Przedstawiono tutaj protokół dostarczania oligonukleotydów, takich jak mało-interferujące RNA (siRNA), mimiki mikro-RNA (miRs) lub anty-mikro-RNA (anty-miR) do dojrzałych adipocytów w celu modulacji ekspresji białek i mikro-RNA.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model hodowli komórek adipocytów do badania wpływu modulacji białek i mikro-RNA na funkcję adipocytów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zmiana funkcji adipocytów przyczynia się do patogenezy chorób metabolicznych, w tym cukrzycy typu 2 i insulinooporności. Podkreśla to potrzebę lepszego zrozumienia mechanizmu molekularnego zaangażowanego w dysfunkcję adipocytów w celu opracowania nowych terapii przeciwko chorobom związanym z otyłością. Modulowanie ekspresji białek i mikro-RNA w adipocytach pozostaje dużym wyzwaniem. W artykule opisano protokół różnicowania mysich fibroblastów na dojrzałe adipocyty oraz modulowania ekspresji białek i mikro-RNA w dojrzałych adipocytach poprzez odwrotną transfekcję przy użyciu oligonukleotydów naśladujących małe interferujące RNA (siRNA) i mikro-RNA (mimik miR). Ten protokół odwrotnej transfekcji obejmuje inkubację odczynnika do transfekcji i oligonukleotydów w celu utworzenia kompleksu na płytce hodowli komórkowej, do którego dodaje się dojrzałe adipocyty. Adipocyty mogą następnie ponownie przyłączyć się do przylegającej powierzchni płytki w obecności kompleksu oligonukleotydów/odczynników do transfekcji. Analizy funkcjonalne, takie jak badanie sygnalizacji insuliny, wychwytu glukozy, lipogenezy i lipolizy, można przeprowadzić na transfekowanych dojrzałych adipocytach 3T3-L1 w celu zbadania wpływu manipulacji białkiem lub mikro-RNA na funkcję adipocytów.
Wprowadzenie
Otyłość jest uważana za główny czynnik ryzyka wielu chorób metabolicznych, w tym insulinooporności (IR), cukrzycy typu 2 (T2D) i chorób sercowo-naczyniowych1. Obecne terapie nie są w stanie powstrzymać stale rosnącej częstości występowania tych chorób, a leczenie IR u pacjentów otyłych i chorych na cukrzycę pozostaje ważnym problemem klinicznym. Tkanka tłuszczowa odgrywa kluczową rolę w kontroli homeostazy energetycznej, a jej patologiczne rozrosty w czasie otyłości przyczynia się do rozwoju IR i T2D2,3. Podkreśla to potrzebę lepszego zrozumienia mechanizmu molekularnego zaangażowanego w dysfunkcję adipocytów w celu opracowania nowych terapii przeciwko chorobom związanym z otyłością. W wielu badaniach naukowych badano rolę RNA kodujących białka w fizjologii adipocytów i ich związek z otyłością.
Niedawno, odkrycie niekodujących RNA (ncRNA), zwłaszcza mikro-RNA (miR), stworzyło nowe koncepcje związane z mechanizmem regulacji programów ekspresji genów. Badania wykazały, że ncRNA są ważnymi regulatorami funkcji adipocytów, a ich rozregulowanie odgrywa ważną rolę w chorobach metabolicznych4. W związku z tym manipulacja białkami i ncRNA w adipocytach ma kluczowe znaczenie dla rozszyfrowania ich roli w funkcjonowaniu adipocytów i ich wpływu na patologie, takie jak cukrzyca typu 2. Jednak manipulowanie ekspresją białek i ncRNA in vivo, a także w pierwotnych adipocytach, pozostaje dużym wyzwaniem, co sprzyja stosowaniu modeli adipocytów in vitro.
