Artykuł metodologiczny

Izolacja kałowego (mikro) RNA

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61908

⸱

28 października 2020

 ,  , 
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Department of Neurology, Partners Multiple Sclerosis Center, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Evergrande Center for Immunologic Diseases, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół izoluje wysokiej jakości całkowite RNA z próbek kału zwierząt i ludzi. Komercyjny zestaw do izolacji miRNA jest używany ze znaczną adaptacją do izolowania czystego RNA ze zoptymalizowaną ilością i jakością. Izolaty RNA są dobre dla większości dalszych testów RNA, takich jak sekwencjonowanie, mikromacierz i RT-PCR.

Streszczenie

Staje się jasne, że RNA istnieje w świetle jelit i kale u zwierząt i ludzi. Opisany poniżej protokół izoluje całkowite RNA, w tym mikroRNA, z próbek kału zwierząt i ludzi. Celem jest wyizolowanie całkowitego RNA o wysokiej czystości i ilości do dalszych analiz, takich jak sekwencjonowanie RNA, RT-PCR i mikromacierze. Zaletami tego zoptymalizowanego protokołu izolacji miRNA są możliwości izolowania wysoko oczyszczonych produktów RNA z opisanymi dodatkowymi etapami mycia, zwiększona ilość RNA uzyskana za pomocą ulepszonej metody ponownego zawieszania próbki oraz ważne wskazówki dotyczące odkażania. Jednym z ograniczeń jest niemożność przetworzenia i oczyszczenia większej próbki powyżej 200 mg, ponieważ takie rozmiary próbek spowodowałyby trudności w wyraźnym tworzeniu interfazy. W związku z tym duży rozmiar próbki może zanieczyścić fazę wodną, która ma być wyekstrahowana, zgodnie z opisem w protokole, substancjami organicznymi, które wpływają na jakość wyizolowanego RNA na końcu. Jednak izolaty RNA z próbki do 200 mg są wystarczające do większości dalszych analiz.

Wprowadzenie

Zewnątrzkomórkowe RNA jest uznawane za istotny czynnik pośredniczący w wielu procesach biologicznych1. Zewnątrzkomórkowe RNA w kale zostało po raz pierwszy zgłoszone w 2008 roku jako marker raka jelita grubego i aktywnego wrzodziejącego zapalenia jelita grubego2, a ostatnio ujawniono, że jest normalnym składnikiem światła jelita i kału oraz pośredniczy w komunikacji między gospodarzem a mikrobem3,4,5. Celem tego protokołu izolacji RNA jest ekstrakcja wysokiej jakości zewnątrzkomórkowego RNA z próbek kału pobranych od zwierząt i ludzi. Protokół został zaadaptowany z komercyjnego zestawu do izolacji miRNA. Pozyskane RNA jest wykorzystywane do dalszych analiz, takich jak sekwencjonowanie RNA, RT-PCR i mikromacierz. Protokół zawiera kilka ważnych i przydatnych wskazówek, jak zmaksymalizować ilość i jakość RNA znajdującego się w kale zwierząt i ludzi. Powodem opracowania i optymalizacji tej metody izolacji RNA (w tym mikroRNA) jest zmniejszenie drobnoustrojowego RNA w kale, ograniczenie zmiennych w badaniach naukowych i analiza składu RNA w jelitach bez uwzględniania różnych czynników zakłócających i źródeł zanieczyszczenia. Warto zauważyć, że ta izolacja RNA minimalizuje uwalnianie RNA z żywej komórki i żywych drobnoustrojów (komórkowego RNA). Koncentruje się na zewnątrzkomórkowych RNA, które zostały uwolnione przez komórki jelitowe lub zostały nabyte poprzez spożycie pokarmu. Zasadniczo metoda ta nie nadaje się do badań, w których bada się transkryptom drobnoustrojów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody z udziałem zwierząt badawczych zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) z Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.

Wszystkie opisane tutaj metody z udziałem ludzi są zgodne z wytycznymi ustalonymi przez Komitet ds. Badań Naukowych na Ludziach Partnerów.

