Ten artykuł zawiera trzy łatwe i łatwo dostępne testy do oceny metabolizmu lipidów u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena zdolności całego organizmu do obsługi lipidów u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ocena metabolizmu lipidów jest podstawą oceny funkcji metabolicznej i jest uważana za niezbędną do badań metabolizmu in vivo. Lipidy to klasa wielu różnych cząsteczek z wieloma szlakami zaangażowanymi w ich syntezę i metabolizm. Potrzebny jest punkt wyjścia do oceny hemostazy lipidowej w badaniach nad odżywianiem i otyłością. W tym artykule opisano trzy łatwe i dostępne metody, które wymagają niewielkiej wiedzy lub praktyki do opanowania, a które mogą być zaadaptowane przez większość laboratoriów do badań przesiewowych pod kątem nieprawidłowości metabolizmu lipidów u myszy. Metody te to (1) pomiar kilku cząsteczek lipidów w surowicy na czczo przy użyciu komercyjnych zestawów, (2) oznaczanie zdolności do radzenia sobie z lipidami w diecie za pomocą doustnego testu tolerancji wewnątrzlipidowej oraz (3) ocena odpowiedzi na związek farmaceutyczny, CL 316,243, u myszy. Łącznie metody te zapewnią ogólny przegląd zdolności do radzenia sobie z lipidami u myszy.
Wprowadzenie
Węglowodany i lipidy to dwa główne substraty metabolizmu energetycznego. Nieprawidłowy metabolizm lipidów powoduje wiele chorób u ludzi, w tym cukrzycę typu II, choroby układu krążenia, stłuszczenie wątroby i nowotwory. Lipidy dietetyczne, głównie trójglicerydy, są wchłaniane przez jelito do układu limfatycznego i dostają się do krążenia żylnego w chylomikronach w pobliżu serca1. Lipidy są przenoszone przez cząsteczki lipoprotein w krwiobiegu, gdzie cząstki kwasów tłuszczowych są uwalniane przez działanie lipazy lipoproteinowej na narządy obwodowe, takie jak mięśnie i tkanka tłuszczowa2. Pozostałe cząsteczki bogate w cholesterol są usuwane przez liver3. Myszy są szeroko stosowane w laboratoriach jako model badawczy do badania metabolizmu lipidów. Dzięki dostępnym kompleksowym zestawom narzędzi genetycznych i stosunkowo krótkiemu cyklowi hodowlanemu są one potężnym modelem do badania, w jaki sposób lipidy są wchłaniane, syntetyzowane i metabolizowane.
Ze względu na złożoność metabolizmu lipidów, zaawansowane badania lipidomiczne lub badania znaczników izotopowych są zwykle używane do ilościowego określania zbiorów gatunków lipidów lub związanych z lipidami przepływów metabolicznych i losów4,5. Stanowi to ogromne wyzwanie dla badaczy, którzy nie mają specjalistycznego sprzętu ani specjalistycznej wiedzy. W tym artykule przedstawiamy trzy testy, które mogą służyć jako wstępne testy przed zastosowaniem trudnych technicznie technik. Są to procedury nieterminalne dla myszy, a zatem bardzo przydatne do identyfikacji potencjalnych różnic w zdolności do obsługi lipidów i zawężenia procesów, na które wpływają.
Po pierwsze, pomiar cząsteczek lipidowych w surowicy na czczo może pomóc w ustaleniu ogólnego profilu lipidowego myszy. Myszy powinny być na czczo, ponieważ wiele gatunków lipidów podnosi się po posiłkach, a na stopień tego wzrostu duży wpływ ma skład diety. Wiele cząsteczek lipidów, w tym cholesterol całkowity, trójglicerydy i nieestryfikowane kwasy tłuszczowe (NEFA), można zmierzyć za pomocą komercyjnego zestawu i czytnika płytek, który może odczytać absorbancję.
