Artykuł metodologiczny

Xenopus laevis (Xenopus laevis) Przygotowanie ekstraktu z jaj i metody obrazowania na żywo do wizualizacji dynamicznej organizacji cytoplazmy

DOI:

10.3791/61923

⸱

6 czerwca 2021

 , 
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine, 2Current Address: Department of Biological Sciences, University of Southern California, 3Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę przygotowania i obrazowania na żywo nierozcieńczonych ekstraktów cytoplazmatycznych z jaj Xenopus laevis.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjnie używane do masowych testów biochemicznych, ekstrakty z jaj Xenopus laevis stały się potężnym narzędziem opartym na obrazowaniu do badania zjawisk cytoplazmatycznych, takich jak cytokineza, tworzenie wrzeciona mitotycznego i składanie jądra. Opierając się na wczesnych metodach, które obrazowały utrwalone ekstrakty próbkowane w rzadkich punktach czasowych, najnowsze podejścia obrazują ekstrakty na żywo za pomocą mikroskopii poklatkowej, ujawniając bardziej dynamiczne cechy o zwiększonej rozdzielczości czasowej. Metody te zwykle wymagają wyrafinowanej obróbki powierzchni naczynia obrazowego. W tym miejscu przedstawiamy alternatywną metodę obrazowania na żywo ekstraktów z jaj, które nie wymagają chemicznej obróbki powierzchni. Jest prosty do wdrożenia i wykorzystuje masowo produkowane laboratoryjne materiały eksploatacyjne do obrazowania. Opisujemy system, który może być stosowany zarówno w mikroskopii szerokokątnej, jak i konfokalnej. Jest przeznaczony do obrazowania ekstraktów w polu 2-wymiarowym (2D), ale można go łatwo rozszerzyć do obrazowania w 3D. Doskonale nadaje się do badania tworzenia wzorców przestrzennych w cytoplazmie. Dysponując reprezentatywnymi danymi, wykazujemy typową dynamiczną organizację mikrotubul, jąder i mitochondriów w ekstraktach międzyfazowych przygotowanych tą metodą. Te dane obrazowe mogą dostarczyć informacji ilościowych na temat dynamiki cytoplazmy i organizacji przestrzennej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytoplazma stanowi główną objętość komórki i ma odrębną organizację. Składniki cytoplazmy eukariotycznej mogą samoorganizować się w szeroki zakres struktur przestrzennych, takich jak astry mikrotubul i aparat Golgiego, które z kolei są dynamicznie układane i obracane w zależności od tożsamości komórki i stanu fizjologicznego. Zrozumienie organizacji przestrzennej cytoplazmy i jej związku z funkcjami komórkowymi jest zatem ważne dla zrozumienia, jak działa komórka. Ekstrakty z jaj Xenopus laevis były tradycyjnie używane do masowych testów biochemicznych1,2,3,4,5,6,7,8, ale ostatnie prace wskazują, że jest to potężny system obrazowania na żywo do mechanistycznych badań struktur cytoplazmatycznych i ich funkcji komórkowych9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Te nierozcieńczone ekstrakty zachowują wiele struktur i funkcji cytoplazmy, umożliwiając jednocześnie bezpośrednie manipulowanie zawartością cytoplazmy, co nie jest osiągalne w konwencjonalnych modelach komórkowych19,20. To sprawia, że idealnie nadają się do charakteryzowania zjawisk cytoplazmatycznych i analizowania ich mechanistycznych podstaw.

Istniejące metody obrazowania ekstraktów wymagają chemicznych modyfikacji powierzchni lub produkcji urządzeń mikroprzepływowych. Jedna metoda oparta na szkiełkach nakrywkowych wymaga pasywacji szkła za pomocą glikolu polietylenowego (PEG) szkiełek nakrywkowych21. Metoda oparta na mikroemulsji wymaga osadzania z fazy gazowej trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanu na powierzchniach szklanych22,23. Systemy oparte na mikroprzepływach umożliwiają precyzyjną kontrolę objętości, geometrii i składu kropelek ekstraktu, ale wymagają specjalistycznych urządzeń do mikroprodukcji11,12,24.

Tutaj wprowadzamy alternatywną metodę obrazowania ekstraktów z jaj, która jest łatwa do wdrożenia i wykorzystuje łatwo dostępne, tanie materiały. Obejmuje to przygotowanie komory obrazowania ze szkiełkiem podstawowym i szkiełkiem nakrywkowym pokrytym taśmą z fluorowanego etylenu i propylenu (FEP). Komora może być używana do obrazowania ekstraktów za pomocą różnych systemów mikroskopowych, w tym stereoskopów oraz mikroskopów pionowych i odwróconych. Metoda ta nie wymaga chemicznej obróbki powierzchni przy jednoczesnym osiągnięciu podobnej przejrzystości optycznej uzyskanej przy użyciu istniejących metod na bazie szkła omówionych powyżej. Jest przeznaczony do obrazowania warstwy ekstraktów o jednolitej grubości w polu 2D i można go łatwo rozszerzyć w celu zobrazowania objętości ekstraktów 3D. Doskonale nadaje się do obrazowania poklatkowego zbiorowego zachowania cytoplazmatycznego w dużym polu widzenia.

