografa jest wpływanie na stopień nukleacji lub dodawanie kryształów zarodkowych. Krystalograf zajmujący się mikrokryształami musi ocenić, w jaki sposób zwiększyć Xn, aby uzyskać jednocześnie odpowiednie stężenie i wielkość kryształów.

Większość technik krystalizacji wymaga tzw. „okresu przejściowego” (Ryc. 1B). Na przykład w eksperymencie z dyfuzją pary, po zmieszaniu roztworów białka i precypitantu, stężenia obu składników będą ulegać zmianom w miarę równoważenia się kropli z roztworem w studzience. Zakłada się, że zmiany te stopniowo wprowadzą kroplę w strefę nukleacji, w której wzrośnie skłonność do krystalizacji. W miarę jak kryształy zaczynają nukleować i rosnąć, ilość białka w roztworze będzie spadać, co zmniejszy prawdopodobieństwo dalszej nukleacji. Ostateczna ilość nukleacji będzie specyficzna dla białka i zastosowanych warunków, a także zależna od głębokości wejścia w strefę nukleacji. Biorąc pod uwagę ograniczoną penetrację strefy nukleacji w metodach wymagających etapu przejściowego, poziom nukleacji będzie ostatecznie ograniczony do szybkości nukleacji na granicy obszaru metastabilnego i strefy nukleacji.

Z uwagi na znaczenie możliwości zwiększenia poziomu nukleacji dla mikrokrystalografa, istotne jest przejście na metodologię krystalizacji okresowej (batch). Metoda ta pozwala w większym stopniu wykorzystać cały obszar nukleacji (Rycina 1C). W metodach okresowych założeniem jest zmieszanie białka z precypitantem w taki sposób, aby powstał roztwór nasycony bez konieczności wprowadzania zmian w stężeniach składników. Nukleacja powinna być możliwa natychmiast po zmieszaniu. Metody okresowe pozwalają zatem teoretycznie na osiągnięcie całej strefy nukleacji. Można wówczas wykorzystać każdy wzrost kinetyki nukleacji wykraczający poza granicę metastabilna-nukleacyjną.

Jeśli podstawowy poziom nukleacji kryształów jest niewystarczający do uzyskania dużej wartości Xn, można zastosować metody mikrozasiewu. W mikrozasiewie uprzednio wyhodowane kryształy są rozdrabniane w celu stworzenia zawiesiny fragmentów krystalicznych, które mogą służyć jako rusztowanie dla wzrostu nowych kryształów31,32. Mikrozasiew jest szeroko stosowany w seryjnym przygotowywaniu próbek krystalograficznych jako sposób na zwiększenie Xn bez konieczności zwiększania nukleacji kryształów (Rycyna 1C).

Przejście z dyfuzji pary do metody batch można zwizualizować na wykresie fazowym jako przesunięcie eksperymentalnego punktu wyjścia z obszarów nienasyconych lub metastabilnych do strefy nukleacji. Można to osiągnąć poprzez zwiększenie stężenia białka i/lub precypitantu i/lub zmiane ich stosunku wewnątrz kropli (Rysunek 1D) oraz obserwację, w których warunkach kryształy pojawiają się szybko (< 24 h)26. Pełna równowaga kropli w procesie dyfuzji pary może trwać wiele dni lub tygodni33. Zatem, poszukując warunków, w których kryształy pojawiają się szybko, można ustalić warunki batch bez konieczności przejścia na alternatywne formaty screeningu krystalizacji, takie jak micro-batch34,35,36,37.

Po znalezieniu strefy nukleacji oraz odpowiednich warunków dla metody wsadowej (batch), można stworzyć morfogram – w tym przypadku wstępny diagram fazowy. Morfogram jest niezwykle użyteczny przy rozważaniu wyboru między protokołem wsadowym z zaszczepieniem (seeded-batch) a standardowym protokołem wsadowym. Poprzez wykreślenie Xn jako funkcji stężenia białka i precypitantu, można dokonać oceny kinetyki nukleacji26. Jeśli Xn pozostaje niska w całej strefie nukleacji, może być wymagane zastosowanie metody seeded-batch, aby zwiększyć Xn do wartości wystarczającej do ograniczenia wzrostu kryształów. Ocena ta jest pierwszym krokiem w procesie skalowania do większych objętości (> 100 µL).

Metodę tę zaprojektowano w taki sposób, aby można było ją przeprowadzić w większości laboratoriów krystalizacji, korzystając ze standardowego sprzętu do krystalizacji metodą dyfuzji pary. Przeprowadzono również wiele badań opisujących techniki ułatwiające poszczególne etapy tego procesu, o ile dostępny jest odpowiedni sprzęt. Należą do nich między innymi: dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)25,27, obrazowanie nieliniowe20,24,25, dyfrakcja proszkowa20,24,27 oraz mikroskopia elektronowa26 [patrz: Cheng et al. (2020)40 w celu zapoznania się z przejrzystym przeglądem literatury].

Celem niniejszej pracy jest przedstawienie wizualnej demonstracji metody przejścia z krystalizacji metodą dyfuzji pary w małych objętościach (< 500 nL) do krystalizacji seryjnej (batch) w dużych objętościach (> 100 µL). Jako układ przykładowy do zademonstrowania tego przejścia wykorzystano endotiapepsynę z Cryphonectria parasitica. Rodzaj eksperymentu oraz metoda dostarczania próbek, dla których wymagane są mikrokryształy, wpływają na optymalną wartość końcową Xs26. W przypadku eksperymentów mieszania wymagających rozdzielczości czasowej rzędu milisekund41 lub zastosowania gazodynamicznych dysz wirtualnych42, pożądana może być końcowa wartość Xs < 5 µm. W niniejszym przypadku celem było otrzymanie kryształów białka dyfrakcyjnych do około 1.5 Å, na potrzeby eksperymentu pompowo-sondującego aktywowanego fotonami, z zastosowaniem metody dostarczania na stałym celu.

Aby zilustrować wymagania dotyczące próbek dla takiego seryjnego eksperymentu krystalograficznego z użyciem endotiapepsyny, w Tabeli 1 przedstawiono parametry eksperymentalne hipotetycznego badania. Informacje o próbkach oparto na opisanym poniżej protokole. Przyjmując konserwatywne szacunki dotyczące współczynników trafień oraz wymagań w zakresie gromadzenia danych, całkowite zużycie próbki dla całego eksperymentu szacuje się na 50 mg.

Rysunek 3 przedstawia schemat blokowy pełnego procesu optymalizacji, od początkowej krystalizacji metodą dyfuzji pary w małych objętościach po krystalizację seryjną w dużym rozmiarze. W większości projektów krystalografii seryjnej protokół ten rozpocznie się od Kroku 2: „przejście do metody batch”, ponieważ białko docelowe będzie już wcześniej skrystalizowane. Niemniej jednak, Krok 1 został uwzględniony dla kompletności oraz aby przypomnieć czytelnikom o jego znaczeniu. Znalezienie warunków, które prowadzą do powstania pojedynczego, dużego kryształu dobrze dyfraktującego, jest najlepszym punktem wyjścia dla optymalizacji mikrokryształów. W Kroku 2 warunki te można następnie zoptymalizować, przechodząc z dyfuzji pary na metodę batch, a następnie wykreślić morfogram obszarów nukleacji i metastabilności. Po wykonaniu tych czynności, w Kroku 3 można przeprowadzić skalowanie warunków metody batch do większych objętości. Na końcu ścieżki przedstawionej na schemacie krystalograf opracuje powtarzalny, wielkoskalowy (> 100 µL) protokół mikrokrystalizacji metodą batch dla endotiapsyny. Metodę tę można następnie zastosować do konkretnego białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Protokół

UWAGA: Wszystkie 96-dołkowe eksperymenty z krystalizacją w kropli siedzącej były przeprowadzane przy użyciu płytek z 2 lub 3 kroplami. Wykorzystano robota do obsługi cieczy oraz kamerę krystalizacyjną/hotelową, aby ułatwić przygotowanie i monitorowanie wszystkich 96-dołkowych ekranów. Wszystkie stężenia odczynników do eksperymentów krystalizacji są podawane w ich stężeniach wyjściowych przed zmieszaniem.

1. Optymalizacja morfologii kryształów

UWAGA: Kroki 1.1.1. i 1.1.6. opisują, jak znaleziono warunki krystalizacji endotiapepsyny i jak te warunki zostały zoptymalizowane, aby znaleźć pojedynczy warunek, który dawał pojedyncze, dobrze dyfrakcyjne kryształy.

