Artykuł metodologiczny

Ulepszony test i narzędzia do pomiaru mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61911

⸱

29 października 2020

 , 
1Department of Genetics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Neuroscience Graduate Program, Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Genetics and Epigenetics Graduate Program, Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak przeprowadzić ulepszony test mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila. Używamy tutaj testu, aby wykazać, że nadwrażliwość mechaniczna (allodynia i hiperalgezja) występuje u larw Drosophila.

Streszczenie

Opublikowane testy mechanicznej nocycepcji u Drosophila doprowadziły do różnych ocen zachowania. Tutaj wyprodukowaliśmy, do użytku z larwami Drosophila, niestandardowe włókna ze stopu metalu i niklu i tytanu (nitinol). Te mechaniczne sondy są podobne do włókien von Freya stosowanych u kręgowców do pomiaru mechanicznej nocycepcji. Tutaj pokazujemy, jak wykonać i skalibrować te mechaniczne sondy oraz jak wygenerować pełną behawioralną odpowiedź na dawkę od bodźców podprogowych (nieszkodliwy lub nieszkodliwy) do ponadprogowych (niski do wysokiego szkodliwego zakresu). Aby zademonstrować użyteczność sond, zbadaliśmy nadwrażliwość wywołaną uszkodzeniem tkanek u larw Drosophila. U larw Drosophila nie stwierdzono jeszcze allodynii mechanicznej (nadwrażliwości na normalnie nieszkodliwy bodziec mechaniczny) i hiperalgezji (przesadnej reakcji na szkodliwy bodziec mechaniczny). Używając sond mechanicznych, które zwykle są nieszkodliwe, lub sond, które zazwyczaj wywołują zachowanie awersyjne, stwierdziliśmy, że larwy Drosophila rozwijają nadwrażliwość mechaniczną (zarówno allodynię, jak i hiperalgezję) po uszkodzeniu tkanki. Tak więc mechaniczne sondy i testy, które tutaj ilustrujemy, będą prawdopodobnie ważnymi narzędziami do analizy podstawowych molekularnych/genetycznych mechanizmów nadwrażliwości mechanicznej.

Wprowadzenie

Larwy Drosophila wykazują charakterystyczne awersyjne zachowanie toczenia, gdy są wystawione na działanie różnych szkodliwych bodźców: thermal1, mechanical2, oraz chemical3. Takie zachowanie wyraźnie różni się od normalnej lokomocji. Tutaj opisujemy ulepszony test mechaniczny, który można wykorzystać do oceny mechanicznej nocycepcji i mechanicznego uczulenia.

W niedawnym badaniu, wyprodukowaliśmy włókna podobne do von Freya przy użyciu drutów nitinolowych4. Sondy wywierające różne siły i ciśnienia zostały wykonane poprzez zmianę długości i średnic drutów nitinolowych tworzących każdą sondę. Sondy mechaniczne zostały skalibrowane, a zmierzone wartości siły (w miliniutonach, mN) zostały przeliczone na ciśnienie (kilopaskale, kPa), w oparciu o powierzchnię końcówki każdej sondy4. Niestandardowe wyprodukowanie sond mechanicznych pozwoliło nam na generowanie ciśnień od podprogowych (≤200 kPa) do ponadprogowych (225 kPa do 5318 kPa), co w zasadzie może być korzystne dla badania nadwrażliwości mechanicznej. Korzystając z tych ulepszonych mechanicznych włókien podobnych do von Freya, wykazaliśmy, że ciśnienie4, w przeciwieństwie do poprzednio badanego force2,5,6 koreluje bardziej konsekwentnie z awersyjną reakcją behawioralną u larw Drosophila. Opisany tutaj ulepszony test mechaniczny pomógł również zidentyfikować konserwatywną kinazę tyrozynową związaną z receptorem czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), sygnalizującą szlak regulujący mechaniczną nocycepcję u much i szczurów4.

Mechaniczna allodynia i hiperalgezja, dwie formy nadwrażliwości, są stosunkowo słabo zbadane u larw Drosophila, w porównaniu do termicznych (ciepło i zimno) i chemicznych modalności sensorycznych3,7,8,9,10. Jest to prawdopodobnie spowodowane brakiem specyficznych sond mechanicznych, które obejmują zarówno bodźce nieszkodliwe, jak i zakres wysokiej szkodliwości2,5,6. Normalnie nieszkodliwy bodziec, który wywołuje typowe awersyjne zachowanie toczenia po tym, jak larwy Drosophila doświadczą uszkodzenia tkanki3,7 jest określany jako allodynia. Przesadna reakcja toczenia się na typowo szkodliwy bodziec jest znana jako hiperalgezja7. Szkodliwe bodźce definiuje się jako te, które wywołują uszkodzenie tkanek i mogą aktywować nocyceptory11. Szkodliwe bodźce dostarczane larwom Drosophila uszkadzają albo barierę naskórkową, obwodowe nocyceptywne neurony czuciowe3,4,7, albo jedno i drugie.

W tym artykule pokazujemy, jak samodzielnie wytwarzać i kalibrować mechaniczne sondy podobne do von Freya, które są odpowiednie dla larw Drosophila. Ponadto pokazujemy, jak używać tych sond do oznaczania mechanicznych odpowiedzi nocyceptywnych u larw Drosophila. Wreszcie, dalej demonstrujemy użyteczność tych sond, używając ich do wykazania obecności nadwrażliwości mechanicznej, zarówno allodynii, jak i hiperalgezji, po uszkodzeniu tkanek u larw Drosophila (patrz Reprezentatywne wyniki).

