Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe profilowanie metaboliczne w celu udoskonalenia modelu mikroalg

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61913

⸱

4 grudnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), New York University Abu Dhabi Research Institute, 2Department of Biology, United Arab Emirates University, 3Laboratory of Algal, Systems, and Synthetic Biology (LASSB), Division of Science and Math, New York University Abu Dhabi, 4Department of Marine Science, Ocean College, Zhejiang University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje użycie platformy technologicznej mikromacierzy fenotypowej (PM) do zdefiniowania wymagań metabolicznych Chlamydomonas reinhardtii, zielonej mikroalgi, i udoskonalenia istniejącego modelu sieci metabolicznej.

Streszczenie

Modele metaboliczne są rekonstruowane na podstawie dostępnych adnotacji genomu organizmu i dostarczają narzędzi predykcyjnych do badania procesów metabolicznych na poziomie systemu. Modele metaboliczne w skali genomu mogą zawierać luki, a także reakcje, które nie są zweryfikowane eksperymentalnie. Zrekonstruowane modele nowo wyizolowanych gatunków mikroglonów spowodują słabości wynikające z tych luk, ponieważ zwykle dostępnych jest niewiele dowodów biochemicznych na metabolizm takich izolatów. Technologia mikromacierzy fenotypowych (PM) jest skuteczną, wysokoprzepustową metodą, która funkcjonalnie określa komórkową aktywność metaboliczną w odpowiedzi na szeroki wachlarz metabolitów wejściowych. Połączenie wysokoprzepustowych testów fenotypowych z modelowaniem metabolicznym może umożliwić szybką rekonstrukcję lub optymalizację istniejących modeli sieci metabolicznych poprzez dostarczenie dowodów biochemicznych wspierających i rozszerzających dowody genomowe. Praca ta pokaże zastosowanie testów PM do badania mikroglonów na przykładzie modelu zielonej mikroglonów Chlamydomonas reinhardtii. Dowody eksperymentalne dla ponad 254 reakcji uzyskanych przez PM wykorzystano w tym badaniu w celu rozszerzenia i udoskonalenia modelu sieci metabolicznej C. reinhardtii w skali genomu, iRC1080, o około 25 procent. Stworzony tutaj protokół może być wykorzystany jako podstawa do funkcjonalnego profilowania metabolizmu innych mikroalg, w tym znanych mutantów mikroalg i nowych izolatów.

Wprowadzenie

Optymalizacja metabolizmu glonów w celu zwiększenia i stabilnej produkcji docelowych metabolitów wymaga opracowania złożonych strategii inżynierii metabolicznej poprzez analizy sieci metabolicznych na poziomie systemów. Modele sieci metabolicznych mogą kierować racjonalnymi projektami szybkiego rozwoju strategii optymalizacji1,2,3,4. Chociaż zsekwencjonowano około 160 gatunków mikroglonów5, według naszej wiedzy dostępne są tylko 44 modele metabolizmu glonów4,6,7. Ze względu na trudności w uzyskaniu wysokoprzepustowych danych fenotypowych metabolicznych do eksperymentalnej walidacji informacji genomicznej, rekonstrukcja wysokiej jakości modeli sieciowych pozostaje w tyle za szybkim rozwojem sekwencjonowania genomu glonów.

C. reinhardtii jest atrakcyjnym modelowym systemem do badań na bazie glonów. Gatunek ten może rosnąć fotoautotroficznie lub heterotroficznie i jest szeroko stosowany jako organizm modelowy w badaniach podstawowych i stosowanych. Jego sekwencja genomu została opublikowana w 2007 roku8, a następnie zrekonstruowano modele metaboliczne w skali genomu dla gatunku9,10,11. Model w skali genomu C. reinhardtii (iRC1080) został zrekonstruowany przez Changa i wsp.10 na podstawie dowodów genomicznych i literatury (obejmujących ~250 źródeł). Ma 1 706 metabolitów z 2 190 reakcjami10; Nie można było jednak zweryfikować kompletności modelu poza dostępnymi w tym czasie dowodami eksperymentalnymi.

Technologia mikromacierzy fenotypowych (PMs) to platforma o wysokiej przepustowości, która może dostarczyć informacji o profilowaniu metabolicznym mikroorganizmów heterotroficznych, jak również komórek hodowli tkankowej. W szczególności może być wykorzystany do wypełnienia luki w wiedzy na temat fenotypu i genotypu w mikroalgach, jak po raz pierwszy zgłoszono dla Chlamydomonas reinhardtii12, a następnie dla gatunku Chloroidium13 i Chlorella14. Badając reakcje komórek na tysiące metabolitów, cząsteczek sygnałowych, osmolitów i cząsteczek efektorowych, testy PM mogą zapewnić funkcjonalne profilowanie metaboliczne i zaoferować wgląd w funkcję, metabolizm i wrażliwość środowiskową15,16,17. W szczególności testy PM wykrywają wykorzystanie metabolitów w komórkach w 96-dołkowych mikropłytkach z różnymi składnikami odżywczymi, metabolitami lub osmolitami zawartymi w każdym dołku. Co więcej, możliwe jest również oznaczanie cząsteczek bioaktywnych, takich jak antybiotyki i hormony. Zgodnie z intensywnością produkcji koloru przez redukcję NADH barwnika redoks na bazie tetrazolium, metaboliczne wykorzystanie substratów jest oceniane pod kątem oddychania komórkowego15,16,17. Eksperymenty na 96-dołkowych mikropłytkach mogą być monitorowane i wyznaczane automatycznie w czasie za pomocą platformy phenotype microarray instrument (PMI). Dwadzieścia 96-dołkowych mikropłytek zostało zaprojektowanych tak, aby reprezentowały wspólny zestaw metabolitów do badania fenotypów komórkowych w celu wykorzystania źródeł węgla, azotu, siarki i fosforu, a także różnych efektów osmotycznych / jonowych i pH. Technologia PM została z powodzeniem wykorzystana do aktualizacji i unowocześnienia wielu istniejących modeli metabolicznych mikroorganizmów w skali genomu15,16,17,18.

Protokół i dane pokazane tutaj są oparte na wcześniej opublikowanych pracach Chaiboonchoe et al.12 Prezentowana praca szczegółowo opisuje wykorzystanie metody testu PM do scharakteryzowania fenotypów metabolicznych mikroalg i rozszerzenia istniejącego modelu metabolizmu glonów C. reinhardtii, jak również do kierowania rekonstrukcją nowych modeli metabolicznych.