  1. Optymalizacja macierzy rzadkich
    1. Przygotować świeży roztwór endotiapepsyny.
      UWAGA: Endotiapepsyna, gdy jest otrzymywana jako Superan 600, musi zostać przeniesiona buforowo z roztworu do przechowywania i skoncentrowana.
      1. Przygotować 3 l 0,1 M octanu o pH 4,6 w temperaturze 4 °C.
      2. Przeciąć 20 cm rurki do dializy i krótko umyć w buforze. Uszczelnij jeden koniec rurki za pomocą klipsa, umieść 50 ml roztworu endotiapepsyny w rurce, a następnie uszczelnij drugi koniec.
      3. Pozostawić roztwór do dializy przez co najmniej 4 godziny (lub na noc) w temperaturze 4 °C w 1 l buforu z octanu Na. Ze względu na składniki bufora do przechowywania, roztwór w worku do dializy będzie teraz wynosił około 100 ml.
      4. Przenieść worek dializacyjny zawierający endotiapepsynę do świeżego litra o temperaturze 4 °C i temperaturze 0,1 M Na Acetate pH 4,6. Powtórz ten krok jeszcze raz, tak aby oryginalny bufor został rozcieńczony 2000x w stosunku do octanu Na.
      5. Endotiapepsyna będzie teraz miała stężenie około 10 mg/ml. Zagęścić do 100 mg/ml za pomocą koncentratora odśrodkowego 10 kDa i wirówki.
      6. Błyskawicznie schłodzić roztwór endotiapepsyny w ciekłym azocie w 50 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    2. Przygotuj 96-dołkowe sito z matrycą rzadką PACT Premier (PACT Premier 96-dołkowe).
      1. Za pomocą robota do obsługi cieczy dozować 100 nL endotiapepsyny o stężeniu 70 mg/ml i 100 nl roztworu studzienki do jednego dołka na studzienkę. Wymieszać białko i dobrze rozpuścić 3 razy po dodaniu buforu krystalizacyjnego.
      2. Uszczelnić płytkę i pozostawić na 28 dni w temperaturze 20 °C, wykonując zdjęcia codziennie przez pierwszy tydzień, a następnie co tydzień przez 4 tygodnie.
    3. Analiza macierzy rzadkich
      1. Zidentyfikuj trafienia, które wytwarzają pojedyncze kryształy endotiapepsyny. Z badania przesiewowego PACT wynika, że warunki zawierające MgCl2 rosły jako pojedyncze tony, a nie klastry igieł.
    4. Optymalizacja macierzy rzadkich
      1. Z warunków zawierających MgCl2 określonych w kroku 1.1.3.1 utwórz 96-dołkowe badanie przesiewowe, losowo łącząc i zmieniając różne składniki studzienki.
      2. Za pomocą robota do obsługi cieczy dozować 100 nL endotiapepsyny o stężeniu 70 mg/ml i 100 nl roztworu studzienki do jednego dołka na studzienkę. Wymieszać białko i dobrze rozpuścić 3 razy po dodaniu buforu krystalizacyjnego.
      3. Uszczelnić płytkę i pozostawić na 28 dni w temperaturze 20 °C, wykonując zdjęcia codziennie przez pierwszy tydzień, a następnie co tydzień przez 4 tygodnie.
    5. Analiza optymalizacyjna
      1. Korzystając z odpowiedniego oprogramowania arkusza kalkulacyjnego, uszereguj warunki krystalizacji, które powodują powstawanie kryształów, na podstawie jakości kryształów i poziomu wytrącenia, od braku kryształów (0) do ideału (5) i od niskiego (0) do wysokiego (5). Jeśli chodzi o jakość kryształów, szerokim kryterium są monokryształy o pudełkowej morfologii.
      2. Wykonaj analizę korelacji Pearsona między zawartością warunków krystalizacji a ilością kryształów i poziomem wytrącania.
      3. Wykreśl te dane jako mapę cieplną. Poszukaj składników i warunków, które były skorelowane z preferowanymi wynikami.
    6. Analiza dyfrakcyjna.
      1. Potwierdzić, że kryształy wyhodowane z warunków zidentyfikowanych w kroku 1.1.5 nadają się do krystalografii szeregowej, wykonując eksperyment dyfrakcji rentgenowskiej.
      2. Załaduj próbkę kryształów endotiapepsyny z każdego ze zidentyfikowanych warunków na nośniki, które pozwalają na zbieranie danych w temperaturze 100 lub 293 K i przeprowadź eksperyment dyfrakcji rentgenowskiej. W przypadku pracy w krioterapii należy użyć 25% glikolu etylenowego jako krio-protektoru.
      3. Przetwarzaj te dane za pomocą odpowiedniego pakietu oprogramowania. Kryształy endotiapepsyny powinny ulegać dyfrakcji powyżej 1,5 A. Sprawdź, czy nie ma bliźniaków, ponieważ bliźniacze kryształy mogą znacznie skomplikować szeregowe przetwarzanie danych krystalograficznych.
      4. Jeśli kryształy są singletonami i ulegają dyfrakcji do 1,5 A, przejdź do kroku 2. Jeśli nie, wróć do kroku 1.1.2 i wypróbuj bardziej rzadkie ekrany matrycowe, aby zidentyfikować obiecujące warunki. Po przeprowadzeniu analiz w krokach 1.1.5. i 1.1.6., jako przybliżony ideał należało uznać stan krystalizacji wynoszący 25% (w/v) PEG 6,000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 i 0,15 M MgCl2.

2. Przejście do partii

  1. Eksperyment z morfogramem
    1. Stwórz mikrokrystaliczny materiał zalążkowy.
      UWAGA: Najlepszą praktyką podczas tworzenia zapasów nasiennych jest wytwarzanie nasion z kryształów wyhodowanych specjalnie do tego zadania. To bardzo pomaga w odtwarzalności. Inne pomysły przedstawione w krokach od 2.1.1.1 do 2.1.1.11 polegają na tym, aby zawsze używać kryształów wyhodowanych ze standardowej liczby studzienek - tutaj 5 - i dzielić zapasy po ich wykonaniu, aby zanegować cykle zamrażania i rozmrażania.
      1. Przygotować 96-dołkową płytkę krystalizacyjną z dołkami zawierającymi bufor krystalizacyjny: 25% (w/v) PEG 6,000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 i 0,15 M MgCl2.
      2. Za pomocą robota do obsługi cieczy dozować 200 nl rozmrożonej endotiapepsyny o stężeniu 70 mg/ml i 200 ml roztworu studzienki do jednego dołka na studzienkę. Wymieszać białko i dobrze rozpuścić 3 razy po dodaniu buforu krystalizacyjnego.
      3. Uszczelnij płytkę i pozostaw na 24 godziny.
      4. Napełnij probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml 250 μl buforu krystalizacyjnego i 10-15 szklanych kulek o średnicy 1 mm. Pozostaw probówkę wirówkową na lodzie do ostygnięcia na 5-10 minut.
      5. Wybierz 5 dołków z kryształami, otwórz dołki skalpelem i za pomocą końcówki pipety zmiażdż kryształy w dołkach.
      6. Odessać 1 μl buforu z zamrożonej probówki wirówkowej i użyć do homogenizacji rozdrobnionej zawiesiny krystalicznej. Po uzyskaniu jednorodności odessać całą gnojowicę i zebrać ją w schłodzonej probówce wirówkowej.
      7. Powtórz krok 2.1.2.6 dla każdej z 5 studzienek podstudziennych.
      8. Wirować probówkę wirówkową zawierającą bufor, zebrane zawiesiny i kulki z prędkością 1000 obr./min przez 30 s.
      9. Umieść probówkę wirówkową z lodem na 30 sekund.
      10. Powtórz kroki 2.1.2.8 i 2.1.2.9 jeszcze dwa razy.
      11. Materiał siewny jest teraz gotowy i może być podzielony na partie o pojemności 10 μl i przechowywany w temperaturze -20 °C.
    2. Wykonaj eksperyment z morfogramem.
      1. Przygotuj 2-kroplowe 96-dołkowe sito siatkowe. Zmieniaj stężenie PEG 6,000 od 5 do 40% (w/v) wzdłuż kolumn płytowych, utrzymując bufor i sól na poziomie odpowiednio 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 i 0,15 M MgCl2.
      2. Przygotować sekwencyjne rozcieńczenie endotiapepsyny w 0,1 M octanu Na pH 4,6 od 100 do 12,5 mg/ml w 8 krokach. Dla każdego rzędu płytki zostanie użyta inna koncentracja endotiapepsyny.
      3. Za pomocą robota do obsługi cieczy dozuj 150 nL endotiapepsyny do obu studzienek 1 i 2. W dołku 1 należy dozować 150 ml roztworu studzienki. W basenie 2 należy zasysać jednocześnie 50 ml rozmrożonego materiału siewnego i 100 ml roztworu studzienki, a następnie dozować oba do roztworu białkowego. Wymieszaj roztwory 3 razy po dodaniu buforu krystalizacyjnego.
      4. Uszczelnij płytkę i pozostaw w temperaturze 20 °C, wykonując zdjęcia co 0, 3, 6, 12, 18, 24 godziny, a następnie codziennie przez pierwszy tydzień i co tydzień przez następne cztery. Jeśli automatyczne obrazowanie nie jest możliwe, nie martw się o obrazowanie godzinowe w 1. dniu.
  2. Analiza morfogramu
    1. Patrząc na zdjęcia wykonane po 24 godzinach, oszacuj liczbę kryształów, które są obecne w każdym dołku i zapisz te szacunki w dostarczonym arkuszu "generator morfogramów". Szacunki te nie muszą być precyzyjne; Indywidualne liczenie tysięcy mikrokryształów, jeśli są obecne, nie jest ani praktyczne, ani konieczne. Przede wszystkim staraj się, aby szacunki były spójne na całej płycie.
      UWAGA: Reguła 24 godzin została oparta na obserwacjach poczynionych w Beale et al. (2019)26. Warunki krystalizacji dyfuzji parowej mogą trwać dni lub tygodnie, aby się zrównoważyć. Kryształy, które pojawiają się szybko, są bardziej prawdopodobne, że rosły w procesie wsadowym, a nie w wyniku stopniowej równoważenia składników kropli. Kryterium 24 godzin jest zatem nieco arbitralne, a dokładny czas graniczny między eksperymentem z partią a dyfuzją pary będzie zależał od konkretnej mieszaniny danego stanu [patrz Beale i wsp. (2019)26 aby uzyskać szczegółowe informacje].
    2. Wprowadzić początkowe stężenia endotiapepsyny i PEG 6 000 we wskazanych polach.
    3. Arkusz roboczy automatycznie wykreśli wyniki w tradycyjnym formacie diagramu fazowego ze stężeniem strącania i białka odpowiednio na osiach x i y. Cóż, warunki, które powodują powstawanie kryształów tylko w ich zasianych kroplach, wskazują metastabilny obszar diagramu (przezroczysty niebieski), podczas gdy warunki, w których kryształy występują zarówno w zaszczepionych, jak i niezaszczepionych kroplach, wskazują na strefę zarodkowania (stałe zielone).
      UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby większość strefy zarodkowania była obecna na schemacie (tj. na dole schematu znajdują się czyste studzienki, a część osadu powinna być widoczna przy wysokich stężeniach białka i strącacza). Jeśli tak nie jest, być może powtórz eksperyment, ale zwiększ stężenie białka i/lub strącającego się (jeśli to możliwe).
    4. Jeśli kryształ pojawił się w czasie krótszym niż 24 godziny, przejdź do kroku 2.3.1. Jeśli nie, przejdź do kroku 2.4 i kontynuuj optymalizację w kierunku partii.
  3. Analiza krystaliczna
    1. Jak wspomniano na końcu kroku 1, przed przejściem do następnego kroku upewnij się, że kryształy te mają pożądaną morfologię i jakość dyfrakcji. Jeśli chodzi o morfologię, czy kryształy są obserwowalnie niesplątane i tworzą się jako singletony, a nie struktury przypominające kule igłowe lub wachlarzowe? Jeśli chodzi o dyfrakcję, jeśli to możliwe, zbierz dane dyfrakcyjne z kryształów. Jeśli te kryształy nie ulegną dyfrakcji, jest mało prawdopodobne, że kryształy wyhodowane w większej objętości ulegną dyfrakcji.
    2. Załaduj próbkę kryształów endotiapepsyny z eksperymentu morfogramu na nośniki, które umożliwiają zbieranie danych w temperaturze 100 lub 293 K i wykonaj eksperyment dyfrakcji rentgenowskiej. W przypadku pracy w krioterapii należy użyć 25% glikolu etylenowego jako krio-protektoru.
    3. Przetwarzaj te dane za pomocą odpowiedniego pakietu oprogramowania. Kryształy endotiapepsyny powinny ulegać dyfrakcji powyżej 1,5 A. W poprzek próbki kryształów obserwuj rozmiar komórki, całkowitą liczbę obserwacji i mozaikowatość; Pomiary te dadzą wskazówkę co do jednorodności kryształów dyfrakcyjnych.
    4. Jeśli morfologia kryształów i jakość dyfrakcji są wystarczające, przejdź do kroku 3.
  4. Zoptymalizuj czas wzrostu kryształów.
    UWAGA: Analiza morfogramu (krok 2.2) wskaże punkt początkowy krystalizacji (tj. obszar diagramu fazowego, w którym znajduje się kropla po zmieszaniu roztworów strącających i białkowych). Czy spadek znajduje się w obszarze metastabilnym czy poniżej linii rozpuszczalności? Krystalizacja wsadowa rozpoczyna się w strefie zarodkowania (Rysunek 1C). Celem tego kroku jest przeniesienie tego punktu początkowego z poniżej linii rozpuszczalności lub obszaru metastabilnego do strefy zarodkowania (Rysunek 1D). Jeśli seeded-spadnie z kroku 2.2. szybko dały kryształy, co wskazuje, że mieszanina kropli znajduje się już w obszarze metastabilnym, jeśli nie, to prawdopodobnie kropla nie jest przesycona.
    1. Optymalizacja czasu wzrostu kryształów.
      1. Korzystając z tego samego sita, co w kroku 2.1.3, przygotuj 96-dołkowy eksperyment krystalizacji dyfuzji parowej na płytce 3-kroplowej.
      2. Zwiększyć początkowe stężenie białka endotiapepsyny na osi y (tj. zagęścić białko dalej, być może 120 mg/ml dla endotiapepsyny).
      3. Przeprowadzić rozcieńczanie seryjne, jak w kroku 2.1.3.2, tak aby każdy rząd płytki zawierał kolejno niższe stężenie białka.
      4. Użyj różnych proporcji kropli w każdej z trzech kropli na płytce: 1:1, 1:2 i 2:1, białko:strącacz.
      5. Przeglądaj lub zobrazuj płytkę pierwszego dnia o godzinie 0, 3, 6, 12, 18, 24 godzin, a następnie codziennie przez pierwszy tydzień i co tydzień przez następne cztery. Jeśli automatyczne obrazowanie nie jest możliwe, nie martw się o obrazowanie godzinowe w 1. dniu.
      6. Zidentyfikuj krople, które wytwarzają najszybciej pojawiające się kryształy i uczyń je punktami wyjścia do wielokrotnych optymalizacji, aż wzrost kryształów nastąpi w ciągu 24 godzin.
      7. Po zidentyfikowaniu szybko pojawiającego się stanu krystalicznego wróć do Kroku 2.1, aby ponownie wykreślić morfogram jako preludium do rozpoczęcia skalowania.