Po drugie, doustny test tolerancji wewnątrzlipidowej ocenia zdolność do radzenia sobie z lipidami jako efekt netto wchłaniania i metabolizmu. Doustnie podawany intralipid powoduje skok poziomu krążących trójglicerydów (1-2 godziny), po czym poziom trójglicerydów w surowicy wraca do poziomu podstawowego (4-6 godzin). Ten test dostarcza informacji o tym, jak dobrze mysz radzi sobie z egzogennymi lipidami. Serce, wątroba i brunatna tkanka tłuszczowa są aktywnymi konsumentami trójglicerydów, podczas gdy biała tkanka tłuszczowa przechowuje je jako rezerwę energii. Zmiany w tych funkcjach będą prowadziły do różnic w wynikach testów.
Na koniec, promowanie lipolizy w celu mobilizacji zmagazynowanych lipidów jest uważane za możliwą strategię utraty wagi. Szlak sygnałowy receptora β3-adrenergicznego w tkance tłuszczowej odgrywa ważną rolę w lipolizie adipocytów, a ludzka genetyka zidentyfikowała polimorfizm utraty funkcji Trp64Arg w receptorze β3-adrenergicznym skorelowany z otyłością6. CL 316,243, specyficzny i silny agonista receptora β3-adrenergicznego, stymuluje lipolizę tkanki tłuszczowej i uwalnianie glicerolu. Ocena reakcji myszy na CL 316,243 może dostarczyć cennych informacji na temat rozwoju, poprawy i zrozumienia skuteczności tego związku.
Łącznie, te testy mogą być używane jako wstępne badanie przesiewowe zmian w stanie metabolizmu lipidów u myszy. Są one wybierane ze względu na dostępność narzędzi i odczynników. Dzięki wynikom uzyskanym z tych testów naukowcy mogą stworzyć ogólny obraz sprawności metabolicznej swoich zwierząt i zdecydować się na bardziej wyrafinowane i ukierunkowane podejścia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Zwierzęta są trzymane w standardowych warunkach, zgodnie z protokołami opieki nad zwierzętami i eksperymentami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Baylor College of Medicine (BCM). Zwierzęta są karmione standardową lub specjalną dietą, wodą ad libitum i utrzymywane w 12-godzinnym cyklu dnia i nocy.
1. Pomiar stężenia lipidów w surowicy na czczo
- Przenieś myszy do nowej klatki po godzinie 17:00 i poszcz z wolnym dostępem do wody, przez noc (z około 16 godzinami postu przed eksperymentem). Nocny post zapewnia całkowite opróżnienie przewodu pokarmowego myszy.
UWAGA: Myszy zjadają kał podczas postu, więc odstawienie pokarmu nie może zapewnić, że są odpowiednio poszczone. - Następnego ranka chwyć mysz za ogon i połóż ją na powierzchni. Delikatnie pociągnij do tyłu ogon myszy, aby umieścić mysz w ograniczniku. Umieść ogranicznik nosa, aby ponownie przekwalifikować ruch myszy, jednocześnie pozwalając myszy oddychać. Dokręć pokrętło ogranicznika nosa. Monitoruj ruchy klatki piersiowej, aby upewnić się, że zwierzę oddycha normalnie i zminimalizować czas, jaki mysz spędza w krępowaniach.
- Wykonaj powierzchowne nacięcie (nacięcie) w żyle ogonowej swobodnie poruszającej się myszy i pobierz 25 μl krwi z nacięcia do szklanej naczynia włosowatej (wypełniającej około 1/3 naczynia włosowatego) bez krępowania myszy. Szybko wdmuchnij krew do probówki mikrowirówkowej.
- Zatamuj krwawienie za pomocą ściągających proszków, uzupełnij karmę w klatce i upewnij się, że myszy nie wykazują oznak stresu.
- Zakończ pobieranie krwi dla wszystkich myszy.
- Pozwól krwi krzepnąć, pozostawiając ją w spokoju w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Wirować zakrzepłe próbki krwi w temperaturze 2 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut w chłodzonej mikrowirówce stołowej i przenieść supernatant (surowicę) do analizy.
UWAGA: Surowica może być przechowywana w temperaturze –20 °C przez kilka tygodni do czasu analizy. W przypadku długotrwałego przechowywania serum należy przechowywać w temperaturze –70°C. - Przeanalizuj każdy metabolit lipidowy przy użyciu protokołu dostarczonego przez producenta.