Protokół

1. Eksperymenty z mikromacierzami fenotypowymi

  1. Szczep C. reinhardtii CC-503 należy uzyskać w Centrum Zasobów Chlamydomonas na Uniwersytecie Minnesoty, USA (https://www.chlamycollection.org).
  2. Hoduj komórki w świeżych pożywkach tris-acetate-phosphate (TAP) class19 o końcowych stężeniach 400 μg/ml timentyny, 50 μg/ml ampicyliny i 100 μg/ml kanamycyny (w celu zahamowania wzrostu bakterii) poniżej 400 mikromolowych fotonów/m2s, w temperaturze 25 °C, przez dwa dni do połowy fazy logarytmicznej.
  3. Odwirować kulturę w temperaturze 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 22 °C i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu.
  4. Przygotować świeżą pożywkę TAP zawierającą 0,1% barwnika fioletu tetrazolowego "D".
    UWAGA: Zmodyfikuj pożywkę TAP na tym etapie, aby wykluczyć niektóre składniki odżywcze w zależności od kategorii metabolitów testowanych na każdej płytce (np. wyklucz chlorek amonu dla płytek źródłowych azotu).
  5. Zawiesić osad w świeżej pożywce TAP przygotowanej (od kroku 1.2) do końcowego stężenia 1 x 106 komórek/ml.
  6. Użyj płytek do oznaczania związków chemicznych (źródła węgla, źródła azotu, płytki ze źródłami fosforu i siarki oraz źródła azotu peptydowego).
  7. Zaszczepić 100 μl podwielokrotności pożywki zawierającej komórki do każdego dołka na płytkach testowych.
    UWAGA: Upewnij się, że zduplikowałeś testy.
  8. Umieść komórki na płytkach z ekstraktem drożdżowym/peptonem i wykonaj barwienie metodą Grama, jak w Smith i wsp.20 przed i po teście w celu monitorowania skażenia bakteryjnego.
  9. Włóż płytki do oznaczania związków chemicznych do systemu czytnika mikropłytek.
  10. Inkubować wszystkie płytki w temperaturze 30 °C przez okres do 7 dni i zaprogramować system czytnika mikropłytek tak, aby odczytywał zmianę koloru barwnika co 15 minut.
    UWAGA: Ponieważ większość czytników mikropłytek nie zapewnia źródła ciągłego światła podczas inkubacji, glony powinny być w stanie przeprowadzić oddychanie heterotroficzne.

2. Analiza danych

  1. Eksportuj surowe dane kinetyczne z czytnika mikropłytek jako pliki CSV, które następnie zostaną wykorzystane jako dane wejściowe do pakietu Omnilog Phenotype Microarray (OPM) w R. Dodaj informacje biologiczne jako metadane (np. oznaczenie szczepu, pożywka wzrostowa, temperatura itp.).
    1. Korzystając z oprogramowania do konwersji danych PM Kinetic, załaduj pliki danych D5E i przekonwertuj je na pliki OKA za pomocą następujących wierszy poleceń w oprogramowaniu do analizy kinetycznej PM:
      Obciążenie | Importuj (zlokalizuj folder z plikami OKA) | Wypełnianie filtrów | Import | Dodaj wszystkie płyty | Zamykać.
      Eksport | wybierz odczytane dane (Kinetic), wybierz format (CSV) (Nagłówek tabeli) i wybierz płyty (każda płyta (indywidualne pliki)) | Eksport danych | Zapisać.
    2. Aby przeprowadzić analizę danych Phenotype Microarray (PM), użyj pakietu oprogramowania OPM21,22, który działa w środowisku oprogramowania R. Pakiet, samouczek i dokumentacja referencyjna są dostępne pod adresem: http://www.goeker.org/opm/. W programie RStudio, graficznym interfejsie użytkownika dla języka R, zainstaluj pakiet opm i jego zależności przy użyciu następujących poleceń:
      źródło (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R)
      Biblioteka (OPM)
    3. Przejdź do katalogu zawierającego pliki CSV z danymi kinetycznymi i zaimportuj dane za pomocą funkcji read_opm:
      x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
    4. Agreguj i dyskretynuj dane kinetyczne za pomocą estymacji parametrów krzywej.
      Dla (i in 1 :length(x)) {
      x[[i]] br /> x[[i]] <- do_disc(x[[i]], odcięcie = FAŁSZ)
      }
      #Collection metadanych
      metadane <- collect_template(".")
      metadata$Szczep <- c("BLANK","CC- 503")
      for (I in 1 :length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = metadane, zamień = PRAWDA)}
    5. Użyj funkcji xy_plot, aby odwzorować pomiary oddychania (lub wzrostu) (oś y) w funkcji czasu (oś x) dla badanych płytek 96-dołkowych.
      print (xy_plot(x[[ 1 ]], include ="Napięcie", theor.max = FAŁSZ))
    6. Wizualizuj dane w postaci mapy cieplnej za pomocą funkcji level_plot, aby umożliwić szybki przegląd porównawczy danych kinetycznych.
      level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt("color.borders"), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", space = "Lab", bias = 0.7 , num.colors = 200 L)
    7. Wyodrębnij ważne informacje biologiczne, parametry krzywej, z surowych krzywych kinetycznych i uwzględnij fazę opóźnienia (λ), szybkość wzrostu (μ), maksymalne oddychanie komórek (A) i obszar pod krzywą (AUC)21. W celu zidentyfikowania metabolitów dodatnich należy użyć wartości A kontroli ujemnej, która reprezentuje reaktywność abiotyczną barwnika z pożywką, oprócz ślepej próby każdej płytki mikrodołkowej jako wartości odejmowania tła. Funkcja extract służy do uzyskiwania parametru A.
      opm_opt("curve.param")
      param <- extract (x, as.labels = list("Szczep")))

3. Identyfikacja reakcji i genów związanych z nowymi metabolitami

  1. Przeszukaj KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/kegg/) i MetaCyc (http://metacyc.org/), aby zidentyfikować numery Komisji Enzymów (EC) dla reakcji z użyciem metabolitów znalezionych w macierzach związków chemicznych23,2423,24.
  2. Użyj zidentyfikowanych numerów EC jako podstawy wyszukiwania w wielu dostępnych zasobach adnotacji glonów, takich jak Joint Genome Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) i recenzowane publikacje23,25,26,27.
  3. Jeśli zapytanie nie zwraca żadnych dowodów genetycznych dla danego numeru EC, zidentyfikuj odpowiednie powiązane białka w innych organizmach, zaczynając od gatunków najbliższych C. reinhardtii, a następnie przeprowadź wyszukiwanie oparte na profilu przy użyciu serwera NCBI PSI-BLAST z ustawieniami domyślnymi i użyj nieredundantnych białek (nr) w C. reinhardtii (taxid:3055) w celu zidentyfikowania genów kandydujących związanych z reakcją12.
  4. Ręcznie selekcjonuj trafienia PSI-BLAST z wartościami E < 0,05 pod kątem istotności dla wyszukiwanego numeru EC, wysyłając zapytanie o te trafienia BLAST za pośrednictwem serwerów przewidywania domen białek EMBL-EBI, Pfam (http://pfam.xfam.org/search) lub InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/). Należy pamiętać, że dwa ostatnie skany są krytycznymi krokami w celu zapewnienia identyfikacji prawidłowej aktywności enzymatycznej białka.