1. Pobieranie próbek kału

  1. Autoklaw lub przygotuj sterylną i wolną od nukleaz probówkę do mikrowirówek o pojemności 2 ml z zakrętką dla każdego zwierzęcia biorącego udział w eksperymencie.
    1. W przypadku ludzi należy zapewnić odpowiednie, wolne od nukleaz i sterylne urządzenie do pobierania próbek kału dla każdego pacjenta.
  2. Zbierz 25-100 mg (około 1-4 granulki kału dla próbek kału myszy) próbek kału od każdego zwierzęcia w sterylnym środowisku.
    UWAGA: Dwie lub więcej granulek kału (~50 mg lub cięższych) są preferowane do uzyskania RNA o najwyższej czystości.
    1. Wykorzystaj wszystkie niezbędne środki ochrony osobistej (PPE) i materiały, na przykład: parę rękawic laboratoryjnych, spray dezynfekujący i sterylny ręcznik papierowy, aby wysterylizować obszar roboczy, na którym umieszcza się obiekt badań na zwierzętach, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki kału.
      1. W przypadku ludzi poinstruuj każdego uczestnika badań/kolekcjonera, aby zebrał 100-200 mg próbek kału w środowisku tak sterylnym, jak to tylko możliwe. Stosuj standardową sterylną operację i unikaj zanieczyszczenia próbki kału.
  3. Próbki kału od każdego zwierzęcia należy pobrać bezpośrednio do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml z zakrętką, nie dotykając żadnych innych powierzchni, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    1. W przypadku ludzi należy poinstruować każdego uczestnika, aby wypróżniał się bezpośrednio do odpowiedniego dostarczonego urządzenia do pobierania kału (np. sterylnego zestawu do pobierania próbek kału), aby uniknąć zanieczyszczenia.
      UWAGA: Poinstruuj testera, aby unikał zanieczyszczenia powierzchniami toalet, wodą, moczem lub innymi niesterylnymi powierzchniami/przedmiotami.
  4. Próbki kału zebrane w probówkach mikrowirówkowych o pojemności 2 ml należy natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C lub umieścić w wiadrze z suchym lodem w celu uzyskania lepszej ilości i jakości RNA przed ponownym zawieszeniem kału, jak opisano w poniższych krokach.
    1. W przypadku próbek kału ludzkiego, każdą świeżą próbkę o objętości 200 mg należy rozmieścić w probówkach mikrowirówek o pojemności 2 ml z nakrętkami i zamrozić w temperaturze -80 °C przed ponownym zawieszeniem kału, jak opisano poniżej.
      1. W celu przechowywania próbek kału znajdujących się nie w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml z nakrętkami, należy zważyć i przenieść 100-200 mg każdej z zamrożonych próbek do oddzielnych probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml z zakrętkami przed ponownym zawieszeniem kału, jak opisano poniżej.
        UWAGA: W przypadku próbek kału ludzkiego należy unikać pobierania więcej niż 200 mg próbek kału do izolacji RNA, ponieważ może to spowodować trudności w kolejnych krokach. W przypadku przeciążonej próbki w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml faza wodna, faza organiczna i faza pośrednia mogą nie być wyraźnie uformowane i oddzielone. W tym miejscu procedurę można wstrzymać.

2. Przygotowanie roztworów myjących

  1. Dodaj 21 ml 100% etanolu klasy American Chemical Society (ACS) do roztworu myjącego 1 dostarczonego w zestawie do izolacji miRNA (patrz tabela materiałów), aby osiągnąć końcową objętość 30 ml, jak pokazano na butelce. Wiruj, aż wszystko rozpuści się w butelce.
  2. Dodaj 40 ml 100% etanolu klasy ACS do dostarczonego roztworu myjącego 2/3, aby osiągnąć końcową objętość 50 ml, jak pokazano na butelce. Wiruj przez 5 s lub do momentu, gdy ostateczna mieszanina dobrze się połączy.