Protokół

1. Konstrukcja sondy mechanicznej

  1. Przytnij każdy filament nitinolowy (Rysunek 1B), prostopadle do jego długiej osi, na określoną długość (Rysunek 1M–N) za pomocą małego przecinaka do drutu (Rysunek 1C). Filamenty są dostępne w trzech różnych, wstępnie ustawionych średnicach (Rysunek 1B).
    UWAGA: Podane tutaj długości są wskazówką, jak osiągnąć przybliżone wskazane ciśnienia, przy użyciu podobnego protokołu do budowy mocowania. Ostatecznie, niezależnie od długości naciętego filamentu i głębokości otworu w mocowaniu, filamenty muszą zostać zmierzone/skalibrowane na wadze, aby uzyskać dokładną wartość siły/nacisku.
  2. Zbadaj końcówkę żarnika pod mikroskopem stereoskopowym, aby upewnić się, że nie pozostały żadne ostre lub nieregularne krawędzie, ponieważ mogą one spowodować uszkodzenie tkanki skóry larw i zakłócić kalibrację.
  3. Ręcznie wygładź ostre krawędzie sondy mechanicznej za pomocą kamienia do ostrzenia, aż nie utrzymają się żadne ostre nierówności (Rysunek 1D).
  4. Zrób otwór na końcu drewnianego patyczka do lodów (Rysunek 1E) za pomocą igły podskórnej (patrz Tabela Materiałów). Wbij igłę co najmniej w połowie wysokości patyczka do lodów (Rysunek 1E). W ten sposób powstaje komora do wprowadzania filamentu nitinolowego.
  5. Nałóż klej do drewna na pojedynczy filament nitinolowy (Rysunek 1F) i włóż pokryty klejem filament do szczeliny igły w drewnianym patyczku do lodów (Rysunek 1G). Pozostawić do wyschnięcia na ~5 godzin.
  6. Skalibruj każdą sondę mechaniczną, dociskając ją do skali, aż sonda mechaniczna się wygnie (Rysunek1 H–L). Jest to punkt maksymalnej siły, który można zapisać w gramach. W zależności od średnic filamentu (wstępnie ustawionych) i długości (określonych przez użytkownika) można generować pełen zakres sił i ciśnień.
  7. Przelicz masę zapisaną w kroku 1.6 na siłę w miliniutonach (mN), korzystając ze wzoru f = ma (siła jest równa masie pomnożonej przez przyspieszenie grawitacyjne). f: siła; m: masa; a: przyspieszenie grawitacyjne (9,8 m/s2) (Rysunek 1M).
  8. Na koniec przelicz obliczoną siłę na ciśnienie (siła/powierzchnia) w kilopaskalach (kPa), dzieląc zmierzoną siłę przez powierzchnię końcówki filamentu (Rysunek 1M). Aby obliczyć powierzchnię, przelicz średnicę różnych włókien nitinolowych z cali (0,04", 0,06" i 0,08") na centymetry. Następnie πr2 (gdzie, r = promień włókna nitinolowego) określa obszar (patrz Rysunek 1M). Przygotowanie wielu sond przy użyciu włókien o różnych średnicach i długościach wygeneruje pełny zestaw obejmujący zakres reakcji dla larw Drosophila (zestaw próbek pokazany w Rysunek 1N).
    UWAGA: Sprawdzaj każdą sondę mechaniczną co najmniej co 3–4 tygodnie. Gdy ciśnienie odbiega o więcej niż ± 3% od pierwotnego pomiaru, należy wyprodukować nową sondę mechaniczną.

2. Przygotowanie larw

  1. Wyhodować szczep kontrolny (w1118) larwalne potomstwo lub larwy zawierające transgeny ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (do wizualizacji uszkodzenia neuronów czuciowych) na standardowym pokarmie w inkubatorze w temperaturze 25 °C. Zazwyczaj stada są rutynowo utrzymywane w temperaturze 18 °C, ale zarówno rodzice, jak i potomstwo larwalne są hodowane w temperaturze 25 °C na standardowym pokarmie z mąki kukurydzianej w celach eksperymentalnych.
    UWAGA: Dorosłe muchy (pięć samców i dziesięć samic, stosunek 1:2) są trzymane w fiolkach na muchy, aby umożliwić złożenie jaj, przez około 24 godziny. Czas po złożeniu jaj (AEL) rozpoczyna się od momentu usunięcia dorosłych osobników.
  2. Zbierz trzecie larwy w stadium rozwojowym, po około 96 godzinach składania jaj, delikatnie spryskując wodą z kranu miękki pokarm dla much zawierający larwy. Wędrujące larwy, które opuściły pokarm lub które mają zawsze przednie lub tylne przetchlinki, są zbyt duże/stare do tego testu. Larwy drugiego stadium (~ mniej niż 4 mm długości) są zbyt małe.
  3. Wysypać zawartość pokarmu dla miękkich much na czystą szalkę Petriego o standardowych rozmiarach (100 mm x 15 mm).
  4. Za pomocą kleszczy oddziel larwy średniej wielkości w trzecim stadium (patrz Ryc. 2A) od mniejszych (w drugim stadium i wcześnie w trzecim stadium) lub większych (późnych lub wędrujących w trzecim stadium). Zaleca się delikatną manipulację kleszczami, aby uniknąć uszkodzenia tkanek larw.
    UWAGA: Przenoszenie za pomocą kleszczy opiera się głównie na napięciu wody, a nie na wywieraniu nacisku na larwy ostrzami kleszczy. Alternatywą dla użycia kleszczy do manewrowania larwami są miękkie pędzle. W przypadku każdego z tych narzędzi użytkownik powinien ćwiczyć przenoszenie zwierząt, aby nie spowodować niezamierzonego uszkodzenia tkanek, które mogłoby skomplikować pomiary behawioralne.
  5. Przenieść larwy środkowego trzeciego stadium rozwojowego, za pomocą kleszczy, na małą szalkę Petriego (30 mm x 15 mm) zawierającą małą zatyczkę z pokarmem dla much, zwilżoną wodą o temperaturze pokojowej. Trzymaj larwy na małej szalce Petriego do czasu przeprowadzenia doświadczeń, ale nie dłużej niż 20 min.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, przeniesienie 20-30 larw do korka pokarmowego da odpowiednią liczbę na 20 minut testów behawioralnych.