Użyliśmy ekstraktów z jaj zatrzymanych w interfazie, aby zademonstrować naszą metodę obrazowania. Przygotowanie ekstraktu jest zgodne z protokołem Deminga i Kornbluth19. Krótko mówiąc, jaja naturalnie zatrzymane w metafazie mejozy II są miażdżone przez wirowanie o niskiej prędkości. Ten spin uwalnia cytoplazmę z zatrzymania mejotycznego i pozwala ekstraktowi przejść w interfazę. Zwykle cytochalazyna B jest dodawana przed wirowaniem kruszącym, aby zahamować tworzenie F-aktyny. Można go jednak pominąć, jeśli pożądana jest F-aktyna. Cykloheksymid jest również dodawany przed wirowaniem kruszącym, aby zapobiec przedostawaniu się ekstraktu interfazowego do następnej mitozy. Ekstrakty są następnie umieszczane we wspomnianych komorach obrazowania i umieszczane pod mikroskopem. Na koniec obrazy są rejestrowane w czasie w określonych odstępach czasu przez kamerę podłączoną do mikroskopu, tworząc serie zdjęć poklatkowych, które rejestrują dynamiczne zachowanie ekstraktu w polu 2D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Stanforda.

1. Przygotowanie preparatów i szkiełek nakrywkowych

  1. Nałóż warstwę taśmy klejącej z fluorowanego etylenu i propylenu (FEP) na szkiełko za pomocą aplikatora rolkowego. Odetnij nadmiar taśmy na krawędziach czystą żyletką. W ten sam sposób przygotuj szkiełka nakrywkowe powlekane taśmą FEP (Rysunek 1A).
  2. Nałóż dwustronną, lepką przekładkę obrazową na stronę szkiełka pokrytą taśmą FEP. Pozostaw wkładkę ochronną na wierzchu nieobraną (Rysunek 1A).
    UWAGA: Szkiełka podstawowe i nakrywkowe należy przygotować przed eksperymentem. Można je zużyć natychmiast lub przechowywać w pudełkach, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu na powierzchniach. Studzienka w ramce obrazowej ma głębokość 120 μm i średnicę 9 mm.

