Method Article

Mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony

DOI:

10.3791/61941

⸱

February 15th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Geneva Foundation, Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 2Walter Reed Army Institute of Research, Medical Readiness Systems Biology, Center for Military Psychiatry and Neuroscience, 3ORISE Fellow, Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 4Headquarter, Walter Reed Army Institute of Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy praktyczny, krok po kroku, szybki protokół usuwania mózgu myszy i preparowania dyskretnych obszarów z świeżej tkanki mózgowej. Pozyskiwanie regionów mózgu do analizy molekularnej stało się rutyną w wielu laboratoriach neurobiologicznych. Te obszary mózgu są natychmiast zamrażane w celu uzyskania wysokiej jakości danych transkryptomicznych do analizy na poziomie systemu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mózg jest centrum dowodzenia dla układu nerwowego ssaków i organem o ogromnej złożoności strukturalnej. Chroniony w czaszce mózg składa się z zewnętrznej powłoki istoty szarej nad półkulami zwanymi korą mózgową. Pod tą warstwą znajduje się wiele innych wyspecjalizowanych struktur, które są niezbędne dla wielu zjawisk ważnych dla istnienia. Pobieranie próbek określonych obszarów mózgu wymaga szybkich i precyzyjnych etapów sekcji. Rozumie się, że na poziomie mikroskopowym istnieje wiele podregionów, które prawdopodobnie przekraczają arbitralne granice regionalne, które narzucamy na potrzeby tej sekcji.

Modele mysie są rutynowo używane do badania funkcji ludzkiego mózgu i chorób. Zmiany we wzorcach ekspresji genów mogą być ograniczone do określonych obszarów mózgu ukierunkowanych na określony fenotyp w zależności od stanu chorobowego. Dlatego bardzo ważne jest zbadanie regulacji transkrypcji w odniesieniu do jej dobrze zdefiniowanej organizacji strukturalnej. Pełne zrozumienie mózgu wymaga zbadania odrębnych obszarów mózgu, zdefiniowania połączeń i zidentyfikowania kluczowych różnic w aktywności każdego z tych obszarów mózgu. Bardziej kompleksowe zrozumienie każdego z tych odrębnych regionów może utorować drogę dla nowych i ulepszonych metod leczenia w dziedzinie neuronauki. W tym artykule omawiamy krok po kroku metodologię analizy mózgu myszy na szesnaście odrębnych regionów. W tej procedurze skupiliśmy się na usunięciu mózgu samca myszy C57Bl / 6J (w wieku 6-8 tygodni) i sekcji na wiele regionów przy użyciu neuroanatomicznych punktów orientacyjnych w celu zidentyfikowania i pobrania próbek dyskretnych funkcjonalnie i behawioralnie istotnych obszarów mózgu. Prace te pomogą stworzyć solidne podstawy w dziedzinie neuronauki, prowadząc do bardziej ukierunkowanych podejść do głębszego zrozumienia funkcji mózgu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mózg, wraz z rdzeniem kręgowym i siatkówką, tworzy centralny układ nerwowy, który wykonuje złożone zachowania, kontrolowane przez wyspecjalizowane, precyzyjnie rozmieszczone i oddziałujące typy komórek w całym ciele1. Mózg jest złożonym narządem z miliardami połączonych ze sobą neuronów i gleju z precyzyjnymi obwodami pełniącymi wiele funkcji. Jest to struktura obustronna z dwoma odrębnymi płatami i różnymi składnikami komórkowymi2. Rdzeń kręgowy łączy mózg ze światem zewnętrznym i jest chroniony przez kości, opony mózgowe i płyn mózgowo-rdzeniowy oraz kieruje wiadomości do i z mózgu2,3,4. Powierzchnia mózgu, kora mózgowa, jest nierówna i ma wyraźne fałdy, zwane zakrętami, i rowki, zwane bruzdami, które dzielą mózg na funkcjonalne centra5. Kora mózgowa jest gładka u ssaków z małym mózgiem6,7. Ważne jest, aby scharakteryzować i zbadać architekturę ludzkiego mózgu, aby zrozumieć zaburzenia związane z różnymi regionami mózgu, a także jego obwodami funkcjonalnymi. Badania neurobiologiczne rozszerzyły się w ostatnich latach, a do badania struktury i funkcji mózgu stosuje się różne metody eksperymentalne. Postępy w dziedzinie biologii molekularnej i systemowej zapoczątkowały nową erę badania złożonych relacji między strukturami mózgu a funkcjonowaniem molekuł. Ponadto biologia molekularna, genetyka i epigenetyka szybko się rozwijają, co pozwala nam pogłębić naszą wiedzę na temat mechanizmów leżących u podstaw funkcjonowania systemów. Analizy te mogą być przeprowadzane w znacznie bardziej zlokalizowanych obszarach, aby pomóc w ukierunkowaniu badań i opracowywaniu skuteczniejszych terapii.