Mysie fibroblasty 3T3-L1 łatwo różnicują się w dojrzałe, funkcjonalne i reagujące na insulinę adipocyty, które są dobrze scharakteryzowaną linią komórkową używaną do badania funkcji adipocytów (np. sygnalizacji insuliny, wychwytu glukozy, lipolizy i wydzielania adipokin)5,6,7,8,9,10. Te właściwości sprawiają, że adipocyty 3T3-L1 są atrakcyjnym modelem do modulowania ekspresji białek kodujących i nc-RNA w celu rozszyfrowania ich roli w funkcjonowaniu adipocytów i ich potencjalnej roli w chorobach związanych z otyłością. Niestety, podczas gdy fibroblasty 3T3-L1 są łatwe do transfekcji przy użyciu dostępnych na rynku odczynników, zróżnicowane adipocyty 3T3-L1 są jednymi z najtrudniejszych do transfekcji linii komórkowych. Dlatego liczne badania manipulujące ekspresją genów w komórkach 3T3-L1 koncentrowały się na różnicowaniu adipocytów, a nie na funkcji adipocytów.
Przez długi czas jedyną skuteczną techniką transfekcji adipocytów była elektroporacja5, która jest żmudna, kosztowna i może powodować uszkodzenia komórek. W artykule opisano technikę odwrotnej transfekcji przy użyciu powszechnie używanego odczynnika do transfekcji, która skraca czas potrzebny na transfekcję, nie ma wpływu na żywotność komórek i jest znacznie tańsza niż elektroporacja. Protokół ten doskonale nadaje się do transfekcji siRNA i innych oligonukleotydów, takich jak mimiki mikro-RNA (mimiki) i anty-miR. Zasada protokołu odwrotnej transfekcji polega na inkubacji odczynnika do transfekcji i oligonukleotydów w celu utworzenia kompleksu na płytce hodowli komórkowej, a następnie zasianiu dojrzałych adipocytów w studzienkach. Następnie adipocyty ponownie przyczepiają się do przylegającej powierzchni płytki w obecności kompleksu oligonukleotydów/odczynników do transfekcji. Ta prosta, wydajna i niedroga metodologia pozwala na badanie roli kodujących białka RNA i miR w funkcji adipocytów oraz ich potencjalnej roli w chorobach związanych z otyłością.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Użyj sterylnych technik, aby wykonać wszystkie kroki protokołu w kapturze do hodowli komórek z przepływem laminarnym. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich odczynników i sprzętu.
1. Różnicowanie mysich fibroblastów 3T3-L1 w adipocyty
- Hoduj fibroblasty 3T3-L1 na 100 mm szalkach w pożywce hodowlanej-DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% surowicy nowonarodzonych cieląt oraz 1% penicyliny i streptomycyny (Rysunek 1A). Umieścić szalki w inkubatorze do hodowli tkankowych (7% CO2 i 37 °C).
- Dwa dni po konfluencji zmień pożywkę, zastępując DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) oraz 1% penicyliny i streptomycyny uzupełnionej 0,25 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX), 0,25 μM deksametazonu, 5 μg/ml insuliny i 10 μM rozyglitazonu.
UWAGA: Osiągnięcie konfluencji zajmuje 5 dni, gdy komórki są wysiewane w ilości 300 000 komórek na 100 mm szalki. - Dwa dni później zastąp pożywkę hodowlaną DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% FCS oraz 1% penicyliny i streptomycyny uzupełnionej 5 μg/ml insuliny i 10 μM rozyglitazonu i inkubuj przez 2 dni. Następnie karmić komórki co 2 dni DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% FCS oraz 1% penicyliny i streptomycyny (Ryc. 1B).
- Transfekcja adipocytów 3T3-L1 7-8 dni po rozpoczęciu protokołu różnicowania.
UWAGA: Ważne jest, aby osiągnąć wysoki poziom różnicowania (>80%) przed transfekcją, aby uniknąć proliferacji pozostałych fibroblastów po transfekcji, co doprowadziłoby do mieszanej populacji komórek, która mogłaby zniekształcić wyniki.
2. Przygotowanie wstępnie powlekanych płyt
- Dzień przed lub kilka godzin przed transfekcją przygotować roztwór kolagenu typu I w stężeniu 100 μg/ml w 30% etanolu z roztworu podstawowego o stężeniu 1 mg/ml. Dodać 250 μl kolagenu na dołek płytki 12-dołkowej i 125 μl na dołek płytki 24-dołkowej i rozprowadzić roztwór na powierzchni dołka.