2. Przygotowanie i obrazowanie na żywo ekstraktów z jaj zatrzymanych w interfazie

UWAGA: Następujący protokół jest zaadaptowany z Deminga i Kornbluth19, Murray20, oraz Smythe i Newport25 z modyfikacjami. Wszystkie czynności należy wykonywać w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Trzy do dziesięciu dni przed pobraniem komórek jajowych wstrzyknąć dojrzałe samice żab Xenopus laevis podskórnie do grzbietowego worka limfatycznego ze 100 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG).
  2. Szesnaście do osiemnastu godzin przed planowanym pobraniem komórek jajowych wstrzyknąć żabom z kroku 2.1 500 j.m. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG). Pozostawić żaby w temperaturze 18 °C w buforze do składania jaj (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO,4·7H2O, 2,5 mM CaCl2·2H2O, 0,5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, przygotować jako 20x roztwór podstawowy o pH 7,4 i rozcieńczyć czystą wodą ze zbiornika żaba do 1x przed użyciem) do momentu zebrania jaj.
  3. W dniu eksperymentu zbierz jaja na dużą szklaną szalkę Petriego i oceń jakość jaj. Wyrzuć wszystkie jajka, które wyglądają jak białe, puszyste kulki lub pojawiają się w ciągu (Rysunek 1B). Zbadaj jaja pod stereoskopem, utrzymuj jaja o normalnym wyglądzie (Rysunek 1C) i odrzuć te z nieregularnym lub cętkowanym pigmentem (Rysunek 1D).
    UWAGA: Ten protokół działa z jajami pobranymi od pojedynczej żaby, która zwykle składa 25 ml jaj w ciągu 16 godzin po wstrzyknięciu hCG. Zwykle hCG indukuje od 3 do 6 żab, a do eksperymentu z przygotowaniem ekstraktu wybiera się żabę o najwyższej jakości jaj.
  4. Przenieść jaja do szklanej zlewki o pojemności 400 ml i usunąć jak najwięcej buforu do składania jaj przez dekantację.
  5. Jaja należy inkubować w 100 ml świeżo przygotowanego roztworu do deżelacji (2% w/v L-cysteiny w wodzie, dostosować do pH 8,0 za pomocą NaOH) i delikatnie je okresowo obracać. Po około 3 minutach odlej roztwór i dodaj 100 ml świeżego roztworu do deżelacji. Kontynuuj inkubację, aż jaja będą szczelnie upakowane (bez odstępów między jajami), ale unikaj pozostawiania jaj w roztworze dejellying na dłużej niż 5 minut.
  6. Usunąć jak najwięcej roztworu dejellying przez dekantację i umyć jaja w 0,25x buforze MMR (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, przygotowanym jako 10x roztwór podstawowy, doprowadzonym do pH 7,8 za pomocą NaOH i rozcieńczonym w wodzie Milli-Q przed użyciem) przez dodanie buforu, wirowanie jaj, a następnie wylanie buforu. Powtórz kilka razy, aż do całkowitego zużycia 1 l buforu do prania.
  7. Umyj jaja kilka razy łącznie 400 ml buforu do lizy jaj (250 mM sacharozy, 10 mM HEPES, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, świeżo przygotowanych i dostosowanych do pH 7,7 z KOH). Usuń jaja o nietypowym wyglądzie za pomocą pipety Pasteura między myciami.
    UWAGA: Jaja o nietypowym wyglądzie odnoszą się do tych, które wyglądają jak białe, opuchnięte kulki (Rysunek 1B), mają cętkowaną pigmentację (Rysunek 1D), pogarszają się z rosnącym białym obszarem (Rysunek 1E) lub wykazują przyciemniony i skurczony pigmentowany obszar na półkuli zwierzęcej (Rysunek 1F).
  8. Za pomocą pipety transferowej z szeroko rozciętą końcówką przenieś jaja do 17 ml okrągłodennej probówki wirówkowej zawierającej 1 ml buforu do lizy jaj. Wirować probówkę w wirówce klinicznej o masie 400 x g przez 15 sekund, aby zapakować jajka.
  9. Usunąć jak najwięcej buforu do lizy jaj z wierzchu zapakowanych jaj za pomocą pipety Pasteura.
    UWAGA: Ważne jest, aby usunąć jak najwięcej buforu z zapakowanych jaj, aby zminimalizować rozcieńczenie ekstraktu jajowego. Czasami w tym celu konieczne jest usunięcie niektórych luźnych jaj wraz z resztkowym buforem.
  10. Określ przybliżoną objętość zapakowanych jaj, a następnie dodaj 5 μg/ml aprotyniny, 5 μg/ml leupeptyny, 5 μg/ml cytochalazyny B i 50 μg/ml cykloheksymidu bezpośrednio na wierzch zapakowanych jaj.
    UWAGA: Aprotynina i leupeptyna są inhibitorami proteazy. Cytochalazyna B hamuje polimeryzację aktyny, zapobiegając kurczeniu się i żelowaniu ekstraktu26. Cykloheksymid hamuje syntezę białek, utrzymując w ten sposób ekstrakt w interfazie cyklu komórkowego.
  11. Rozdrobnić jaja, odwirowując probówkę o temperaturze 12 000 x g, 4 °C, przez 15 minut, w obracającym się wirniku kubełkowym.
    UWAGA: Pod koniec wirowania jaja powinny pęknąć, a lizat powinien zostać rozdzielony na trzy główne warstwy: żółtą warstwę lipidową na górze, ekstrakt cytoplazmatyczny (zwany również ekstraktem surowym) w środku i ciemną, gęstą warstwę zawierającą granulki pigmentu na dole (Rysunek 1G).
  12. Podłączyć igłę o rozmiarze 18 do strzykawki. Z końcówką igły skierowaną skosem do góry, przekłuć rurkę od boku na dole warstwy cytoplazmatycznej i odzyskać ekstrakt, ciągnąc powoli.
    UWAGA: Ekstrakt cytoplazmatyczny należy pobierać powoli, aby uniknąć włączenia zanieczyszczającej zawartości z żółtej warstwy lipidowej.
  13. Przenieś odzyskany ekstrakt cytoplazmatyczny do nowej probówki mikrowirówkowej i trzymaj ją na lodzie. Ekstrakt należy zużyć w ciągu 1 godziny.
  14. Gdy będziesz gotowy do obrazowania, uzupełnij ekstrakt żądanymi odczynnikami i sondami do obrazowania fluorescencyjnego.
    UWAGA: Sondy do obrazowania fluorescencyjnego znakują określone struktury cytoplazmatyczne, aby można je było uwidocznić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
  15. Usuń górną warstwę ochronną z przekładki obrazowej na szkiełku przygotowanym w kroku 1.2 i umieść około 7 μl ekstraktu na środku studzienki. Natychmiast nałożyć szkiełko nakrywkowe pokryte taśmą FEP stroną FEP skierowaną w stronę ekstraktu, aby uszczelnić studzienkę. Szybko przejdź do obrazowania (Rysunek 1H,I).
  16. Ustaw szkiełko na mikroskopie odwróconym lub pionowym z zmotoryzowanym stolikiem i kamerą cyfrową. Zobrazuj ekstrakty w żądanych pozycjach przestrzennych i odstępach czasu zarówno w kanale jasnego pola, jak i w kanale fluorescencyjnym.
    UWAGA: Zazwyczaj do obrazowania używa się obiektywu 5x. Zmotoryzowany stolik umożliwia automatyczną akwizycję obrazu w wielu zdefiniowanych pozycjach przestrzennych. Mikroskopia jasnego pola wizualizuje struktury cytoplazmatyczne o różnym stopniu przezroczystości. Mikroskopia fluorescencyjna wizualizuje struktury cytoplazmatyczne specjalnie znakowane przez sondy do obrazowania fluorescencyjnego dodane w kroku 2.14. Kamera rejestruje poklatkowe obrazy tych struktur, rejestrując w ten sposób dynamikę organizacji cytoplazmatycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstrakty z jaj Xenopus laevis mogą być używane do badania samoorganizacji cytoplazmy podczas interfazy. Rysunek 2A pokazuje wyniki udanego eksperymentu. Uzupełniliśmy ekstrakty z zatrzymaną interfazą zdemembranowanymi jądrami plemników Xenopus laevis19 o stężeniu 27 jąder/μL i 0,38 μM oczyszczonym GST-GFP-NLS27,28,29,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstrakty z jaj Xenopus laevis stały się potężnym systemem modelowym do badań obrazowych różnych struktur subkomórkowych 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 i organizacji cytoplazmatycznej na