3. Mechaniczny test nocycepcji

  1. Umieść larwę w środkowym trzecim stadium rozwojowym (za pomocą kleszczy) na cienkiej podkładce z czarnego lub ciemnego winylu pod mikroskopem stereoskopowym w jasnym polu. Ciemny kolor zapewnia kontrast, który poprawia wizualizację larwy. Lepiej jest mieć swobodnie poruszający się kawałek ciemnego winylu, ponieważ pozwala to użytkownikowi wyrównać larwę bez dotykania jej lub ranienia.
  2. Umieść światła światłowodowe między soczewkami obiektywu mikroskopu a czarną lub ciemną podkładką winylową; pozwoli to na odpowiednie oświetlenie o wysokim kontraście, aby zobaczyć larwę.
  3. Odrzuć larwy, które nie wykazują normalnej lokomocji po przeniesieniu do poduszki. Mogą one zakłócać normalną nocyceptywną reakcję behawioralną. Informacje na temat normalnej lokomocji znajdują się na filmie 1.
  4. Wytrzyj ręcznikiem papierowym nadmiar wody otaczającej larwę, która może spowodować, że larwa unosi się na podkładce winylowej.
  5. Zorientuj larwę, przesuwając ciemną podkładkę winylową. Głowa/pysk larwy powinny być skierowane w lewo, jeśli jesteś praworęczny i odwrotnie, jeśli jesteś leworęczny (Rysunek 2A–B).
  6. Zastosuj wybraną sondę mechaniczną, zwykle na 1-2 s, na tylną grzbietową stronę larwy w przybliżeniu w segmencie brzusznym A8 (patrz Rysunek 2B), aż sonda ugnie się i wywoła wcześniej zmierzony nacisk ( Rysunek 2C). Ważne jest, aby sonda naciskała na grzbietową powierzchnię larwy i ściskała larwy w leżącej poniżej opuszki w miejscu kontaktu sondy.
    UWAGA: W miejscu styku między końcówką włókna nitinolowego a grzbietowym naskórkiem-naskórkiem, sondy poniżej 2,300 kPa, głównie zginają się bez penetracji naskórka i leżących pod nim tkanek. Takie sondy rzadko wpływają na śmiertelność larw4. Przy wyższych ciśnieniach (>5 000 kPa) sondy zarówno wyginają się, jak i czasami wnikają w naskórek i leżące pod nimi tkanki. Nakłuwanie larw upośledza przeżywalność larw4 i, jeśli zostaną zaobserwowane, larwy te są zazwyczaj odrzucane z analizy behawioralnej.
  7. Rejestruj reakcję behawioralną dla każdej larwy. Pozytywna odpowiedź nocyceptywna (Wideo 2) jest wskazana, jeśli larwa wykazuje pełny obrót o 360° wzdłuż osi swojego ciała w ciągu 3 sekund. Inne reakcje (próba skrętu, szybkie czołganie się i poruszanie) są uważane za negatywne dla celów tego testu.
    UWAGA: Larwy stymulowane podprogowym bodźcem mechanicznym (200 kPa) nie wywoływały typowej reakcji nocyceptywnej lub toczenia (Wideo 3). Niektóre larwy wykazywały szybkie reakcje do przodu lub lekkie reakcje dotykowe, takie jak zmiany kierunku ruchu.
  8. Odrzucić larwę i przygotować następną larwę do oznaczenia, powtarzając kroki od 3.1 do 3.7.
  9. Powtarzaj kroki 3.1–3.7, aż do osiągnięcia pożądanej liczby larw (tutaj użyto od trzech do sześciu zestawów n = 10 larw dla każdej sondy).
    UWAGA: W przypadku stosowania sond mechanicznych o niższym ciśnieniu (174–462 kPa) test zajmie więcej czasu na larwę. Dzieje się tak, ponieważ końcówka dłuższych włókien oscyluje bardziej, co utrudnia szturchnięcie larwy w środku segmentu A8. W przypadku tych sond konieczna jest praktyka.

4. Mikroskopia konfokalna do oceny morfologii neuronów

  1. Umieść larwę (o genotypie ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP w celu oznakowania neuronów czuciowych) uprzednio stymulowaną włóknem nitinolowym w komorze eteryzacyjnej wewnątrz słoika Coplin zawierającego zlewkę o pojemności 10 ml z wacikiem nasączonym ~ 1 ml eteru dietylowego. Pozostaw larwę w komorze na ~5 min.
    UWAGA: Szczegółowy protokół etheryzacji znajduje się w poprzednim badaniu opublikowanym przez naszą grupę12.
  2. Delikatnie opłucz larwę z komory eteryzacji na małą szalkę Petriego.
  3. Przygotuj jedno szkiełko mikroskopowe, dwa małe szkiełka nakrywkowe (22 x 22 mm) i jedno długie szkiełko nakrywkowe (22 x 54 mm) (patrz tabela materiałów).
  4. Dodaj małe krople roztworu eteru: oleju (stosunek eteru etylowego do roztworu oleju halowęglowego 1:5, patrz Tabela materiałów) na oba końce szkiełka, a następnie umieść małe szkiełka nakrywkowe na małych kropelkach. Taki układ tworzy niewielką szczelinę, w której larwa może się zmieścić.
    UWAGA: Dociśnij małe szkiełka nakrywkowe do szkiełka mikroskopu, aż będzie trudno je zsunąć.
  5. Dodaj kilka kropli roztworu eteru: oleju na środku szkiełka mikroskopowego, a następnie umieść larwę za pomocą kleszczy na środku szkiełka mikroskopowego (między małymi szkiełkami nakrywkowymi). Upewnij się, że przednio-tylna oś larwy jest równoległa do krótszego boku szkiełka, a strona grzbietowa jest skierowana do góry.
  6. Przykryj larwy długim szkiełkiem nakrywkowym umieszczonym na wierzchu larwy i dwoma mniejszymi szkiełkami nakrywkowymi.
    UWAGA: Obficie dociśnij długie szkiełko nakrywkowe, aż larwa będzie prawie płaska.
  7. Zobrazuj segment A8 larwy za pomocą mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów) przy użyciu długości fali lasera 488 (GFP).
    UWAGA: Zobrazuj larwę natychmiast, ponieważ znieczulenie za pomocą eteru szybko zaniknie (~5-10 min), a larwa obudzi się i poruszy, co skomplikuje dalsze obrazowanie.
  8. Rejestruj obrazy Z-stack w rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli za pomocą suchego obiektywu z 20-krotną aperturą numeryczną (NA) 0,7 przy 1-krotnym zoomie, kroku co 1,5 μm.

