Pobieranie próbek i analiza mikrobiomu dwunastnicy

Podsumowanie

W tym manuskrypcie omawiamy nowatorską metodę pobierania próbek i analizy mikrobiomu dwunastnicy. Metoda ta zapewnia dokładne zobrazowanie różnorodności i składu mikrobiologicznego w dwunastnicy i może być przydatna do dalszych badań mikrobiomu dwunastnicy.

Streszczenie

Zmiany w mikrobiomie zostały skorelowane z fizjologią i patofizjologią wielu układów narządów, zarówno u ludzi, jak i u myszy. Mikrobiom jelitowy był zwykle badany poprzez pobieranie próbek kału. Łatwość pobierania próbek kału zaowocowała wieloma badaniami, które ujawniły informacje dotyczące dystalnego światła przewodu pokarmowego. Jednak niewiele badań dotyczyło znaczenia mikrobiomu w bliższym jelicie. Biorąc pod uwagę, że dwunastnica jest głównym miejscem trawienia i wchłaniania, jej mikrobiom jest istotny dla odżywiania i chorób wątroby i wymaga dalszych badań. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nową metodę pobierania próbek proksymalnego mikrobiomu jelitowego światła i błony śluzowej u ludzi poddawanych endoskopii górnego odcinka przewodu pokarmowego poprzez uzyskanie aspiratu dwunastnicy i biopsji. Pobieranie próbek jest łatwe i nie mają na nie wpływu artefakty, takie jak przestrzeganie zaleceń lekarskich przez pacjenta, jak to może mieć miejsce w przypadku pobierania próbek okrężnicy podczas kolonoskopii. Wstępne wyniki pokazują, że mikrobiomy światła i błony śluzowej znacznie się różnią, co prawdopodobnie jest związane z warunkami środowiskowymi i funkcjami bariery. Dlatego połączenie aspiracji dwunastnicy i biopsji ujawnia bardziej kompleksowy obraz mikrobiomu w dwunastnicy. Biopsje pobiera się z zstępujących i poziomych segmentów dwunastnicy, które są anatomicznie zbliżone do wątroby i drzewa żółciowego. Jest to ważne w badaniu roli biologii kwasów żółciowych i osi jelitowo-wątrobowej w chorobach wątroby. Biopsje i aspirat mogą być używane do sekwencjonowania rybosomalnego RNA 16S, metabolomiki i innych podobnych zastosowań.

Wprowadzenie

Mikrobiom jelitowy stał się w ostatnich latach przedmiotem zwiększonego zainteresowania. Obecnie wiadomo, że zróżnicowana populacja bakterii w jelitach może się różnić w zależności od różnych czynników, w tym genetyki, diety, leków i wpływów środowiskowych¹. Badania zidentyfikowały również unikalne profile mikrobiologiczne związane z różnymi chorobami przewodu pokarmowego, takimi jak otyłość, nieswoiste zapalenie jelit i choroby wątroby^2,3. Większość badań koncentruje się na profilowaniu mikrobiomu jelita grubego poprzez analizę próbek błony śluzowej kału i dystalnej części błony śluzowej⁴. Chociaż największe stężenie bakterii jelitowych znajduje się w okrężnicy (10¹² bakterii/gram), istnieje jednak złożona społeczność drobnoustrojów rezydujących w dwunastnicy (10³ / g), jelicie czczym (10⁴ / g) i jelicie krętym (10⁷ / g), która odgrywa kluczową rolę w metabolizmie i wchłanianiu trawiennym⁵.

Jelito cienkie służy jako główne miejsce rozkładu i wchłaniania składników odżywczych w przewodzie pokarmowym. Bakterie komensalne wyściełające jelito cienkie odgrywają fundamentalną rolę we wspomaganiu chemicznego rozkładu substratów pokarmowych i uwalnianiu związków bioaktywnych, które pomagają w wchłanianiu składników odżywczych⁶. Interakcje te przyczyniają się do powstania złożonego środowiska aktywności mikroorganizm-mikrob i gospodarz-mikrob w jelicie cienkim⁷. Badanie obserwujące mikrobiotę jelita cienkiego w modelach mysich wykazało, że myszy wolne od zarazków karmione dietą wysokotłuszczową miały upośledzone wchłanianie lipidów, ale po skolonizowaniu mikrobiotą jelita czczego miały bezpośredni wzrost wchłaniania lipidów⁶. Badanie pilotażowe na ludziach profilujące mikrobiotę dwunastnicy u osób otyłych i zdrowych wykazało, że mikrobiota dwunastnicy u osób otyłych miała zmiany w szlakach rozkładu kwasów tłuszczowych i sacharozy, prawdopodobnie wywołane związkiem zależnym od diety⁸. Ponadto dysbiozę mikrobioty jelita cienkiego stwierdzono w kilku chorobach, w tym w przeroscie bakteryjnym jelita cienkiego, zespole krótkiego jelita, zapaleniu torebki, dysfunkcji jelit środowiskowych i zespole jelita drażliwego⁷.