Mózg ssaków jest strukturalnie zdefiniowany w wyraźnie rozpoznawalne odrębne regiony; jednak funkcjonalne i molekularne zawiłości tych dyskretnych struktur nie są jeszcze jasno zrozumiane. Wielowymiarowy i wielowarstwowy charakter tkanki mózgowej sprawia, że krajobraz ten jest trudny do zbadania na poziomie funkcjonalnym. Ponadto fakt, że ta sama struktura pełni wiele funkcji i na odwrót, jeszcze bardziej komplikuje zrozumienie brain8. Istotne jest, aby podejście eksperymentalne przeprowadzone w celu strukturalnej i funkcjonalnej charakterystyki regionów mózgu wykorzystywało precyzyjne metodologie badawcze w celu osiągnięcia spójności w próbkowaniu w celu skorelowania architektury neuroanatomicznej z funkcją. Złożoność mózgu została niedawno wyjaśniona za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek9,10, takich jak zakręt skroniowy ludzkiego mózgu, który składa się z 75 różnych typów komórek11. Porównując te dane z tymi z analogicznego regionu mózgu myszy, badanie nie tylko ujawnia podobieństwa w ich architekturze i typach komórek, ale także przedstawia różnice. Aby rozwikłać skomplikowane mechanizmy, ważne jest zatem badanie różnych obszarów mózgu z pełną precyzją. Zachowane struktury i funkcje między mózgiem człowieka i myszy umożliwiają wykorzystanie myszy jako wstępnego substytutu do wyjaśnienia funkcji ludzkiego mózgu i wyników behawioralnych.

Wraz z postępem w biologii systemowej, uzyskiwanie informacji z odrębnych obszarów mózgu u gryzoni stało się kluczową procedurą w badaniach neurobiologicznych. Podczas gdy niektóre protokoły, takie jak mikrodysekcja przechwytywania laserowego12 mogą być drogie, protokoły mechaniczne są niedrogie i wykonywane przy użyciu powszechnie dostępnych narzędzi13,14. Użyliśmy wielu regionów mózgu do testów transkryptomicznych15 i opracowaliśmy praktyczną i szybką procedurę do preparowania interesujących nas obszarów mózgu myszy krok po kroku w krótkim czasie. Po wypreparowaniu próbki te można natychmiast przechowywać w niskich temperaturach, aby zachować kwasy nukleinowe i białka tych tkanek. Nasze podejście może być wykonane szybciej, co prowadzi do wysokiej wydajności i pozwala na mniejsze ryzyko pogorszenia stanu tkanek. To ostatecznie zwiększa szanse na generowanie wysokiej jakości, powtarzalnych eksperymentów z wykorzystaniem tkanek mózgowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępowanie ze zwierzętami i procedury eksperymentalne były prowadzone zgodnie z europejskimi, krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Centrum Badań nad Zdrowiem Środowiskowym Armii Stanów Zjednoczonych, obecnie Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) i przeprowadzone w placówce akredytowanej przez Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC).
UWAGA: Zabieg zostanie przeprowadzony na sześcio- do ośmiotygodniowych samcach myszy szczepu C57BL/6j poddanych eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy16. W naszym laboratorium nie wykonuje się żadnych perfuzji, ale ten protokół można zmodyfikować, dzięki czemu można przeprowadzić perfuzje w celu usunięcia krwi z naczyń krwionośnych. Wszystkie materiały potrzebne do przeprowadzenia sekcji są wymienione w Tabeli Materiałów. Rozwarstwienie dzieli się na trzy elementy, w tym usunięcie mózgu, usunięcie przysadki mózgowej i rozwarstwienie mózgu. Celem pobierania tkanki mózgowej jest przetworzenie jej do testów transkryptomicznych po ekstrakcji RNA. Jak tylko obszar mózgu zostanie wypreparowany, natychmiast przenosimy każdy z obszarów mózgu do już oznakowanej fiolki zamrażarki, a następnie przechowujemy fiolkę w ciekłym azocie lub -80 °C.
UWAGA: Dokładna znajomość neuroanatomii jest niezbędna do wykonania tej procedury. Przekroje poziome i podłużne, a także zwykłe przekroje poprzeczne, powinny być studiowane i uczone się. Ponieważ tkanka mózgowa ulega bardzo szybkiej degradacji, nie ma czasu na konsultowanie się z atlasem podczas wykonywania tego zabiegu.

