Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie regionalne móżdżku do analizy molekularnej

DOI:

10.3791/61922

⸱

5 grudnia 2020

 , 
1Department of Neuroscience, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne regiony móżdżku są zaangażowane w różne procesy behawioralne, jednak leżące u ich podstaw mechanizmy molekularne pozostają nieznane. W pracy opisano metodę powtarzalnego i szybkiego preparowania kory móżdżku półkul, przednich i tylnych obszarów robaka oraz głębokich jąder móżdżku w celu zbadania różnic molekularnych poprzez wyizolowanie RNA i zbadanie różnic w ekspresji genów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Móżdżek odgrywa ważną rolę w kilku kluczowych funkcjach, takich jak kontrola ruchu, równowaga, poznanie, nagroda i afekt. Badania obrazowe wskazują, że różne regiony móżdżku przyczyniają się do tych różnych funkcji. Badania molekularne badające regionalne różnice móżdżku pozostają w tyle, ponieważ są one w większości wykonywane na całych ekstraktach móżdżku, maskując w ten sposób wszelkie różnice w określonych regionach móżdżku. Tutaj opisujemy technikę powtarzalnego i szybkiego preparowania czterech różnych obszarów móżdżku: głębokich jąder móżdżku (DCN), przedniej i tylnej kory móżdżku oraz kory móżdżku półkul. Wyodrębnienie tych odrębnych regionów pozwala na zbadanie mechanizmów molekularnych, które mogą leżeć u podstaw ich unikalnego wkładu w równowagę, ruch, afekt i poznanie. Technika ta może być również wykorzystana do zbadania różnic w patologicznej podatności tych konkretnych regionów w różnych modelach chorób myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Móżdżek zawiera ponad połowę neuronów w mózgu i historycznie był określany jako centrum kontroli motorycznej i równowagi w mózgu1. Niedawne badania wykazały, że móżdżek odgrywa kluczową rolę w różnych innych funkcjach, w tym w poznaniu, przetwarzaniu nagrody i afekcie2,3,4,5.

Móżdżek ma dobrze opisaną anatomię: obszar kory składa się z granulek, Purkinjego i warstw molekularnych. Komórki ziarniste tworzą warstwę komórek ziarnistych i wysyłają dane wejściowe przez równoległe włókna do dendrytów komórek Purkinjego warstwy molekularnej, które również otrzymują dane wejściowe od włókien pnących pochodzących z dolnej oliwki. Komórki Purkiniego wysyłają hamujące projekcje do komórek w głębokich jądrach móżdżku (DCN), które służą jako główne wyjście z móżdżku. Wyjście tego obwodu móżdżku jest dodatkowo modulowane przez aktywność interneuronów hamujących w korze móżdżku, w tym komórek Golgiego, gwiaździstych i koszyczkowych4. Ta jednostka funkcjonalna móżdżku jest rozmieszczona we wszystkich zrazikach kory móżdżku. Pomimo tego stosunkowo jednolitego obwodu w móżdżku, dowody z literatury neuroobrazowej na temat ludzkiej neuroobrazowania i badań na pacjentach wskazują na funkcjonalną heterogeniczność móżdżku6,7.

Kora móżdżku może być podzielona na dwa główne obszary: wermisy zdefiniowane przez linię środkową i półkule boczne. Robak można dalej podzielić na płatki przednie i tylne. Te odrębne obszary móżdżku są zaangażowane w przyczynianie się do różnych zachowań. Wzorce aktywności wywołane zadaniami lub wolne od zadań sugerowały, że przednie obszary robaka bardziej przyczyniają się do funkcji motorycznych, podczas gdy tylne robaki bardziej przyczyniają się do poznania6,7. Robak jest również związany z afektem i emocjami, podczas gdy półkule móżdżku przyczyniają się do funkcji wykonawczych, wzrokowo-przestrzennych, językowych i innych funkcji mnemotechnicznych8. Ponadto badania anatomiczne dostarczyły dowodów na to, że funkcjonalnie odrębne regiony móżdżku są połączone z różnymi obszarami kory mózgowej9. Mapowanie objawów zmian ujawniło, że pacjenci z udarami wpływającymi na przednie płatki (rozciągające się do zrazika VI) mieli gorszą wydajność w zadaniach motorycznych, podczas gdy pacjenci z uszkodzeniem tylnych obszarów płata i półkul wykazywali deficyty poznawcze przy braku zespołu motorycznego móżdżku10. Wreszcie, regionalna patologia móżdżku w chorobie wskazuje, że funkcjonalnie odrębne regiony móżdżku są również różnie podatne na chorobę11,12.