5. Kwantyfikacja uszkodzeń tkanek

  1. Zbierz i przekonwertuj obrazy stosu serii Z, z sekcji 4.8, na pojedynczą projekcję Z (spłaszczenie wielu obrazów wykonanych w różnych płaszczyznach ogniskowych w jeden obraz kompozytowy). Można to zrobić za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania (np. Olympus Fluoview) lub dowolnej równoważnej platformy open source, np. Fiji/Image J. Zapisz pojedynczą projekcję Z w formacie TIFF.
  2. Otwórz program do analizy obrazu Fiji/ImageJ.
  3. Kliknij Plik na pasku menu i wybierz Otwórz w wyświetlonym oknie.
  4. Wybierz zapisaną projekcję pojedynczego obrazu, zapisaną w formacie TIFF, która ma być analizowana.
  5. Kliknij Edytuj na pasku menu i wybierz opcję Odwróć w wyświetlonym oknie.
  6. Kliknij Obraz na pasku menu, a następnie wybierz Dostosuj, w wyświetlonym oknie, a na koniec wybierz opcję Jasność/Kontrast.
  7. Wybierz opcję Kształt odręczny na pasku narzędzi, aby zmierzyć obszar przerwy (jeśli istnieje).
  8. Kliknij Analizuj na pasku menu i wybierz opcję Zmierz. Spowoduje to wyświetlenie obszaru przerwy lub rany.

Wyniki

Opracowaliśmy spersonalizowane sondy mechaniczne, wykorzystując włókna nitinolowe (Rysunek 1A,N), w celu wywoływania zachowań indukowanych mechanicznie, a następnie wygenerowaliśmy pełną krzywą zależności odpowiedzi behawioralnej od dawki, stosując zarówno niebolesne, jak i bolesne sondy mechaniczne o różnym natężeniu (Rysunek 2D), co wykazało, że sondy te mogą być używane do badania bazowej nocycepcji mechanicznej (w przypadku braku urazu).

Wyniki naszego testu behawioralnego wykazały, że sondy wywierające ciśnienie poniżej 200 kPa (~1,57 mN) (Rycina 1M), zastosowane u larw Drosophila, nie wywołują awersyjnej reakcji toczenia (Rycina 2D oraz Wideo 3). Zgodnie z oczekiwaniami, te podprogowe lub nienoksyczne sondy mechaniczne (175 kPa lub 200 kPa) nie spowodowały widocznych uszkodzeń tkanki neuronalnej (Rycina 2E). Ponieważ nie wywołują one uszkodzeń, takie sondy mogą być użyteczne do oceny allodynii mechanicznej (nadwrażliwości na bodźce mechaniczne, które normalnie nie są noksyczne). Z kolei sondy nadprogowe lub noksyczne (od 462 kPa do 5 116 kPa) wywołały nasiloną odpowiedź behawioralną (Rycina 2D) w sposób zależny od dawki — wyższe ciśnienia wywoływały silniejsze reakcje behawioralne. Jak przewidywano, nadprogowe ciśnienie mechaniczne wywołało również zależne od dawki uszkodzenie tkanki samych obwodowych neuronów sensorycznych (Rycina 2E). Zmierzona powierzchnia uszkodzenia tkanki (w µm2 ± odchylenie standardowe) uzyskana z czterech larw dla każdej grupy wynosiła: 2 051,03 ± 703,81 (462 kPa), 5 102,29 ± 1 004,67 (2 283 kPa) oraz 12 238,83 ± 3 724,11 (5 116 kPa). Zatem ciśnienia większe lub równe 462 kPa (~63 mN), które wywołują awersyjną reakcję toczenia (u 25% lub więcej larw) i powodują widoczne uszkodzenie tkanki neuronalnej (Rycina 2E), mogą być odpowiednie do badania hiperalgezji mechanicznej (nadwrażliwości na bodźce mechaniczne, które normalnie są noksyczne). Nocyceptywne sondy mechaniczne (≥462 kPa) zawsze powodują uszkodzenie tkanki (n = 10, ocena jakościowa), ale nie zawsze wywołują awersyjną reakcję toczenia.

