Izolacja kałowego (mikro) RNA

Summary

Ten protokół izoluje wysokiej jakości całkowite RNA z próbek kału zwierząt i ludzi. Komercyjny zestaw do izolacji miRNA jest używany ze znaczną adaptacją do izolowania czystego RNA ze zoptymalizowaną ilością i jakością. Izolaty RNA są dobre dla większości dalszych testów RNA, takich jak sekwencjonowanie, mikromacierz i RT-PCR.

Abstract

Staje się jasne, że RNA istnieje w świetle jelit i kale u zwierząt i ludzi. Opisany poniżej protokół izoluje całkowite RNA, w tym mikroRNA, z próbek kału zwierząt i ludzi. Celem jest wyizolowanie całkowitego RNA o wysokiej czystości i ilości do dalszych analiz, takich jak sekwencjonowanie RNA, RT-PCR i mikromacierze. Zaletami tego zoptymalizowanego protokołu izolacji miRNA są możliwości izolowania wysoko oczyszczonych produktów RNA z opisanymi dodatkowymi etapami mycia, zwiększona ilość RNA uzyskana za pomocą ulepszonej metody ponownego zawieszania próbki oraz ważne wskazówki dotyczące odkażania. Jednym z ograniczeń jest niemożność przetworzenia i oczyszczenia większej próbki powyżej 200 mg, ponieważ takie rozmiary próbek spowodowałyby trudności w wyraźnym tworzeniu interfazy. W związku z tym duży rozmiar próbki może zanieczyścić fazę wodną, która ma być wyekstrahowana, zgodnie z opisem w protokole, substancjami organicznymi, które wpływają na jakość wyizolowanego RNA na końcu. Jednak izolaty RNA z próbki do 200 mg są wystarczające do większości dalszych analiz.

Introduction

Zewnątrzkomórkowe RNA jest uznawane za istotny czynnik pośredniczący w wielu procesach biologicznych¹. Zewnątrzkomórkowe RNA w kale zostało po raz pierwszy zgłoszone w 2008 roku jako marker raka jelita grubego i aktywnego wrzodziejącego zapalenia jelita grubego², a ostatnio ujawniono, że jest normalnym składnikiem światła jelita i kału oraz pośredniczy w komunikacji między gospodarzem a mikrobem^3,4,5. Celem tego protokołu izolacji RNA jest ekstrakcja wysokiej jakości zewnątrzkomórkowego RNA z próbek kału pobranych od zwierząt i ....

Protocol

Wszystkie opisane tutaj metody z udziałem zwierząt badawczych zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) z Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.

Wszystkie opisane tutaj metody z udziałem ludzi są zgodne z wytycznymi ustalonymi przez Komitet ds. Badań Naukowych na Ludziach Partnerów.

1. Pobieranie próbek kału

1. Autoklaw lub przygotuj sterylną i wolną od nukleaz probówkę do mikrowirówek o pojemności 2 ml z zakrętką dla każdego zwierzęcia biorącego udział w eksperymencie.
   1. W przypadku ludzi należy zapewnić odpowiednie, wolne od nukleaz i steryl....

Results

Reprezentatywne RNA zostały wyizolowane z 50 mg próbek kału myszy (2 mysie granulki kału) i 100 mg ludzkiego kału odpowiednio i wymyte w 50 μL wody wolnej od nukleaz. Analiza stężenia za pomocą spektrofotometru sugeruje, że wyizolowano odpowiednio 49 μg i 16 μg RNA (tabela 1). Czystość RNA była wysoka, na co wskazuje stosunek A260/A280 wynoszący ~2,0 i stosunek A260/A230 wynoszący ~1,8 (Tabela 1). Jak zgłoszono³, większość RNA w kale to mikroRNA i te mikroRNA mogą.......

Discussion

Ważne jest, aby stosować technikę wolną od RNaz, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazą podczas izolacji⁷. Po odwirowaniu i utworzeniu zwartej interfazy kluczowe jest unikanie interfazy, dolnej fazy i zanieczyszczenia cząstkami unoszącymi się na wierzchu fazy wodnej podczas odzyskiwania fazy wodnej. Dodatkowo dodawane są dwa etapy mycia z 500 μl i 250 μl roztworu myjącego 2/3 w celu wyeliminowania zanieczyszczeń z membrany filtracyjnej w celu uzyskania optymalnej jakości. Ponadto nie zaleca się stoso.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid-Phenol: Chloroform, pH 4,5 (z IAA, 125:24:1)	Thermo Fischer Scientific	AM9720
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Rękawice Thermo Fischer Scientific	14190-144
Mikrowirówka
mirVana Zestaw do izolacji miRNA	Thermo Fischer Scientific	AM1561
Probówki do mikrowirówek bez nukleaz (1,5 ml, 2 ml)
Woda bez nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)	Thermo Fischer Scientific	AM9937
Pipety i końcówki do pipet bez nukleaz (z filtrem)
Homogenizator PowerLyzer 24	QIAGEN	13155
RNaseZap Roztwór do dekontaminacji RNazy	Thermo Fischer Scientific	AM9780
Wytrząsarka