Chociaż znacznie mniej zbadane, wstępne dowody wskazują na wyraźne sygnatury ekspresji genów w obszarach kory móżdżku. Ekspresja Zebryny II w komórkach Purkinjego wykazuje specyficzne dla regionu wzorce w robaku, tak że w tylnych zrazikach jest więcej komórek dodatnich Zebryny II, a mniej w przednich płatkach13. Koreluje to również z regionalnie odmienną funkcją fizjologiczną, ponieważ komórki Purkinjego ujemne Zebrin II wykazują wyższą częstotliwość wypalania tonicznego niż komórki Purkinjego, które są Zebrin II dodatnie14.

Oprócz kory móżdżku, móżdżek zawiera głębokie jądra móżdżku (DCN), które służą jako główne wyjście dla móżdżku. Jądra składają się z jąder przyśrodkowych (MN), interlokowanych (IN) i bocznych (LN). Obrazowanie funkcjonalne i badania na pacjentach wykazały, że DCN również uczestniczy w różnych zachowaniach15, ale bardzo niewiele badań analizuje zmianę ekspresji genów w DCN.

Postępy w technikach molekularnych umożliwiły ocenę regionalnej ekspresji genów w mózgu i odkryły niejednorodność między i wewnątrz różnych regionów mózgu, zarówno w stanach fizjologicznych, jak i chorobowych16. Takie badania sugerują, że móżdżek różni się od innych obszarów mózgu. Na przykład stosunek neuronów do komórek glejowych w móżdżku jest odwrócony w porównaniu z innymi obszarami mózgu1. Nawet w normalnych warunkach fizjologicznych ekspresja genów prozapalnych jest zwiększona w móżdżku w porównaniu z innymi obszarami mózgu17. Techniki molekularne okazały się również bardzo przydatne w identyfikacji szlaków, które przyczyniają się do patogenezy chorób móżdżku. Na przykład sekwencjonowanie RNA całych ekstraktów móżdżku zidentyfikowało geny zmienione w transgenicznym mysim modelu ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 1 (SCA1) specyficznym dla komórek Purkinjego w porównaniu z ich kontrolami typu dzikiego. Takie dowody ujawniły kluczowe szlaki molekularne leżące u podstaw patogenezy komórek Purkinjego móżdżku i pomogły zidentyfikować potencjalne cele terapeutyczne18. Jednak ostatnie badania sugerują, że istnieją różnice w podatności na choroby w różnych regionach móżdżku11,12,19. Może to wskazywać, że w różnych regionach móżdżku zachodzą kluczowe zmiany, które mogą być zamaskowane lub niewykryte za pomocą ekstraktów z całego móżdżku. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania technik, które pozwolą naukowcom badać profile molekularne w różnych obszarach móżdżku.

Proponowana tutaj technika opisuje powtarzalną metodę preparowania czterech odrębnych regionów móżdżku myszy w celu wyizolowania RNA z tych regionów i zbadania regionalnych różnic w ekspresji genów. Schemat móżdżku myszy w Rysunek 1A podkreśla robaki na niebiesko, a półkule na żółto. W szczególności technika ta umożliwia wyizolowanie czterech regionów: głębokich jąder móżdżku (DCN) (pola z czerwonymi kropkami w Ryc. 1A), kora móżdżku przedniego robaka (CCaV) (ciemnoniebieska w Ryc. 1A), kora móżdżku tylnego robaka (CCpV) (jasnoniebieska w Ryc. 1A) i kora móżdżku półkul (CCH) (żółta w Rycina 1A)). Oceniając ekspresję genów w tych regionach oddzielnie, możliwe będzie zbadanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw dyskretnych funkcji tych różnych regionów, a także potencjalnych różnic w ich podatności na choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja

