Method Article

Wysokoprzepustowe profilowanie metaboliczne w celu udoskonalenia modelu mikroalg

DOI:

10.3791/61913

⸱

December 4th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), New York University Abu Dhabi Research Institute, 2Department of Biology, United Arab Emirates University, 3Laboratory of Algal, Systems, and Synthetic Biology (LASSB), Division of Science and Math, New York University Abu Dhabi, 4Department of Marine Science, Ocean College, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje użycie platformy technologicznej mikromacierzy fenotypowej (PM) do zdefiniowania wymagań metabolicznych Chlamydomonas reinhardtii, zielonej mikroalgi, i udoskonalenia istniejącego modelu sieci metabolicznej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele metaboliczne są rekonstruowane na podstawie dostępnych adnotacji genomu organizmu i dostarczają narzędzi predykcyjnych do badania procesów metabolicznych na poziomie systemu. Modele metaboliczne w skali genomu mogą zawierać luki, a także reakcje, które nie są zweryfikowane eksperymentalnie. Zrekonstruowane modele nowo wyizolowanych gatunków mikroglonów spowodują słabości wynikające z tych luk, ponieważ zwykle dostępnych jest niewiele dowodów biochemicznych na metabolizm takich izolatów. Technologia mikromacierzy fenotypowych (PM) jest skuteczną, wysokoprzepustową metodą, która funkcjonalnie określa komórkową aktywność metaboliczną w odpowiedzi na szeroki wachlarz metabolitów wejściowych. Połączenie wysokoprzepustowych testów fenotypowych z modelowaniem metabolicznym może umożliwić szybką rekonstrukcję lub optymalizację istniejących modeli sieci metabolicznych poprzez dostarczenie dowodów biochemicznych wspierających i rozszerzających dowody genomowe. Praca ta pokaże zastosowanie testów PM do badania mikroglonów na przykładzie modelu zielonej mikroglonów Chlamydomonas reinhardtii. Dowody eksperymentalne dla ponad 254 reakcji uzyskanych przez PM wykorzystano w tym badaniu w celu rozszerzenia i udoskonalenia modelu sieci metabolicznej C. reinhardtii w skali genomu, iRC1080, o około 25 procent. Stworzony tutaj protokół może być wykorzystany jako podstawa do funkcjonalnego profilowania metabolizmu innych mikroalg, w tym znanych mutantów mikroalg i nowych izolatów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalizacja metabolizmu glonów w celu zwiększenia i stabilnej produkcji docelowych metabolitów wymaga opracowania złożonych strategii inżynierii metabolicznej poprzez analizy sieci metabolicznych na poziomie systemów. Modele sieci metabolicznych mogą kierować racjonalnymi projektami szybkiego rozwoju strategii optymalizacji1,2,3,4. Chociaż zsekwencjonowano około 160 gatunków mikroglonów5, według naszej wiedzy dostępne są tylko 44 modele metabolizmu glonów4,6,7. Ze względu na trudności w uzyskaniu wysokoprzepustowych danych fenotypowych metabolicznych do eksperymentalnej walidacji informacji genomicznej, rekonstrukcja wysokiej jakości modeli sieciowych pozostaje w tyle za szybkim rozwojem sekwencjonowania genomu glonów.

C. reinhardtii jest atrakcyjnym modelowym systemem do badań na bazie glonów. Gatunek ten może rosnąć fotoautotroficznie lub heterotroficznie i jest szeroko stosowany jako organizm modelowy w badaniach podstawowych i stosowanych. Jego sekwencja genomu została opublikowana w 2007 roku8, a następnie zrekonstruowano modele metaboliczne w skali genomu dla gatunku9,10,11. Model w skali genomu C. reinhardtii (iRC1080) został zrekonstruowany przez Changa i wsp.10 na podstawie dowodów genomicznych i literatury (obejmujących ~250 źródeł). Ma 1 706 metabolitów z 2 190 reakcjami10; Nie można było jednak zweryfikować kompletności modelu poza dostępnymi w tym czasie dowodami eksperymentalnymi.

Technologia mikromacierzy fenotypowych (PMs) to platforma o wysokiej przepustowości, która może dostarczyć informacji o profilowaniu metabolicznym mikroorganizmów heterotroficznych, jak również komórek hodowli tkankowej. W szczególności może być wykorzystany do wypełnienia luki w wiedzy na temat fenotypu i genotypu w mikroalgach, jak po raz pierwszy zgłoszono dla Chlamydomonas reinhardtii12, a następnie dla gatunku Chloroidium13 i Chlorella14. Badając reakcje komórek na tysiące metabolitów, cząsteczek sygnałowych, osmolitów i cząsteczek efektorowych, testy PM mogą zapewnić funkcjonalne profilowanie metaboliczne i zaoferować wgląd w funkcję, metabolizm i wrażliwość środowiskową15,16,17. W szczególności testy PM wykrywają wykorzystanie metabolitów w komórkach w 96-dołkowych mikropłytkach z różnymi składnikami odżywczymi, metabolitami lub osmolitami zawartymi w każdym dołku. Co więcej, możliwe jest również oznaczanie cząsteczek bioaktywnych, takich jak antybiotyki i hormony. Zgodnie z intensywnością produkcji koloru przez redukcję NADH barwnika redoks na bazie tetrazolium, metaboliczne wykorzystanie substratów jest oceniane pod kątem oddychania komórkowego15,16,17. Eksperymenty na 96-dołkowych mikropłytkach mogą być monitorowane i wyznaczane automatycznie w czasie za pomocą platformy phenotype microarray instrument (PMI). Dwadzieścia 96-dołkowych mikropłytek zostało zaprojektowanych tak, aby reprezentowały wspólny zestaw metabolitów do badania fenotypów komórkowych w celu wykorzystania źródeł węgla, azotu, siarki i fosforu, a także różnych efektów osmotycznych / jonowych i pH. Technologia PM została z powodzeniem wykorzystana do aktualizacji i unowocześnienia wielu istniejących modeli metabolicznych mikroorganizmów w skali genomu15,16,17,18.

Protokół i dane pokazane tutaj są oparte na wcześniej opublikowanych pracach Chaiboonchoe et al.12 Prezentowana praca szczegółowo opisuje wykorzystanie metody testu PM do scharakteryzowania fenotypów metabolicznych mikroalg i rozszerzenia istniejącego modelu metabolizmu glonów C. reinhardtii, jak również do kierowania rekonstrukcją nowych modeli metabolicznych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Eksperymenty z mikromacierzami fenotypowymi