Interesuje nas związek między mikrobiomem a różnymi etapami przewlekłej choroby wątroby. W szczególności dwunastnica służy jako pierwsze miejsce rozkładu chemicznego i wchłaniania składników odżywczych w jelicie cienkim. Dodatkowo krążenie wrotne wątrobowe dostarcza składniki odżywcze i metabolity do wątroby, gdzie są one przetwarzane i regulowane do krwiobiegu. Anatomiczna bliskość między jelitem a wątrobą tworzy środowisko podatne na reakcje prozapalne, które mogą powstać z powodu uszkodzenia bariery jelitowej lub zmian w mikrobiomie jelitowym⁹. Badania badające progresję mikrobiomu i choroby wątroby zidentyfikowały dysbiozę mikrobiologiczną u pacjentów z niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby (NAFLD), stłuszczeniowym zapaleniem wątroby (NASH), alkoholową chorobą wątroby i marskością wątroby^10,11. Podczas gdy większość badań charakteryzuje mikrobiom jelita grubego, nas interesowało zbadanie mikrobiomu jelita cienkiego w odniesieniu do chorób wątroby. Wykorzystując nowatorską metodę przedstawioną tutaj, zidentyfikowaliśmy unikalne profile mikrobiologiczne dwunastnicy u pacjentów z marskością wątroby w odniesieniu do diety¹².

Ponieważ charakterystyka mikrobiomu jelita cienkiego staje się coraz bardziej interesującym obszarem, konieczne jest opracowanie jednolitych technik uzyskiwania próbek, które dokładnie reprezentują mikrobiotę jelita cienkiego. Istnieją jednak wyzwania związane z pobieraniem próbek, które skomplikowały badanie środowiska mikrobiomu jelita cienkiego. Obecne metody pobierania próbek wymagają inwazyjnych procedur, które często podlegają zanieczyszczeniu, jak opisano w Kastl et al⁷. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nowatorską metodę uzyskiwania aspiratu dwunastnicy i biopsji do analizy mikrobiologicznej od pacjentów z chorobami wątroby poddawanych ezofagogastroduodenoskopii.

Protokół

Próbki dwunastnicy zostały pobrane w Veteran Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, Cedars-Sinai Medical Center i Ronald Reagan UCLA Medical Center po tym, jak protokół kliniczny dla badania Microbiome, Microbial Markers and Liver Disease (M3LD) został zaakceptowany przez instytucjonalną komisję rewizyjną lokalnej komisji etycznej. Uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich pacjentów uczestniczących w badaniu.

1. Zgoda uczestników

1. Zwróć się do pacjentów z rozpoznaniem marskości wątroby o dowolnej etiologii za pomocą endoskopii zaplanowanej do badania przesiewowego żylaków lub nadciśnienia wrotnego w celu rekrutacji. Wykluczyć pacjentów z rakiem wątrobowokomórkowym (HCC).
2. Przedstaw badanie, dokładnie upewnij się, że uczestnik je rozumie i zapytaj uczestnika, czy chciałby zgłosić się na ochotnika do badania. Wypełnij formularz świadomej zgody, jeśli wyrażą zgodę.
3. Upewnij się, że endoskopię wykonuje odpowiednio przeszkolony i certyfikowany personel medyczny.