  1. Zbierz niezbędny sprzęt, w tym nożyczki do dekapitacji, kleszcze, nożyczki do preparacji, nożyczki naczyniowe, mikroszpatułkę, strzałkową matrycę mózgu myszy, żyletki, końcówki do pipet 200 μl, szklaną szalkę Petriego, szklaną szkiełko i wiadro na lód. Rozłóż cały sprzęt na podkładce chłonnej.
  2. Umieść szalkę Petriego, szklany talerz i macierz mózgową na lodzie.
  3. Za pomocą żyletki ustawionej pod prostopadłym kątem odetnij około 5 mm końcówki jednej końcówki pipety o pojemności 200 μl. To sprawia, że rozmiar otworu na końcu końcówki ma około 1 mm szerokości. Powinno to wystarczyć do wybicia DCN. Ale można to również dostosować w razie potrzeby w zależności od sekcji. Przygotuj wiele końcówek do łatwej wymiany i regulacji.
  4. Oznacz probówki do mikrofug o pojemności 1,5 ml z identyfikacją zwierzęcia i obszarem móżdżku (cztery probówki na zwierzę).
  5. Napełnij pojemnik cryosafe ciekłym azotem, aby błyskawicznie zamrozić tkankę po ekstrakcji.

2. Ekstrakcja i sekcja mózgu

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetów ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Minnesoty.