4. Udoskonalanie i ocena modelu

  1. Użyj najnowszego programu COBRA Toolbox v.3.028 w MATLAB29,30 w celu wykonania następujących kroków w celu udoskonalenia modelu. Program COBRA Toolbox można zainstalować, wykonując czynności opisane w następujący sposób: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . Można też zauważyć, że COBRA Toolbox jest również implementowany w innych językach programowania typu open source, takich jak Python (COBRApy31) i jest dostępny pod adresem: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .
    1. Po zainstalowaniu programu COBRA Toolbox v.3.0 otwórz program MATLAB i wykonaj następujące polecenie, aby zainicjować przybornik:
      initCobraSkrzynka narzędziowa;
    2. Dodaj zidentyfikowane reakcje wraz z powiązanymi z nimi genami do modelu metabolicznego, takiego jak iRC1080, za pomocą funkcji COBRA Toolbox addReaction i changeGeneAssociation. Przejdź do katalogu zawierającego model IRC1080, pobrany z http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 i wykonaj następujące polecenia, aby załadować model, zmienić jego nazwę i dodać nową reakcję oraz skojarzony z nią gen.
      Load('iRC 1080 .mat')
      modelNowy = iRC 1080;
      modelNew = addReaction(modelNowy, 'D-ALA 2' , ...
      {'d-ala[c]' , 'atp[c]' , ...
      'D-aladata[c]' , 'adp[c]' , 'pi[c]' , ...
      'h[c]' },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false);
      modelNEW = changeGeneAssociation(modelNowy, ...
      "D-ALA 2","au.g 14655 _t 1");
    3. W niektórych przypadkach, gdy metabolit nie jest wytwarzany wewnątrzkomórkowo, ale jest pobierany z pożywki, należy dodać do modelu reakcje transportu nowych metabolitów. Te reakcje transportu reprezentują bierną dyfuzję metabolitu z pożywki zewnątrzkomórkowej do cytozolu. Ponadto należy dodać odpowiednią reakcję sztucznej wymiany za pomocą funkcji addExchangeRxn w celu wprowadzenia lub wyprowadzenia metabolitu do podłoża zewnątrzkomórkowego.
      modelNew = addReaction(modelNowy, 'CYCPt' , ...
      {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)'
      modelNew = addExchangeRxn(modelNowy, 'cycp[e]' ,- 1000 ,1000 );
    4. Przetestuj zachowanie nowego modelu wynikowego, np. iBD1106, przeprowadzając analizę bilansu strumienia (FBA) przy użyciu funkcji optimizeCbModel w jasnych i ciemnych warunkach w celu maksymalizacji biomasy jako funkcji celu. Dla wzrostu światła ustaw dolną i górną granicę reakcji świetlnych PRISM solar lito na 646,07 (maksymalna szybkość). W przypadku ciemnego wzrostu ustaw granice wszystkich reakcji światła PRISM na zero. Użyj zdefiniowanej wcześniej funkcji Biomasa10 dla wzrostu w ciemnych i jasnych warunkach. Roztwór FBA wygeneruje dwa wektory odpowiadające strumieniom reakcji (solution.v) i zmniejszonym kosztom (solution.w), a także jeden wektor odpowiadający cenom ukrytym metabolitów (solution.y).
      %Symuluj wzrost w warunkach oświetleniowych:
      modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ ...
      % 'PRISM_solar_litho' , ...
      'PRISM_solar_exo' , ...
      'PRISM_incandescent_ 60 W' , ...
      'PRISM_fluorescent_cool_ 215 W' , ...
      'PRISM_metal_halide' , ...
      'PRISM_high_pressure_sodium' , ...
      'PRISM_growth_room' , ...
      'PRISM_white_LED' , ...
      "PRISM_red_LED_array_ 653 nm" , ...
      "PRISM_red_LED_ 674 nm" , ...
      'PRISM_fluorescent_warm_ 18 W' , ...
      'PRISM_design_growth' , ...
      }, 0, 'b' );
      modelNew = changeObjective(modelNowy, 'BIOMASS__mixo');
      FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNowy, 'max');
    5. Powtórz krok 4.1.4 dla iRC1080, aby porównać roztwory FBA otrzymane dla iBD1106 z roztworami uzyskanymi dla iRC1080.
    6. Dostępnych jest wiele metod COBRA, które można wykorzystać do porównywania modeli (np. analiza zmienności strumienia, badania delecji genów, analizy odporności, przewidywania podziału strumienia, FBA, pobieranie próbek itp.). Szczegółowe samouczki można znaleźć na stronie https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. W tym miejscu przedstawiono przykład, w którym model iRC1080 jest porównywany z jego udoskonaloną wersją, iBD1106, poprzez uzyskanie cen równoległych (wrażliwości obiektywnej funkcji biomasy na zmiany zmiennej systemowej) metabolitów uwzględnionych w każdym modelu.
      Należy uzyskać ceny równoległe metabolitów:
      shadowPrices = tabela(modelNowy.mets, ...
      modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);

Wyniki

Przesiewowe badanie fenotypowe za pomocą mikrotablic dla modelowej glonu Chlamydomonas reinhardtii
Testy PM oceniają zdolność glonu do wykorzystywania różnych źródeł węgla, azotu, siarki i fosforu w pożywce minimalnej. W niniejszym opisie metod zademonstrowano, w jaki sposób testy PM zostały wykorzystane do identyfikacji metabolizmu węgla i azotu. Kinetykę wykorzystania węgla i azotu mierzono za pomocą czytnika mikropłytek. Dane analizowano przy użyciu oprogramowania PMI. Zbiorcza kinetyka wybranych płytek testowych PM (PM01 i PM03) przedstawiona jest na Rysunku 1. „Wykresy xy” przedstawiają pomiary respiracji w czasie dla testów na płytkach 96-dołkowych, gdzie oś y i oś x reprezentują odpowiednio wartości surowych pomiarów oraz czas. Dane przekształcono w mapę ciepła w celu porównawczej analizy zestawu danych kinetycznych.