1. Usuwanie mózgu myszy

  1. Zacisnąć szczękę odciętej głowy hemostatem (Ryc. 2i) i użyj gazika, aby odbić skórę głowy w sposób rostralny, tworząc suche pole na grzbiecie czaszki (Rysunek 2ii).
  2. Włóż cienkie, zakrzywione nożyczki do otworu wielkiego, aby oddzielić przylegające opony. Tutaj włóż nożyczki w otwór u podstawy czaszki jest otworem wielkim, w którym rdzeń kręgowy przechodzi z ostrzem skierowanym pionowo (pozycja godziny 12), ale równolegle i naciskając na wewnętrzną powierzchnię kości podstawy płytki (tj. łuski potylicznej) i obracając ostrze o czterdzieści pięć ° w lewą stronę, a następnie w prawą stronę.
  3. Kontynuuj obracanie nadgarstka, aby podważyć kość płytki podstawnej, która przetnie środek pozostałej kości, kontynuując do kości potylicznej i kości śródciemieniowej, podważając kości w lewo i w prawo, aż zostaną usunięte. W podobny sposób usuń kość potyliczną i kość śródciemieniową, aby odsłonić móżdżek.
    UWAGA: W tym momencie pusta struktura kostna zwana pęcherzami bębenkowymi, na brzusznej tylnej części czaszki, która obejmuje części ucha środkowego i wewnętrznego, może zostać usunięta, chyba że przeprowadza się sekcję tylnych i przednich płatów przysadki mózgowej (Ryc. 2iii).
  4. Usuń przyczepy mięśni do grzbietu skroniowego za pomocą zakrzywionego ostrego ostrza nożycowego. Umieść jedną kończynę zakrzywionych ostrych nożyczek pod szwem lambdoidalnym wnikającym w połączenie zatok poprzecznych i strzałkowych (Rysunek 2iv).
  5. Przesuwaj nożyczki rostralnie wzdłuż szwu środkowego aż do bregmy i przetnij je bardzo delikatnie, ostrożnie podnosząc do góry, aby uniknąć uszkodzenia kory mózgowej. Jest to krytyczny krok w procedurze (Rysunek 2v).
  6. Na tym etapie kości ciemieniowe są podnoszone i obracane, zeskrobując w ten sposób wewnętrzną powierzchnię kości w celu zidentyfikowania i przecięcia pozostałych przyczepów oponowych. Chwyć kość skroniową podważającą na zewnątrz, z dala od mózgu. Usuń kość czołową z każdej strony za pomocą zakrzywionych nożyczek lub rongeur do oczodołu i przecinając koronalnie pod kątem prostym do grzbietu oczodołu, ale nie dalej niż do linii środkowej (Rysunek 2vii).
  7. Wykonaj dwa cięcia równolegle i w odległości około 4 mm od siebie w płaszczyźnie strzałkowej (Rysunek 2viii).
    UWAGA: Nie tnij obu stron jednym pociągnięciem.
  8. Usuń fragmenty kości czołowej, unikając uszkodzenia powierzchni mózgu (Rysunek 2ix). W tym momencie użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć oponę twardą, która powinna być dostępna między opuszkami węchowymi.
  9. Delikatnie odwróć czaszkę, aby grawitacja pomogła w usunięciu mózgu, jednocześnie kontynuując identyfikację i przecięcie pozostałych przyczepów oponowych i nerwów czaszkowych. Mózg zostanie uwolniony przez przecięcie największego nerwu trójdzielnego przyczepionego do mózgu i jest wyraźnie widoczny rozciągający się od podstawy kalwarii (Rysunek 2x).
    UWAGA: Przenieś mózg do zimnego roztworu soli fizjologicznej (lodowato zimny cytrynian sodu wolny od RNaz (0,9%) lub sól fizjologiczna (0,9%) soli fizjologicznej) w celu dalszej sekcji.