3. Przygotowanie sprzętu i materiałów

  1. Spryskać obszar roboczy i sprzęt, na przykładample: stół laboratoryjny, obszar roboczy w dygestoriach chemicznych i stojaki na probówki do mikrowirówek, roztworem do odkażania rybonukleazą (RNazą) (np. dostępnym w handlu roztworem do odkażania RNazy). Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy nakładać roztwór odkażający RNase na powierzchnie, gdziekolwiek i kiedykolwiek uznasz to za konieczne.
  2. Załóż czysty fartuch laboratoryjny, załóż maskę na twarz i załóż odpowiednie rękawice laboratoryjne, aby chronić RNA w próbkach kału przed nukleazami obecnymi na ludzkiej skórze. Spryskaj rękawice roztworem do odkażania RNazy i często zmieniaj rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  3. Przygotować wiadro z suchym lodem na próbki kału przechowywane w temperaturze -80 °C, aby zapobiec rozmrożeniu przed ponownym zawieszeniem kału, oraz wiadro z lodem w przypadku materiałów, na przykład: Kwas-fenol: Chloroform, w celu przedłużenia okresu przydatności do spożycia.
    UWAGA: Upewnij się, że materiały, w tym pożywki użyte w protokole, są sterylne bez zanieczyszczenia nukleazami.

4. Zawieszenie kału

  1. Zawiesić 25-100 mg próbek kału w 600 μl sterylnego 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS).
    UWAGA: Próbki kału należy przetwarzać natychmiast po rozmrożeniu od -80 °C bez nawet częściowego rozmrażania, aby zminimalizować uwalnianie RNaz i komórkowego RNA, ponieważ kryształki lodu pękają zarówno wewnętrzne, jak i zewnętrzne przedziały komórkowe, gdy komórki w próbce rozmrażają się.
    1. Dodać 600 μl 1x DPBS do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml z zakrętką zawierającej próbki kału w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Inkubować mieszaninę próbek kału zanurzonych w 600 μl 1x DPBS w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml zakrytej korkiem na 30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Zawiesić mieszaninę, rozcierając końcówką pipety o pojemności 1 ml i dobrze przemieszać z zakręconą probówką do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Aby zoptymalizować i zwiększyć ilość i jakość RNA, należy ponownie zawiesić mieszaninę za pomocą homogenizatora z ustawieniem na jeden cykl przy S4000 (lub 4000 obr./min) i 45 s.

5. Ekstrakcja organiczna

UWAGA: Użyj dygestorii z niebezpiecznymi chemikaliami do następujących kroków, aż do Kroku 6 z użyciem kwasowo-fenolowego: chloroform i 100% etanol klasy ACS ze względu na ich toksyczność i łatwopalność. W razie potrzeby należy zmieniać środki ochrony osobistej i przestrzegać odpowiednich standardowych środków ostrożności podczas pracy z materiałami niebezpiecznymi.

  1. Ekstrahuj RNA za pomocą 600 μl kwasu-fenolu: chloroformu (wymagana objętość kwasu-fenolu: chloroformu jest równa początkowej objętości dodanego 1x DPBS w kroku 4.1).
    1. Dodać 600 μl kwasowo-fenolowo-chloroformowego do zawiesiny z etapu 4.1.
      UWAGA: Pobrać kwas-fenol: chloroform z dolnej fazy w butelce, ponieważ górna faza jest mieszana z buforem wodnym. Jeśli interfaza między tymi dwiema fazami zostanie zakłócona, należy odczekać i wycofać kwas-fenol: chloroform tylko wtedy, gdy interfaza ponownie się utrwali, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  2. Mieszaj mieszaninę przez 60 sekund, aby dokładnie wymieszać. Alternatywnie, aby zoptymalizować i zwiększyć ilość RNA w wydajności, wymieszaj za pomocą homogenizatora z ustawieniem na jeden cykl w S4000 i 45 s.
  3. Wirować przez 15 minut przy 10 000 x g w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia fazy wodnej i organicznej za pomocą mikrowirówki. Po odwirowaniu interfaza powinna być zwarta. Jeśli nie, powtórz wirowanie.
    UWAGA: Jeśli interfaza nie może być tak zwarta, jak jest to pożądane, prawdopodobnie z powodu nierównomiernego stosunku objętości początkowej do objętości dodanego kwasu-fenolu: chloroformu, po kilku powtórzeniach wirowania, należy przystąpić do odzyskiwania fazy wodnej z większą ostrożnością, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  4. Odzyskaj fazę wodną i przenieś ją do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml z nasadką zawiasową (brak zestawu do izolacji miRNA).
    1. Ostrożnie usunąć fazę wodną (lub górną), nie naruszając fazy dolnej, i przenieść ją do nowej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml z nasadką zawiasową. Zwróć uwagę na przenoszoną objętość (np. ~500 μL).
      UWAGA: Gdy interfaza jest zwarta, a górna faza jest wyraźnie oddzielona, na wierzchu fazy wodnej może unosić się kilka maleńkich cząstek resztkowych. Pipetę należy dokładnie odpipetować, aby uniknąć tych pozostałości i odzyskać tylko widocznie i wyraźnie oddzieloną fazę wodną, aby zapewnić wysokiej jakości wydajność RNA, nawet jeśli można uzyskać tylko niewielką objętość fazy wodnej.