  1. Szczep C. reinhardtii CC-503 należy uzyskać w Centrum Zasobów Chlamydomonas na Uniwersytecie Minnesoty, USA (https://www.chlamycollection.org).
  2. Hoduj komórki w świeżych pożywkach tris-acetate-phosphate (TAP) class19 o końcowych stężeniach 400 μg/ml timentyny, 50 μg/ml ampicyliny i 100 μg/ml kanamycyny (w celu zahamowania wzrostu bakterii) poniżej 400 mikromolowych fotonów/m2s, w temperaturze 25 °C, przez dwa dni do połowy fazy logarytmicznej.
  3. Odwirować kulturę w temperaturze 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 22 °C i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu.
  4. Przygotować świeżą pożywkę TAP zawierającą 0,1% barwnika fioletu tetrazolowego "D".
    UWAGA: Zmodyfikuj pożywkę TAP na tym etapie, aby wykluczyć niektóre składniki odżywcze w zależności od kategorii metabolitów testowanych na każdej płytce (np. wyklucz chlorek amonu dla płytek źródłowych azotu).
  5. Zawiesić osad w świeżej pożywce TAP przygotowanej (od kroku 1.2) do końcowego stężenia 1 x 106 komórek/ml.
  6. Użyj płytek do oznaczania związków chemicznych (źródła węgla, źródła azotu, płytki ze źródłami fosforu i siarki oraz źródła azotu peptydowego).
  7. Zaszczepić 100 μl podwielokrotności pożywki zawierającej komórki do każdego dołka na płytkach testowych.
    UWAGA: Upewnij się, że zduplikowałeś testy.
  8. Umieść komórki na płytkach z ekstraktem drożdżowym/peptonem i wykonaj barwienie metodą Grama, jak w Smith i wsp.20 przed i po teście w celu monitorowania skażenia bakteryjnego.
  9. Włóż płytki do oznaczania związków chemicznych do systemu czytnika mikropłytek.
  10. Inkubować wszystkie płytki w temperaturze 30 °C przez okres do 7 dni i zaprogramować system czytnika mikropłytek tak, aby odczytywał zmianę koloru barwnika co 15 minut.
    UWAGA: Ponieważ większość czytników mikropłytek nie zapewnia źródła ciągłego światła podczas inkubacji, glony powinny być w stanie przeprowadzić oddychanie heterotroficzne.

2. Analiza danych

  1. Eksportuj surowe dane kinetyczne z czytnika mikropłytek jako pliki CSV, które następnie zostaną wykorzystane jako dane wejściowe do pakietu Omnilog Phenotype Microarray (OPM) w R. Dodaj informacje biologiczne jako metadane (np. oznaczenie szczepu, pożywka wzrostowa, temperatura itp.).
    1. Korzystając z oprogramowania do konwersji danych PM Kinetic, załaduj pliki danych D5E i przekonwertuj je na pliki OKA za pomocą następujących wierszy poleceń w oprogramowaniu do analizy kinetycznej PM:
      Obciążenie | Importuj (zlokalizuj folder z plikami OKA) | Wypełnianie filtrów | Import | Dodaj wszystkie płyty | Zamykać.
      Eksport | wybierz odczytane dane (Kinetic), wybierz format (CSV) (Nagłówek tabeli) i wybierz płyty (każda płyta (indywidualne pliki)) | Eksport danych | Zapisać.
    2. Aby przeprowadzić analizę danych Phenotype Microarray (PM), użyj pakietu oprogramowania OPM21,22, który działa w środowisku oprogramowania R. Pakiet, samouczek i dokumentacja referencyjna są dostępne pod adresem: http://www.goeker.org/opm/. W programie RStudio, graficznym interfejsie użytkownika dla języka R, zainstaluj pakiet opm i jego zależności przy użyciu następujących poleceń:
      źródło (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R)
      Biblioteka (OPM)
    3. Przejdź do katalogu zawierającego pliki CSV z danymi kinetycznymi i zaimportuj dane za pomocą funkcji read_opm:
      x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
    4. Agreguj i dyskretynuj dane kinetyczne za pomocą estymacji parametrów krzywej.
      Dla (i in 1 :length(x)) {
      x[[i]] br /> x[[i]] <- do_disc(x[[i]], odcięcie = FAŁSZ)
      }
      #Collection metadanych
      metadane <- collect_template(".")
      metadata$Szczep <- c("BLANK","CC- 503")
      for (I in 1 :length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = metadane, zamień = PRAWDA)}
    5. Użyj funkcji xy_plot, aby odwzorować pomiary oddychania (lub wzrostu) (oś y) w funkcji czasu (oś x) dla badanych płytek 96-dołkowych.
      print (xy_plot(x[[ 1 ]], include ="Napięcie", theor.max = FAŁSZ))
    6. Wizualizuj dane w postaci mapy cieplnej za pomocą funkcji level_plot, aby umożliwić szybki przegląd porównawczy danych kinetycznych.
      level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt("color.borders"), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", space = "Lab", bias = 0.7 , num.colors = 200 L)
    7. Wyodrębnij ważne informacje biologiczne, parametry krzywej, z surowych krzywych kinetycznych i uwzględnij fazę opóźnienia (λ), szybkość wzrostu (μ), maksymalne oddychanie komórek (A) i obszar pod krzywą (AUC)21. W celu zidentyfikowania metabolitów dodatnich należy użyć wartości A kontroli ujemnej, która reprezentuje reaktywność abiotyczną barwnika z pożywką, oprócz ślepej próby każdej płytki mikrodołkowej jako wartości odejmowania tła. Funkcja extract służy do uzyskiwania parametru A.
      opm_opt("curve.param")
      param <- extract (x, as.labels = list("Szczep")))

3. Identyfikacja reakcji i genów związanych z nowymi metabolitami

  1. Przeszukaj KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/kegg/) i MetaCyc (http://metacyc.org/), aby zidentyfikować numery Komisji Enzymów (EC) dla reakcji z użyciem metabolitów znalezionych w macierzach związków chemicznych23,2423,24.
  2. Użyj zidentyfikowanych numerów EC jako podstawy wyszukiwania w wielu dostępnych zasobach adnotacji glonów, takich jak Joint Genome Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) i recenzowane publikacje23,25,26,27.
  3. Jeśli zapytanie nie zwraca żadnych dowodów genetycznych dla danego numeru EC, zidentyfikuj odpowiednie powiązane białka w innych organizmach, zaczynając od gatunków najbliższych C. reinhardtii, a następnie przeprowadź wyszukiwanie oparte na profilu przy użyciu serwera NCBI PSI-BLAST z ustawieniami domyślnymi i użyj nieredundantnych białek (nr) w C. reinhardtii (taxid:3055) w celu zidentyfikowania genów kandydujących związanych z reakcją12.
  4. Ręcznie selekcjonuj trafienia PSI-BLAST z wartościami E < 0,05 pod kątem istotności dla wyszukiwanego numeru EC, wysyłając zapytanie o te trafienia BLAST za pośrednictwem serwerów przewidywania domen białek EMBL-EBI, Pfam (http://pfam.xfam.org/search) lub InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/). Należy pamiętać, że dwa ostatnie skany są krytycznymi krokami w celu zapewnienia identyfikacji prawidłowej aktywności enzymatycznej białka.