Aby ocenić nadwrażliwość mechaniczną (allodynię i hiperalgezję), zastosowaliśmy uznany model larwalny Drosophila w badaniu sensytyzacji nocyceptywnej, w którym do indukowania uszkodzeń tkanek wykorzystuje się promieniowanie ultrafioletowe (UV)7,12. Test ten pomógł w analizie genetycznych i komórkowych mechanizmów termicznej nadwrażliwości nocyceptywnej8,9,10,13,14,15. Aby ustalić, czy traktowanie UV wywołuje allodynię mechaniczną, larwy kontrolne (w1118) w połowie trzeciego stadium larwalnego poddano pozornemu naświetlaniu lub naświetlaniu UV (15–20 mJ/cm2) (Rycina 3A). Następnie, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h i 24 h po zabiegu, przeprowadzono testy behawioralne larw przy użyciu sondy mechanicznej o sile zazwyczaj podprogowej (200 kPa, 1.57 mN). Około 20% larw zareagowało już 2 h po traktowaniu UV, natomiast 50% zareagowało po 4 h, w porównaniu do odpowiednio 6,6% i 8,3% zwierząt poddanych pozornemu naświetlaniu UV (Rycina 3B). Wskazuje to, że indukowane promieniami UV uszkodzenie tkanek powoduje allodynię mechaniczną 4 h po naświetlaniu. W późniejszych punktach czasowych (8 h, 16 h i 24 h) odpowiedź behawioralna larw traktowanych UV mieściła się w zakresie 16%–20% osobników reagujących (średnia dla n = 3–6 zestawów po 10 larw), co było nieco wyższe (ale nie statystycznie istotne) w porównaniu z grupą kontrolną poddaną pozornemu naświetlaniu (zakres 3%–6% osobników reagujących, średnia dla n = 3–6 zestawów po 10 larw) (Rycina 3B).

Aby zbadać hiperalgezję mechaniczną, zastosowano ciśnienie powyżej progu (462 kPa, 3,63 mN), które zazwyczaj wywołuje awersyjną reakcję toczenia u ~20% larw (Rycina 2D) i powoduje uszkodzenie tkanki neuronalnej (Rycina 2E). Sondę o ciśnieniu 462 kPa przykładano do strony grzbietowej larw z indukowanym promieniami UV uszkodzeniem tkanki lub bez takiego uszkodzenia (Rycina 3A). Stwierdzono, że larwy badane po 4 h, 8 h i 16 h od naświetlania UV wykazywały znaczący wzrost awersyjnej reakcji toczenia, przy czym szczyt behawioralnej nadwrażliwości wystąpił po 4 h (~60% osobników reagujących); zwierzęta poddane pozornej irradiacji UV wykazały reakcję awersyjną na poziomie ~27% (Rycina 3C). Podobnie jak w przypadku allodynii mechanicznej, reakcja behawioralna zwierząt traktowanych UV po 8 h, 16 h i 24 h (w zakresie 36%–42%) była statystycznie nieodróżnialna od reakcji larw nieleczonych (w zakresie 20%–26%). Larwy w późnym stadium trzeciego zaskóczenia wykazywały lekki spadek bazowej reakcji behawioralnej w porównaniu ze stadium środkowym trzeciego zaskóczenia. Hipotezą jest, że może to wynikać albo ze zwiększonego rozmiaru larw (Rycina 2A), albo ze zwiększonej grubości kutykuli pokrywającej ciało. Fakt ten mógłby wyjaśniać, dlaczego na późniejszym etapie rozwoju traktowanie UV nie indukuje silniejszej sensytyzacji mechanicznej, jakiej obserwowano 4 h po naświetlaniu UV.

Wzięte razem, nasze wyniki wskazują, że larwy Drosophila rozwijają zarówno allodynię mechaniczną, jak i hiperalgezję mechaniczną po uszkodzeniu tkanek wywołanym promieniowaniem UV. Szczytowy czas występowania allodynii i hiperalgezji mechanicznej jest taki sam i przypada na 4 h po zabiegu UV; jednak hiperalgezja mechaniczna wykazuje bardziej wyraźny ogon czasowy, ponieważ wolniej powraca do poziomu bazowego w porównaniu z allodynią mechaniczną.