3. Skalowanie

  1. Skalowanie tras rangi. Na tym etapie nie trzeba decydować się na jedną ścieżkę skalowania, wystarczy zidentyfikować i uszeregować opcje, aby można je było po kolei eksplorować. Wraz ze wzrostem objętości mieszaniny wsadowej podczas procedury skalowania, nastąpią zmiany w szybkości zarodkowania i zakresie rozmiarów kryształów. Można je jednak przezwyciężyć poprzez staranne dostosowywanie stężeń składników w miarę zwiększania objętości skalowanej.
    UWAGA: Kroki 3.1.1 i 3.1.2 opisują, jak na podstawie morfogramu odróżnić, czy bardziej odpowiedni jest protokół partii czy partii zasianej.
    1. Prosty protokół wsadowy
      1. Czy Xn w strefie zarodkowania jest proporcjonalne do stężenia białka i/lub środka strącającego? Tj. czy Xn wzrasta w zależności od stężenia środka strącającego i/lub białka? -Tak? Przejdź do kroku 3.1.1.2. Nie? Przejdź do kroku 3.1.2.
      2. Zlokalizuj warunki, w których powstają kryształy o wymaganej wielkości i przejdź do kroku 3.2.
    2. Protokół partii zasiewnej
      1. Czy Xn jest płaskie w poprzek strefy zarodkowania? Oznacza to, że Xn nie wzrasta ani w funkcji stężenia strącacza, ani stężenia białka.
      2. Zlokalizuj warunki zasiane, w których powstają kryształy o wymaganej wielkości i przejdź do kroku 3.2. Jeśli wszystkie kryształy są zbyt duże - przejdź do kroku 3.1.2.3.
      3. Powtórzyć doświadczenie z morfogramem (krok 2.1), ale tym razem zwiększyć stężenie materiału siewnego użytego w dołkach z nasionami. Zapas nasion można zwiększyć, używając więcej kryształów do jego stworzenia. Na przykład zamiast 5 dołków w kroku 2.1.1.5 użyj 10 dołków.
      4. Wyświetl lub zobrazuj płytkę w ciągu pierwszych 0, 3, 6, 12, 18, 24 godzin.
      5. Xn powinno było wzrosnąć, a Xs zmniejszyć się w rozstawionych kroplach. Powtórz ten cykl, jeśli potrzebne są mniejsze kryształy, a następnie postępuj zgodnie z protokołem partii zasianej.
  2. Stopniowe skalowanie
    1. Skalowanie w płytkach 96-dołkowych. Na podstawie morfogramu endotiapepsyny początkowo wybrano do skalowania prostą metodę wsadową wykorzystującą warunki krystalizacji 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 30% (w/v) PEG 6 000. 100 mg/ml endotiapepsyny zmieszanej z buforem krystalizacyjnym w stosunku 1:1.
      1. Przygotuj 2-3 dołki w 2-dołkowej 96-dołkowej płytce z kroplami do siedzenia ze 100 μl 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 30% (w/v) PEG 6,000.
      2. Używając świeżo rozmrożonego roztworu endotiapepsyny o stężeniu 100 mg/ml, dozować 0,5 μl białka i 0,5 μl środka strącającego do dołka, zamknąć i przechowywać w temperaturze 20°C.
      3. Wyświetl lub zobrazuj płytkę w ciągu pierwszych 0, 3, 6, 12, 18, 24 godzin. Zwróć uwagę na wszelkie zmiany w zakresie Xs i Xn.
      4. Jeśli wystąpiły zmiany, powtórzyć kroki 3.2.1.1 do 3.2.1.2, ale zwiększyć lub zmniejszyć stężenie białka, środka strącającego i/lub nasion, aby przywrócić wszelkie zmiany w zakresie Xs i Xn.
      5. Gdy zakres Xs i Xn jest dopuszczalny, przejdź do kroku 3.2.2.
    2. Skaling w 24-dołkowych płytkach wiszących
      1. Przygotuj pojedynczą studzienkę z 24-dołkową wiszącą płytą, smarując krawędzie studzienki smarem próżniowym.
      2. Przygotuj 0,5 ml 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 30% (w/v) PEG 6,000 i dobrze napełnij natłuszczony.
      3. Używając świeżo rozmrożonego roztworu endotiapepsyny, odpipetować 1 μl białka na powierzchnię szklanego szkiełka nakrywkowego. Odpipetować 1 μl buforu krystalizacyjnego na kroplę białka i wymieszać za pomocą pipety.
      4. Wyświetl lub zobrazuj płytkę w ciągu pierwszych 0, 3, 6, 12, 24 godzin. Zwróć uwagę na wszelkie zmiany w zakresie Xs i Xn.
      5. Jeżeli nastąpiły zmiany, powtórzyć kroki 3.2.2.1 do 3.2.2.4, ale zwiększyć lub zmniejszyć stężenie białka, środka strącającego i/lub nasion, aby przywrócić wszelkie zmiany w zakresie Xs i Xn.
      6. Kiedy/jeśli zakres Xs i Xn jest dopuszczalny, przejdź do kroku 3.2.2.7.
      7. Powtórzyć kroki 3.2.2.1 do 3.2.2.5, stopniowo zwiększając całkowitą objętość doświadczenia do 10 μl.
      8. Gdy osiągnie objętość 10 μl lub większą, przystąpić do odwirowania probówek w kroku 3.2.3.
    3. Skalowanie w probówkach wirówkowych
      UWAGA: Udoskonalenie stanu partii endotiapepsyny nastąpiło zasadniczo w punkcie objętości 200 μl (patrz Wyniki, skalowanie). Proces rozpoczął się od warunków krystalizacji 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 30% (w/v) PEG 6,000. Jednak stężenie PEG ostatecznie zmieniło się na 40% (w/v). Nasiona były również potrzebne do kontrolowania Xn, a aby zapobiec zbyt dużemu wzrostowi kryształów, wzrost kryształów musiał zostać wygaszony. Kroki od 3.2.3.1 do 3.2.3.7 szczegółowo opisują proces optymalizacji warunków. Krok 3.2.4. Opisz końcowy protokół partii.
      1. Przygotuj 1 ml buforu krystalizacyjnego: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 30% (w/v) PEG 6,000.
      2. Używając świeżo rozmrożonej 100 mg/ml endotiapepsyny, dodaj 25 μl białka do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      3. Dokładnie wymieszać bufor krystalizacyjny z roztworem białka w stosunku 1:1 za pomocą końcówki pipety. Umieścić rurkę w rewolwerze/rotatorze z dużym mieszaniem w temperaturze 20 °C.
      4. Weź regularne (5, 10, 30, 60 min, 2, 5, 10, 24 godziny) podwielokrotności 2,5 μl i wyświetl w hemocytometrze. Zapisz zakres Xn i Xs.
      5. Jeżeli nastąpiły zmiany, należy powtórzyć kroki 3.2.3.1 do 3.2.3.4, ale zwiększyć lub zmniejszyć stężenie białka, środka strącającego i/lub nasion, aby przywrócić wszelkie zmiany w zakresie Xs i Xn
      6. Gdy zakres Xs i Xn jest akceptowalny, przejdź do kroku 3.2.3.7.
      7. Powtórzyć kroki 3.2.2.1-3.2.2.5, stopniowo zwiększając całkowitą objętość doświadczenia do 200 μl lub większej, w zależności od potrzeb.
    4. Ostateczny protokół partii rozstawionej
      1. Przygotować materiał siewny.
        1. Przygotuj 2 ml buforu krystalizacyjnego: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 40% (w/v) PEG 6,000.
        2. Używając świeżo rozmrożonej 100 mg/ml endotiapepsyny, dodaj 100 μl białka do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
        3. Dokładnie wymieszać bufor krystalizacyjny z roztworem białka w stosunku 1:1 za pomocą końcówki pipety. Umieścić rurkę w rewolwerze/rotatorze z dużym mieszaniem w temperaturze 20 °C na 24 godziny, aby umożliwić wzrost kryształów o wielkości 50 μm.
        4. Dodać 10-15 kulek szklanych o średnicy 1 mm do zawiesiny krystalicznej o grubości 50 μm.
        5. Wirować probówkę wirówkową zawierającą gnojowicę i kulki z prędkością 1000 obr./min przez 30 s.
        6. Umieść probówkę wirówkową z lodem na 30 sekund.
        7. Powtórz kroki 3.2.4.1.5 i 3.2.4.1.6 jeszcze 10 razy.
        8. Jest to teraz 200 μL 1x wywaru siewnego. Rozcieńczyć materiał siewny 10x przez dodanie 1,8 ml buforu krystalizacyjnego. Podwielokrotnić 10x materiał siewny w partiach po 50 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      2. Protokół partii zasiewanej.
        1. Przygotuj bufor krystalizacyjny: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 40% (w/v) PEG 6,000.
        2. W probówce wirówkowej wymieszać 100 μl buforu krystalizacyjnego z 50 μl świeżo rozmrożonego 10-krotnego wywaru siewnego.
        3. Używając świeżo rozmrożonej 100 mg/ml endotiapepsyny, dodaj 150 μl białka do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
        4. Dokładnie wymieszać mieszaninę buforu krystalizacyjnego/nasion z roztworem endotiapepsyny za pomocą końcówki pipety i umieścić probówkę w rewolwerze/rotatorze z dużym mieszaniem w temperaturze 20 °C.
        5. Monitoruj krystalizację, pobierając regularne podwielokrotności o pojemności 2,5 μl i przeglądaj kryształy w hemocytometrze. Zapisz zakres Xn i Xs.
        6. Po około 80 minutach, gdy kryształy osiągną Xs wynoszące 15 μm, wygasić reakcję przez dodanie 150 μl 0,05 M Na Acetate pH 4,6, 0,05 M Tris-HCl pH 7,0, 0,075 M MgCl2 i 20% (w/v) PEG 6,000 (roztwór złożony z buforu endotiapepsyny i buforu krystalizacyjnego), mieszane 1:1).
        7. Przechowywać kryształy w temperaturze 20 °C.
      3. Czy protokół ustalił dopuszczalny zakres rozmiarów i liczbę kryształów dla planowanego eksperymentu? Tak - GOTOWE - Nie - wróć do kroku 3.1. i spróbuj użyć alternatywnej opcji skalowania. Na przykład możliwy może być inny stosunek białka do strącania lub dodanie nasion, jeśli nie zostało to zrobione wcześniej. Kiedy wszystkie te elementy zostaną wyczerpane, może być konieczne znalezienie nowego warunku w kroku 1.