4. Udoskonalanie i ocena modelu

  1. Użyj najnowszego programu COBRA Toolbox v.3.028 w MATLAB29,30 w celu wykonania następujących kroków w celu udoskonalenia modelu. Program COBRA Toolbox można zainstalować, wykonując czynności opisane w następujący sposób: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . Można też zauważyć, że COBRA Toolbox jest również implementowany w innych językach programowania typu open source, takich jak Python (COBRApy31) i jest dostępny pod adresem: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .
    1. Po zainstalowaniu programu COBRA Toolbox v.3.0 otwórz program MATLAB i wykonaj następujące polecenie, aby zainicjować przybornik:
      initCobraSkrzynka narzędziowa;
    2. Dodaj zidentyfikowane reakcje wraz z powiązanymi z nimi genami do modelu metabolicznego, takiego jak iRC1080, za pomocą funkcji COBRA Toolbox addReaction i changeGeneAssociation. Przejdź do katalogu zawierającego model IRC1080, pobrany z http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 i wykonaj następujące polecenia, aby załadować model, zmienić jego nazwę i dodać nową reakcję oraz skojarzony z nią gen.
      Load('iRC 1080 .mat')
      modelNowy = iRC 1080;
      modelNew = addReaction(modelNowy, 'D-ALA 2' , ...
      {'d-ala[c]' , 'atp[c]' , ...
      'D-aladata[c]' , 'adp[c]' , 'pi[c]' , ...
      'h[c]' },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false);
      modelNEW = changeGeneAssociation(modelNowy, ...
      "D-ALA 2","au.g 14655 _t 1");
    3. W niektórych przypadkach, gdy metabolit nie jest wytwarzany wewnątrzkomórkowo, ale jest pobierany z pożywki, należy dodać do modelu reakcje transportu nowych metabolitów. Te reakcje transportu reprezentują bierną dyfuzję metabolitu z pożywki zewnątrzkomórkowej do cytozolu. Ponadto należy dodać odpowiednią reakcję sztucznej wymiany za pomocą funkcji addExchangeRxn w celu wprowadzenia lub wyprowadzenia metabolitu do podłoża zewnątrzkomórkowego.
      modelNew = addReaction(modelNowy, 'CYCPt' , ...
      {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)'
      modelNew = addExchangeRxn(modelNowy, 'cycp[e]' ,- 1000 ,1000 );
    4. Przetestuj zachowanie nowego modelu wynikowego, np. iBD1106, przeprowadzając analizę bilansu strumienia (FBA) przy użyciu funkcji optimizeCbModel w jasnych i ciemnych warunkach w celu maksymalizacji biomasy jako funkcji celu. Dla wzrostu światła ustaw dolną i górną granicę reakcji świetlnych PRISM solar lito na 646,07 (maksymalna szybkość). W przypadku ciemnego wzrostu ustaw granice wszystkich reakcji światła PRISM na zero. Użyj zdefiniowanej wcześniej funkcji Biomasa10 dla wzrostu w ciemnych i jasnych warunkach. Roztwór FBA wygeneruje dwa wektory odpowiadające strumieniom reakcji (solution.v) i zmniejszonym kosztom (solution.w), a także jeden wektor odpowiadający cenom ukrytym metabolitów (solution.y).
      %Symuluj wzrost w warunkach oświetleniowych:
      modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ ...
      % 'PRISM_solar_litho' , ...
      'PRISM_solar_exo' , ...
      'PRISM_incandescent_ 60 W' , ...
      'PRISM_fluorescent_cool_ 215 W' , ...
      'PRISM_metal_halide' , ...
      'PRISM_high_pressure_sodium' , ...
      'PRISM_growth_room' , ...
      'PRISM_white_LED' , ...
      "PRISM_red_LED_array_ 653 nm" , ...
      "PRISM_red_LED_ 674 nm" , ...
      'PRISM_fluorescent_warm_ 18 W' , ...
      'PRISM_design_growth' , ...
      }, 0, 'b' );
      modelNew = changeObjective(modelNowy, 'BIOMASS__mixo');
      FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNowy, 'max');
    5. Powtórz krok 4.1.4 dla iRC1080, aby porównać roztwory FBA otrzymane dla iBD1106 z roztworami uzyskanymi dla iRC1080.
    6. Dostępnych jest wiele metod COBRA, które można wykorzystać do porównywania modeli (np. analiza zmienności strumienia, badania delecji genów, analizy odporności, przewidywania podziału strumienia, FBA, pobieranie próbek itp.). Szczegółowe samouczki można znaleźć na stronie https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. W tym miejscu przedstawiono przykład, w którym model iRC1080 jest porównywany z jego udoskonaloną wersją, iBD1106, poprzez uzyskanie cen równoległych (wrażliwości obiektywnej funkcji biomasy na zmiany zmiennej systemowej) metabolitów uwzględnionych w każdym modelu.
      Należy uzyskać ceny równoległe metabolitów:
      shadowPrices = tabela(modelNowy.mets, ...
      modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie przesiewowe mikromacierzy fenotypu modelowej algi Chlamydomonas reinhardtii
Testy PM testują zdolność glonów do wykorzystywania różnych źródeł węgla, azotu, siarki i fosforu w minimalnym środowisku. W tym opisie metod pokazaliśmy, w jaki sposób testy PM zostały wykorzystane do identyfikacji metabolizmu węgla i azotu. Kinetykę wykorzystania węgla i azotu mierzono za pomocą czytnika mikropłytek. Dane zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania PMI. Podsumowującą kinetykę wybranych płytek do oznaczania PM (PM01 i PM03) przedstawiono na rysunku Rysunek 1. "Wykresy xy" wyświetlają pomiary oddychania w czasie wykreślone dla testów na płytkach 96-dołkowych, gdzie oś y i oś x reprezentują odpowiednio wartości pomiarów surowych i czasu. Dane zostały przekształcone we wzorzec mapy cieplnej w celu porównawczej analizy montażu danych kinetycznych.

Potok udoskonalania sieci metabolicznej w skali genomu przy użyciu danych PM (Rysunek 2) ilustruje integrację wysokoprzepustowych testów PM z dowodami eksperymentalnymi dostarczonymi przez poszukiwania genomiczne, które mogą rozszerzyć model sieci metabolicznej.

Aby określić odtwarzalność danych PM uzyskanych z płytek PM01 - 04 i PM10, przeanalizowano regresję liniową w celu wykreślenia danych z dwóch niezależnych eksperymentów powtórzonych względem siebie (Rysunek 3). Rysunek 3 pokazuje, że większość danych była prawie podobna, ponieważ znajdowały się na linii 45°, z zaledwie kilkoma wartościami odstającymi, a ich współczynnik determinacji R2 wynosił 0,9. Spójność i powtarzalność doświadczeń dla glonów są weryfikowane na tym wykresie.

Identyfikacja nowych metabolitów
Test PM zidentyfikował 662 metabolity na siedmiu płytkach; PM01-PM04 i PM06-PM08, podczas gdy chromatografia gazowa Time-Of-Flight (GC-TOF) zidentyfikowała 77 metabolitów32 (Rysunek 4). Porównując te dwa zestawy z 1068 metabolitami wchodzącymi w skład iRC1080, tylko sześć metabolitów nakładało się na siebie między trzema zestawami, a 149 nakładało się między iRC1080 i PM. Wynik ten pokazuje, że platforma profilowania metabolicznego może być znaczącym źródłem nowych informacji metabolicznych.