  1. Poddaj mysz eutanazji przy użyciu 5% ekspozycji na CO2 . Po ustaniu oddychania wykonaj zwichnięcie szyjki macicy. Odetnij głowę myszy nożyczkami do dekapitacji i wyrzuć tuszę do odpowiedniego pojemnika.
  2. Wykonaj nacięcie żyletką wzdłuż przyśrodkowej linii strzałkowej głowy, zaczynając od nosa i kontynuując aż do tyłu. Oddziel skórę, rozchylając się po obu stronach linii środkowej. Użyj żyletki, aby odciąć mięsień z każdej strony, przecinając kanały słuchowe.
  3. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przytnij wszystkie obszary rdzenia kręgowego, aż do miejsca, w którym pień mózgu styka się z móżdżkiem, uważając, aby nie uszkodzić móżdżku.
  4. Włóż jedno z ostrzy nożyczek naczyniowych w przestrzeń między pniem mózgu a kręgosłupem i przetnij w kierunku kanału słuchowego, podnosząc nożyczki, aby czysto przeciąć kość, ale ograniczyć uszkodzenie tkanki.
  5. Kontynuuj cięcie wzdłuż krawędzi czaszki w kierunku opuszki węchowej, kontynuując podnoszenie podczas cięcia, aby ograniczyć uszkodzenie tkanki mózgowej.
  6. Za pomocą kleszczy delikatnie oderwij tylną część czaszki, odsłaniając tylną część mózgu i móżdżku.
  7. Używając kleszczy wzdłuż krawędzi czaszki, która właśnie została przecięta, oderwij resztę czaszki w górę i nad mózgiem. Ten krok powinien usunąć większość czaszki, odsłaniając mózg.
  8. Przytnij resztę czaszki nożyczkami naczyniowymi i kleszczami, usuwając większość czaszki z górnej części mózgu.
  9. Za pomocą mikroszpatułki lekko unieś mózg, zgarnij go i przesuń w górę, aby usunąć opuszki węchowe z pozostałej czaszki i odłączyć włókna przewodu wzrokowego. W tym momencie mózg powinien łatwo się uwolnić.
  10. Umieść mózg na szalce Petriego siedząc na lodzie i usuń pozostałą czaszkę lub inne szczątki.
  11. Za pomocą mikroszpatułki delikatnie umieść mózg w macierzy mózgowej grzbietem do góry. Poświęć trochę czasu, aby upewnić się, że jest ustawiony na poziomie w macierzy, zwłaszcza że linia środkowa znajduje się w środku macierzy. Ta matryca jest przeznaczona dla tkanki mózgowej dorosłej myszy, tkanka od młodszych lub chorych zwierząt może spoczywać niżej w matrycy, ale nadal powinno być możliwe osiągnięcie powtarzalnych wyników w próbkach.
  12. Umieść jedną żyletkę wzdłuż strzałkowej linii środkowej, upewniając się, że ostrze dociska się do samego dołu matrycy (Rysunek 1B).
  13. Umieść kolejną żyletkę 1 mm z boku pierwszego ostrza (Rysunek 1B). Umieść dwa kolejne ostrza w odległości 1 mm od siebie. Efektem końcowym powinny być trzy ostrza umieszczone po jednej stronie mózgu, wszystkie oddalone od siebie o 1 mm. Zrób to samo z drugą stroną. W sumie 7 ostrzy zostanie rozmieszczonych w odległości 1 mm od siebie (Rysunek 1C).
  14. Ostrożnie chwyć przedni i tylny koniec żyletek i podnieś prosto z matrycy. Tkankę znajdującą się na zewnątrz żyletek można wyrzucić.
  15. Powoli oddzielaj jedną żyletkę na raz od pozostałych, uważając, aby nie uszkodzić odcinków tkanki.
  16. Ostrożnie zsuń fragment tkanki z żyletki na szkiełko za pomocą mikroszpatułki. W sumie będzie to sześć strzałkowych sekcji mózgu (Rysunek 1D).
  17. 4 najbardziej boczne sekcje będą miały widoczny DCN (fioletowe pole, Rysunek 1D). Aby wyizolować DCN, przytrzymaj przyciętą końcówkę pipety o pojemności 200 μl prostopadle do DCN i mocno dociśnij tkankę, kołysząc się we wszystkich kierunkach, aby w pełni wypreparować DCN z otaczającej tkanki. Podnieś prosto z powrotem, aby czysto usunąć DCN i wizualnie potwierdzić obecność tkanki w końcówce.
  18. Umieść jeden palec na górze końcówki i popchnij w dół, powodując wybrzuszenie tkanki. Umieść końcówkę w prawidłowo oznakowanej probówce do mikrofugi i upewnij się, że dziurkacz do tkanek jest umieszczony na dnie tuby. Powtórzyć czynności 2.17 dla pozostałych trzech sekcji, umieszczając stemple DCN w tej samej probówce. Umieść probówkę w ciekłym azocie, aby błyskawicznie zamrozić. Reprezentacja rozmiaru każdego stempla w Rysunek 1E.
  19. Sekcje, z których wyekstrahowano DCN, kwalifikują się jako półkula móżdżku. W tych sekcjach odepchnij resztę tkanki mózgowej wokół móżdżku. Użyj kleszczy i delikatnie podnieś te sekcje kory móżdżku półkuli i umieść w odpowiedniej probówce do mikrofuge. Błyskawiczne zamrożenie.
  20. Dla dwóch ostatnich sekcji robaka (jasnoniebieska ramka, Ryc. 1D) odepchnij otaczającą tkankę mózgową, pozostawiając tylko móżdżek. Za pomocą żyletki wykonaj nacięcie oddzielające przednie zraziki od tylnych zrazików. Cięcie powinno nastąpić tuż po utworzeniu zrazika 6 i nie powinno obejmować zrazika 10 (Rysunek 1F).
  21. Za pomocą kleszczy ostrożnie umieść przednie odcinki kory móżdżku i tylne odcinki kory móżdżku w odpowiednich rurkach do mikrofuge i błyskawicznie zamroź, pozostawiając rurki w ciekłym azocie na 5 minut. Stąd przejdź do ekstrakcji RNA lub może przechowywać probówki w temperaturze -80 °C.

3. Ekstrakcja RNA

UWAGA: Ten protokół jest zmodyfikowany w stosunku do protokołu Cold Spring Harbor dla ekstrakcji RNA za pomocą TRIzol20. TRIzol rozpuszcza materiał biologiczny, umożliwiając ekstrakcję RNA.