- Pozostaw płytkę bez pokrywki pod kapturem hodowlanym, aż kolagen wyschnie. Przemyć dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (D-PBS) firmy Dulbecco.
UWAGA: Płyty wstępnie powlekane są dostępne w sprzedaży.
3. Przygotowanie mieszanki transfekcyjnej
UWAGA: Końcowe stężenie siRNA wynosi od 1 do 100 nM (1 do 100 pmol siRNA na dołek płytki 12-dołkowej). Końcowe stężenie mimiku miR wynosi 10 nM (10 pmol/dołek). Określ najlepsze stężenie każdego siRNA, mimiku miR lub innego oligonukleotydu przed rozpoczęciem eksperymentu, aby uniknąć efektów niedocelowych. Wykonaj eksperymenty transfekcji w trzech egzemplarzach, aby ułatwić analizę statystyczną wyników. Przygotować wszystkie odczynniki w nadmiarze, aby uwzględnić normalne straty podczas pipetowania.
- Wymieszać przez pipetowanie (objętość/objętość) siRNA (lub innych oligonukleotydów) z ulepszoną minimalną pożywką niezbędną (Tabela 1). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodać odczynnik do transfekcji i ulepszone Minimal Essential Medium do siRNA i pipetować do mieszania (Tabela 1). Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (w tym czasie przejść do sekcji 4). Dodaj mieszankę transfekcyjną do każdego dołka płytki pokrytej kolagenem.
4. Przygotowanie adipocytów 3T3-L1
- Umyć komórki na szalce Petriego o średnicy 100 mm dwukrotnie za pomocą D-PBS. Dodaj 5x trypsynę do komórek (1 ml na 100 mm szalka), upewniając się, że cała powierzchnia została pokryta trypsyną. Odczekaj 30 s i ostrożnie usuń trypsynę.
- Inkubować szalkę Petriego przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Dotknij czaszy 100 mm, aby odłączyć komórki.
- Dodaj 10 ml DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% FCS oraz 1% penicyliny i streptomycyny, aby zneutralizować trypsynę. Ostrożnie pipetować pożywkę w górę i w dół, aby odłączyć komórki i homogenizować zawiesinę komórkową.
- Policz komórki za pomocą komory liczącej Malasseza lub automatycznego licznika komórek i dostosuj stężenie komórek do 6,25 x 105 komórek/ml pożywki. Wysiew: 800 μl zawiesiny komórek/dołka płytki 12-dołkowej (5 x 105 komórek) lub 400 μl zawiesiny komórek/basenika płytki 24-dołkowej (2,5 x 105 komórek) zawierającej mieszaninę transfekcyjną.
UWAGA: Jedna 100 mm szalka Petriego z adipocytami pozwoli na przygotowanie jednej płytki 12-dołkowej lub jednej płytki 24-dołkowej. Naczynie o średnicy 100 mm zawiera zwykle 6-7 x 106 adipocytów, co odpowiada 5 x 105 adipocytów na dołek 12-dołkowej płytki. - Inkubować płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych (7 % CO2 i 37 °C) i nie naruszać komórek przez 24 godziny. Następnego dnia ostrożnie zastąp supernatant świeżym DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% FCS oraz 1% penicyliny i streptomycyny.
UWAGA: Możliwe jest również wysiewanie komórek na 48- i 96-dołkowych płytkach pokrytych kolagenem, ale należy zachować więcej środków ostrożności podczas wymiany pożywki, aby uniknąć oderwania adipocytów.
5. Analiza funkcjonalna transfekowanych adipocytów 3T3-L1
- Badaj docelowe knockdown 24-48 godzin i 48-96 godzin po dostarczeniu siRNA lub miR naśladującego odpowiednio mRNA i białko.