Kwas octowy był jedynym źródłem węgla wykrytym w płycie PM01 jako węgiel pomocniczy po odjęciu sygnału tła. To odkrycie jest zgodne z literaturą33 i pokazuje specyficzność testów PM. Testy PM ujawniły nowe źródła siarki, fosforu i azotu, które C. reinhardtii może wykorzystać do wzrostu. Metabolitami siarki były: siarczan, tiosiarczan, tetrationian i DL-lipoamid. Źródłem fosforu był tiofosforan, ditiofosforan, kwas D-3-fosfoglicerynowy i cysteamino-S-fosforan. Metabolitami będącymi źródłem azotu były L-aminokwasy i D-aminokwasy, w tym rzadziej występujące aminokwasy; L-homoseryna, L-piroglutamin, metyloamina, etyloamina, etanoloamina i D,L-α-aminomasło oraz 108 dipeptydów i pięć tripeptydów (tabela 1). Wszystkie 128 nowo zidentyfikowanych metabolitów przeszukano w KEGG i MetaCyc pod kątem powiązanych z nimi reakcji, liczby EC i szlaków.

Nowe 128 metabolitów było powiązanych z 49 unikalnymi numerami EC. Spośród nich 15 EC powiązano z dowodami genomowymi przy użyciu pięciu źródeł, w tym; Phytozome Version 10.0.234 JGI Version 435, AUGUSTUS 5.0, and 5.210 adnotacji od Manichaikul et al.36 oraz KEGG13. Metabolity bez dowodów genomowych zostały wprowadzone na stronę internetową Universal Protein Resource (UniProt, http://www.uniprot.org/)37,38, gdzie ich powiązane sekwencje znaleziono w innych organizmach. Sekwencje homologiczne u C. reinhardtii zidentyfikowano, uruchamiając Position-Specific Iterated BLAST (PSI-BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ze strony internetowej NCBI, biorąc pod uwagę tylko sekwencje, które dały znaczące dopasowania (wartość E <0,005).

Udoskonalenie modelu
Reakcje związane z nowymi 128 metabolitami, wraz z ich zakodowanymi genami, zostały dodane do modelu iRC1080, rozszerzając sieć. Otrzymany model iBD1106 odpowiada za 2444 reakcje, 1959 metabolitów i 1106 genów (Tabela 2). Nowe 254 dodane reakcje to 20 reakcji utleniania aminokwasów, 108 reakcji hydrolizy dipeptydów, pięć reakcji hydrolizy tripeptydów i 120 reakcji transportu, kodowanych przez cztery geny (Cre02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.1, Cre12.g486350.t1.3).

Łącznie 113 dodanych nowych reakcji odpowiada za hydrolizę di-peptydów i tripeptydów. Hydroliza di-peptydów i tripeptydów jest związana z dwoma genami, jednym dla di-peptydów (Cre02.g078650.t1.3) i jednym dla tripeptydów (Cre16.g675350.t1.3).

Jeśli chodzi o źródła fosforu, dodano reakcję hydrolizy cysteaminy-S-fosforanu do cysteaminy i fosforanu związanego z genem JLM_162926.

Narzędzie WoLF PSORT39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) i wyniki zgłoszone przez Ghamsari et al.35 zostały zastosowane w celu uzyskania specyfikacji przedziałów komórkowych, w których zachodzą nowe reakcje. Analizując sekwencje białek związane z nowymi reakcjami, WoLF PSORT przewidział cytozol jako przedział komórkowy dla reakcji.

Wygenerowany model metaboliczny może zawierać luki, gdy informacje biochemiczne są niekompletne. W takich przypadkach używane jest polecenie typu COBRA gapFind. Zawiera listę luk głównych i umożliwia identyfikację nowych luk wprowadzanych w nowym modelu. Metabolity, które nie mogą być wytworzone w modelu metabolicznym, są określane jako luki w korzeniach40,41. Analiza szczeliny między korzeniami wykazała, że zarówno modele iRC1080, jak i iBD1106 zawierają te same 91 przerw. Pokazuje to, że dodanie nowych metabolitów i związanych z nimi reakcji nie wprowadziło żadnych dodatkowych luk w korzeniach. Należy zauważyć, że metoda fenotypowania zastosowana w tym protokole nie zamyka luk w korzeniach, ponieważ pierwotne metabolity szczelin korzeniowych nie mają mechanizmów transportu lub produkcji, które nie zostały uwzględnione w testach fenotypowania. Analizę bilansu strumienia przeprowadzono w celu przetestowania zachowania metabolicznego iBD1106 w jasnych i ciemnych warunkach; (bez octanu) i (z octanem). Algorytm maksymalizuje reakcje prekursorów biomasy dla funkcji obiektywnej (wzrost biomasy). Aby ocenić udział każdego metabolitu w ustawionej funkcji celu, obliczono "ceny równoległe" dla wszystkich metabolitów. Zmiana funkcji celu dotycząca zmian strumienia metabolitu definiuje cenę ukrytą metabolitu30,42. Wskazanie, czy metabolit jest w "nadmiarze", czy też "ogranicza" funkcję obiektywną, można określić za pomocą analizy cen równoległych, np. produkcji biomasy. Ujemne lub dodatnie wartości cen ukrytych ujawniają metabolity, które po dodaniu zmniejszają lub zwiększają funkcję celu. Zerowe wartości cen równoległych ujawniają metabolity, które nie będą miały wpływu na funkcję celu. Porównanie cen równoległych między iBD1106 i iRC1080 w Rysunek 5 pokazuje, że w przypadku większości metabolitów nie obserwuje się znaczącej zmiany; Jednak różnice występują w 105 i 70 przypadkach odpowiednio w jasnych i ciemnych warunkach wzrostu. Tabela 4 zawiera przykłady takich metabolitów.