Wyniki

Optymalizacja morfologii kryształów
Krok 1, optymalizacja morfologii kryształów, został uwzględniony, aby przypomnieć czytelnikowi o jego znaczeniu. Możliwe może być uzyskanie idealnych mikrokryształów z słabo dyfrakcyjnych form igiełkowo-kulistych; jednak autorzy sugerują, że lepiej jest optymalizować te dwa aspekty oddzielnie. Najpierw należy znaleźć warunki, które prowadzą do powstania dobrze dyfrakcyjnych pojedynczych kryształów via dyfuzję par, a następnie przekształcić te warunki w metodę okresową (batch), zamiast próbować łączyć oba te kroki. Odkrywanie warunków sprzyjających intensywnej nukleacji nie jest na tym etapie konieczne; głównymi celami są morfologia i jakość dyfrakcji.

Przed rozpoczęciem mikrokrystalizacji endotiapepsyny przeprowadzono analizę warunków krystalizacji struktur zdeponowanych w PDB. Warunki krystalizacji oraz przybliżone protokoły udało się uzyskać dla 47 z 48 depozycji endotiapepsyny. Większość z nich opierała się na pierwszej krystalizacji endotiapepsyny przeprowadzonej przez Moewsa i Bunna (1970)46. Ze względu na podobieństwo tych warunków i ich „klasyczne” pochodzenie, w celu zbadania szerszego zakresu warunków krystalizacji przeprowadzono przesiew rzadkiej macierzy (sparse-matrix screen) metodą dyfuzji pary w płytce 96-dołkowej. Endotiapepsynę skoncentrowano do 70 mg/mL, a następnie przeprowadzono przesiew rzadkiej macierzy PACT47 w 96-dołkowej płytce z kroplą osiadłą (sitting-drop) w temperaturze 20 °C, mieszając 100 nL białka ze 100 nL roztworu w dołku. Po 36 h we wszystkich warunkach tego eksperymentu pojawiły się kryształy. Jednak analiza morfologii kryształów wykazała, że niektóre warunki mogą okazać się lepsze dla optymalizacji mikrokrystalizacji.

Rysunek 4A przedstawia kroplę z przesiewania PACT, która była reprezentatywna dla większości kropli na płytce. Na pierwszy rzut oka można odnieść wrażenie, że kryształy te mogą być warte dalszej optymalizacji pod kątem mikrokrystalizacji. Kryształy są duże i widoczna jest znacząca nukleacja. Jednak ogólna morfologia kryształów nie jest idealna. Po pierwsze, kryształy nie są zauważalnie pojedyncze, ponieważ wydaje się, że z pojedynczych punktów nukleacji wyrasta wiele kryształów. Po drugie, rozmiar kryształów jest silnie asymetryczny, a wzrost zachodzi głównie wzdłuż jednej osi. Takie kryształy teoretycznie częściej wykazują tendencję do preferencyjnego ustawiania się podczas dostarczania do wiązki promieni rentgenowskich. Obie te cechy stwarzają problemy podczas zbierania i przetwarzania seryjnych danych krystalograficznych.

Rycina 4B, przedstawia natomiast kryształy endotiapepsyny wyhodowane w obecności MgCl2. Taka morfologia była spójna we wszystkich warunkach zawierających MgCl2, co sugerowało, że wynika ona z obecności MgCl2. Warunki z MgCl2 pozwoliły na uzyskanie pojedynczych, bardziej pudełkowatych kryształów, które stanowiły lepszy cel dla końcowych eksperymentów seryjnych.

W ramach przesiewu PACT istniały cztery warunki zawierające MgCl2. Aby lepiej zrozumieć wpływ wszystkich różnych składników tych warunków na krystalizację endotiapepsyny, przeprowadzono optymalizację losową. Stworzono przesiew zawierający losową kombinację buforów i precypitantów w różnych zakresach stężeń i wartości pH. Zmieniano również stężenie MgCl2, a następnie powstałe krople oceniano arbitralnie w skali 0-5 (gdzie 0 oznacza brak kryształów lub osadu) pod kątem wizualnej jakości kryształów i poziomu precypitacji.

Rycina 5A przedstawia mapę cieplną wyników analizy korelacji Pearsona pomiędzy poziomem wytrącania a jakością kryształów oraz zmiennymi przesiewowymi (przykłady kropel z tego eksperymentu pokazano na Rycini 5B, C i D). Wyniki wskazały, że pH roztworu było silnie skorelowane z poziomem wytrącania, przy czym bufory zasadowe prowadziły do większego wytrącania. Stężenie MgCl2 było słabo skorelowane z poziomem wytrącania, podobnie jak pH i stężenie czynnika wytrącającego z jakością kryształów.

Na podstawie tych wyników podjęto decyzję o przekazaniu kryształów wyhodowanych w 0.1 M Tris-HCl pH 7.0, 0.15 M MgCl2, 20% (w/v) PEG 6,000 do kolejnego etapu protokołu – Przejścia do metody seryjnej (batch). Morfologia kryształów była akceptowalna, a analiza dyfrakcji rentgenowskiej oraz wskaźników jakości danych z tych kryształów sugerowała, że nie ma istotnej różnicy między kryształami wyhodowanymi w obecności i poza obecnością Mg2+ (Rysunek 9).

Przejście do metody wsadowej
W przypadku wielu optymalizacji mikrokrystalizacji dla krystalografii seryjnej, punktem wyjścia będzie Krok 2. Białko będące przedmiotem badań zostało już poddane krystalizacji do krystalografii kriogenicznej, a protokół krystalizacji będzie teraz wymagał modyfikacji w celu wytworzenia zawiesin mikrokryształów. W niniejszym protokole do przejścia na metodę wsadową wykorzystano wyłącznie płytki 96-dołkowe do dyfuzji par, ponieważ dyfuzja par jest metodą krystalizacji stosowaną w 95% wpisów w PDB26. Unikano przejścia do metody mikrowsadowej34,35,37, ponieważ taka zmiana mogłaby nadal wymagać podobnej optymalizacji. Nie oznacza to, że niniejszy protokół można przeprowadzić wyłącznie na płytkach do dyfuzji par. Wszystkie przedstawione kroki zadziałałyby również w metodzie mikrowsadowej, jeśli byłaby ona pierwotną metodą krystalizacji.