2. Rozwarstwienie przedniego i tylnego płata przysadki mózgowej

UWAGA: Przysadka mózgowa pokryta jest bardzo twardą błoną przypominającą namiot, z grzbietem biegnącym bocznie między lewym i prawym nerwem trójdzielnym. Struktury te są niezwykle miękkie i delikatne, dlatego zaleca się wycinanie tylnych i przednich płatów przysadki mózgowej oddzielnie etapami, in situ, bezpośrednio z czaszki. Natychmiast po rozbiorze należy przenieść odpowiednią przysadkę mózgową do wstępnie oznakowanej fiolki i przechowywać fiolkę w ciekłym azocie, najlepiej w przeciwnym razie w temperaturze -80 °C. Przysadka mózgowa spoczywa dokładnie na połączeniu kości potylicznej i podstawno-fenoidalnej; Jeśli się wyginają, architektura przysadki mózgowej jest zakłócona.

  1. Utrzymuj pęcherze słuchowe w stanie nienaruszonym, aby upewnić się, że anatomia przysadki mózgowej jest nienaruszona i łatwa do zidentyfikowania (Rysunek 2ix).
  2. Wypreparuj tylny płat przysadki mózgowej, a następnie przedni płat przysadki mózgowej od pozostałej części czaszki.
  3. Wykonaj bardzo małe nacięcie przystrzałkowe po obu stronach w grzbiecie namiotu błoniastego i podnieś tylny płat przysadki mózgowej za pomocą ultracienkich kleszczy, uważając, aby nie naruszyć tkanki przedniego płata przysadki (Rysunek 2x).
  4. Wykonaj strzałkowe cięcie między bocznymi brzegami przedniego płata przysadki mózgowej a najbliższym nerwem trójdzielnym, a następnie wyjmij przedni płat przysadki (Rysunek 2x).

3. Sekcja mózgu myszy

UWAGA: Natychmiast po usunięciu mózgu i przysadki mózgowej, przeprowadza się dalszą sekcję na wstępnie schłodzonym bloku ze stali nierdzewnej (Rysunek 3). Po rozbiorze, przenieść obszary mózgu do wstępnie oznakowanych fiolek i przenieść fiolki najlepiej do ciekłego azotu, w przeciwnym razie -80 °C. Struktury wytworzone metodą odgórną (w porządku chronologicznym) mogą obejmować: móżdżek (CB), pień mózgu/tyło mózgu (most i rdzeń przedłużony) (HB), opuszki węchowe (OB) jako dodatkowe opuszki węchowe, przyśrodkowa kora przedczołowa (MPFC), boczna kora przedczołowa (FCX), przednie i tylne ciało prążkowia (ST), prążkowie brzuszne (VS) składające się z jądra półleżącego (NAC) i guzka węchowego (OT), przegroda (SE), obszar przedwzrokowy, kora gruszkowata (PFM), podwzgórze (HY), ciało migdałowate (AY), hipokamp (HC), tylna kora obręczy (CNG), kora śródwęchowa (ERC), śródmózgowie (MB) ze wzgórzem i resztą kory mózgowej (ROC) (Tabela 1). Poszczególne regiony zostaną omówione w kolejności izolacji, pracując z pojedynczą półkulą.