Schemat udoskonalania metabolicznej sieci w skali genomu z wykorzystaniem danych PM (Rycina 2>) ilustruje, w jaki sposób integracja wysokoprzepustowych testów PM z dowodami eksperymentalnymi uzyskanymi z poszukiwań genomowych może rozszerzyć model sieci metabolicznej.

Aby określić powtarzalność danych PM uzyskanych z płytek PM01 - 04 i PM10, przeprowadzono analizę regresji liniowej w celu zestawienia danych z dwóch niezależnych eksperymentów powtórzonych (Rysunek 3). Rysunek 3 pokazuje, że większość danych była niemal identyczna, gdyż znajdują się one na linii 45°, przy obecności jedynie kilku wartości odstających, a współczynnik determinacji R2 wyniósł 0,9. Spójność i powtarzalność eksperymentów dla tej algi zostały potwierdzone przez ten wykres.

Identyfikacja nowych metabolitów
Analiza PM zidentyfikowała 662 metabolity na siedmiu płytkach; PM01-PM04 i PM06-PM08, podczas gdy chromatografia gazowa z detekcją czasu przelotu (GC-TOF) zidentyfikowała 77 metabolitów32 (Rysunek 4). Porównując te dwa zestawy z 1068 metabolitami uwzględnionymi w iRC1080, tylko sześć metabolitów pokrywało się we wszystkich trzech zestawach, a 149 pokrywało się pomiędzy iRC1080 a PM. Wynik ten wykazuje, że platforma do profilowania metabolicznego może być istotnym źródłem nowych informacji metabolicznych.

Kwas octowy był jedynym źródłem węgla wykrytym na płytce PM01 jako wspomagające źródło węgla po odjęciu sygnału tła. Wynik ten jest zgodny z literaturą33 i wykazuje swoistość testów PM. Testy PM ujawniły nowe źródła siarki, fosforu i azotu, które C. reinhardtii może wykorzystywać do wzrostu. Metabolitami siarki były siarczan, tiosiarczan, tetrationian oraz DL-lipoamid. Źródłami fosforu były tiofosforan, ditiofosforan, kwas D-3-fosfoglicerynowy oraz cysteamino-S-fosforan. Metabolitami będącymi źródłami azotu były L-aminokwasy i D-aminokwasy, w tym rzadziej występujące aminokwasy: L-homoseryna, kwas L-piroglutaminowy, metyloamina, etyloamina, etanolamina i kwas D,L-α-aminomasłowy, a także 108 dipeptydów i pięć tripeptydów (Tabela 1). Wszystkie 128 nowo zidentyfikowanych metabolitów przeszukano w bazach KEGG i MetaCyc pod kątem powiązanych reakcji, numerów EC i szlaków metabolicznych.

Nowe 128 metabolitów powiązano z 49 unikalnymi numerami EC. Z tych numerów 15 EC powiązano z dowodami genomicznymi, korzystając z pięciu źródeł, w tym: Phytozome wersja 10.0.234, JGI wersja 435, AUGUSTUS 5.0 oraz 5.210, adnotacji od Manichaikul et al.36 oraz KEGG13. Metabolity bez dowodów genomicznych wprowadzono do witryny Universal Protein Resource (UniProt, http://www.uniprot.org/)37,38, gdzie znaleziono powiązane z nimi sekwencje u innych organizmów. Homologiczne sekwencje u C. reinhardtii zidentyfikowano, przeprowadzając Position-Specific Iterated BLAST (PSI-BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) z witryny NCBI, biorąc pod uwagę wyłącznie sekwencje, które wygenerowały istotne dopasowania (E-value <0,005).

Udoskonalenie modelu
Reakcje związane z 128 nowymi metabolitami, wraz z ich genami kodującymi, zostały dodane do modelu iRC1080, co poszerzyło sieć. Powstały model iBD1106 uwzględnia 2 444 reakcje, 1 959 metabolitów i 1 106 genów (Tabela 2). Nowo dodane 254 reakcje obejmowały 20 reakcji utleniania aminokwasów, 108 reakcji hydrolizy dipeptydów, pięć reakcji hydrolizy tripeptydów oraz 120 reakcji transportu, kodowanych przez cztery geny (Cre02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.1, Cre12.g486350.t1.3).

Łącznie 113 nowo dodanych reakcji odpowiada za hydrolizę dipeptydów i tripeptydów. Hydroliza dipeptydów i tripeptydów jest powiązana z dwoma genami: jednym dla dipeptydów (Cre02.g078650.t1.3) oraz jednym dla tripeptydów (Cre16.g675350.t1.3).

W odniesieniu do źródeł fosforu, z genem JLM_162926 powiązano reakcję hydrolizy cysteaminy-S-fosforanu do cysteaminy i fosforanu.

W celu określenia przedziałów komórkowych, w których zachodzą nowe reakcje, zastosowano narzędzie WoLF PSORT39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) oraz wyniki przedstawione przez Ghamsari et al.35. Na podstawie analizy sekwencji białek związanych z nowymi reakcjami, program WoLF PSORT wskazał cytozol jako przedział komórkowy, w którym przebiegają te reakcje.

Wygenerowany model metaboliczny może zawierać luki, gdy informacje biochemiczne są niekompletne. W takich przypadkach stosuje się gapFind, komendę COBRA. Wyświetla ona luki pierwotne (root gaps) i pozwala zidentyfikować wprowadzenie nowych luk w nowym modelu. Metabolity, których nie można wytworzyć w modelu metabolicznym, nazywa się lukami pierwotnymi40,41. Analiza luk pierwotnych wykazała, że modele iRC1080 i iBD1106 zawierają te same 91 luk. Świadczy to o tym, że dodanie nowych metabolitów i powiązanych z nimi reakcji nie wprowadziło żadnych dodatkowych luk pierwotnych. Należy zaznaczyć, że metoda fenotypowania zastosowana w niniejszym protokole nie zamyka luk pierwotnych, ponieważ oryginalne metabolity tworzące luki pierwotne nie posiadają mechanizmów transportu lub produkcji, które nie były uwzględnione w testach fenotypowania. Przeprowadzono analizę bilansu strumieni (flux balance analysis), aby zbadać zachowanie metaboliczne iBD1106 w warunkach oświetlenia i ciemności; odpowiednio (bez octanu) i (z octanem). Algorytm maksymalizuje reakcje prekursorów biomasy dla funkcji celu (wzrost biomasy). Aby ocenić wpływ każdego metabolitu na określoną funkcję celu, obliczono „ceny cienia” (shadow prices) dla wszystkich metabolitów. Cena cienia metabolitu definiowana jest jako zmiana funkcji celu w stosunku do zmian strumienia tego metabolitu30,42. Analiza cen cienia pozwala określić, czy metabolit występuje w „nadmiarze”, czy też „ogranicza” funkcję celu, np. produkcję biomasy. Ujemne lub dodatnie wartości ceny cienia wskazują metabolity, których dodanie zmniejszy lub zwiększy wartość funkcji celu. Wartości ceny cienia równe zero wskazują metabolity, które nie wpłyną na funkcję celu. Porównanie cen cienia między iBD1106 a iRC1080 na Rysunku 5 pokazuje, że dla większości metabolitów nie zaobserwowano istotnych zmian; jednakże różnice stwierdzono w 105 i 70 przypadkach odpowiednio w warunkach wzrostu na świetle i w ciemności. Tabela 4 zawiera przykłady takich metabolitów.