2. Pobieranie próbek

1. Znieczulić pacjenta 50 mg fentanylu i 2 mg midazolamu. W razie potrzeby należy zwiększać dawkę, aż pacjent będzie umiarkowanie znieczulony i będzie tolerował endoskop.
2. Wprowadzić endoskop (np. Pentax EG29-i10) do przełyku pacjenta i postępować w kierunku odźwiernika.
   UWAGA: Rozmiar endoskopu będzie się różnić w zależności od fizjologii pacjenta. Nie należy używać endoskopu do aspiracji przed pobraniem próbki, aby uniknąć zanieczyszczenia kanału endoskopu wydzieliną żołądkową lub ustno-gardłową.
3. Zaopatrz się w szkiełko mikroskopowe i igłę strzykawki w rozmiarze 18, aby przygotować się do pobrania próbki. Przygotuj sterylną podkładkę, która będzie używana do przenoszenia biopsji ze szkiełka mikroskopowego do kriowialiów.
4. Gdy luneta dotrze do drugiej części dwunastnicy dystalnej do bańki Vatera, odessać dowolny płyn obecny przez sterylny jednorazowy cewnik aspiracyjny przepuszczony przez kanał roboczy górnego endoskopu i zebrać go do jednorazowego pojemnika na próbkę o pojemności 40 ml. Wpłukać do 30 ml dodatkowej sterylnej wody za pomocą strzykawki do dwunastnicy i zassać płyn do pułapki na próbkę płynu, aby zebrać łącznie 15 ml.
5. Natychmiast wyjąć i zakryć pojemnik do aspiracji przymocowany do elementu ssącego cewnika. Umieść pojemnik w termosie nad lodem i w torbie do transportu próbek w celu przekazania do laboratorium przetwarzającego.
6. Włóż jednorazowe kleszczyki do biopsji o średnicy 2,8 mm do portu z boku endoskopu, aby usunąć próbki tkanek do badań. Wykonaj 2 losowe przejścia kleszczy w drugiej części dwunastnicy, zbierając dwa kęsy tkanki w każdym przejściu.
7. Użyj igły strzykawki w rozmiarze 18, aby pobrać próbki tkanek z kleszczy i na szkiełko mikroskopowe przed przeniesieniem próbek do czterech oddzielnych pustych kriowiali o pojemności 2 ml. Mocno przykręć nakrętki.
8. Włóż wszystkie 4 szczelnie zamknięte kriowiale do pustego pojemnika, takiego jak kubek na mocz, i utwórz kąpiel składającą się z 20 ml etanolu i suchego lodu, aby błyskawicznie zamrozić biopsje.
9. Umieścić kriowialisty biopsyjne w izolowanym pojemniku styropianowym na podłożu z suchego lodu i przenieść próbki do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania w celu zachowania próbek.

3. Przetwarzanie aspiracyjne

1. Po pobraniu próbek biologicznych należy je natychmiast przenieść do laboratorium BSL2 lub wyższego w celu przetworzenia.
2. Delikatnie odwróć pojemnik z zasysanym płynem cztery razy, a następnie podziel około 1,5 ml płynu na 2 ml kriowialiów.
3. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia analizy wsadowej.

4. Administrowanie kwestionariuszem i zbieranie danych klinicznych

1. Poproś uczestników o wypełnienie kwestionariuszy w celu uzyskania informacji na temat diety, danych demograficznych, nawyków związanych z paleniem/alkoholem, schorzeń/leków i jakości życia¹³.
2. Przeglądaj karty medyczne, aby przechwytywać dane kliniczne, w tym laboratoria kliniczne, dane obrazowania, leki i powikłania medyczne.

5. Ekstrakcja DNA

1. Ekstrakcję DNA należy przeprowadzić natychmiast po usunięciu biopsji dwunastnicy i odessać z magazynu w temperaturze -80 °C. Nie są wymagane żadne czynności przygotowawcze do ekstrakcji DNA z próbek biopsji dwunastnicy.
2. Przeprowadź ekstrakcję i sekwencjonowanie DNA dla wszystkich próbek tego samego dnia, aby zmniejszyć ryzyko wystąpienia efektu partii w analizie. Skonfiguruj bibliotekę specyficzną dla pobranych próbek, zanim będzie można je zsekwencjonować.
3. Użyj zestawu do mikroprzygotowania DNA, aby wyekstrahować DNA z próbek biopsji dwunastnicy, zgodnie z protokołem producenta¹⁴.
4. Dodać maksymalną ilość próbki zgodnie z wytycznymi protokołu do probówki do lizy zawierającej 750 μl roztworu do lizy i 0,7 ml suchej objętości szklanych kulek o średnicy 2 mm.
5. Zabezpiecz rurki do lizy w ubijaku do kulek z uchwytem na rurkę i uruchom ubijak z maksymalną prędkością przez co najmniej pięć minut. Czas będzie się różnić w zależności od ubijaka do kulek i analizowanej próbki.
6. Odwirować probówki do lizy w mikrowirówce o stężeniu 10 000 x g przez 1 minutę.
7. Przenieść do 400 μl supernatantu przez przefiltrowaną probówkę zbiorczą i ponownie odwirować przy 8000 x g przez 1 minutę.
8. Dodać 1200 μl buforu wiążącego do filtratu w probówce mikrowirówki i dokładnie wymieszać do uzyskania jednorodnej konsystencji.
9. Przenieść 800 μl mieszaniny do zespołu kolumny wirującej i probówki. Wirować przy 10 000 x g przez 1 min. Odrzuć przepływ.
10. Umieścić kolumnę wirową na nowej probówce wirówkowej z 400 μl buforu do przemywania DNA i dokładnie wymieszać do uzyskania jednorodnej konsystencji. Wirować przy 10 000 x g przez 1 min. Odrzuć przepływ.
11. Powtórz krok 5.10 dwa razy, z 700 μl, a następnie 200 μl buforu DNA na pranie.
12. Dodać 20 μl buforu elucyjnego do kolumny wirowej w nowej probówce wirówkowej. Inkubować przez jedną minutę, a następnie odwirować przy 10 000 x g przez 1 minutę w celu wymycia DNA. Odrzuć kolumnę.
13. Ponownie przefiltruj DNA. DNA jest teraz gotowe do amplifikacji PCR.