- Wykonuj analizy funkcjonalne transfekowanych adipocytów w celu zbadania sygnalizacji insuliny, wychwytu glukozy, wydzielania adipokiny, lipolizy i lipogenezy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stosując opisaną tutaj procedurę transfekcji odwrotnej w celu modulacji ekspresji białek lub mikro-RNA w adipocytach 3T3-L1, wykazano, że adipocyty zachowują swoją morfologię po transfekcji (Rysunek 1B,C). Rzeczywiście, 2 dni po transfekcji adipocyty były dobrze rozprzestrzenione i przytwierdzone do płytki oraz wykazywały obecność wielokomorowych kropel lipidowych, które są charakterystyczne dla dojrzałych adipocytów 3T3-L1. Zawartość lipidów...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W pracy przedstawiono szczegółowy protokół różnicowania i transfekcji dojrzałych adipocytów. Ta metoda odwrotnej transfekcji jest prostą, ekonomiczną i wysoce wydajną metodą transfekcji oligonukleotydów, takich jak między innymi siRNA, mimiki mikro-RNA i anty-mikro-RNA do adipocytów 3T3-L1, które są jedną z najtrudniejszych linii komórkowych do transfekcji. Ta metoda ma pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. Protokół ten nie jest skuteczny w przypadku transfekcji plazmidowym DNA, co ogranicza użyteczność tej t...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez INSERM, Université Côte d'Azur i Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR) poprzez program Inwestycje dla przyszłego Laboratorium Doskonałości (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) i Inicjatywę Doskonałości (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. jest wspierany przez granty z Société Francophone du Diabète (SFD), Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) oraz Fondation Benjamin-Delessert. J.G. jest obsługiwany przez ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. jest wspierany przez grant ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 oraz grant z Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Dziękujemy również Centralnemu Ośrodku Obrazowania C3M finansowanemu przez Conseil Départemental des Alpes-Maritimes i Région PACA, który jest również wspierany przez Platformę Mikroskopii i Obrazowania GIS IBiSA Côte d'Azur (MICA).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 12-dołkowa płytka do hodowli tkankowej | Dutscher | 353043 | |
| 2,5% trypsyna (10x) | Gibco | 15090-046 | rozcieńczony do 5x z D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-izobutylo-1-metyloksantyna | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Kolagen typu I ze skóry cielęcej | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Deksametazon | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Zmodyfikowane podłoże Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4,5 g/L D-Glukozy; L-glutamina; bez pirogronianu |
| etanolu | Sigma | 51976 | |
| Kontrola negatywna si-RNA znakowana FAM | Invitrogen | AM4620 | |
| Surowica bydlęca | płodu Gibco | 10270-106 | |
| Wolny odczynnik glicerolowy | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Roztwór wzorcowy glicerolu | Przeciwciało | ||
| HSP90 | Santa Cruz | sc-131119 | Rozcieńczenie: 0,5 i mikro; g/mL |
| Ulepszone minimalne niezbędne podłoże (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulina, ludzka rekombinowana | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN mikro-RNA naśladuje | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Testy Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Testy Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Zielony zestaw PCR | Qiagen | 219073 | |
| Serum dla noworodków | Gibco | 16010-159 | |
| Olej Czerwony O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mysz Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicylina i Streptomycyna | Gibco | 15140-122 | |
| Przeciwciało Perilipin-1 | Sygnalizacja komórkowa | 3470 | Rozcieńczenie: 1/1000 |
| szalka Petriego 100 mm x 20 mm | Przeciwciało Dutscher | 353003 | |
| PKB | Sygnalizacja komórkowa | 9272 | Rozcieńczenie: 1/1000 |
| Komórka przeciwciała PKB Phospho Thr308 | Sygnalizacja | 9275 | Rozcieńczenie: 1/1000 |
| Rozyglitazon | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Odczynnik do transfekcji (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| &alfa;-tubulina | przeciwciało Sigma aldrich | T6199 | Rozcieńczenie: 0,5 &mikro; g/mL |
| przeciwciało Vamp2 | R& Systemy D | MAB5136 | Rozcieńczenie: 0,1 i mikro; g/ml |
Bibliografia
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187(2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365(2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