figure-results-1
Rysunek 1: Profilowanie mikromacierzy fenotypowej C. reinhardtii. Wykresy XY i wykresy poziomu oddechu PM01 (źródła węgla; A, C) i PM03 (źródła azotu; B, D) pokazane są płytki testowe. Rysunek jest tablicą 8x12, w której każda komórka reprezentuje płytkę studzienki, a tym samym dany metabolit lub środowisko wzrostu. W każdej reprezentacji komórki lub studni krzywe reprezentują konwersję barwnika przez redukcję (oś y) w funkcji czasu (oś x). Krzywe oddychania PM z CC-503 i studni ślepych są pokazane w każdej komórce i są oznaczone kolorem (kolor turkusowy reprezentuje puste studzienki, a kolor fioletowy reprezentuje CC-503). Wykres poziomości przedstawia każdą krzywą oddychania jako cienką poziomą linię, która zmienia kolor (lub pozostaje niezmieniona) w czasie. Zmiany koloru mapy cieplnej są od jasnożółtego (oddychanie było niewielkie lub nie miało miejsca) do ciemnopomarańczowego lub brązowego (miało miejsce znaczne oddychanie). Pokazano metabolity wykorzystywane przez C. reinhardtii (CC-503) oraz ślepe płytki. Rysunek ten pochodzi z wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe et al.12 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Potok udoskonalania sieci metabolicznej w skali genomu przy użyciu danych PM. Po pozytywnym wyniku testu nowego związku w teście PM, jego numer Komisji ds. Enzymów (EC), reakcja i szlak są identyfikowane na podstawie dostępnych baz danych, np. KEGG i MetaCyc. Dowody genomiczne są następnie ekstrahowane z zasobów genomicznych i adnotacji, jeśli są dostępne, i stanowią związek między genotypem a fenotypem. Gdy bezpośrednie dowody genomowe nie są dostępne, sekwencja białka jest identyfikowana na podstawie numerów EC, a dowody genetyczne są identyfikowane za pomocą PSI-Blast. Zrekonstruowana sieć metaboliczna jest następnie udoskonalana w oparciu o nowo zidentyfikowane związki, ale dopiero po etapie kontroli jakości, który obejmuje zapytanie o domeny białkowe przy użyciu odpowiednich baz danych. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanych prac Chaiboonchoe i wsp.12 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Powtarzalność testów PM. Wartości PMI zbierano w okresie 168 godzin, a maksymalne wartości PMI wykreślono dla dwóch powtórzonych badań. Każda oś reprezentuje maksymalne wartości PMI dla każdego badania (oś x to jedno badanie powtórzone, a oś y to drugie). Odtwarzane wartości są w równej odległości od każdej osi. Każdy punkt reprezentuje pojedynczą wartość maksymalną. Regresję liniową przeprowadzono za pomocą arkusza kalkulacyjnego i przedstawiono wynikowy współczynnik determinacji (R2). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanych prac Chaiboonchoe i wsp.12 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Diagram Venna metabolitów. Diagram Venna wylicza metabolity zidentyfikowane za pomocą płytek PM, modelu metabolicznego iRC1080 oraz eksperymentów z chromatografią gazową w czasie przelotu (GC-TOF). Każdy okrąg wskazuje całkowitą liczbę metabolitów, które występują w każdej odpowiedniej metodzie badania. Jednocześnie nakładające się na siebie regiony reprezentują liczbę metabolitów wspólnych dla tych metod. Model metaboliczny iRC1080 zawiera łącznie 1068 unikalnych metabolitów. GC-TOF zidentyfikował łącznie 77 metabolitów32, podczas gdy za pomocą płytek PM zidentyfikowano łącznie 662 metabolity. Rysunek ten pochodzi z wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe i wsp. 12 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Ukryte ceny metabolitów w iRC1080 i iBD1106 w różnych warunkach dla maksymalizacji biomasy. Każdy okrąg na "wykresach radarowych" odpowiada wartości ceny w tle, podczas gdy każda linia rozciągająca się od środka wykresu wskazuje metabolit. (A) Ceny równoległe i zachowania metaboliczne iRC1080 i iBD1106 w warunkach słabego wzrostu; (B), różne zachowania metaboliczne iRC1080 i ii BD1106 w ciemnych warunkach wzrostu. Rysunek ten pochodzi z wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe i wsp. 12 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Biolog ChemicznyKomisja Europejska*Adnotacja genuPSI-BLAST (Atak Psi)
Cysteamina-S-fosforan3.1.3.1JLM_1629261,2,3,4
Tetrationian1.8.2.2nieznaczna wartość E
1.8.5.2nieznaczna wartość E
D-alanina1.4.1.1XP_001700222.1
1.5.1.22nieudana ręczna kontrola jakości
2.1.2.7nieznaczna wartość E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
2.3.2.10nieznaczna wartość E
2.3.2.14nieznaczna wartość E
2.3.2.16nieznaczna wartość E
2.3.2.17nieznaczna wartość E
2.3.2.18nieznaczna wartość E
2.6.1.21nieudana ręczna kontrola jakości
3.4.13.22XP_001698572.1, XP_001693532.1, XP_001701890.1, XP_001700930.1
3.4.16.4Chlre2_kg.scaffold_ 140000391,2,3
3.4.17.8nieudana ręczna kontrola jakości
3.4.17.13nieznaczna wartość E
3.4.17.14nieznaczna wartość E
4.5.1.2nieznaczna wartość E
6.1.1.13nieudana ręczna kontrola jakości
6.1.2.1nieudana ręczna kontrola jakości
6.3.2.4au.g14655_t11,2,3
6.3.2.10nieudana ręczna kontrola jakości
6.3.2.16nieznaczna wartość E
6.3.2.35nieznaczna wartość E
D-asparagina1.4.5.1nieznaczna wartość E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
3.1.1.96nieznaczna wartość E
2.3.1.36nieznaczna wartość E
1.4.99.1XP_001692123.1
3.5.1.77e_gwW.1.243.11,2
3.5.1.81nieznaczna wartość E
5.1.1.10nieudana ręczna kontrola jakości
Kwas D-asparaginowy6.3.1.12nieznaczna wartość E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
Kwas D-glutaminowy1.4.3.7nieznaczna wartość E
1.4.3.3nieznaczna wartość E
D-lizyna5.4.3.4nieznaczna wartość E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
6.3.2.37nieudana ręczna kontrola jakości
D-seryna2.7.11.8nieznaczna wartość E
2.7.11.17Cre12.g486350.t1.31,2,3,4
3.4.21.78nieudana ręczna kontrola jakości
3.4.21.104nieudana ręczna kontrola jakości
4.3.1.18G6244.T14nieudana ręczna kontrola jakości
6.3.2.35nieznaczna wartość E
6.3.3.5nieznaczna wartość E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
D-Walina1.21.3.1nieudana ręczna kontrola jakości
6.3.2.26nieudana ręczna kontrola jakości
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
Kwas L-piroglutamowy
Tiofosforan
Ditiofosforan
Etyloamina6.3.1.6
Kwas D,L-a-aminomasłowy2.1.1.49nieznaczna wartość E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
Di-peptyd3.4.13.18Cre02.g078650.t1.31
Tri-peptyd3.4.11.4Cre16.g675350.t1.31

Tabela 1: Lista zidentyfikowanych metabolitów z dodatnim wykorzystaniem substratów (C, P, S, N) nieobecnych w modelu metabolicznym iRC1080. *Reakcja nie została uwzględniona, jeśli nie zidentyfikowano żadnego genu. 1Phytozome wersja 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii). 2JGI wersja 4 35. 3Augustus wersja 510. 4KEGG (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html). 5JGI wersja 3.136. Ta tabela pochodzi z wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe et al. 12

szt. osób osób osób osób szt.
modelReakcjemetabolityGenów
Kontroler iRC10802 1911 7061 086
Dysk iBD11062 4451 9591 106

Tabela 2: Zawartość iRC1080 oraz iBD1106. Ta tabela pochodzi z wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe et al. 12

szt.
Kategoria lub klasa reakcjiLiczba reakcji
Aminokwasy20
DipeptydyRozdział 108
Tripeptydy5
Reakcja transportowa120

Tabela 3: Podsumowanie nowych reakcji w iBD1106. Ta tabela pochodzi z wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe et al. 12

pkt. pkt. pkt. pkt.
Warunek wzrostumetabolitNazwaKontroler iRC1080Dysk iBD1106
4R5AU powiedział:4-(1-D-Ribitylamino)-5-aminouracyl00,168
5kwiecień5-Amino-6-(5'-phosphoribitylamino)uracyl-0,0090,158
światłopa1819Z18111Z1-(9Z)-oktadecenoil,2-(11Z)-oktadecenoilo-sn-glicerol3-fosforan-0,009-0,65
ciemny4abut4-aminobutanian0,18-0,05