2. Doustny test tolerancji intralipidowej
- Po godzinie 17:00 zważ myszy w celu obliczenia objętości intralipidów, którą należy im podać następnego dnia. Następnie przenieś myszy do nowej klatki i pościj je przez noc (16 godzin).
- Następnego ranka oznacz ogony myszy trzymanych w jednej klatce, aby pomóc zidentyfikować je w kolejnych etapach krwawienia.
- Wykonaj nacięcie w żyle ogonowej i pobierz 15 μl krwi z nacięcia do szklanej kapilary (wypełniającej około 1/5 naczynia włosowatego), a następnie szybko wdmuchnij krew do probówki mikrowirówkowej na surowicę T = 0.
UWAGA: Nie ma potrzeby tamowania krwawienia podczas testu, chyba że myszy wykazują nadmierne krwawienie. - Myszy z zgłębkiem 20% intralipidu za pomocą igły do zgłębnika 18G w proporcji 15 μl na gram masy ciała, używając masy ciała przed postem. Ułóż każdą mysz o 1 minutę.
UWAGA: Zważ zwierzę i określ odpowiedni rozmiar igły do wbijania w zgłębnik. Ogólnie rzecz biorąc, igła do zgłębnika o rozmiarze 18 jest odpowiednia dla myszy o wadze >25 g, a igła do głębka o rozmiarze 20-22 byłaby bardziej odpowiednia dla mniejszych zwierząt. Chropij mysz, chwytając skórę przez ramiona, aby utrzymać głowę zwierzęcia na miejscu. Umieść igłębkę w jamie ustnej, a następnie delikatnie przesuwaj wzdłuż górnego podniebienia, aż dotrzesz do przełyku. Rurka powinna przejść bez oporu. Po osiągnięciu odpowiedniej głębokości Intralipid może być powoli podawany. Delikatnie wyjmij igłę pod tym samym kątem podczas wprowadzania igły po podaniu Intralipidu. Umieść zwierzę z powrotem w klatce i obserwuj, czy nie ma oznak trudnego oddychania lub innego niepokoju.
UWAGA: Naukowcy, którzy nie mają doświadczenia w technikach wykrwawiania się z jamy ustnej lub ogona, mogą układać każdą mysz w stos przez 2 minuty lub nawet dłużej. - Pobranie krwi w temperaturze T = 1, 2, 3, 4, 5 i 6 godzin: Pobrać 15 μl krwi (1/5 naczynia włosowatego) na mysz przez krwawienie z ogona i szybko wdmuchnąć krew do probówki mikrowirówkowej.
- Wirować próbki krwi w temperaturze 2 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut w mikrowirówce. Przenieść supernatant, łącznie z pływającą warstwą tłuszczu, do probówki do PCR w celu przechowywania. Supernatant może być przechowywany w temperaturze –20 °C przez kilka tygodni do czasu analizy.
UWAGA: Supernatantem powinno być osocze. Jeśli niektóre próbki już zakrzepły do czasu wirowania, nie ma to wpływu na pomiar trójglicerydów. - Po ostatnim pobraniu krwi zatamuj krwawienie za pomocą proszków ściągających, uzupełnij karmę w klatce i upewnij się, że myszy nie wykazują oznak ekstremalnego stresu.
- Załadować 2 μl wzorca triglicerydów i zebranych supernatantów do 96-dołkowej płytki.
- Dodać 200 μl odczynnika triglicerydowego i pozostawić na płytce inkubację przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu uzyskania koloru.
- Zmierzyć absorbancję przy długości fali 500 nm przy długości fali odniesienia 660 nm w laboratoryjnym czytniku płytek i obliczyć stężenie próbki.
3. β3 Agonista receptora adrenergicznego CL 316,243 Test lipolizy stymulowanej
- Przygotować CL 316,243 jako roztwór podstawowy 5 mg/ml (50x) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej i przechowywać w temperaturze –20°C do momentu użycia.