6. Amplifikacja DNA

1. Przeprowadzić amplifikację PCR regionu V4 genu rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwencjonowania 250 × 2 sparowanych końców na sekwencerze aMiSeq, HiSeq lub NovaSeq¹⁵.
2. Utworzyć 96-dołkową płytkę podkładową. Stwórz główną mieszankę 165 μl ILHS_515f konserwowanego startera (100 mM zapasu) i 2970 μl wody klasy biologii molekularnej. Dodaj 28,5 μl tej mieszanki do każdego dołka.
3. Dodać 1,5 μl odpowiedniego startera odwrotnego z 96-dołkowej płytki z kodami kreskowymi IL_806r unikalnych starterów (zapas 100 μM). Te kody kreskowe identyfikują unikalne próbki pacjentów.
4. Utwórz główną mieszankę wody (23,1 μl x 3,3 x liczba próbek), buforu PCR (3 μl x 3,3 x liczba próbek), dNTP (0,6 μl x 3,3 x liczba próbek) i polimerazy DNA JumpStart Taq (0,3 μl x 3,3 x liczba próbek).
   UWAGA: Amplifikację DNA 16S należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach.
5. Dodać 81 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka w pierwszej płytce 96-dołkowej. Do każdego dołka dodać 6 μl DNA i 3 ml mieszanki starterów. Użyj pipety wielokanałowej P200, aby wymieszać dołki, a następnie odpipetuj 30 μl do odpowiedniego dołka każdej z pozostałych dwóch płytek PCR. Uszczelnij płytę.
6. Użyj następujących ustawień termocyklera: 94 °C x 3 min; 35 cykli: 94 °C x 45 s, 50 °C x 1 min, 72 °C x 1.5 min. Po 35 cyklach: 72 °C x 10 min, 94 °C x 5 min, 4 °C na czas nieokreślony.

7. Czyszczenie i konfiguracja biblioteki

1. Zastosuj zestaw do czyszczenia PCR lub DNA, aby oczyścić produkty PCR. Eluować DNA za pomocą 30 μl wody klasy PCR (poddanej działaniu DEPC).
2. Użyj spektrofotometru UV w zakresie widzialnego spektrofotometru, który ma możliwość ilościowego oznaczania próbek PCR.
3. Otwórz oprogramowanie spektrofotometru na pulpicie komputera. Kliknij Kwas nukleinowy.
4. Wytrzyj port wodą destylowaną. Dodaj 1 μl 1x bufor/wody PCR do portu i skalibruj.
5. Wprowadź identyfikator próbki i odpipetuj 1 μl próbki do portu.
6. Zamknij port i naciśnij Measure.
   UWAGA: Unikaj pęcherzyków powietrza podczas dodawania próbek do portu.
7. Zetrzyj próbkę chusteczkami laboratoryjnymi i wodą destylowaną, a następnie przygotuj następną próbkę. Rejestruj wartości dla każdej próbki. Komputer powinien również zostać automatycznie zapisany.
8. Połączyć 250 ng każdego amplifikowanego produktu PCR w 1 probówce. To jest biblioteka DNA.
9. Dostarcz bibliotekę wraz z odczytami 1 i 2 oraz starterami sekwencjonowania indeksu do laboratorium sekwencjonowania w celu sekwencjonowania.
   UWAGA: Jeśli lokalne laboratorium nie jest dostępne, do tego kroku można wykorzystać komercyjne laboratorium sekwencjonowania.