Tabela 4: Przykład znaczących cen ukrytych dla iRC1080 oraz iBD1106. Ta tabela pochodzi z wcześniej opublikowanej pracy Chaiboonchoe et al. 12

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fenotypowanie metaboliczne zielonej mikroalgi, C. reinhardtii, opisano tutaj przy użyciu wysokoprzepustowych płytek do oznaczania PM i niezmodyfikowanego PMI. Testy wykorzystano łącznie dla 190 źródeł węgla (PM01 i PM02), 95 źródeł azotu (PM03), 59 źródeł fosforu i 35 źródeł siarki (PM04) oraz peptydowych źródeł azotu (PM06-08). Dodatnie oddychanie zaobserwowano dla 148 składników odżywczych (jeden pozytywny test dla wykorzystania źródła C, cztery pozytywne testy dla każdego wykorzystania źródła S i P oraz 139 pozytywnych testów dla wykorzystania źródła N). Podłoża lub składniki pokarmowe (węgiel, azot, fosfor lub siarka) wchodzące w skład pożywki nie powinny być dodawane do zdefiniowanej pożywki po zastosowaniu do odpowiednich mikropłytek PM, które badają każde z tych źródeł.

Przedstawiona tutaj metoda jest skuteczna w charakteryzowaniu fenotypów metabolicznych mikroalg, które można wykorzystać do rozszerzenia istniejących modeli sieci metabolicznych lub kierowania rekonstrukcją nowych modeli. Ponadto, ponieważ wymagania żywieniowe większości mikroalg nie są znane, platforma ta może być wykorzystana do ich szybkiego zdefiniowania. Nelson i wsp.W ramach projektu 43 z powodzeniem zastosowano te metody w celu zidentyfikowania nowych związków, które wspomagają wzrost mikroalg Chloroidium sp. UTEX 3007 i wykorzystano uzyskane informacje do zdefiniowania metabolitów wprowadzających się do gatunków, które w przeciwieństwie do Chlamydomonas obejmują 40 różnych źródeł węgla.

Jednym z głównych ograniczeń PM do profilowania mikroalg jest to, że PMI nie ma oświetlenia w komorze inkubacyjnej, a mikroalgi muszą być w stanie przeprowadzać metabolizm heterotroficzny . Brak światła może wpływać na interpretację modeli, które uwzględniają światło do obliczania strumieni metabolicznych. Pary genów o funkcjach koordynacyjnych ewoluowały współewoluując, tworząc węzły sieci metabolicznej, a rozróżnienie między węzłami sieci fotosyntetycznych i niefotosyntetycznych można dokonać44. Ogólnie rzecz biorąc, węzły sieci fotosyntetycznych (tj. wysoce połączone węzły w modelu) zostałyby pominięte w modelach heterotroficznych. Ze względów praktycznych modelowanie heterotrofizmu u gatunków miksotroficznych powinno pomijać reakcje, o których wiadomo, że są napędzane przez światło, i uwzględniać różnice w bilansie energetycznym między warunkami. Tak więc modelowanie metabolizmu zależnego od światła i niezależnego od światła jest standardową praktyką w modelowaniu metabolicznym Chlamydomonas 6,45.

Niektóre zielone mikroalgi, takie jak Trebouxiophytes, są znane z asymilacji różnych cząsteczek węgla do wzrostu i uważa się, że wynika to z ich długiej historii ewolucyjnej jako członków porostów46. Podczas gdy chlorofity, takie jak Chlamydomonas, mogą wykorzystywać octan do wzrostu, brązowa mikroalga morska Tisochrysis lutea, znana ze swojego potencjału do komercyjnej produkcji bardzo długołańcuchowych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (VLC-PUFA), nie może używać octanu, ale może używać glicerolu do wzrostu47. Koncentracja biomasy powyżej 100 g l−1 masy suchych komórek została osiągnięta przy użyciu chlorelli ze zoptymalizowanym dodatkiem źródeł węgla organicznego w trybie zasilaniawsadowego 48. Co więcej, dodanie cukru do Chlorellavulgaris może zwiększyć jego sekwestrację CO2 , zapewniając w ten sposób dodatkowe korzyści podczas wzrostu fotosyntetycznego49. Większość heterotroficznych mikroalg może również rosnąć miksotroficznie, ale wykazano, że chlorofit Chromochloris zofingiensis wyłącza fotosyntezę po dodaniu cukru50.

Okrzemki, należące do działu Bacillariophyta, są główną grupą fitoplanktonu. Chociaż większość okrzemek może rosnąć tylko fotoautotroficznie, niektóre z nich mogą być uprawiane miksotroficznie lub heterotroficznie51. Na przykład stwierdzono, że glicerol wspomaga wzrost w świetle przy braku CO2 w niektórych okrzemkach, w tym w gatunku modelowym Phaeodactylum tricornutum52. Ponadto niektóre okrzemki bentosowe, takie jak Nitzschia linearis , mogą rosnąć na węglowodanach w ciemności53. Jest prawdopodobne, że testy PM zostaną rozszerzone na okrzemki i inne grupy glonów poprzez uzupełnienie odpowiednich źródeł węgla organicznego, aby umożliwić komórkom heterotroficzny wzrost, a strategia miksotrofii może być również potencjalnie zastosowana w przypadku obligatoryjnych autotroficznych mikroalg zapewniających minimalny wymagany dopływ światła.