- Rano zważ myszy, aby obliczyć ilość rozcieńczonego roztworu CL 316,243 potrzebną do eksperymentu. Mysz otrzyma 10 μl na gram masy ciała rozcieńczonego CL 316,243, dla ostatecznej dawki 1 mg/kg masy ciała.
- Przenieś myszy do nowej klatki ze swobodnym dostępem do wody i pościj je przez 4 godziny.
- Przygotuj wystarczającą ilość 1x CL 316,243 roztworu z 50x bulionu, używając soli fizjologicznej. Końcowe stężenie 1x roztworu CL 316,243 wynosi 0,1 mg/ml. Stosować sól fizjologiczną w grupie kontrolnej.
- Zaznacz ogony myszy trzymanych w tej samej klatce, aby ułatwić identyfikację podczas etapów krwawienia.
- Wykonaj nacięcie w żyle ogonowej i pobierz 15 μl krwi z nacięcia do szklanej kapilary (wypełniającej około 1/5 naczynia włosowatego) i szybko wdmuchnij krew do probówki mikrowirówkowej dla próbki T = 0.
UWAGA: Nie ma potrzeby tamowania krwawienia podczas testu, chyba że myszy wykazują nadmierne krwawienie. - Wstrzyknąć rozcieńczony roztwór CL 316,243 (lub kontrolę, jeśli został uwzględniony w doświadczeniu) dootrzewnowo o objętości 10 μl/g masy ciała. Ułóż każdą mysz w stos przez 1 minutę. Użyj maksymalnie 5 myszy na każdy 60-minutowy eksperyment lub 10 myszy na dwuosobowy zespół.
- Pobrać krew w T = 5, 15, 30, 60 minut: pobrać 15 μl krwi (1/5 naczynia włosowatego) na mysz przez krwawienie z ogona.
- Po ostatnim pobraniu krwi zatamuj krwawienie za pomocą proszków ściągających, uzupełnij karmę w klatce i upewnij się, że myszy nie wykazują oznak ekstremalnego stresu.
- Wirować próbki krwi w temperaturze 2 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w chłodzonej mikrowirówce. Przenieść supernatant do probówki do PCR w celu przechowywania. Supernatant może być przechowywany w temperaturze –20°C przez kilka tygodni do czasu analizy.
- Załadować 1 μl 2x seryjnie rozcieńczonych wzorców glicerolu (0,156, 0,312, 0,625, 1,25 i 2,5 mg/ml równoważników trioleiny) i zebrać supernatanty na 96-dołkową płytkę. Dodać 100 μl wolnego odczynnika glicerolu i pozostawić na płytce inkubację przez 5 minut w temperaturze 37 °C, aby rozwinął się kolor.
- Zmierzyć absorbancję przy długości fali 540 nm za pomocą laboratoryjnego czytnika płytek i obliczyć stężenie próbki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W trzech fragmentach wykazujemy, że każdy z testów dostarcza cennych informacji na temat metabolizmu lipidów u myszy. W przypadku samców myszy C57BL/6J, poddanych ośmiotygodniowej diecie wysokotłuszczowej (HFD) rozpoczynającej się w ósmym tygodniu życia, poziomy cholesterolu całkowitego były znacząco podwyższone, podczas gdy poziomy triglicerydów i NEFA w surowicy nie uległy zmianie (Table 1), co sugeruje, że poziomy triglicerydów i NEFA we krwi nie są regulowane głównie przez podaż tłuszczów w diecie. W...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Trzy opisane testy działają solidnie w laboratorium, z kilkoma krytycznymi względami. Nocny post jest wymagany do określenia poziomu lipidów w surowicy na czczo i doustnego testu tolerancji intralipidowej. W przypadku doustnego testu tolerancji intralipidowej bardzo ważne jest wirowanie krwi w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować tworzenie się warstwy tłuszczu, szczególnie w 1- i 2-godzinnych punktach czasowych; Ważne jest, aby nie wyrzucać tej warstwy tłuszczu, jeśli się utworzy. Upewnij się, że supernatant został...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca jest wspierana przez National Institutes of Health (NIH), grant R00-DK114498, oraz Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA), grant CRIS: 3092-51000-062 dla Y. Z.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 20% Intralipid | Sigma Aldrich | I141 | |
| BD Sterylne strzykawki z końcówką ślizgową 1 ml | Shaotong | B07F1KRMYN | |
| CL 316,243 Hydrate | Sigma-Aldrich | C5976 | |