Aby ocenić krystalizację endotiapepsyny w wybranym warunku, stworzono morfogram – czyli uproszczony wykres fazowy. Cel eksperymentu z wykorzystaniem morfogramu jest potrójny. Po pierwsze, analiza morfogramu jest niezwykle użyteczna przy ocenie ścieżek skalowania w kroku 3 – SkalowaniePo drugie, morfogram służy jako narzędzie optymalizacji, pomagając w znalezieniu warunków dyfuzji par, które prowadzą do powstawania kryształów. poprzez partia [t. j. szybko pojawiające się kryształy (< 24 h)]. Po trzecie, jeśli kryształy nie pojawiły się szybko, analiza kropli zaszczepionych może dać krystalografowi wyobrażenie o przybliżonym położeniu aktualnego stanu na diagramie fazowym. Na przykład, jeśli w warunkach zaszczepionych powstają kryształy, a w niezaszczepionych nie, warunki te najprawdopodobniej znajdują się w obszarze metastabilnym.

Eksperyment morfogramu endotiapepsyny przeprowadzono w warunkach: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2, 20% (w/v) PEG 6,000. Stężenia białka i PEG zmieniano odpowiednio w zakresie od 100 do 12,5 mg/mL oraz od 5 do 40% (w/v). Krople poddano analizie, a wyniki przedstawiono na dołączonym arkuszu (Rysunek 6A).

Już na etapie Optymalizacji morfologii kryształów stało się jasne, że wzrost kryształów endotiapepsyny w tych warunkach i przy tych stężeniach białka prowadzi do ich powstania w czasie krótszym niż 24 h. Wskazywało to, że krystalizacja przebiegała via proces wsadowy, a nie poprzez dyfuzję pary. Kryształy wyhodowane w tych warunkach były zatem odpowiednie do skalowania do większych objętości.

Gdyby kryształy nie były widoczne w kroplach bez zarodników po 24 h, prawdopodobne byłoby, że krystalizacja nadal zależy od przejścia (Rysunek 1B), a zatem nie jest krystalizacją seryjną (batch). W takim przypadku wyniki eksperymentu z morfogramem są nadal interesujące. Wskazują one prawdopodobny punkt startowy krystalizacji na diagramie fazowym, a co za tym idzie, sposób, w jaki powinna przebiegać dalsza optymalizacja. Należy przyjrzeć się kroplom z zarodnikami. Zarodniki umożliwią wzrost kryształów w obszarze metastabilnym, niezależnie od nukleacji. Na przykład, jeśli kryształy pojawią się w ciągu 24 h w kroplach z zarodnikami, ale nie w kroplach bez zarodników, wskazuje to na możliwość obserwacji części obszaru metastabilnego. Jeśli w żadnych kroplach (zarówno z zarodnikami, jak i bez nich) nie zaobserwowano kryształów, wszystkie studzienki pozostają niedonasycone.

Skalowanie
Analiza morfogramu (Rycina 6A) pozwoliła na sformułowanie szeregu obserwacji. Wydawało się, że stopień nukleacji zależy zarówno od stężenia białka, jak i stężenia precypitantu. Zaobserwowano również bardzo wyraźny podział kropli prowadzących do precypitacji białka, w których występowało: nic, kryształy lub osad (Rycina 6B). Dodatek zarodków (Rycina 6D) znacząco zwiększył Xn w porównaniu do kropli bez zarodków (Rycina 6C). Biorąc pod uwagę wszystkie te wyniki, podjęto decyzję o próbie skalowania protokołu metodą wsadową (batch) oraz metodą wsadową z dodatkiem zarodków (seeded-batch) przy zastosowaniu 30% (w/v) PEG 6,000 i 100 mg/mL endothiapepsyny.

Wstępne skalowanie testów przeprowadzono w 24-dołkowych płytkach do metody wiszącej kropli. Objętości kropli stopniowo zwiększano, aby móc obserwować wszelkie zmiany w zachowaniu krystalizacji (Rysunek 7). Jak widać, wzrost kryształów wystąpił zarówno w kroplach niezaszczepionych, jak i szczepionych. We wszystkich niezaszczepionych kroplach wyrosły kryształy o różnych rozmiarach, jednak przeważały kryształy duże (100-200 µm – najdłuższy wymiar). Krople szczepione wytworzyły natomiast mniejsze kryształy (5 - 50 µm – najdłuższy wymiar). Te wstępne testy sugerowały, że do zmniejszenia Xs konieczne będzie zastosowanie zarodków, a także, że warunki te powinny być odpowiednie dla większych objętości.

W przypadku zwiększenia objętości do 200 µL, objętość krystalizacji była stale mieszana podczas wzrostu kryształów. Głównym powodem takiego mieszania była chęć zapewnienia homogeniczności roztworu krystalizacji oraz zapobieganie osadzaniu się rosnących kryształów na dnie lub ściankach probówek. Osadzanie się kryształów może prowadzić do powstania heterogennej populacji kryształów, zawierającej zarówno kryształy bardzo duże, jak i małe. Mieszanie roztworu krystalizacji może również sprzyjać nukleacji44,45.

Niestety, w roztworze 30% (w/v) PEG 6,000 bez szczepienia nie powstały żadne kryształy, dlatego zwiększono stężenie PEG do 35% (w/v). Zwiększenie to wyraźnie poprawiło krystalizację, a końcowy zakres Xn i Xs wyniósł odpowiednio 3,6 ± 1,2 x 106 kryształów·mL-1 oraz 42 ± 4,1 µm (Rycina 8A i B – kolor czarny). Mimo znacznej poprawy i uzyskania akceptowalnego stężenia kryształów, końcowe kryształy były zbyt duże dla planowanego eksperymentu, dlatego podjęto dalszą optymalizację. W celu zmniejszenia rozmiaru końcowych kryształów zbadano dwa kierunki (Rycina 1E): obniżenie stężenia białka w celu ograniczenia końcowego wzrostu kryształów (Rycina 8A i B  – kolor intensywny róż) oraz zwiększenie stężenia PEG w celu zwiększenia nukleacji (Rycina 8A i B  – kolor zielony).

Zmniejszenie stężenia białka niestety doprowadziło również do gwałtownego spadku Xn, co ostatecznie spowodowało powstanie jeszcze większych kryształów. Zwiększenie stężenia PEG do 40% pozwoliło uzyskać końcowy zakres Xn na poziomie 3,1 ± 0,7 x 106 crystals·mL-1 oraz Xs wynoszący 39 ± 2,3 µm. Wyniki te nie różniły się znacząco od tych uzyskanych przy 35%, jednak ze względu na zmniejszenie końcowej wielkości kryształów, warunki te wybrano do dalszych optymalizacji.

Aby zwiększyć Xn, dodano kryształy zarodkowe. Doprowadziło to do gwałtownego wzrostu Xn (1.1 ± 1.8 x 108 crystals·mL-1) oraz do uzyskania mniejszego Xs (4.2 ± 4.0 µm) (Rysunek 8A i B - przerywana linia fioletowa). Kryształy te, choć bardzo odpowiednie do niektórych eksperymentów z krystalografii seryjnej, uznano za zbyt małe, dlatego zmieniono stężenie dodanych zarodków.

Dostrojenie ilości dodanego materiału zarodkowego okazało się jednak trudne do wiarygodnego powtórzenia, dlatego podjęto próbę hartowania. Po dodaniu materiału zarodkowego monitorowano wielkość kryształów, a po osiągnięciu odpowiedniego rozmiaru (około 10 - 20 µm) proces krystalizacji seryjnej zahamowano poprzez hartowanie (Rycina 8C i D). Metoda hartowania w kontekście mikrokrystalizacji została zaproponowana przez Kupitz i wsp. (2014)25. Choć nie jest to metoda idealna, ponieważ ostatecznie marnowany jest roztwór białka26, technika ta okazała się bardzo użyteczna w tej sytuacji, gdyż wzrost kryształów był trudny do kontrolowania. Idea hartowania polega na szybkim przywróceniu mieszaniny krystalizacyjnej do punktu znajdującego się tuż powyżej linii rozpuszczalności (Rycina 1F). Gdy roztwór powróci do linii rozpuszczalności, staje się on ponownie stabilnym roztworem nasyconym i nie następuje dalszy wzrost kryształów.

Próba przerwania reakcji krystalizacji wiąże się z pewnym ryzykiem. Jeśli dodano zbyt dużą ilość roztworu przerywającego, białko w roztworze może zostać rozcieńczone do tego stopnia, że przekroczona zostanie linia rozpuszczalności. W takim przypadku roztwór stanie się niedosycony, a kryształy zaczną się rozpuszczać. Aby temu zapobiec, można oszacować wymaganą ilość roztworu przerywającego na podstawie wyników morfogramu. W punkcie przerywania należy określić stężenie roztworu białka. Porównując stężenie białka na linii rozpuszczalności ze stężeniem białka w roztworze, można oszacować wymagany stopień rozcieńczenia.

Wersja gwałtownie schłodzona eksperymentu z ziarnem w 40% (w/v) PEG 6,000 rozcieńczonym 10-krotnie dała końcowe stężenie kryształów rzędu 2,6 ± 3,1 x 106 crystals·mL-1 oraz zakres wielkości 15 ± 3,9 µm.

W trakcie całego procesu testowe zbiory danych rentgenowskich kryształów endotiapepsyny gromadzono na linii wiązki PXII w Swiss Light Source, wykorzystując ognisko 10 x 30 µm, energię 12,4 keV z tłumieniem 80% oraz warunki kriogeniczne. Dane przetworzono przy użyciu programu dials, a Rysunek 9 przedstawia porównanie CC½. W trakcie optymalizacji nie zaobserwowano gwałtownych zmian wartości CC½.