  1. Umieść probówki do mikrofuge w lodzie, aby zapobiec zbyt szybkiemu rozmrażaniu tkanki, nałóż 150 μl zimnego TRIzolu do probówki do mikrofugi. Homogenizować za pomocą wysterylizowanego tłuczka. Po homogenizacji tkanki pipetuj roztwór w górę iw dół, aby upewnić się, że nie ma nienaruszonej pozostałej tkanki. Następnie rozdrobnij wszelkie małe kawałki tkanki, wciągając je kilka razy do strzykawki insulinowej.
  2. Dodaj kolejne 350 μl TRIzolu i pipetuj w górę iw dół, aby dokładnie wymieszać. Odstawić w temperaturze pokojowej na 5 minut.
  3. Do probówki dodać 150 μl chloroformu i energicznie wstrząsnąć, a następnie odstawić na 2-3 minuty. Chloroform rozdziela homogenizowany roztwór tkankowy na fazy (RNA, DNA i białko).
  4. Wirować przy 12 000 x g, w temperaturze 15°C, przez 10 minut. Upewnij się, że wszystkie rurki są w tej samej orientacji.
  5. Ostrożnie wyjmij probówki i ustaw temperaturę wirówki na 4°C. Do nowej probówki (jest to RNA), należy usunąć tylko klarowną fazę wodną (RNA), uważając, aby nie zakłócić nieprzezroczystej interfazy (DNA). Najniższa faza będzie czerwona i będzie zawierać białko. Pozostały roztwór w probówkach można zachować lub wyrzucić.
  6. Dodać 100% alkoholu izopropylowego w stosunku 1:2 (w przypadku usunięcia 200 ul fazy wodnej dodać 100 μl alkoholu izopropylowego). Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Odstaw w temperaturze pokojowej na 10 minut. Alkohol izopropylowy wytrąca RNA z roztworu.
  7. Wirować przy 12 000 x g, w temperaturze 4°C, przez 10 minut. Pamiętaj, aby umieścić wszystkie rurki w tej samej orientacji, aby ułatwić wizualizację granulki. Powstała osadka będzie wyekstrahowanym RNA.
  8. Ostrożnie wyjąć probówki, usunąć sklarowany osad pipetą, uważając, aby nie naruszyć osadu. Osad jest nieco żelowy i będzie trudny do zobaczenia, ale powinien być w stanie oszacować, gdzie się znajduje, na podstawie orientacji probówek w wirówce.
  9. Po usunięciu całego supernatantu dodać 500 μl 75% etanolu, krótko zmieszać i odwirować przy 7500 x g, w temperaturze 4°C, przez 5 minut. Etanol dodatkowo myje granulki.
  10. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu. Pozostawić otwarte nakrętki w celu wysuszenia próbki. Zwykle zajmuje to 5-10 minut, ale może się różnić w zależności od tego, ile etanolu pozostało na granulce. Nie suszyć zbyt mocno.
  11. Po wyschnięciu ponownie zawiesić granulki w wodzie wolnej od DNaz. Dodać 20 μl do próbek dla DCN i 30 μl dla wszystkich pozostałych.
  12. Po ponownym zawieszeniu próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub przejść do dalszych badań.

4. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RTqPCR)