6. Końcowa izolacja RNA

  1. Dodać 1,25 objętości 100% etanolu klasy RT ACS do fazy wodnej w probówce mikrowirówki o pojemności 2 ml (np. dodać 625 μl 100% etanolu, jeśli 500 μl fazy wodnej zostanie odzyskane z kroku 5.4). Wir 3 s.
  2. Załaduj mieszaninę fazy wodnej i etanolu przez wkład filtracyjny znajdujący się w zestawie do izolacji miRNA.
    1. Dla każdej próbki należy umieścić wkład filtra w jednej z probówek zbiorczych dostarczonych w zestawie.
      1. Odmierzyć pipetą i załadować 600 μl mieszaniny fazy wodnej i etanolu do wkładu filtrującego.
        UWAGA: Krótko wymieszać mieszaninę, aby dokładnie wymieszać etanol z fazą wodną przed pipetowaniem. Jednorazowo można załadować nie więcej niż 700 μl mieszaniny fazy wodnej i etanolu.
    2. Wirować przy 10 000 x g przez 90 s, aby przefiltrować mieszaninę. Wirowanie z większą prędkością może spowodować uszkodzenie filtra.
    3. Odrzucić filtrat i powtarzać kroki 6.2.1-6.2.2, aż cała mieszanina zostanie przefiltrowana przez tę samą membranę filtracyjną w kolejnych zastosowaniach. Zachowaj i ponownie użyj tej samej probówki zbiorczej do poniższych etapów mycia.
    4. Umyj filtr 700 μl roztworu do płukania miRNA 1,
      UWAGA: miRNA Wash Solution 1 zawiera tiocyjanian guanidyny, który może powodować podrażnienie skóry i poważne uszkodzenie oczu. Nosić niezbędne środki ochrony osobistej, na przykład: rękawice, osłonę twarzy, ochronny fartuch laboratoryjny. W razie potrzeby często zmieniaj rękawice.
      1. Do wkładu filtracyjnego nanieść 700 μl miRNA Wash Solution 1, roztworu roboczego przygotowanego ze 100% etanolu klasy ACS.
      2. Wirować przez 60 s, aby przefiltrować roztwór do płukania miRNA 1 przez wkład filtra.
      3. Wyrzuć filtrat z probówki zbiorczej i umieść ten sam wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej.
    5. Umyj filtr roztworem myjącym 2/3 jeden raz w objętościach kolejno 700 μl, 500 μl i 250 μl.
      1. Do wkładu filtracyjnego nanieść 700 μl roztworu myjącego 2/3, roztworu roboczego przygotowanego ze 100% etanolu klasy ACS.
        1. Wirować przy 10 000 x g przez 1 min.
        2. Wyrzuć filtrat z probówki zbiorczej i umieść ten sam wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej.
      2. Nałożyć 500 μl roztworu myjącego 2/3 do wkładu filtra.
        1. Wirować przy 10 000 x g przez 1 min.
        2. Wyrzuć filtrat z probówki zbiorczej i umieść ten sam wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej.
      3. Nałożyć 250 μl roztworu myjącego 2/3 do wkładu filtra.
        1. Wirować przy 10 000 x g przez 1 min.
        2. Wyrzucić filtrat z probówki zbiorczej.
      4. Przenieś wkład filtra do nowej rurki zbiorczej i obracaj zespołem przez 5 minut, aby usunąć resztki płynu z filtra.