Wykresy fazowe krystalizacji białek przedstawiające wytrącanie, nukleację, stany metastabilne, rozpuszczalność.
Rysunek 1: Przegląd krystalizacji przejściowej i okresowej (batch) oraz metod skalowania naniesionych na wykres fazowy. A. Strefy i granice archetypowe wykresu fazowego krystalizacji białek. Stężenia czynnika wytrącającego i białka naniesiono odpowiednio na osie x i y, przy czym punkt czystej wody znajduje się w punkcie początkowym. Fioletowa linia oznacza granicę przesycenia białka, a strefy metastabilną, nukleacji i wytrącania są przedstawione odpowiednio w kolorach niebieskim, zielonym i różowym. B. Przykład granic penetracji strefy nukleacji w metodzie krystalizacji „fazowej przejściowej”, takiej jak dyfuzja pary. W tym teoretycznym eksperymencie stężenia czynnika wytrącającego i białka w kropli zaczynają się tuż poniżej linii rozpuszczalności – roztwór nie jest jeszcze przesycony. Podczas równoważenia kropli stężenia jej składników wzrastają w taki sposób, że kropla staje się przesycona i nadal przesuwa się – lub przechodzi – w strefę nukleacji. Po nukleacji kryształów stężenie białka w roztworze zaczyna spadać. Stężenie nadal maleje w miarę wzrostu kryształów, aż ostatecznie zatrzyma się na linii rozpuszczalności. Niebieska przerywana linia wyznacza teoretyczną granicę przejścia do strefy nukleacji. W momencie rozpoczęcia nukleacji stężenie białka spadnie, co zapobiegnie dalszej penetracji. C. Przykład trajektorii krystalizacji okresowej (batch) i okresowej z zaszczepieniem (seeded-batch). W metodzie batch mieszanie białka i czynnika wytrącającego musi stworzyć roztwór przesycony w strefie nukleacji, aby mógł nastąpić wzrost kryształów. W metodzie seeded-batch przebywanie w strefie nukleacji nie jest ściśle konieczne ze względu na dodatek mikroziaren, dzięki czemu można badać również obszary w regionie metastabilnym. D. Hipotetyczna optymalizacja eksperymentu krystalizacji pokazanego w punkcie B z dyfuzji pary na metodę batch. Pierwotny punkt startowy dyfuzji pary został przeniesiony, via wynikowy wektor optymalizacji, do nowej pozycji startowej; wewnątrz strefy nukleacji. Wynikowy wektor jest produktem dwóch optymalizacji: zwiększenia stężenia zarówno białka, jak i czynnika wytrącającego. E. Przykładowe optymalizacje przy skalowaniu warunków batch w celu dostosowania końcowych wartości Xn i Xs. F. Hamowanie (quenching) eksperymentu krystalizacji poprzez dodanie buforu krystalizacyjnego. Niezbędne jest, aby hamowanie nie wyprowadziło stężenia białka poza region metastabilny, a tym samym poniżej punktu przesycenia białka. W przeciwnym razie kryształy zaczną ponownie rozpuszczać się w roztworze. Punkty B. i C. zostały zaadaptowane z Beale et al. (2019)26 za zgodą autorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres analizy krystalizacji; przedstawia zdarzenia nukleacji w stosunku do rozmiaru i liczby kryształów.
Rycina 2: Zwiększanie Xn i zmniejszanie Xs. Uidealizowana zależność między liczbą kryształów otrzymanych w eksperymencie krystalizacyjnym a ich średnim największym wymiarem. Do stworzenia tego wykresu wykorzystano krystalizację hipotetycznego białka modelowego o masie 10 kDa. Białko krystalizowało przy stężeniu 10 mg/mL, dając kryształy P212121 o wymiarach 49x50x51 Å. Przyjęto, że każde zdarzenie nukleacji prowadzi do powstania kryształu. Założono, że wzrost kryształów przebiega homogenicznie z każdej ścianki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat optymalizacji morfologii kryształów; diagram procesu wzrostu kryształów o wysokiej rozdzielczości.
Rycina 3: Schemat blokowy przedstawiający etapy optymalizacji kryształu wyhodowanego w eksperymencie dyfuzji pary o małej objętości (<500 nL) w eksperyment metodą wsadową (batch) o dużej objętości (> 100 µL). Optymalizacja kryształów jest podzielona na trzy etapy: (1) Optymalizacja morfologii kryształów. (2) Przejście do metody wsadowej. (3) Skalowanie. W etapie 1 istotne jest zidentyfikowanie odpowiednich kryształów do mikrokrystalizacji. Niektóre białka wykazują tylko jedną morfologię kryształów niezależnie od warunków krystalizacji. Warto jednak poszukiwać warunków, które prowadzą do powstania pojedynczych, sześcianowatych kryształów lub form jak najbliższych takiemu kształtowi. Hipotetycznie i anegdotycznie, pojedyncze, sześcianowate kryształy zazwyczaj dają lepsze wyniki w eksperymentach seryjnej krystalografii. Po wybraniu morfologii kryształu i potwierdzeniu dyfrakcji konieczne jest przeniesienie eksperymentu krystalizacji z dyfuzji pary do metody wsadowej (etap 2). Na tym etapie kryształy należy optymalizować pod kątem czasu nukleacji. Celem jest znalezienie warunków, w których kryształy pojawiają się szybko (> 24 h), ponieważ takie warunki prawdopodobnie natychmiast osiągają strefę nukleacji i są zatem odpowiednie dla metody wsadowej. Po znalezieniu warunku w strefie nukleacji można stworzyć morfogram. Morfogram pozwala na zmapowanie większości strefy nukleacji i zidentyfikowanie potencjalnych dróg skalowania dla etapu 3. Objętość zidentyfikowanego warunku wsadowego może być następnie skalowana stopniowo lub gwałtownie, aby uzyskać objętość końcową >100 µL. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Eksperyment krystalizacji białka; A: SPG, PEG 1500; B: HEPES, MgCl2, PEG 6000; obraz mikroskopowy.
Rysunek 4: Analiza warunków krystalizacji endotiapepsyny z PACT sparse-matrix screen. A. oraz B. to zdjęcia odpowiednio studzienek A4 i C10 z PACT screen po 24 h. Składniki buforu krystalizacyjnego są zaznaczone na rysunku. Bufor SPG składa się z kwasu bursztynowego, fosforanu sodu i glicyny zmieszanych w stosunku molowym 2:7:7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces krystalizacji białka; poziom wytrącania, jakość kryształów; wyniki eksperymentu; różne wartości pH, MgCl2.
Rysunek 5: Analiza optymalizacji krystalizacji endotiapepsyny w warunkach PACT MgCl2. A. Mapa ciepła wyników analizy korelacji Pearsona pomiędzy pH buforu, stężeniem MgCl2 oraz stężeniem czynnika wytrącającego a poziomem wytrącania i jakością kryształów. Poziom wytrącania i jakość kryształów oceniono dowolnie w skali 0-5 (gdzie 0 oznacza brak kryształów lub wytrącania) po 24 h. B. C. oraz D. przedstawiają przykłady krystalizacji i wytrącania w trzech różnych kroplach. Przedstawiono również warunki krystalizacji oraz oceny poziomu wytrącania i jakości kryształów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres fazowy krystalizacji, obrazy mikroskopowe; nukleacja białka, wytrącanie z PEG.
Rysunek 6: Morfogram endotiapepsyny w przypadku krystalizacji w 0.1 M Tris-HCl pH 7.0, 0.15 M MgCl2 i PEG 6,000. A. Morfogram utworzony za pomocą dostarczonego arkusza kalkulacyjnego „phase-diagram-generator”. Względna liczba kryształów w każdej kropli jest oznaczona wielkością kół, a wyniki z kropli 1 (białko i czynnik wytrącający) oraz kropli 2 (białko, czynnik wytrącający i zarodki) są wyróżnione odpowiednio na zielono i na niebiesko. Wartości stężeń białka i czynnika wytrącającego na osi x i y oznaczają wartości wstępnie zmieszane, a nie objętości końcowe. Na podstawie wyników narysowano czarne linie i fioletową linię, aby odpowiednio zaznaczyć granice strefy nukleacji i strefy metastabilnej. B. C. oraz D. przedstawiają przykładowe wyniki eksperymentu. Czerwone i niebieskie kropki zaznaczone na A. wskazują odpowiednio lokalizacje punktów B., C. oraz D.. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces krystalizacji, mikrografie, różne objętości, formowanie kryształów, analiza mikroskopowa.
Rysunek 7: Wstępne próby skalowania endotiapepsyny w 24-dołkowych płytkach do metody wiszącej kropli. Dla wszystkich prób zastosowano te same stężenia białka i czynnika wytrącającego: odpowiednio 100 mg/mL endotiapepsyny w 0,1 M octanie Na pH 4,6 oraz 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 30% (w/v) PEG 6,000. Wszystkie przedstawione obrazy wykonano po 24 h, a końcowe objętości kropli są oznaczone na każdym zdjęciu. Lewy panel (A, D i G) przedstawia mieszaninę białka i czynnika wytrącającego w stosunku 1:1, środkowy panel (B, E i H) przedstawia mieszaninę zarodników, czynnika wytrącającego i białka w stosunku 1:2:3, a prawy panel (C, F i I) zawiera powiększone obrazy z panelu środkowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Kinetyka wzrostu kryształów, stężenie w funkcji czasu, analiza punktu hartowania, wykres, roztwory PEG.
Rycina 8: Analiza mikrokrystalizacji endotiapepsyny w objętościach 200-300 µL. A. i C. przedstawiają zmiany Xn w czasie trwania eksperymentu. B. i D. przedstawiają zmiany Xs (najdłuższy wymiar) w czasie. Wyniki eksperymentów zostały rozdzielone dla większej przejrzystości. Czerwona przerywana linia na C. i D. wskazuje punkt, w którym wykonano hartowanie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki krystalizacji z Mg²⁺; CC₁/₂ w funkcji rozdzielczości; obrazy mikroskopowe etapów wzrostu kryształów.
Rycina 9: Wyniki CC½ oraz obrazy kryształów uzyskanych na każdym etapie procesu mikrokrystalizacji w celu oceny jakości dyfrakcji. A. Wykres CC½ w funkcji rozdzielczości dla danych zebranych z kryształów wyhodowanych: z Mg oraz bez Mg – część optymalizacji Etapu 1, w objętości 200 nL, objętości 10 µL oraz końcowej objętości 300 µL. B.C. i D. przedstawiają kryształy odpowiednio z objętości 200 nL, 10 µL i 300 µL. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Informacje o białku
BiałkoEndotiapepsyna
Masa cząsteczkowa (kDa)33.8
Grupa przestrzennaP1211
a, b, c (Å)45.2, 73.3, 52.7
α, β, ɣ (°)90.0, 109.2, 90.0
Parametry celu nieruchomego
Objętość naniesiona na chip (µL)150
Liczba otworów na chip25,600
Wymagane stężenie kryształów (kryształy/ml)500,000
Informacje o próbce
Masa białka wykorzystana do przygotowania 200 µL próbki (mg)10
Najdłuższy wymiar kryształu (µm)15
Stężenie kryształów (kryształów/ml)2,500,000
Zmienne eksperymentalne
Liczba wymaganych punktów czasowych5
Liczba obrazów wymagana dla każdego punktu czasowego50,000
Wskaźnik trafień (liczba zebranych zintegrowanych wzorów/obrazów)0.3
Liczba wymaganych stałych celów na punkt czasowy (po zaokrągleniu w górę)7
Wymagania dotyczące próbek
Wymagana objętość próbki dla każdego punktu czasowego (µL)1,050
Całkowita objętość próbki wymagana do eksperymentu (ml)5.25
Całkowita wymagana masa białka (mg)52.5

Tabela 1: Przykład wymagań dotyczących próbek dla hipotetycznego eksperymentu optycznego typu pompa-sonda przeprowadzonego z wykorzystaniem stałych celów. Białkiem użytym w tym teoretycznym eksperymencie była endotiapepsyna. Parametry stałych celów oparto na eksperymentach opisanych przez Ebrahim et al. (2019)48 oraz Davy et al. (2019)49. Informacje o próbkach pochodzą z protokołu przedstawionego w niniejszym artykule wideo, a zmienne eksperymentalne stanowią ostrożne szacunki oparte na doświadczeniu. Następnie, przy założeniu powyższych parametrów, obliczono następujące wymagania dotyczące próbek.