| (18 rozmiarów) | Kent Scientific | FNC-18-2-2 | |
| Odczynnik do glicerolu bez glicerolu | Sigma Aldrich | F6428 | |
| Roztwór wzorcowy glicerolu | Sigma | G7793 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)ODCZYNNIK KOLOROWY A | Fujifilm Wako Diagnostics | 999-34691 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)ODCZYNNIK KOLORYSTYCZNY B | Fujifilm Wako Diagnostics | 991-34891 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 995-34791 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B | Fujifilm Wako Diagnostyka | 993-35191 | |
| Zestaw referencyjny chemii Matrix Plus Mikroprobówki | wirówkowe Verichem | 9500 | |
| Fisher Scientific | 14-222-168 | ||
| Rurka kapilarna z mikrohematrokrytem, nie heparanizowana | Fisher Scientific | 22-362-574 | |
| STANDARDOWE ROZWIĄZANIE NEFA | Fujifilm Wako Diagnostics | 276-76491 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| Thermo Scientific Odczynnik do trójglicerydów | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Odczynniki do cholesterolu całkowitego | Thermo Scientifi | TR13421 |
Bibliografia
- Dixon, J. B. Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, Suppl 1 52-57 (2010).
- Nuno, J., de Oya, M. Lipoprotein lipase: review. Revista Clínica Española. 170 (3-4), 83-87 (1983).
- Williams, K. J. Molecular processes that handle -- and mishandle -- dietary lipids. Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3247-3259 (2008).
- Burla, B., et al. MS-based lipidomics of human blood plasma: a community-initiated position paper to develop accepted guidelines. Journal of Lipid Research. 59 (10), 2001-2017 (2018).
- Umpleby, A. M. Hormone measurement guidelines: Tracing lipid metabolism: the value of stable isotopes. Journal of Endocrinology. 226 (3), 1-10 (2015).
- Mitchell, B. D., et al. A paired sibling analysis of the beta-3 adrenergic receptor and obesity in Mexican Americans. Journal of Clinical Investigation. 101 (3), 584-587 (1998).
- Mahoney, L. B., Denny, C. A., Seyfried, T. N. Caloric restriction in C57BL/6J mice mimics therapeutic fasting in humans. Lipids in Health and Disease. 5, 13(2006).
- Hayek, T., et al. Dietary fat increases high density lipoprotein (HDL) levels both by increasing the transport rates and decreasing the fractional catabolic rates of HDL cholesterol ester and apolipoprotein (Apo) A-I. Presentation of a new animal model and mechanistic studies in human Apo A-I transgenic and control mice. Journal of Clinical Investigation. 91 (4), 1665-1671 (1993).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry & Molecular Biology. 135 (2), 219-229 (2003).
- Tall, A. R. Functions of cholesterol ester transfer protein and relationship to coronary artery disease risk. Journal of Clinical Lipidology. 4 (5), 389-393 (2010).
- Singh, A. K., Singh, R. Triglyceride and cardiovascular risk: A critical appraisal. Indian Journal of Endocrinology and Metabolism. 20 (4), 418-428 (2016).
- Miller, M., et al. Triglycerides and cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (20), 2292-2333 (2011).
- Dron, J. S., Hegele, R. A. Genetics of Hypertriglyceridemia. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 11, 455(2020).
- Dole, V. P. A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose. Journal of Clinical Investigation. 35 (2), 150-154 (1956).
- Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nature Medicine. 17 (2), 200-205 (2011).
- de Souza, C. J., Burkey, B. F. Beta 3-adrenoceptor agonists as anti-diabetic and anti-obesity drugs in humans. Current Pharmaceutical Design. 7 (14), 1433-1449 (2001).
- Braun, K., Oeckl, J., Westermeier, J., Li, Y., Klingenspor, M. Non-adrenergic control of lipolysis and thermogenesis in adipose tissues. Journal of Experimental Biology. 221, Pt Suppl 1 (2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