Dane z przebiegu czasowego i mapy ciepła przedstawiające wzrost bakterii i produkcję octanu; analiza danych eksperymentalnych.
Rysunek 1: Profilowanie za pomocą mikrotablic fenotypowych C. reinhardtii. Przedstawiono wykresy XY oddychania oraz wykresy poziomów dla płytek testowych PM01 (źródła węgla; A, C) i PM03 (źródła azotu; B, D). Rysunek stanowi macierz 8x12, w której każda komórka reprezentuje dołek na płytce, a tym samym dany metabolit lub środowisko wzrostu. Wewnątrz każdej komórki lub reprezentacji dołka krzywe przedstawiają konwersję barwnika poprzez redukcję (oś y) jako funkcję czasu (oś x). W każdej komórce pokazano krzywe oddychania PM z dołków zawierających szczep CC-503 oraz dołków kontrolnych (blank), które są rozróżnione kolorami (kolor morski reprezentuje dołki kontrolne, a kolor fioletowy reprezentuje CC-503). Wykres poziomów przedstawia każdą krzywą oddychania jako cienką poziomą linię zmieniającą kolor (lub pozostającą bez zmian) w czasie. Zmiany kolorów na mapie ciepła obejmują zakres od jasnożółtego (oddychanie w niewielkim stopniu lub brak oddychania) do ciemnopomarańczowego lub brązowego (nastąpiło znaczące oddychanie). Przedstawiono metabolity wykorzystywane przez C. reinhardtii (CC-503) oraz płytki kontrolne. Rysunek pochodzi z wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe et al.12 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat szlaku metabolicznego przedstawiający transport związków, absorpcję NADH oraz etapy doprecyzowania sieci.
Rysunek 2: Procedura doprecyzowania metabolicznej sieci w skali genomu z wykorzystaniem danych PM. Po uzyskaniu pozytywnego wyniku testu nowego związku w analizie PM, jego numer Komisji Enzymologicznej (EC), reakcja oraz szlak są identyfikowane na podstawie dostępnych baz danych, np. KEGG i MetaCyc. Następnie, jeśli są dostępne, z zasobów genomicznych i adnotacyjnych wyodrębniane są dowody genomiczne, które stanowią łącznik między genotypem a fenotypem. W przypadku braku bezpośrednich dowodów genomicznych, sekwencja białka jest identyfikowana na podstawie numerów EC, a dowody genetyczne są określane za pomocą PSI-Blast. Zrekonstruowana sieć metaboliczna jest następnie doprecyzowana w oparciu o nowo zidentyfikowane związki, jednak dopiero po etapie kontroli jakości, który polega na kwerendzie domen białkowych w odpowiednich bazach danych. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe et al.12 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres rozrzutu, analiza korelacji, R²=0,9049, wykres porównawczy powtórzonych wartości PMI.
Rycina 3: Powtarzalność testów PM. Wartości PMI zbierano przez okres 168 godzin, a maksymalne wartości PMI naniesiono na wykres dla dwóch powtórzonych badań. Każda oś reprezentuje maksymalne wartości PMI dla każdego badania (oś x to jedno badanie powtórzone, a oś y drugie). Powtórzone wartości są równoodległe od każdej z osi. Każdy punkt reprezentuje pojedynczą wartość maksymalną. Regresja liniowa została wykonana za pomocą oprogramowania arkuszowego, a wynikowy współczynnik determinacji (R2) jest przedstawiony na wykresie. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe et al.12 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Diagram Venna porównujący pokrycie i unikalne elementy zbiorów danych GC-TOF, Biolog oraz iRC1080.
Rysunek 4: Diagram Venna metabolitów. Diagram Venna wylicza metabolity zidentyfikowane za pomocą płytek PM, modelu metabolicznego iRC1080 oraz eksperymentów z wykorzystaniem chromatografii gazowej z detekcją czasu przelotu (GC-TOF). Każde koło wskazuje całkowitą liczbę metabolitów występujących w danej metodzie badania. Jednocześnie obszary wspólne reprezentują liczbę metabolitów wspólnych dla tych metod. Model metaboliczny iRC1080 zawiera łącznie 1 068 unikalnych metabolitów. Metodą GC-TOF zidentyfikowano łącznie 77 metabolitów32, natomiast za pomocą płytek PM zidentyfikowano łącznie 662 metabolity. Rysunek pochodzi z wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe et al. 12 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie wykresów polarnych zestawów danych iRC1080 i iBD1106; wykres przedstawiający wariancję danych.
Rysunek 5: Ceny cieniowe metabolitów w iRC1080 i iBD1106 w różnych warunkach dla maksymalizacji biomasy. Każde koło na „wykresach radarowych” odpowiada wartości ceny cieniowej, natomiast każda linia wychodząca z centrum wykresu wskazuje konkretny metabolit. (A) Ceny cieniowe i zachowania metaboliczne iRC1080 oraz iBD1106 w warunkach wzrostu przy świetle; (B), odmienne zachowania metaboliczne iRC1080 i iBD1106 w warunkach wzrostu w ciemności. Rysunek pochodzi z wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe et al. 12 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Odczynnik chemiczny BiologEC*Adnotacja genowaPSI-BLAST
Fosforan cysteaminy-S3.1.3.1JLM_1629261,2,3,4
Tetrationian1.8.2.2nieistotna wartość E
1.8.5.2nieistotna wartość E
D-Alanina1.4.1.1XP_001700222.1
1.5.1.22negatywny wynik ręcznej kontroli jakości
2.1.2.7nieistotna wartość E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
2.3.2.10nieistotna wartość E
2.3.2.14nieistotna wartość E
2.3.2.16nieistotna wartość E
2.3.2.17nieistotna wartość E
2.3.2.18nieistotna wartość E
2.6.1.21negatywny wynik ręcznej kontroli jakości
3.4.13.22XP_001698572.1, XP_001693532.1, XP_001701890.1, XP_001700930.1
3.4.16.4Chlre2_kg.scaffold_ 140000391,2,3
3.4.17.8negatywny wynik ręcznej kontroli jakości
3.4.17.13nieistotna wartość E
3.4.17.14nieistotna wartość E
4.5.1.2nieistotna wartość E
6.1.1.13negatywny wynik ręcznej kontroli jakości
6.1.2.1negatywny wynik ręcznej kontroli jakości
6.3.2.4au.g14655_t11,2,3
6.3.2.10negatywny wynik ręcznej kontroli jakości
6.3.2.16nieistotna wartość E
6.3.2.35nieistotna wartość E
D-Asparagina1.4.5.1nieistotna wartość E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
3.1.1.96nieistotna wartość E
2.3.1.36nieistotna wartość E
1.4.99.1XP_001692123.1
3.5.1.77e_gwW.1.243.11,2
3.5.1.81nieistotna wartość E
5.1.1.10negatywny wynik ręcznej kontroli jakości
Kwas D-asparaginowy6.3.1.12nieistotna wartość E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
Kwas D-glutaminowy1.4.3.7nieistotna wartość E
1.4.3.3nieistotna wartość E
D-Lizyna5.4.3.4nieistotna wartość E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
6.3.2.37negatywny wynik ręcznej kontroli jakości
D-Seryna2.7.11.8nieistotna wartość E
2.7.11.17Cre12.g486350.t1.31,2,3,4
3.4.21.78negatywny wynik ręcznej kontroli jakości
3.4.21.104negatywny wynik ręcznej kontroli jakości
4.3.1.18g6244.t14negatywny wynik ręcznej kontroli jakości
6.3.2.35nieistotna wartość E
6.3.3.5nieistotna wartość E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
D-Walina1.21.3.1negatywny wynik ręcznej kontroli jakości
6.3.2.26negatywny wynik ręcznej kontroli jakości
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
Kwas L-piroglutaminowy
Tiofosforan
Ditiofosforan
Etyloamina6.3.1.6
Kwas D,L-a-aminomasłowy2.1.1.49nieistotna wartość E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
Dipeptyd3.4.13.18Cre02.g078650.t1.31
Tripeptyd3.4.11.4Cre16.g675350.t1.31