Dyskusja

Przedstawiona metoda pokazuje, w jaki sposób można zoptymalizować krystalizację endotiapepsyny z dużych kryształów (≥ najdłuższym wymiarze 100 μm), hodowanych w 96-dołkowych sitach o rzadkiej matrycy, do mikrokryształów, hodowanych w probówkach wirówkowych (objętość 300 μl) za pomocą partii. Ideą protokołu jest to, że kroki podjęte w celu optymalizacji endotiapepsyny mogą być również wykorzystane do innych białek. Ostatecznie odpowiedź na problem tworzenia dużych objętości (>100 μL) mikrokryształów (10-20 μm) do eksperymentów krystalografii szeregowej na XFELach i synchrotronach.

Protokół dzieli zadanie mikrokrystalizacji o dużej objętości na trzy etapy: (1) Optymalizacja morfologii kryształów, (2) Przejście do partii i (3) Skalowanie. W Kroku 1 należy zbadać zakres form krystalicznych, które może wytworzyć białko w płytkach dyfuzyjnych. Celem powinny być warunki, w których powstają pojedyncze, pudełkowe kryształy, które ulegają dyfrakcji z wymaganą rozdzielczością. W kroku 2 wybrane warunki można następnie przekształcić z dyfuzji pary w partię. W tym przypadku kryterium optymalizacji jest czas wzrostu kryształów i znalezienie warunków, w których w ciągu 24 godzin powstają kryształy białka. Można również wykreślić morfogram, który daje eksperymentatorowi wyobrażenie o położeniu linii rozpuszczalności i granic strefy zarodkowania. Ten morfogram jest bardzo przydatny w kroku 3, Skalowanie. Mornogram da wskazówkę, czy samo zarodkowanie może zwiększyć Xn i obniżyć Xs. Wraz ze wzrostem objętości eksperymentu, Xn i Xs mogą być stale oceniane jako kluczowe kryteria sukcesu skalowania.

W przypadku endotiapepsyny, Etap 1 odkrył coś, co potencjalnie było wcześniej nieznaną morfologią kryształów endotiapepsyny. Ta morfologia miała tę samą grupę przestrzenną, co wcześniej opisywane, ale, co ważne dla krystalografii szeregowej, bardziej pudełkowy kształt. Monokryształy również wydawały się rosnąć z pojedynczych punktów zarodkowania, w przeciwieństwie do wentylatorów powstałych w innych warunkach (ryc. 4). Dla wybranego warunku Krok 2 był już częściowo spełniony, ponieważ wzrost kryształów nastąpił w ciągu < 24 godzin. Mornogram wskazał, że zarówno protokół prosty, jak i wsadowy może być skuteczny podczas skalowania w kroku 3. Początkowe skalowanie w prostej partii stworzyło warunki, w których powstały kryształy o zakresie Xn i Xs wynoszącym odpowiednio 3,6 ± 1,2 x 106 kryształów · mL-1 i 42 ± 4,1 μm. Kryształy te, choć dopuszczalne w niektórych seryjnych eksperymentach krystalograficznych, zostały uznane za zbyt duże. Przeprowadzono więc dodatkowe optymalizacje. W końcowym protokole wyprodukowano kryształy o stężeniu i zakresie wielkości 3,1 x 106 kryształów·mL-1 i 15 ± 3,9 μm, odpowiednio. Było to więcej niż idealne rozwiązanie dla planowanych eksperymentów.

Metoda koncentruje się na przekształceniu "rozpuszczalnych" kryształów białek wyhodowanych na płytkach dyfuzyjnych do wsadu. Powodem tego skupienia jest to, że zdecydowana większość rozpuszczalnych kryształów białka jest hodowana poprzez dyfuzję pary26. Przedstawione koncepcje można jednak również zastosować do rozpuszczalnych kryształów białek hodowanych przy użyciu innych metod, takich jak mikropartie. Koncepcje te mogą być również stosowane do kryształów białek błonowych hodowanych w LCP; ponieważ jest to również proces krystalizacji wsadowej.

Kluczowym aspektem protokołu jest proces przekształcania warunków kryształów hodowanych na płytkach dyfuzyjnych w taki sposób, aby można je było hodować wsadowo. Do tej transformacji metoda wykorzystuje kryterium zaproponowane przez Beale'a i in. (2019)26. Kryształy wyhodowane w procesie wsadowym, nawet na płytkach dyfuzyjnych, tworzą się szybko (< 24 godzinach). Kryterium to jest przybliżeniem opartym na prędkości równoważenia kropli dyfuzji pary i jest najbardziej prawdziwe w przypadku warunków strącania opartych na PEG. Jednak warunki krystalizacji będą zawierały szeroką gamę związków, które będą miały wpływ na czas równowagi. Zrównoważenie warunków krystalizacji na bazie soli, np. wysoko stężonego chlorku amonu, może nastąpić w ciągu 1-2 dni. W związku z tym kryterium 24 godzin może nie być prawdziwe w przypadku warunków opartych na soli. Warunki oparte na soli mogą również mieć bardziej złożone diagramy fazowe26, 30 , które mogą nie być zgodne z archetypem przedstawionym w tym protokole. Skrócenie kryterium czasu dla warunków opartych na soli do 12 lub 6 godzin może być konieczne, jeśli skalowanie do większych objętości okaże się niemożliwe.

Kolejnym ograniczeniem tej metody jest jej pozorna złożoność. Protokół, który został zastosowany w celu optymalizacji mikrokrystalizacji endotiapepsyny, w rzeczywistości zmienił pierwotny stan z badania przesiewowego o rzadkiej matrycy stosunkowo nieznacznie. Pierwszym trafieniem zaobserwowanym w badaniu przesiewowym PACT było 0,1 HEPES, pH 7,0, 0,2 M MgCl2 i 20% (w/v) PEG 6,000. Końcowy skalowany bufor krystalizacyjny wynosił 0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 i 40% (w/v) PEG 6,000. Jest również bardzo możliwe, że zmiana stężenia buforu z HEPES na Tris-HCl i MgCl2 w niewielkim stopniu przyczyniła się do powodzenia procesu. Pozostawiając wzrost stężenia PEG 6,000 jako jedyną optymalizację, którą można było osiągnąć w dość prosty sposób.

Ocena ta jest jednak również zbyt uproszczona. Nie tylko pomija problemy napotkane podczas skalowania (tj. użycie nasion i hartowanie), ale także fakt, że tylko dlatego, że to białko okazało się proste, nie ma gwarancji, że następne również okaże się proste. Kroki zalecane w protokole zostały opracowane, ponieważ optymalizacja skalowania objętości krystalizacji białek może być bardzo kosztowna w zakresie białka. W siedmiu pokazanych próbach skalowania endotiapepsyny spożywano 100 mg białka. Trzeba przyznać, że niektóre z tych kroków zostały wykonane w celu ukazania ich konsekwencji w świetle tego protokołu. Mimo to 100 mg białka plus potencjalnie kolejne 50 mg białka spożywanego podczas eksperymentu (Tabela 1) może być znaczącą inwestycją zarówno czasu, jak i pieniędzy.

Na szczęście nie jest jasne, czy ta masa wymaganej próbki jest wszechobecna we wszystkich białkach. Endotiapepsyna była wysoce rozpuszczalna i dlatego wymagała dużego stężenia białka, aby osiągnąć przesycenie. W innych (obecnie optymalizowanych) przesycenie można osiągnąć na poziomie 10, a nawet 5 mg/ml. Takie zmienne są specyficzne dla białka i należy je uwzględnić, gdy się pojawią.

Inne ograniczenia tej metody obejmują jej poleganie na złożonym sprzęcie, takim jak roboty do obsługi cieczy do tworzenia przesiewów i płyt oraz imagery, które w razie potrzeby automatycznie naświetlają płyty. Zaproponowano alternatywne procedury, aby ograniczyć zapotrzebowanie na niektóre z tych elementów wyposażenia, ale przestrzeganie protokołu bez nich będzie bardziej czasochłonne. Protokół sugeruje również testowanie dyfrakcji zoptymalizowanych kryształów. Dla krystalografów, którzy nie mają regularnego dostępu do synchrotronu, testy te mogą okazać się wyzwaniem. Kontrole na każdym kroku mogą nie być konieczne, ale te testy są zdecydowanie zalecane po zidentyfikowaniu trafienia oraz przed i po skalowaniu. Niedyfrakcyjne kryształy w XFEL nie są niestety rzadkim zjawiskiem. Biorąc to pod uwagę, lepiej jest zachować ostrożność w odniesieniu do założeń dotyczących dyfrakcji kryształów.