Aby ocenić odtwarzalność danych, zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie podwójnych testów dla wszystkich płytek. Oznaczenie można uznać za dodatnie tylko wtedy, gdy po odjęciu od kontroli ujemnej i odpowiednich studzienek ślepych, absorbancja (wartość PMI) jest dodatnia. Opis ten, w obecności badanego związku, jest odzwierciedleniem abiotycznej reakcji barwnika z pożywką.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Główne wsparcie dla tej pracy zostało zapewnione przez NYUAD Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), ufundowane przez Tamkeen w ramach grantu New York University Abu Dhabi Research Institute (73 71210 CGSB9) i NYU Abu Dhabi Faculty Research Funds (AD060). W.F. był dodatkowo wspierany przez Program Stu Talentów Uniwersytetu Zhejiang. Dziękujemy Ashishowi Jaiswalowi za pomoc w nagraniu filmu. Dziękujemy Hong Cai za wygenerowanie danych o fenotypie metabolicznym.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinVWR97062-796
Płytki testowe Biolog [ PM01-08]Biolog, Hayward, CA, USA
Biolog Omnilog InstrumentBiolog, Hayward, CA, USA
Szczep Chlamydomonas reinhardtii CC-503Chlamydomonas Resource Center na Uniwersytecie Minnesoty, USA.Regenci University of Minnesota
KanamycynaVWR0408-EU-10G
Barwnik fioletu tetrazolowego " D"Biolog, Hayward, Kalifornia, Stany Zjednoczone
TimentinGlaxoSmithKline Australia Pty Ltd42010012-2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Applications of genome-scale metabolic reconstructions. Molecular Systems Biology. 5 (1), 320(2009).">Oberhardt, M. A., Palsson, B. Ø, Papin, J. A. J. M. Applications of genome-scale metabolic reconstructions. Molecular Systems Biology. 5 (1), 320(2009).
  2. Metabolic systems analysis to advance algal biotechnology. Biotechnology Journal. 5 (7), 660-670 (2010).">Schmidt, B. J., Lin-Schmidt, X., Chamberlin, A., Salehi-Ashtiani, K., Papin, J. A. Metabolic systems analysis to advance algal biotechnology. Biotechnology Journal. 5 (7), 660-670 (2010).
  3. Computational models of algae metabolism for industrial applications. Industrial Biotechnology. 9 (4), 185-195 (2013).">Koskimaki, J. E., Blazier, A. S., Clarens, A. F., Papin, J. A. J. I. B. Computational models of algae metabolism for industrial applications. Industrial Biotechnology. 9 (4), 185-195 (2013).
  4. Computational approaches for microalgal biofuel optimization: a review. BioMed Research. 2014, 649453(2014).">Koussa, J., Chaiboonchoe, A., Salehi-Ashtiani, K. J. B. Computational approaches for microalgal biofuel optimization: a review. BioMed Research. 2014, 649453(2014).
  5. Large-scale genome sequencing reveals the driving forces of viruses in microalgal evolution. Cell Host & Microbe. 29 (2), 250-266 (2021).">Nelson, D. R., et al. Large-scale genome sequencing reveals the driving forces of viruses in microalgal evolution. Cell Host & Microbe. 29 (2), 250-266 (2021).
  6. Metabolic modelling and simulation of the light and dark metabolism of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 96 (5), 1076-1088 (2018).">Shene, C., Asenjo, J. A., Chisti, Y. Metabolic modelling and simulation of the light and dark metabolism of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 96 (5), 1076-1088 (2018).
  7. Advances in metabolic modeling of oleaginous microalgae. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 241(2018).">Tibocha-Bonilla, J. D., Zuñiga, C., Godoy-Silva, R. D., Zengler, K. Advances in metabolic modeling of oleaginous microalgae. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 241(2018).
  8. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 318 (5848), 245-250 (2007).">Merchant, S. S., et al. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 318 (5848), 245-250 (2007).
  9. ChlamyCyc: an integrative systems biology database and web-portal for Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 10 (1), 209(2009).">May, P., Christian, J. -O., Kempa, S., Walther, D. J. B. G. ChlamyCyc: an integrative systems biology database and web-portal for Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 10 (1), 209(2009).
  10. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), (2011).">Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), (2011).
  11. AlgaGEM - a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. BMC Genomics. 12 (5), (2011).">de Oliveira Dal'Molin, C. G., Quek, L. -E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM - a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. BMC Genomics. 12 (5), (2011).
  12. Microalgal metabolic network model refinement through high-throughput functional metabolic profiling. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, 68(2014).">Chaiboonchoe, A., et al. Microalgal metabolic network model refinement through high-throughput functional metabolic profiling. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, 68(2014).
  13. Data, information, knowledge and principle: back to metabolism in KEGG. Nucleic Acids Research. 42 (1), 199-205 (2014).">Kanehisa, M., et al. Data, information, knowledge and principle: back to metabolism in KEGG. Nucleic Acids Research. 42 (1), 199-205 (2014).
  14. Genome-scale metabolic model for the green alga Chlorella vulgaris UTEX 395 accurately predicts phenotypes under autotrophic, heterotrophic, and mixotrophic growth conditions. Plant Physiology. 172 (1), 589-602 (2016).">Zuñiga, C., et al. Genome-scale metabolic model for the green alga Chlorella vulgaris UTEX 395 accurately predicts phenotypes under autotrophic, heterotrophic, and mixotrophic growth conditions. Plant Physiology. 172 (1), 589-602 (2016).
  15. New technologies to assess genotype-phenotype relationships. Nature Reviews Genetics. 4 (4), 309-314 (2003).">Bochner, B. R. New technologies to assess genotype-phenotype relationships. Nature Reviews Genetics. 4 (4), 309-314 (2003).
  16. Global phenotypic characterization of bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 33 (1), 191-205 (2009).">Bochner, B. R. Global phenotypic characterization of bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 33 (1), 191-205 (2009).
  17. Phenotype microarrays for high-throughput phenotypic testing and assay of gene function. Genome Research. 11 (7), 1246-1255 (2001).">Bochner, B. R., Gadzinski, P., Panomitros, E. Phenotype microarrays for high-throughput phenotypic testing and assay of gene function. Genome Research. 11 (7), 1246-1255 (2001).
  18. Comparative metabolic systems analysis of pathogenic Burkholderia. Journal of Bacteriology. 196 (2), 210-226 (2014).">Bartell, J. A., Yen, P., Varga, J. J., Goldberg, J. B., Papin, J. A. Comparative metabolic systems analysis of pathogenic Burkholderia. Journal of Bacteriology. 196 (2), 210-226 (2014).
  19. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. PNAS. 54 (6), 1665-1669 (1965).">Gorman, D. S., Levine, R. J. P. otN. A. oS. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. PNAS. 54 (6), 1665-1669 (1965).
  20. Gram stain protocols. American Society for Microbiology. , 1-9 (2005).">Smith, A. C., Hussey, M. A. Gram stain protocols. American Society for Microbiology. , 1-9 (2005).
  21. opm: an R package for analysing OmniLog phenotype microarray data. Bioinformatics. 29 (14), 1823-1824 (2013).">Vaas, L. A. I., et al. opm: an R package for analysing OmniLog phenotype microarray data. Bioinformatics. 29 (14), 1823-1824 (2013).
  22. Visualization and Curve-Parameter Estimation Strategies for Efficient Exploration of Phenotype Microarray Kinetics. PLoS ONE. 7 (4), 34846(2012).">Vaas, L. A. I., Sikorski, J., Michael, V., Göker, M., Klenk, H. -P. Visualization and Curve-Parameter Estimation Strategies for Efficient Exploration of Phenotype Microarray Kinetics. PLoS ONE. 7 (4), 34846(2012).
  23. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes-a 2019 update. Nucleic Acids Research. 48 (1), 445-453 (2020).">Caspi, R., et al. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes-a 2019 update. Nucleic Acids Research. 48 (1), 445-453 (2020).
  24. KEGG: integrating viruses and cellular organisms. Nucleic Acids Research. , (2020).">Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Ishiguro-Watanabe, M., Tanabe, M. KEGG: integrating viruses and cellular organisms. Nucleic Acids Research. , (2020).