Eksperyment z włóknami nitinolowymi z wykorzystaniem sond mechanicznych, pomiarów siły i wyników ciśnienia.
Rycina 1: Opracowanie narzędzia typu Von Frey do oceny nocycepcji mechanicznej u larw Drosophila. (A) Zdjęcie sondy mechanicznej używanej do badania nocycepcji mechanicznej u larw Drosophila. (B) Włókna nitinolowe i ich względne średnice przedstawione w skali. (C) Zdjęcie ukośnych obcinaczek do drutu używanych do przycinania włókien nitinolowych. (D) Wygładzanie ostrych krawędzi przyciętego włókna nitinolowego za pomocą kamienia ostrzącego. (E) Igła hipodermiczna używana do wykonania otworu w drewnianym uchwycie sondy z patyczka do lodów. Końcówka igły musi sięgnąć co najmniej połowy wysokości patyczka, aby zapewnić bezpieczne osadzenie włókna. (F–G) Mocowanie włókna nitinolowego poprzez wklejenie go w drewniany uchwyt z patyczka do lodów z otworem wlotowym. (H–L) Kalibracja sond mechanicznych poprzez dociskanie ich do wagi. (M) Wartości siły (w mN) i ciśnienia (w kPa) generowane przez różne sondy mechaniczne. Długość każdego włókna nitinolowego użytego do konstrukcji sond (P1–P10; P: sonda) podano w centymetrach (cm). (N) Zdjęcie kompletnego zestawu sond mechanicznych, w zakresie od 174 kPa do 5 116 kPa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Etapy rozwoju owada; schemat anatomiczny; eksperyment z sondą mechaniczną; wykres ciśnienia względem toczenia.
Rysunek 2: Test nocycepcji mechanicznej: włókna typu Von Frey generują krzywą zależności dawka-odpowiedź dla awersyjnego zachowania toczenia i powodują uszkodzenia tkanki neuronów sensorycznych. (A) Zdjęcia różnych stadiów (drugiego i trzeciego stadium larwalnego) larw Drosophila. Pasek skali: 2 mm. (B) Schemat widoku grzbietowego larwy Drosophila w trzecim stadium. Czerwona kropka wskazuje segment brzuszny, w którym stosowana jest sonda mechaniczna. T: segment torakalny; A: segment brzuszny. Oznaczone są inne punkty orientacyjne anatomii. (C) Schemat testu: sonda mechaniczna jest przykładana do strony grzbietowej larwy, aż do momentu wygięcia jej o powierzchnię poniżej, a następnie utrzymywana przez 2 s. Jeśli ciśnienie jest wystarczająco wysokie, po zwolnieniu wywołuje to awersyjną reakcję toczenia. (D) Behawioralna zależność dawka-odpowiedź; każda niebieska kropka reprezentuje procent larw w grupie 10 zwierząt, które zareagowały awersyjnym toczeniem na stymulację mechaniczną. Wykres skrzypcowy przedstawiający procent awersyjnego zachowania toczenia wywołanego przez różne sondy mechaniczne. kPa: kilopaskale. Wykresy pudełkowe reprezentują medianę (zielony), a wąsy (czerwony) reprezentują decyle 10. i 90. (E) Uszkodzenie tkanki: larwy w trzecim stadium (o genotypie ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP w celu znakowania nocyceptywnych neuronów sensorycznych) poddano badaniu sondą w grzbietowym segmencie A8 przy wskazanych ciśnieniach. Następnie zbadano fluorescencyjnie znakowane sparowane neurony sensoryczne klasy IV ddaC (przez linię środkową grzbietu) (patrz sekcje 4 i 5). Białe obszary (czerwone gwiazdki) reprezentują przerwy lub uszkodzenia tkanki. Pasek skali: 100 μm. Na panelu B larwa jest pokazana w widoku grzbietowym, natomiast w C w widoku bocznym. Sondy mechaniczne dociskane do grzbietowej strony kutykula-epidermis larwy powodują powstanie wgłębienia w punkcie styku końcówki sondy i obszarach otaczających. Ciągła czarna linia wygięta w stronę brzuszną to góra wgłębienia, natomiast przerywana szara linia boczna reprezentuje bok i dno wgłębienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Układ do napromieniowania UV i wpływ na allodynię/hiperalgezję mechaniczną; wykresy odpowiedzi behawioralnej.
Rycina 3: Nadwrażliwość mechaniczna po uszkodzeniu UV. (A) Schemat planu eksperymentalnego w celu zbadania sensytyzacji. Larwy w połowie trzeciego stadium rozwojowego poddano procedurze pozorowanej (brak UV) lub napromieniowaniu UV. Następnie przeprowadzono test nocycepcji mechanicznej w różnych punktach czasowych (2 h, 4 h, 8 h, 16 h i 24 h) po procedurze pozorowanej lub napromieniowaniu. (B) Allodynia mechaniczna: Procent larw wykazujących awersyjne zwijanie się po stymulacji bodźcem mechanicznym, który normalnie jest podprogowy lub nieszkodliwy (200 kPa, 1.57 mN), w określonych punktach czasowych po procedurze pozorowanej lub napromieniowaniu UV. (C) Hiperalgezja mechaniczna: Procent larw wykazujących awersyjne zwijanie się po stymulacji bodźcem mechanicznym, który normalnie jest ponadprogowy lub szkodliwy (462 kPa, 3.63 mN), w określonych punktach czasowych po procedurze pozorowanej lub napromieniowaniu UV. Słupki błędu wskazują średnią +/- SEM. Do analizy statystycznej zastosowano dwustronny nieparzysty test t: *p < 0.05, **p < 0.01; ns: brak istotności statystycznej. Każda czerwona kropka na panelach B i C reprezentuje średnią proporcję 10 larw, n = 3–6 zestawów na punkt czasowy/warunek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wideo 1: Normalna lokomocja larw Drosophila. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Film 2: Noksycyjna stymulacja mechaniczna larw Drosophila. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 3: Podprogowa stymulacja mechaniczna larw Drosophila. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Dyskusja

Zmodyfikowaliśmy uznany test mechaniczny 1,2,16 przy użyciu niestandardowych sond mechanicznych wykonanych z włókien nitinolowych. Ten stop metalu pozwala nam na stosowanie włókien o mniejszej średnicy, które są odpowiednie do wielkości larw Drosophila. Żyłki na bazie żyłek wędkarskich zdominowały do tej pory dziedzinę mechanicznej nocycepcji muchowej 2,5,6,16. Nasze filamenty nitinolowe utrzymują swój kształt i zmierzone ciśnienie przez około ~3-5 miesięcy (z naszego doświadczenia). Zmieniając długość i średnicę włókien nitinolowych, użytkownik może generować szeroki zakres ciśnień od podprogu do prawie całkowitej reakcji toczenia. W szczególności wykonanie sond podprogowych jest prostsze w przypadku włókien nitinolowych o mniejszej średnicy. Korzystając z tych sond, odkryliśmy, że nacisk, a nie siła, wywołuje bardziej spójne nocyfencyjne reakcje behawioralne4. Pokazujemy tutaj, używając dobrze znanego modelu uczulenia nocyceptywnego indukowanego promieniowaniem UV 7,10,13, że włókna te są również użytecznym narzędziem do badania nadwrażliwości mechanicznej - allodynii i hiperalgezji.