Ostatecznie, ten protokół i przedstawione tutaj wyniki będą stanowić przewodnik, pomysły i przykład dla tych, którzy zmagają się z wytwarzaniem próbek do seryjnych eksperymentów krystalograficznych. Miejmy nadzieję, że wraz z dalszym rozwojem krystalografii seryjnej wymagania dotyczące próbek tej techniki zostaną zmniejszone, co zmniejszy potrzebę stosowania takich protokołów. Jednak nawet w tym przypadku przedstawione tutaj strategie będą nadal przydatne dla tych, którzy chcą zbadać przestrzeń krystalizacji swojego białka.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ten projekt otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji w ramach umowy o grant nr 701647 Marie Skłodowska-Curie. Wielkie podziękowania za pomoc i wsparcie dla naukowców z linii badawczej Swiss Light Source X10SA-PXII.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Swissci 96-dołkowe płytki 2-kroploweWymiary molekularneMD11-00296-dołkowa 2-kroplowa płytka krystalizacyjna
Swissci 96-dołkowa 3-kroplowaWymiary molekularneMD11-00396-dołkowa 3-kroplowa płytka krystalizacyjna
komar LCP Robot do obsługi cieczysptlabtechmosquito LCPRobot krystalizacyjny
ClearVue Arkusze WymiarymolekularneMD6-01596-dołkowe uszczelki płytkowe do krystalizacji
Safe-Tube 1,5 mlEppendorf301200861,5 ml probówki wirówkowe
ScapleSwan i MortonNo. 3 i rękojeść nr 3Skalpel do cięcia otwartych uszczelek płytowych
MS 3 VortexIKA3319000Vortex do mieszania roztworu i wytwarzania zapasów nasion
24-dołkowa płytka XRLWymiary molekularneMD3-1124-dołkowe płytki wiszące
Rewolwer/rotator rurkowyThermo Fischer Scientific88881001Rewolwer rurkowy do mieszania roztworu podczas skalowania
Eppendorf Research plus pipetyEppendorfGama pipet ręcznych, 0,5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 i mikro; L
Końcówki do pipet EppendorfEppendorfZakres rozmiarów końcówek do pipet ręcznych
Suparen 600Prochem AGSuparen 600Endotiapepsyna roztwór
Octan soduSigma-Aldrich241245-1KGOctan sodu
TrisMerck8382T014Tris
Chlorek magnezuSigma-AldrichM2670-1kgChlorek magnezu
PEG 6,000Sigma-Aldrich81255-1kgPEG 6,000
Glikol ethelyenowySigma-Aldrich324558-1LGlikol ethelyenowy do cyroochrony kryształów
Ekran PACT Premier HTWymiary molekularneMD1-36PACT 96-dołkowy ekran kryształkowy
Smar wysokopróżniowy DOW CORNINGWymiary molekularneMD6-02 do uszczelniania płytek 24-dołkowych
Hirschmann 22 x 22 mm prowadnice osłonowe glaserHirschmann8000104Szkiełka pokrywowe do uszczelniania 24-dołkowych płytek opadowych do siedzenia
Kołki kryształowePSIProdukowane we własnym zakresieCienkowarstwowe nośniki do mikrokryształów.
1-1,3 mm SiLibeads Type SFaust6239547Koraliki szklane do robienia naczyń mikoziarnistych
Macbook ProAppleMacbook ProKomputer do analizy danych
Pakiet oprogramowania CCP4CCP4Oprogramowanie do przetwarzania danych o wzorcach dyfrakcyjnych
ExcelMicrosoftMicrosoft OfficeNarzędzie do kreślenia diagramu fazowego
Komora licząca Hausser Scientific Bright-LineThermo Fischer Scientific02-671-51BNarzędzie do obliczania stężenia kryształów
PACT PremierMolecular DimensionsMD1-29-ECOEkran krystalizacji w matrycy rzadkiej
Imager skałFormulatrixRock ImagerMagazyn i obrazowanie płyt kryształowych z kontrolowaną temperaturą
Rock MakerWebFormulatrixRock MakerWebOprogramowanie do tworzenia i przechowywania obrazów na płytkach kryształowych
FormulatorFormulatrixFormulator96-dołkowy robot do tworzenia ekranów kryształowych do obsługi cieczy
Mikroskop Leica MZ16LeicaLeica MZ16Mikroskop świetlny
LAS V4.6Oprogramowanie LeicaLAS V4.6do mikroskopów
Leica Rurki dializacyjne Spectra/Por 3,5 kDaSpectrumlabsSpectra/Por 3 Membrana dializacyjnaMembrana dializowa 3,5 kDa
Zamknięcia węży do dializySpectrumlabsSpectra/Por 3 Duniversal ZamknięciaZaciski do uszczelniania końcówek przewodów dializacyjnych Koncentrator
odśrodkowy Amicon 10 kDaMerck-MilliporeKoncentrator odśrodkowy Amicon Ultra-15 10 kDaFiltr odśrodkowy
5810 R Wirówka z kubełkiem obrotowymEppendorf5810 R WirówkaWirówka z kubełkiem obrotowym
Smar Mikroskop

Bibliografia

  1. DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. Journal of Physics D: Applied Physics. 41 (19), 195505(2008).
  2. Hunter, M. S., et al. Fixed-target protein serial microcrystallography with an x-ray free electron laser. Scientific Reports. 4 (1), 6026(2014).
  3. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5 (1), 1-6 (2014).
  4. Roessler, C. G. G., et al. Acoustic Injectors for Drop-On-Demand Serial Femtosecond Crystallography. Structure. 24 (4), 631-640 (2016).
  5. Sherrell, D. A., et al. A modular and compact portable mini-endstation for high-precision, high-speed fixed target serial crystallography at FEL and synchrotron sources. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1372-1378 (2015).
  6. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5 (1), 1-11 (2015).
  7. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  8. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542(2017).
  9. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  10. Nango, E., et al. A three-dimensionalmovie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  11. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  12. Mehrabi, P., et al. Liquid application method for time-resolved analyses by serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 16 (10), 979-982 (2019).
  13. Halle, B. Biomolecular cryocrystallography: structural changes during flash-cooling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4793-4798 (2004).
  14. Fraser, J. S., et al. Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis. Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).
  15. Fenwick, R. B., van den Bedem, H., Fraser, J. S., Wright, P. E. Integrated description of protein dynamics from room-temperature X-ray crystallography and NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (4), 445-454 (2014).
  16. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. Elife. 4, (2015).
  17. Thomaston, J. L., et al. XFEL structures of the influenza M2 proton channel: Room temperature water networks and insights into proton conduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 13357-13362 (2017).
  18. Haas, D. J., Rossmann, M. G. Crystallographic studies on lactate dehydrogenase at -75 °C. Acta Crystallographica Section B Structural Crystallography and Crystal Chemistry. 26 (7), 998-1004 (1970).
  19. Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
  20. Wu, W., et al. Batch crystallization of rhodopsin for structural dynamics using an X-ray free-electron laser. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 71 (7), 856-860 (2015).
  21. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and delivery of protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463(2016).
  22. Andersson, R., et al. Well-based crystallization of lipidic cubic phase microcrystals for serial X-ray crystallography experiments. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (10), 937-946 (2019).
  23. Luft, J. R., et al. The detection and subsequent volume optimization of biological nanocrystals. Structural Dynamics. 2 (4), 041710(2015).
  24. Lee, D. B., et al. Supersaturation-controlled microcrystallization and visualization analysis for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
  25. Kupitz, C., et al. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1647), 20130316(2014).
  26. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, Pt 6 1385-1396 (2019).
  27. Rayment, I. Small-scale batch crystallization of proteins revisited: An underutilized way to grow large protein crystals. Structure. 10 (2), 147-151 (2002).
  28. García-Ruiz, J. M. Nucleation of protein crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 22-31 (2003).
  29. McPherson, A., Kuznetsov, Y. G. Mechanisms, kinetics, impurities and defects: Consequences in macromolecular crystallization. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (4), 384-403 (2014).
  30. Rupp, B. Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71, Pt 3 247-260 (2015).
  31. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  32. Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 60 (3), 601-605 (2004).
  33. Forsythe, E. L., Maxwell, D. L., Pusey, M. Vapor diffusion, nucleation rates and the reservoir to crystallization volume ratio. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (10), 1601-1605 (2002).
  34. Chayen, N. E., Shaw Stewart, P. D., Maeder, D. L., Blow, D. M. IUCr An automated system for micro-batch protein crystallization and screening. Journal of Applied Crystallography. 23 (4), 297-302 (1990).
  35. Chayen, N. E., Shaw Stewart, P. D., Blow, D. M. Microbatch crystallization under oil - a new technique allowing many small-volume crystallization trials. Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).
  36. Chayen, N. E. Comparative studies of protein crystallization by vapour-diffusion and microbatch techniques. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54 (1), 8-15 (1998).
  37. D'Arcy, A., Mac Sweeney, A., Stihle, M., Haber, A. The advantages of using a modified microbatch method for rapid screening of protein crystallization conditions. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography. 59 (2), 396-399 (2003).
  38. Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345(2016).
  39. Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
  40. Cheng, R. K. Y. Towards an optimal sample delivery method for serial crystallography at XFEL. Crystals. 10 (3), 215(2020).
  41. Schmidt, M. Mix and Inject: Reaction Initiation by Diffusion for Time-Resolved Macromolecular Crystallography. Advances in Condensed Matter Physics. 2013, 1-10 (2013).
  42. Oberthuer, D., et al. Double-flow focused liquid injector for efficient serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 44628(2017).
  43. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, Pt 1 2-20 (2014).
  44. Yaoi, M., et al. Effect of stirring method on protein crystallization. Japanese Journal of Applied Physics, Part 2: Letters. 43 (10), 1318(2004).
  45. Castro, F., Ferreira, A., Teixeira, J. J., Rocha, F. Influence of Mixing Intensity on Lysozyme Crystallization in a Meso Oscillatory Flow Reactor. Crystal Growth & Design. 18 (10), 5940-5946 (2018).
  46. Moews, P. C., Bunn, C. W. An X-ray crystallographic study of the rennin-like enzyme of Endothia parasitica. Journal of Molecular Biology. 54 (2), 395-397 (1970).
  47. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta crystallographica. Section D, Biological. 61, Pt 10 1426-1431 (2005).
  48. Ebrahim, A., et al. Resolving polymorphs and radiation-driven effects in microcrystals using fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75, Pt 2 151-159 (2019).
  49. Davy, B., et al. Reducing sample consumption for serial crystallography using acoustic drop ejection. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (5), (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Morfologia kryszta wdyfuzja parkrystalizacja okresowaanaliza morfogramuPEG 6000szczepienie kryszta wliczenie w komorze countingowejdyfrakcja rentgenowska
Optymalizacja wzrostu kryształów endotiapepsyny do eksperymentów krystalografii seryjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.