  25. Algal Functional Annotation Tool: a web-based analysis suite to functionally interpret large gene lists using integrated annotation and expression data. BMC Bioinformatics. 12 (1), 282(2011).">Lopez, D., Casero, D., Cokus, S. J., Merchant, S. S., Pellegrini, M. Algal Functional Annotation Tool: a web-based analysis suite to functionally interpret large gene lists using integrated annotation and expression data. BMC Bioinformatics. 12 (1), 282(2011).
  26. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes. Nucleic Acids Research. 46, 633-639 (2018).">Caspi, R., et al. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes. Nucleic Acids Research. 46, 633-639 (2018).
  27. dEMBF v2. 0: An Updated Database of Enzymes for Microalgal Biofuel Feedstock. Plant and Cell Physiology. 61 (5), 1019-1024 (2020).">Sahoo, S., et al. dEMBF v2. 0: An Updated Database of Enzymes for Microalgal Biofuel Feedstock. Plant and Cell Physiology. 61 (5), 1019-1024 (2020).
  28. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 14 (3), 639-702 (2019).">Heirendt, L., et al. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 14 (3), 639-702 (2019).
  29. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 1, (2019).">Heirendt, L., et al. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 1, (2019).
  30. What is flux balance analysis. Nature Biotechnology. 28 (3), 245(2010).">Orth, J. D., Thiele, I., Palsson, B. Ø What is flux balance analysis. Nature Biotechnology. 28 (3), 245(2010).
  31. COBRApy: constraints-based reconstruction and analysis for python. BMC Systems Biology. 7 (1), 74(2013).">Ebrahim, A., Lerman, J. A., Palsson, B. O., Hyduke, D. R. COBRApy: constraints-based reconstruction and analysis for python. BMC Systems Biology. 7 (1), 74(2013).
  32. Metabolite profiling of Chlamydomonas reinhardtii under nutrient deprivation. Plant Physiology. 139 (4), 1995-2005 (2005).">Bölling, C., Fiehn, O. Metabolite profiling of Chlamydomonas reinhardtii under nutrient deprivation. Plant Physiology. 139 (4), 1995-2005 (2005).
  33. The Chlamydomonas sourcebook: introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, Academic Press. (2009).">Harris, E. H. The Chlamydomonas sourcebook: introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, Academic Press. (2009).
  34. Phytozome: a comparative platform for green plant genomics. Nucleic Acids Research. 40, 1178-1186 (2012).">Goodstein, D. M., et al. Phytozome: a comparative platform for green plant genomics. Nucleic Acids Research. 40, 1178-1186 (2012).
  35. Genome-wide functional annotation and structural verification of metabolic ORFeome of Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 12 (1), 4(2011).">Ghamsari, L., et al. Genome-wide functional annotation and structural verification of metabolic ORFeome of Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 12 (1), 4(2011).
  36. Metabolic network analysis integrated with transcript verification for sequenced genomes. Nature Methods. 6 (8), 589-592 (2009).">Manichaikul, A., et al. Metabolic network analysis integrated with transcript verification for sequenced genomes. Nature Methods. 6 (8), 589-592 (2009).
  37. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 32, 115-119 (2004).">Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 32, 115-119 (2004).
  38. Activities at the universal protein resource (UniProt). Nucleic Acids Research. 42 (11), 7486-7486 (2014).">Consortium, T. U. Activities at the universal protein resource (UniProt). Nucleic Acids Research. 42 (11), 7486-7486 (2014).
  39. PSORT: protein localization predictor. Nucleic Acids Research. 35, suppl_2 585-587 (2007).">Horton, P., et al. PSORT: protein localization predictor. Nucleic Acids Research. 35, suppl_2 585-587 (2007).
  40. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox. Nature Protocols. 2 (3), 727-738 (2007).">Becker, S. A., et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox. Nature Protocols. 2 (3), 727-738 (2007).
  41. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox v2.0. Nature Protocols. 6 (9), 1290(2011).">Schellenberger, J., et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox v2.0. Nature Protocols. 6 (9), 1290(2011).
  42. Stoichiometric interpretation of Escherichia coli glucose catabolism under various oxygenation rates. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2465-2473 (1993).">Varma, A., Boesch, B. W., Palsson, B. O. Stoichiometric interpretation of Escherichia coli glucose catabolism under various oxygenation rates. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2465-2473 (1993).
  43. The genome and phenome of the green alga Chloroidium sp. UTEX 3007 reveal adaptive traits for desert acclimatization. eLife. , 25783(2017).">Nelson, D. R., et al. The genome and phenome of the green alga Chloroidium sp. UTEX 3007 reveal adaptive traits for desert acclimatization. eLife. , 25783(2017).
  44. Systems level analysis of the Chlamydomonas reinhardtii metabolic network reveals variability in evolutionary co-conservation. Molecular BioSystems. 12 (8), 2394-2407 (2016).">Chaiboonchoe, A., et al. Systems level analysis of the Chlamydomonas reinhardtii metabolic network reveals variability in evolutionary co-conservation. Molecular BioSystems. 12 (8), 2394-2407 (2016).
  45. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), 518(2011).">Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), 518(2011).
  46. Mycoalgae biofilm: development of a novel platform technology using algae and fungal cultures. Biotechnology for Biofuels. 9 (1), 112(2016).">Rajendran, A., Hu, B. Mycoalgae biofilm: development of a novel platform technology using algae and fungal cultures. Biotechnology for Biofuels. 9 (1), 112(2016).
  47. Effect of cultivation mode on the production of docosahexaenoic acid by Tisochrysis lutea. AMB Express. 8 (1), 50(2018).">Hu, H., et al. Effect of cultivation mode on the production of docosahexaenoic acid by Tisochrysis lutea. AMB Express. 8 (1), 50(2018).
  48. Best practices in heterotrophic high-cell-density microalgal processes: achievements, potential and possible limitations. Applied Microbiology and Biotechnology. 91 (1), 31(2011).">Bumbak, F., Cook, S., Zachleder, V., Hauser, S., Kovar, K. Best practices in heterotrophic high-cell-density microalgal processes: achievements, potential and possible limitations. Applied Microbiology and Biotechnology. 91 (1), 31(2011).
  49. Sugar-stimulated CO2 sequestration by the green microalga Chlorella vulgaris. Science of the Total Environment. 654, 275-283 (2019).">Fu, W., et al. Sugar-stimulated CO2 sequestration by the green microalga Chlorella vulgaris. Science of the Total Environment. 654, 275-283 (2019).
  50. Regulation of oxygenic photosynthesis during trophic transitions in the green alga Chromochloris zofingiensis. The Plant Cell. , (2019).">Roth, M. S., et al. Regulation of oxygenic photosynthesis during trophic transitions in the green alga Chromochloris zofingiensis. The Plant Cell. , (2019).
  51. Investigating mixotrophic metabolism in the model diatom Phaeodactylum tricornutum. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1728), 20160404(2017).">Villanova, V., et al. Investigating mixotrophic metabolism in the model diatom Phaeodactylum tricornutum. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1728), 20160404(2017).
  52. Mixotrophic growth of Phaeodactylum tricornutum on fructose and glycerol in fed-batch and semi-continuous modes. Bioresource Technology. 147, 569-576 (2013).">Cerón-García, M., et al. Mixotrophic growth of Phaeodactylum tricornutum on fructose and glycerol in fed-batch and semi-continuous modes. Bioresource Technology. 147, 569-576 (2013).
  53. Advances in Algal Biology: A Commemoration of the Work of Rex Lowe. , Springer. 167-177 (2006).">Tuchman, N. C., Schollett, M. A., Rier, S. T., Geddes, P. Advances in Algal Biology: A Commemoration of the Work of Rex Lowe. , Springer. 167-177 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Metabolic ProfilingPhenotype MicroarrayGenome Scale ModelsChlamydomonas ReinhardtiiMetabolic Network RefinementFlux Balance AnalysisCOBRA ToolboxPhenotypic AssaysMetabolite IdentificationModel Expansion

Related Articles