Wcześniejsze badania z użyciem sond mechanicznych wykonanych z żyłki wędkarskiej doprowadziły do pewnej zmienności w reakcji behawioralnej 2,6,16,17. Składa się na to kilka czynników. Po pierwsze, ponieważ ciśnienie jest ważną zmienną, kluczowe znaczenie ma polerowanie końcówki filamentu, tak aby była zaokrąglona i nie miała żadnych ostrych krawędzi. Po drugie, podawanie wartości ciśnienia, a nie tylko siły, jest ważne dla odtwarzalności eksperymentów, ponieważ różne sondy mechaniczne, które generują podobne siły, mogą wywoływać różne ciśnienia4. Po trzecie, bardzo ważne jest, aby zastosować tylko jedną stymulację mechaniczną na larwę za pomocą szkodliwych sond, ponieważ takie sondy powodują zależne od dawki uszkodzenie tkanki na poziomie neuronów naskórkowych4 i czuciowych (ryc. 2E). Drugi lub kolejny szkodliwy bodziec mechaniczny, po wywołaniu uszkodzenia tkanki, może prawdopodobnie upośledzać funkcję dotkniętych obwodowych neuronów czuciowych i wywoływać zmienioną reakcję behawioralną. W innym badaniu larwy stymulowane dwukrotnie szkodliwymi sondami mechanicznymi w większości wykazywały zwiększoną reakcję behawioralną5, co sugeruje rozwój ostrego uczulenia mechanicznego (hiperalgezja), które może wynikać z uszkodzenia tkanek wywołanego pierwszym szkodliwym bodźcem mechanicznym. I odwrotnie,inni autorzy 6 zgłaszali mieszaną (zwiększoną lub zmniejszoną) reakcję behawioralną, co wskazuje, że zmieniona reakcja behawioralna może być spowodowana uszkodzeniem/dysfunkcją tkanki neuronalnej. Stymulacja każdej larwy tylko raz eliminuje możliwe różnice w reakcjach behawioralnych wynikające z uczulenia lub uszkodzenia tkanek. Po czwarte, mechanicznie stymulowaliśmy segment A8, który jest bardziej tylny niż poprzednie badania (preferowane obszary A3–A4)2,5,16. Sondy o ciśnieniu od ~3900 kPa do 5300 kPa zastosowane do segmentu A2 lub A8 nie wykazały żadnych różnic behawioralnych4. Ponadto A8, w porównaniu do A2–A4, jest łatwiejszy do stymulacji za pomocą sond mechanicznych, które generują niższe ciśnienie (<300 kPa), ponieważ larwa jest cieńsza w tym obszarze, a tym samym łatwiej się ściska. Inne badania wykazały, że szkodliwa mechaniczna stymulacja tylnego końca larwy (dostarczana przez sztywną szpilkę owada, trzymaną kleszczami) w większości wywoływała lokomocję do przodu, a nie reakcję awersyjną lub toczenia18. Ta odmienna reakcja behawioralna może wynikać z różnic we właściwościach użytych materiałów (giętkie włókno nitinolowe kontra nieściśliwa szpilka owada) lub z różnych nacisków wywieranych na larwy (wartość nacisku szpilki na owady nie została podana).

Opracowanie mechanicznego testu nocycepcji dla larw Drosophila umożliwiło odkrycie, że różne mechaniczne kanały jonowe czuciowe i obwody neuronalne pośredniczą w mechanicznej nocycepcji 5,6,16,17. Jednak badania nad nadwrażliwością mechaniczną (allodynia i hiperalgezja) pozostają w tyle w porównaniu z uwrażliwieniem na inne modalności czuciowe - ciepło 7,8,10,13,14, zimno 9 i chemiczną 3. Opóźnienie to może być częściowo spowodowane brakiem odpowiednich sond mechanicznych, które mogą generować pełny zakres odpowiedzi obejmujący ciśnienie podprogowe do ponadprogowego. Szczególne znaczenie, zwłaszcza dla oceny allodynii mechanicznej, mają sondy podprogowe, które nie wywołują awersyjnej reakcji toczenia u nieuszkodzonych larw. Znaczenie naszych ulepszonych sond mechanicznych polega na tym, że można je wytwarzać tak, aby obejmowały nieszkodliwe bodźce (podpróg ~174 kPa–200 kPa) lub niski do wysokiego zakresu szkodliwości (suprathreshold ~225 kPa do ~5,116 kPa). Tutaj pokazujemy za pomocą włókien nitinolowych von Freya, że larwy Drosophila rozwijają zarówno allodynię mechaniczną, jak i hiperalgezję mechaniczną po naświetlaniu promieniowaniem UV. Uczulenie mechaniczne wykazuje pewne różnice w porównaniu z uczuleniem termicznym. Zarówno początek, jak i szczyt uczulenia mechanicznego jest wcześniejszy (~4 h) w porównaniu z uczuleniem termicznym (cieplnym) (~8 h dla hiperalgezji i ~24 h dla allodynii)7. Ponadto współcześnie występuje allodynia mechaniczna i hiperalgezja (oba osiągają szczyt po ~4 godzinach). Ponadto, podczas gdy uczulenie na ciepło (allodynia i hiperalgezja) ustępuje całkowicie w późniejszych punktachczasowych 7, nadwrażliwość mechaniczna wykazywała długi ogon, który pozostawał nieco powyżej linii podstawowej. Uczulenie na zimno u Drosophila polega na zmianie zachowań wywołanych zimnem9 i pojawieniu się nowych zachowań wywołanych zimnem – zjawisku, którego nie obserwuje się przy stymulacji mechanicznej. Te różnice w początku, czasie trwania i obserwowanych zachowaniach sugerują, że każda modalność sensoryczna może być kontrolowana przez różne szlaki sygnałowe. Połączenie opisanego tutaj testu uczulającego z potężnymi narzędziami genetycznymi dostępnymi u Drosophila powinno pozwolić na precyzyjną analizę genetyczną obserwowanej nadwrażliwości mechanicznej (allodynia i hiperalgezja).