Tabela 1: Lista zidentyfikowanych pozytywnych metabolitów wykorzystania substratów (C, P, S, N) nieobecnych w modelu metabolicznym iRC1080. *Reakcja nie została uwzględniona, jeśli nie zidentyfikowano odpowiedniego genu. 1Phytozome wersja 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii). 2JGI wersja 4 35. 3Augustus wersja 510. 4KEGG (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html). 5JGI wersja 3.136. Tabela pochodzi z wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe et al. 12

ModelReakcjeMetabolityGeny
iRC10802,1911,7061,086
iBD11062,4451,9591,106

Tabela 2: Skład iRC1080 oraz iBD1106.  Tabela ta pochodzi z wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe et al. 12

Kategoria lub klasa reakcjiLiczba reakcji
Aminokwasy20
Dipeptydy108
Tripeptydy5
Reakcja transportowa120

Tabela 3Podsumowanie nowych reakcji w iBD1106. Tabela ta pochodzi z wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe i wsp. 12

Warunki wzrostuMetabolitNazwaiRC1080iBD1106
4r5au4-(1-D-Ribitylamino)-5-aminouracyl00.168
5aprbu5-Amino-6-(5'-fosforibitylamino)uracyl-0.0090.158
Światłopa1819Z18111Z1-(9Z)-oktadecenoylo,2-(11Z)-oktadecenoylo-sn-glicerol-3-fosforan-0.009-0.65
Ciemność4abut4-aminobutanoian0.18-0.05

Tabela 4: Przykład istotnych cen cień dla iRC1080 oraz iBD1106. Tabela ta pochodzi z wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe et al. 12

Dyskusja

Fenotypowanie metaboliczne zielonej mikroalgi, C. reinhardtii, opisano tutaj przy użyciu wysokoprzepustowych płytek do oznaczania PM i niezmodyfikowanego PMI. Testy wykorzystano łącznie dla 190 źródeł węgla (PM01 i PM02), 95 źródeł azotu (PM03), 59 źródeł fosforu i 35 źródeł siarki (PM04) oraz peptydowych źródeł azotu (PM06-08). Dodatnie oddychanie zaobserwowano dla 148 składników odżywczych (jeden pozytywny test dla wykorzystania źródła C, cztery pozytywne testy dla każdego wykorzystania źródła S i P oraz 139 pozytywnych testów dla wykorzystania źródła N). Podłoża lub składniki pokarmowe (węgiel, azot, fosfor lub siarka) wchodzące w skład pożywki nie powinny być dodawane do zdefiniowanej pożywki po zastosowaniu do odpowiednich mikropłytek PM, które badają każde z tych źródeł.

Przedstawiona tutaj metoda jest skuteczna w charakteryzowaniu fenotypów metabolicznych mikroalg, które można wykorzystać do rozszerzenia istniejących modeli sieci metabolicznych lub kierowania rekonstrukcją nowych modeli. Ponadto, ponieważ wymagania żywieniowe większości mikroalg nie są znane, platforma ta może być wykorzystana do ich szybkiego zdefiniowania. Nelson i wsp.W ramach projektu 43 z powodzeniem zastosowano te metody w celu zidentyfikowania nowych związków, które wspomagają wzrost mikroalg Chloroidium sp. UTEX 3007 i wykorzystano uzyskane informacje do zdefiniowania metabolitów wprowadzających się do gatunków, które w przeciwieństwie do Chlamydomonas obejmują 40 różnych źródeł węgla.

Jednym z głównych ograniczeń PM do profilowania mikroalg jest to, że PMI nie ma oświetlenia w komorze inkubacyjnej, a mikroalgi muszą być w stanie przeprowadzać metabolizm heterotroficzny . Brak światła może wpływać na interpretację modeli, które uwzględniają światło do obliczania strumieni metabolicznych. Pary genów o funkcjach koordynacyjnych ewoluowały współewoluując, tworząc węzły sieci metabolicznej, a rozróżnienie między węzłami sieci fotosyntetycznych i niefotosyntetycznych można dokonać44. Ogólnie rzecz biorąc, węzły sieci fotosyntetycznych (tj. wysoce połączone węzły w modelu) zostałyby pominięte w modelach heterotroficznych. Ze względów praktycznych modelowanie heterotrofizmu u gatunków miksotroficznych powinno pomijać reakcje, o których wiadomo, że są napędzane przez światło, i uwzględniać różnice w bilansie energetycznym między warunkami. Tak więc modelowanie metabolizmu zależnego od światła i niezależnego od światła jest standardową praktyką w modelowaniu metabolicznym Chlamydomonas 6,45.