8. Formatowanie danych

1. Dane sekwencjonowania dostarczają wyników w plikach .fastq do przodu i do tyłu. Przekształć te dane w arkusz danych i wyczyść, aby informacje mogły być analizowane dla dalszych aplikacji.
2. Otwórz oprogramowanie do programowania języka R. Postępuj zgodnie z instrukcjami i kodem wymienionym w dodatkowym pliku kodowania, aby przejść przez potok DADA2 i wyczyścić dane sekwencjonowania DNA¹⁶. Pobierz referencyjną bazę danych SILVA do przypisania taksonomii po przepuszczeniu sekwencji przez potok¹⁷.
3. Krótko mówiąc, załaduj pakiet DADA2 w R. Zdefiniuj ścieżkę, w której wszystkie pliki .fastq są zapisywane w tym samym katalogu i rozpakuj pliki do R.
4. Odczytuje nazwy plików fastq i dopasowuje listy plików fastq do przodu i do tyłu.
5. Sprawdź jakość odczytów do przodu i do tyłu.
   UWAGA: Sekwencje nukleotydowe można skracać w celu zachowania wysokiej jakości sekwencji.
6. Filtruj i przycinaj pliki fastq. Użyj metody learnErrors, aby nauczyć się parametrycznego modelu błędów używanego przez DADA2. Pokaże to obserwowane i oczekiwane poziomy błędów dla każdego możliwego podstawienia nukleotydów (A → C, A → T, A → G itd.).
7. Zastosuj algorytm wnioskowania próbki, aby określić liczbę unikalnych sekwencji w każdej próbce i dalej zbadaj obiekt klasy dada, aby uzyskać liczbę prawdziwych unikalnych wariantów na próbkę.
8. Scal odczyty do przodu i do tyłu, aby uzyskać pełne i odszumione sekwencje.
9. Skonstruuj tabelę wariantów sekwencji amplikonów (ASV).
10. Usuń chimery z tabeli ASV. Sekwencje chimeryczne to pojedyncza sekwencja wynikająca z dwóch liczniejszych sekwencji rodzicielskich.
11. Śledź łączną liczbę odczytów, które przeszły przez potok. DADA2 użyje SILVA do przypisania taksonomii do każdej unikalnej sekwencji. Dokładność można przeanalizować, włączając społeczność znanych sekwencji bakterii do potoku DADA2 i porównując warianty sekwencji DADA2 z oczekiwanym składem społeczności.
    UWAGA: Dane sekwencjonowania DNA są teraz oczyszczone i gotowe do analizy w oparciu o konkretny zakres i cele projektu badawczego.

Wyniki

Różnice w populacjach mikrobiomu śluzówkowego i luminalnego w proksymalnym odcinku jelita
Wcześniejsze badania wykazały różnice w populacjach drobnoustrojów w próbkach luminalnych i śluzówkowych okrężnicy^4,5,18. Wyniki wstępne wskazują, że aspiraty z dwunastnicy oraz próbki z biopsji pozwalają na pomiar mikrobioty zarówno luminalnej, jak i śluzówkowej w proksymalnym odcinku jelita. Co więcej, stwierdzono, że...

Dyskusja

Badania mikrobiomu są niezwykle ważne, ponieważ ten złożony ekosystem odgrywa kluczową rolę w homeostazie energetycznej, reakcjach immunologicznych i metabolizmie^. Istnieją regionalne różnice w mikrobiomie, które mogą odzwierciedlać różne funkcje fizjologiczne różnych regionów przewodu pokarmowego, które mogą wpływać na różne stany chorobowe²⁰. Najczęściej badany jest mikrobiom kałowy, ale ostatnio badano mikrobiom jelita cienkiego ^6,21

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kriowiale 2 ml	Corning	430659
96-dołkowe płytki	Applied Biosystems	4306737
dNTPs	Sigma	D7295
Suchy lód			Dostarczone przez instytucję
Endoskop EG29-i10	Pentax	N/A	Rozmiar endoskopu może się różnić w zależności od fizjologii pacjenta
Epokowa mikropłytka spektrofotometr	Biotek	N/A
Etanol	Sigma Aldrich	676829
HiSeq 2500	Illumina	Nie dotyczy
IL_806r odwrócony starter	Technologie IDT DNA	niestandardowe	startery
ILHS_515f forward startery	IDT DNA technologies	niestandardowe	niestandardowe startery
JumpStart Taq DNA	Sigma	D4184
Pułapka na próbki śluzu	Busse Hospital Disposables	405	Pułapka na próbki 40 cc z nasadką transportową
Oprogramowanie Nanodrop Gen5	Bufor ThermoFisher Scientific
PCR	Sigma	P2192
	Zymo Research	D4204
Szczęka promieniowa 4 kleszcze Jumbo	Boston Scientific	M00513343	Średnica zewnętrzna szczęki 2,8 mm
Kwestionariusz dietetyczny	Vioscreen VioCare	N/A
ZymoBIOMICS DNA Microprep Kit	Zymo Research	D4300	Zdolność wiązania 25 ug

Zestaw do czyszczenia PCR