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy J. Kamenzowi, Y. Chenowi i W. Y. C. Huangowi za komentarze do manuskryptu. Praca ta została wsparta grantami z National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 i R35 GM131792) przyznanymi Jamesowi E. Ferrellowi, Jr.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka wirówkowa 17 mlBeckman Coulter337986
kwadrat 22x22 mm #1 szkło nakrywkoweCorning284522
AprotyninaMiliporeSigma10236624001Inhibitor proteazy
CykloheksymidMiliporeSigma01810Inhibitor syntezy białek
Cytochalazyna BMiliporeSigmaC6762Aktyna Inhibitor polimeryzacji
Samica Xenopus laevis żabyNascoLM00535MX
Fluorescencyjne białko tubulinowe znakowane HiLyte 488Cytoskeleton, Inc.TL488M-ADo wizualizacji cytoszkieletu mikrotubul
Fluorescencyjny HiLyte 647 znakowany białkiem tubulinyCytoskeleton, Inc.TL670M-A Dowizualizacji cytoszkieletu mikrotubul
Taśma optycznie przezroczysta z fluorowanego etylenu i propylenu (FEP)CS Hyde company23-FEP-2-5
Szklana pipeta PasteuraFisher Scientific13-678-20C
Ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG)MiliporeSigmaCG10
Dystans obrazowaniaMikroskopia elektronowa Nauki70327-8S
LeupeptinMilliporeSigma11017101001Inhibitor proteazy
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-518-100B
Olej mineralnyMilliporeSigma330760
MitoTracker Red CMXRosThermo Fisher ScientificM7512Do wizualizacji mitochondriów
Gonadotropina surowicy ciężarnej klaczy (PMSG)BioVendorRP1782725000
Aplikator rolkowyAmazonB07HMBJSP8Do nakładania taśmy FEP na szkiełka i szkiełka nakrywkowe
Jednosieczne żyletkiFisher Scientific12-640Do usuwania nadmiaru taśmy FEP
Pipeta transferowaFisher Scientific13-711-7M

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
  2. Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
  3. Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
  4. Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
  5. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
  6. Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
  7. Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
  8. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
  9. Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
  10. Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
  11. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
  12. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
  13. Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
  14. Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
  15. Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
  16. Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
  17. Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
  18. Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
  19. Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
  20. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  21. Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  22. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
  23. Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240(2018).
  24. Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
  25. Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
  26. Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).
  27. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
  28. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
  29. Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
  30. Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
  31. Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
  32. Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
  33. Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
  34. Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
  35. Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
  36. Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
  37. Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
  38. Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  39. Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakt z jaj Xenopuspasywacja ta my FEPmikroskopia poklatkowakonfokalna mikroskopia szerokopolowaprzestrzenna formacja wzor wdynamika mikrotubulpartycjonowanie mitochondri w

Powiązane artykuły