Niektóre zielone mikroalgi, takie jak Trebouxiophytes, są znane z asymilacji różnych cząsteczek węgla do wzrostu i uważa się, że wynika to z ich długiej historii ewolucyjnej jako członków porostów46. Podczas gdy chlorofity, takie jak Chlamydomonas, mogą wykorzystywać octan do wzrostu, brązowa mikroalga morska Tisochrysis lutea, znana ze swojego potencjału do komercyjnej produkcji bardzo długołańcuchowych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (VLC-PUFA), nie może używać octanu, ale może używać glicerolu do wzrostu47. Koncentracja biomasy powyżej 100 g l−1 masy suchych komórek została osiągnięta przy użyciu chlorelli ze zoptymalizowanym dodatkiem źródeł węgla organicznego w trybie zasilaniawsadowego 48. Co więcej, dodanie cukru do Chlorellavulgaris może zwiększyć jego sekwestrację CO2 , zapewniając w ten sposób dodatkowe korzyści podczas wzrostu fotosyntetycznego49. Większość heterotroficznych mikroalg może również rosnąć miksotroficznie, ale wykazano, że chlorofit Chromochloris zofingiensis wyłącza fotosyntezę po dodaniu cukru50.

Okrzemki, należące do działu Bacillariophyta, są główną grupą fitoplanktonu. Chociaż większość okrzemek może rosnąć tylko fotoautotroficznie, niektóre z nich mogą być uprawiane miksotroficznie lub heterotroficznie51. Na przykład stwierdzono, że glicerol wspomaga wzrost w świetle przy braku CO2 w niektórych okrzemkach, w tym w gatunku modelowym Phaeodactylum tricornutum52. Ponadto niektóre okrzemki bentosowe, takie jak Nitzschia linearis , mogą rosnąć na węglowodanach w ciemności53. Jest prawdopodobne, że testy PM zostaną rozszerzone na okrzemki i inne grupy glonów poprzez uzupełnienie odpowiednich źródeł węgla organicznego, aby umożliwić komórkom heterotroficzny wzrost, a strategia miksotrofii może być również potencjalnie zastosowana w przypadku obligatoryjnych autotroficznych mikroalg zapewniających minimalny wymagany dopływ światła.

Aby ocenić odtwarzalność danych, zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie podwójnych testów dla wszystkich płytek. Oznaczenie można uznać za dodatnie tylko wtedy, gdy po odjęciu od kontroli ujemnej i odpowiednich studzienek ślepych, absorbancja (wartość PMI) jest dodatnia. Opis ten, w obecności badanego związku, jest odzwierciedleniem abiotycznej reakcji barwnika z pożywką.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Główne wsparcie dla tej pracy zostało zapewnione przez NYUAD Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), ufundowane przez Tamkeen w ramach grantu New York University Abu Dhabi Research Institute (73 71210 CGSB9) i NYU Abu Dhabi Faculty Research Funds (AD060). W.F. był dodatkowo wspierany przez Program Stu Talentów Uniwersytetu Zhejiang. Dziękujemy Ashishowi Jaiswalowi za pomoc w nagraniu filmu. Dziękujemy Hong Cai za wygenerowanie danych o fenotypie metabolicznym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AmpicillinVWR97062-796
Płytki testowe Biolog [ PM01-08]Biolog, Hayward, CA, USA
Biolog Omnilog InstrumentBiolog, Hayward, CA, USA
Szczep Chlamydomonas reinhardtii CC-503Chlamydomonas Resource Center na Uniwersytecie Minnesoty, USA.Regenci University of Minnesota
KanamycynaVWR0408-EU-10G
Barwnik fioletu tetrazolowego " D"Biolog, Hayward, Kalifornia, Stany Zjednoczone
TimentinGlaxoSmithKline Australia Pty Ltd42010012-2