7. Elute RNA za pomocą 50 μL wody wolnej od nukleaz

  1. Przenieś wkład filtra do nowej rurki zbiorczej. Odpipetować 50 μl wody wolnej od nukleaz do środka filtra i zakryć probówkę zbiorczą.
    1. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    2. Wirować przez 5 minut przy 8,000 x g, aby odzyskać RNA do nowej probówki zbiorczej.
    3. Określ stężenie i czystość odzyskanego RNA w kale za pomocą fluorometru. Odzyskane RNA kału można przechowywać w temperaturze -80 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywny RNA wyizolowano odpowiednio z 50 mg próbek kału mysiego (2 pellety kału mysiego) oraz 100 mg próbek kału ludzkiego, a następnie eluowano w 50 µL wody wolnej od nukleaz. Analiza stężenia za pomocą spektrofotometru wskazuje, że wyizolowano odpowiednio całkowitą ilość 49 µg i 16 µg RNA (Tabela 1). Czystość RNA była wysoka, o czym świadczy stosunek A260/A280 wynoszący ~2,0 oraz stosunek A260/A230 wynoszący ~1,8 (Tabela 1). Jak donoszono3, większość czą...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ważne jest, aby stosować technikę wolną od RNaz, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazą podczas izolacji7. Po odwirowaniu i utworzeniu zwartej interfazy kluczowe jest unikanie interfazy, dolnej fazy i zanieczyszczenia cząstkami unoszącymi się na wierzchu fazy wodnej podczas odzyskiwania fazy wodnej. Dodatkowo dodawane są dwa etapy mycia z 500 μl i 250 μl roztworu myjącego 2/3 w celu wyeliminowania zanieczyszczeń z membrany filtracyjnej w celu uzyskania optymalnej jakości. Ponadto nie zaleca się stoso...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak istotnych lub istotnych interesów finansowych, które są związane z metodą badawczą opisaną w niniejszym dokumencie.

Podziękowania

Otrzymaliśmy pomoc techniczną od Zakładu Biopolimerów w Harvard Medical School w zakresie bioanalizatora. Praca ta była wspierana przez grant badawczy National Multiple Sclerosis Society RG-1707-28516 (H.L.W. i S.L.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Acid-Phenol: Chloroform, pH 4,5 (z IAA, 125:24:1)Thermo Fischer ScientificAM9720
DPBS, bez wapnia, bez magnezuRękawice Thermo Fischer Scientific14190-144
Mikrowirówka
mirVana Zestaw do izolacji miRNAThermo Fischer ScientificAM1561
Probówki do mikrowirówek bez nukleaz (1,5 ml, 2 ml)
Woda bez nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)Thermo Fischer ScientificAM9937
Pipety i końcówki do pipet bez nukleaz (z filtrem)
Homogenizator PowerLyzer 24QIAGEN13155
RNaseZap Roztwór do dekontaminacji RNazyThermo Fischer ScientificAM9780
Wytrząsarka
wirowa

Bibliografia

  1. Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
  2. Ahmed, F. E., et al. Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).
  3. Liu, S., et al. The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA. Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).
  4. Viennois, E., et al. Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation. Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).
  5. Liu, S., et al. Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila. Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).
  6. Masotti, A., et al. Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028(2009).
  7. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857(2019).
  8. Franzosa, E. A., et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).
  9. Wohnhaas, C. T., et al. Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers. Crohn's & Colitis. 2 (1), 003(2020).
  10. Tomkovich, S., et al. Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer. mSystems. 5 (1), (2020).
  11. Tarallo, S., et al. Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples. mSystems. 4 (5), 70(2019).
  12. Xing, S., et al. Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria. Research Square. , (2020).
  13. Teng, Y., et al. Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota. Cell Host & Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).
  14. Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface. Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).
  15. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja RNA z ka uekstrakcja mikroRNAkwasowy fenol z chloroformemoczyszczanie RNAresuspensja pr bkiprotok wirowaniaprzemywanie wk adu filtrawoda wolna od nukleazelektroforeza chipowastosunek absorbancji

Powiązane artykuły