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Thomasowi Wangowi za opracowanie prototypu filamentów von Freya, Patrickowi J. Huangowi za ulepszenie testu mechanicznego za pomocą sondy, Bloomington Drosophila Stock Center za kontrolę (>w1118) i ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP, a także członkom laboratorium Galko za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Prace te były wspierane przez R21NS087360 i R35GM126929 MJG.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ZlewkaFisher Scientific02-540CZlewka o pojemności 10 ml. Każdy podobny pojemnik się nada.
(Arkansas) kamienny ławkaDan' s OsełkaSKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-CSłuży do wygładzania wszelkich nierówności końcówek drutu nitinolowego. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/
Mikroskop konfokalnyOlympusFV1000Każdy równoważny mikroskop konfokalny zrobi to
Coplin JarFisher Scientific08-816https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816
Eter dietylowyFisher ScientificE138-500Do znieczulania larw.
eteryzacjiJest to domowa komora dostosowana do potrzeb klienta. Szczegóły jego budowy można znaleźć w naszym poprzednio opublikowanym artykule12. Zadaniem komory eteryzacyjnej jest umożliwienie przedostania się oparów eteru dietylowego, ale zapobieganie ucieczce larw.
Światłowód światłowodowySchott AGA08575Schott Podwójne kleszcze na gęsiej szyi 23 cale
Precyzyjne narzędzie naukoweFS-1670Do przenoszenia larw
KlejAleenaNie dotyczyAleene's® Klej do drewna, dawniej nazywany (Aleene's All-Purpose Wood Glue)
https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue
Uchwytny uchwytLoew CornellN/ALoew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 sztuk.
Olej halowęglowy 700SigmaH8898-100ML
Igła podskórna 30G 1/2 "LFisher ScientificNC1471286BD Precisionglide & igły strzykawkowe, przekrój 30, L 1/2 cala. Służy do wykonania otworu w drewnianym uchwycie na druty nitinolowe
351007SokółPetrydysz60 mm x 10 mm Polistyren Mikroskop Petridish
(Zeiss) Stemi 2000Carl Zeiss, Inc.NT55-605Każdy równoważny mikroskop zrobi to
Szkło pokrywowe mikroskopu 22x22Fisher12-545-B
Szkło pokrywowe mikroskopu 22x40Corning2980-224Tickness 1 1/2
Szkiełka mikroskopoweGlobe Scientific Inc.1358Y
Mini nóż kątowyFisher ScientificS43981Do cięcia filamentów nitinolowych
Filamenty nitinolowe, Średnice: 0,004", 0,006", 0,008"Mailin CoN/AZamówiono piętnaście sztuk o każdej średnicy o długości 12 cali.
https://malinco.com/
Kawałek czarnego winyluOffice DepotN/AUżywamy małego kawałka winylu wyciętego ze spoiwa. Ciemny kolor zapewnia kontrast. Mały element umożliwia orientację larwy
sokółPetridish35100835 mm x 10 mm Polistyrenowa
szpatułkaFisher Scientific21-401-10Dwustronna mikrostożkowa szpatułka ze stali nierdzewnej. Służy do umieszczania żywności na szalce Petriego
WipesFisher Scientific06-666AKimpes KMTECH, Science Brand. Służy do suszenia larw nadmiaru wilgoci.
W1118Bloomington Drosophila Stock Center3605Szczep kontrolny do testów behawioralnych
ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFPBloomington Drosophila Stock Center8749Szczep do fluorescencyjnego znakowania neuronów md klasy IV
Komora Duży Mały Petridish

Bibliografia

  1. Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. Painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
  2. Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).
  3. Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. J. An assay for chemical nociception in Drosophila larvae. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 374 (1785), 20190282(2019).
  4. Lopez-Bellido, R., et al. Growth factor signaling regulates mechanical nociception in flies and vertebrates. Journal of Neuroscience. 39 (30), 6012-6030 (2019).
  5. Hu, C., et al. Sensory integration and neuromodulatory feedback facilitate Drosophila mechanonociceptive behavior. Nature Neuroscience. 20 (8), 1085-1095 (2017).
  6. Kim, S. E., Coste, B., Chadha, A., Cook, B., Patapoutian, A. The role of Drosophila Piezo in mechanical nociception. Nature. 483 (7388), 209-212 (2012).
  7. Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (10), 799-806 (2009).
  8. Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Current Biology. 21 (18), 1525-1533 (2011).
  9. Turner, H. N., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Injury-induced cold sensitization in Drosophila larvae involves behavioral shifts that require the TRP channel Brv1. PloS One. 13 (12), 0209577(2018).
  10. Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. eLife. 4, 10735(2015).
  11. Cervero, F., Merskey, H. What is a noxious stimulus. Pain Forum. 5 (3), 157-161 (1996).
  12. Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3837(2012).
  13. Follansbee, T. L., et al. Drosophila nociceptive sensitization requires BMP signaling via the canonical SMAD pathway. Journal of Neuroscience. 37 (35), 8524-8533 (2017).
  14. Im, S. H., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Drosophila insulin receptor regulates the persistence of injury-induced nociceptive sensitization. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), (2018).
  15. Jo, J., et al. Drosophila caspase activity is required independently of apoptosis to produce active TNF/Eiger during nociceptive sensitization. Cell Death & Disease. 8 (5), 2786(2017).
  16. Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Current Biology. 17 (24), 2105-2116 (2007).
  17. Guo, Y., Wang, Y., Wang, Q., Wang, Z. The role of PPK26 in Drosophila larval mechanical nociception. Cell Reports. 9 (4), 1183-1190 (2014).
  18. Takagi, S., et al. Divergent connectivity of homologous command-like neurons mediates segment-specific touch responses in Drosophila. Neuron. 96 (6), 1373-1387 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Włókna nitinolowewłókna Von Freykrzywa dawka-odpowiedźallodynia mechanicznahiperalgezja mechanicznauszkodzenie tkankistereomikroskoppomiar siły
Ulepszony test i narzędzia do pomiaru mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.