Bibliografia

  1. Oberhardt, M. A., Palsson, B. Ø, Papin, J. A. J. M. Applications of genome-scale metabolic reconstructions. Molecular Systems Biology. 5 (1), 320(2009).
  2. Schmidt, B. J., Lin-Schmidt, X., Chamberlin, A., Salehi-Ashtiani, K., Papin, J. A. Metabolic systems analysis to advance algal biotechnology. Biotechnology Journal. 5 (7), 660-670 (2010).
  3. Koskimaki, J. E., Blazier, A. S., Clarens, A. F., Papin, J. A. J. I. B. Computational models of algae metabolism for industrial applications. Industrial Biotechnology. 9 (4), 185-195 (2013).
  4. Koussa, J., Chaiboonchoe, A., Salehi-Ashtiani, K. J. B. Computational approaches for microalgal biofuel optimization: a review. BioMed Research. 2014, 649453(2014).
  5. Nelson, D. R., et al. Large-scale genome sequencing reveals the driving forces of viruses in microalgal evolution. Cell Host & Microbe. 29 (2), 250-266 (2021).
  6. Shene, C., Asenjo, J. A., Chisti, Y. Metabolic modelling and simulation of the light and dark metabolism of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 96 (5), 1076-1088 (2018).
  7. Tibocha-Bonilla, J. D., Zuñiga, C., Godoy-Silva, R. D., Zengler, K. Advances in metabolic modeling of oleaginous microalgae. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 241(2018).
  8. Merchant, S. S., et al. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 318 (5848), 245-250 (2007).
  9. May, P., Christian, J. -O., Kempa, S., Walther, D. J. B. G. ChlamyCyc: an integrative systems biology database and web-portal for Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 10 (1), 209(2009).
  10. Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), (2011).
  11. de Oliveira Dal'Molin, C. G., Quek, L. -E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM - a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. BMC Genomics. 12 (5), (2011).
  12. Chaiboonchoe, A., et al. Microalgal metabolic network model refinement through high-throughput functional metabolic profiling. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, 68(2014).
  13. Kanehisa, M., et al. Data, information, knowledge and principle: back to metabolism in KEGG. Nucleic Acids Research. 42 (1), 199-205 (2014).
  14. Zuñiga, C., et al. Genome-scale metabolic model for the green alga Chlorella vulgaris UTEX 395 accurately predicts phenotypes under autotrophic, heterotrophic, and mixotrophic growth conditions. Plant Physiology. 172 (1), 589-602 (2016).
  15. Bochner, B. R. New technologies to assess genotype-phenotype relationships. Nature Reviews Genetics. 4 (4), 309-314 (2003).
  16. Bochner, B. R. Global phenotypic characterization of bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 33 (1), 191-205 (2009).
  17. Bochner, B. R., Gadzinski, P., Panomitros, E. Phenotype microarrays for high-throughput phenotypic testing and assay of gene function. Genome Research. 11 (7), 1246-1255 (2001).
  18. Bartell, J. A., Yen, P., Varga, J. J., Goldberg, J. B., Papin, J. A. Comparative metabolic systems analysis of pathogenic Burkholderia. Journal of Bacteriology. 196 (2), 210-226 (2014).
  19. Gorman, D. S., Levine, R. J. P. otN. A. oS. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. PNAS. 54 (6), 1665-1669 (1965).
  20. Smith, A. C., Hussey, M. A. Gram stain protocols. American Society for Microbiology. , 1-9 (2005).
  21. Vaas, L. A. I., et al. opm: an R package for analysing OmniLog phenotype microarray data. Bioinformatics. 29 (14), 1823-1824 (2013).
  22. Vaas, L. A. I., Sikorski, J., Michael, V., Göker, M., Klenk, H. -P. Visualization and Curve-Parameter Estimation Strategies for Efficient Exploration of Phenotype Microarray Kinetics. PLoS ONE. 7 (4), 34846(2012).
  23. Caspi, R., et al. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes-a 2019 update. Nucleic Acids Research. 48 (1), 445-453 (2020).
  24. Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Ishiguro-Watanabe, M., Tanabe, M. KEGG: integrating viruses and cellular organisms. Nucleic Acids Research. , (2020).
  25. Lopez, D., Casero, D., Cokus, S. J., Merchant, S. S., Pellegrini, M. Algal Functional Annotation Tool: a web-based analysis suite to functionally interpret large gene lists using integrated annotation and expression data. BMC Bioinformatics. 12 (1), 282(2011).
  26. Caspi, R., et al. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes. Nucleic Acids Research. 46, 633-639 (2018).
  27. Sahoo, S., et al. dEMBF v2. 0: An Updated Database of Enzymes for Microalgal Biofuel Feedstock. Plant and Cell Physiology. 61 (5), 1019-1024 (2020).
  28. Heirendt, L., et al. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 14 (3), 639-702 (2019).
  29. Heirendt, L., et al. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 1, (2019).
  30. Orth, J. D., Thiele, I., Palsson, B. Ø What is flux balance analysis. Nature Biotechnology. 28 (3), 245(2010).
  31. Ebrahim, A., Lerman, J. A., Palsson, B. O., Hyduke, D. R. COBRApy: constraints-based reconstruction and analysis for python. BMC Systems Biology. 7 (1), 74(2013).
  32. Bölling, C., Fiehn, O. Metabolite profiling of Chlamydomonas reinhardtii under nutrient deprivation. Plant Physiology. 139 (4), 1995-2005 (2005).
  33. Harris, E. H. The Chlamydomonas sourcebook: introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, Academic Press. (2009).
  34. Goodstein, D. M., et al. Phytozome: a comparative platform for green plant genomics. Nucleic Acids Research. 40, 1178-1186 (2012).
  35. Ghamsari, L., et al. Genome-wide functional annotation and structural verification of metabolic ORFeome of Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 12 (1), 4(2011).
  36. Manichaikul, A., et al. Metabolic network analysis integrated with transcript verification for sequenced genomes. Nature Methods. 6 (8), 589-592 (2009).
  37. Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 32, 115-119 (2004).
  38. Consortium, T. U. Activities at the universal protein resource (UniProt). Nucleic Acids Research. 42 (11), 7486-7486 (2014).
  39. Horton, P., et al. PSORT: protein localization predictor. Nucleic Acids Research. 35, suppl_2 585-587 (2007).
  40. Becker, S. A., et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox. Nature Protocols. 2 (3), 727-738 (2007).
  41. Schellenberger, J., et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox v2.0. Nature Protocols. 6 (9), 1290(2011).
  42. Varma, A., Boesch, B. W., Palsson, B. O. Stoichiometric interpretation of Escherichia coli glucose catabolism under various oxygenation rates. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2465-2473 (1993).
  43. Nelson, D. R., et al. The genome and phenome of the green alga Chloroidium sp. UTEX 3007 reveal adaptive traits for desert acclimatization. eLife. , 25783(2017).
  44. Chaiboonchoe, A., et al. Systems level analysis of the Chlamydomonas reinhardtii metabolic network reveals variability in evolutionary co-conservation. Molecular BioSystems. 12 (8), 2394-2407 (2016).
  45. Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), 518(2011).
  46. Rajendran, A., Hu, B. Mycoalgae biofilm: development of a novel platform technology using algae and fungal cultures. Biotechnology for Biofuels. 9 (1), 112(2016).
  47. Hu, H., et al. Effect of cultivation mode on the production of docosahexaenoic acid by Tisochrysis lutea. AMB Express. 8 (1), 50(2018).
  48. Bumbak, F., Cook, S., Zachleder, V., Hauser, S., Kovar, K. Best practices in heterotrophic high-cell-density microalgal processes: achievements, potential and possible limitations. Applied Microbiology and Biotechnology. 91 (1), 31(2011).
  49. Fu, W., et al. Sugar-stimulated CO2 sequestration by the green microalga Chlorella vulgaris. Science of the Total Environment. 654, 275-283 (2019).
  50. Roth, M. S., et al. Regulation of oxygenic photosynthesis during trophic transitions in the green alga Chromochloris zofingiensis. The Plant Cell. , (2019).
  51. Villanova, V., et al. Investigating mixotrophic metabolism in the model diatom Phaeodactylum tricornutum. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1728), 20160404(2017).
  52. Cerón-García, M., et al. Mixotrophic growth of Phaeodactylum tricornutum on fructose and glycerol in fed-batch and semi-continuous modes. Bioresource Technology. 147, 569-576 (2013).
  53. Tuchman, N. C., Schollett, M. A., Rier, S. T., Geddes, P. Advances in Algal Biology: A Commemoration of the Work of Rex Lowe. , Springer. 167-177 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikromacierze fenotypowemodele w skali genomuChlamydomonas reinhardtiidoprecyzowanie sieci metabolicznejanaliza bilansu strumieniCOBRA Toolboxtesty fenotypoweidentyfikacja metabolitówrozbudowa modelu
Wysokoprzepustowe profilowanie metaboliczne w celu udoskonalenia modelu mikroalg
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.