  1. Przed tym krokiem konieczne będzie poddanie RNA działaniu DNazy w celu usunięcia genomowego DNA i wygenerowania cDNA za pomocą iScript firmy BioRad. Pamiętaj, aby znormalizować stężenie RNA przed wytworzeniem cDNA. Ponadto ważne jest, aby zoptymalizować startery pod kątem qPCR. Postępuj zgodnie z opisanymi tutaj metodami, aby wykonać ten krok21. Krótki opis qPCR poniżej.
  2. Wszystkie podkłady są kupowane w IDT. Sekwencje do przodu i do tyłu znajdują się w tej samej probówce z próbką i są przechowywane w stężeniu 20x.
    Rps18 (gen kontrolny):
    Naprzód – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
    Rewers – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
    Parwalbumina (białko wiążące wapń, komórki hamujące):
    Naprzód – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
    Rewers – '5-AGCGTCTTTTTTTCTTTAGCAG-3'
    Kcng4 (podjednostka kanału potasowego):
    Naprzód – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
    Rewers – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
    Aldolaza C (Zebrin II, różnicowo wyrażana w korze móżdżku):
    Naprzód – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3'
    Rewers – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3'
  3. Warunki qPCR były następujące. Okres wstępnej inkubacji, 5 minut, w temperaturze 95°C. Okres amplifikacji, 50 cykli: 10 minut w temperaturze 95°C, 10 minut w temperaturze 62°C i 10 minut w temperaturze 72°C. Okres krzywej topnienia: 5 sekund w temperaturze 95°C, jedna minuta w temperaturze 65°C, i ustaw szybkość narastania na 0,07°C/sekundę, aż do temperatury docelowej 97°C. Następnie okres schładzania przez 10 minut do 40°C. Wszystkie reakcje qPCR przeprowadzono trzykrotnie, a ekspresję genów analizowano przy użyciu 2-ΔΔCt z Rps18 jako kontroli obciążenia w celu normalizacji ekspresji genów. Jako odniesienie użyto ekstraktu z móżdżku luzem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tych eksperymentów użyto czterech jedenastotygodniowych samic myszy typu dzikiego C57/Black6. Jedna mysz została wykorzystana do przeprowadzenia pełnej sekcji móżdżku, która jest określana jako "masowy móżdżek" i pozwoliła na porównanie poziomów RNA w wypreparowanych obszarach z pełną sekcją. Pozostałe trzy myszy wykorzystano do przeprowadzenia sekcji móżdżku opisanej w tym protokole. Wykorzystanie trzech myszy umożliwia zapewnienie, że trendy wykryte w poziomach RNA są powtarzalne u w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana metoda umożliwia ocenę podstawowej ekspresji genów i mechanizmów molekularnych w czterech odrębnych regionach móżdżku – głębokich jądrach móżdżku (DCN), przedniej korze móżdżku robaka (CCaV), tylnej korze móżdżku robaka (CCpV) i korze móżdżku półkul (CCH). Możliwość oceny tych regionów oddzielnie poszerzy naszą wiedzę na temat heterogeniczności poszczególnych regionów móżdżku i być może rzuci światło na ich wkład w różne zachowania.

Poprzez przekrojenie całej tkanki mózgowej strzałkowo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Austinowi Ferro i Juao-Guilherme Rosa z laboratorium Cvetanovic za ich pomoc w rozwiązywaniu problemów z sekcjami oraz w ekstrakcji RNA i RTqPCR. Badania te są finansowane przez M. Cvetanovic, R01 NS197387; HHS | Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1.5 Probówki do mikrowirówekThermoScietific3456
100% alkohol izopropylowyVWR Nauki przyrodnicze1106C361
200 ul Końcówki do pipetGeneMateP-1237-200
Matryca mózgu dorosłej myszy strzałkowaKent Scientific CorporationRBMA-200S
kleszcze
ChloroformMacron220905
Nożyczki
Nożyczki
Alkohol etylowySzkiełko szklane Pharmco111000200
(do elektroforezy)Homogenizator BIORAD
Kimble6HAZ6
Wiadro
Strzykawka insulinowa (.5ml)BD329461
iScript Adv zestaw cDNA do RT-qPCRBIORAD1725037
Micro Spatula
Igła Kleszcze
Szalka PetriegoPyrex
Primetime Primer do aldolazy CIDTMm.PT.58>43415246
Primetime Primer dla Kcng4IDTMm.PT.56a.9448518
Primetime Primer dla parvalbuminyIDTMm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18 IDTMm.PT.58.12109666
Ostrza jednoostrzoweLitera GEM
Sterylne tłuczki do użytku syglerowegoFisherScientific12141364
TRIzol OdczynnikAmbion by Life Technologies15596018
Nożyczki
do dekapitacjipreparacyjne na lóddo nosa naczyniowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  2. Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
  3. Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401(2018).
  4. Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
  5. Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
  6. King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
  7. Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
  8. Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
  9. Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
  10. Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
  11. Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
  12. Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
  13. Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
  14. Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513(2019).
  15. Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
  16. Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
  17. Grabert, K., et al. Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504(2016).
  18. Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
  19. Cendelin, J. From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
  20. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  21. Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
  22. Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , Online Preprint (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Disekcja m d kug bokie j dra m d kukora m d kuprzekroje robakakora p kulwycinanie fragment w tkankiizolacja RNAilo ciowy PCRanaliza ekspresji gen wpor wnanie regionalne

Powiązane artykuły