  1. Zachowaj szczególną ostrożność przy usuwaniu mózgu z kalwarii, ponieważ punkty orientacyjne mogą zostać zniszczone w przypadku jakichkolwiek ran szarpanych. Na tym etapie należy wykonać wszystkie sekcje przy użyciu ochrony twarzy, w szczególności 7-krotnego wizjera jubilerskiego, a oświetlenie zapewnią lampy chirurgiczne umieszczone nad każdym z ramion seksektora. Znaczna część sekcji zostanie wykonana za pomocą małych zakrzywionych kleszczy (tj. kleszczy Graefe).
  2. Umieść mózg na bloku ze stali nierdzewnej (Rysunek 4i i Rysunek 4ii). Utrzymuj blok w chłodzie, otaczając go lodem i lodowatym roztworem soli fizjologicznej. Okresowo zwilżaj tkankę lodowatym roztworem soli, aby zachować struktury.
  3. Ustaw mózg tak, aby kora mózgowa była skierowana do góry. Używając małych zakrzywionych kleszczy, delikatnie odbij CB, odsłaniając górne, środkowe i dolne szypułki móżdżku i usuń CB (Rysunek 4iii i Rysunek 4iv).
  4. Wykonaj cięcie śródstrzałkowe, zaczynając od grzbietu i między OB a półkulami mózgowymi (Ryc. 4v) i upewnij się, że nie rozciągasz się dalej niż spoidło przednie. W tym momencie robak można łatwo oddzielić od części bocznych, a HB zostanie uzyskany przez cięcie koronalne na przednim brzegu mostu.
  5. Oddziel rdzeń przez nacięcie koronalne na tylnym brzegu mostu.
    UWAGA: W tym momencie międzymózgowie, tylna część przodomózgowia zawierająca nawzgórze, wzgórze, podwzgórze i brzuszne wzgórze oraz trzecią komorę, zostanie odwrócona brzuszną stroną do góry, a cięcie śródstrzałkowe zostanie wykonane z skrzyżowania wzrokowego rostralnie. Sekcja półkul mózgowych, a następnie usunięcie OB z jednej z półkul będzie miała miejsce na tym etapie (Rysunek 4v i Rysunek 4vi).
  6. Oddziel półkule mózgowe (Rysunek 4v) przed dalszym wycięciem międzymózgowia (Rysunek 4v). Podejście grzbietowe zostanie zastosowane przez staranne rozwarstwienie, aby zachować krytycznie wydatne punkty orientacyjne w linii środkowej. Wizualizuj każde połączenie międzypółkulowe przed ich zerwaniem, ponieważ zminimalizuje to możliwość odchylenia się od linii środkowej.
    UWAGA: Na tym etapie jedna z półkul mózgowych (Hemibrain) może zostać zachowana, a druga półkula może być wykorzystana do dalszej sekcji
  7. Wsuń zamknięte ostrza małego, zakrzywionego kleszcza pod ciało modzelowate i delikatnie rozsuń, aby cofnąć korę nową obustronnie. Ciało modzelowate to szerokie pasmo włókien nerwowych, które łączy dwie półkule, które zostaną tępo wycięte przez ściskanie kleszczami, bez naruszania struktur linii środkowej leżących poniżej.
    UWAGA: Mezjalne powierzchnie półkul będą miały widoczne wiele punktów orientacyjnych, takich jak zmielinizowane struktury, takie jak rodzaj ciała modzelowatego, otwornice i spoidło przednie. Ponadto, chociaż kilka milimetrów w bok od linii środkowej, może być również widoczny przewód sutkowo-wzgórzowy i pęczek retrofleksyjny.
  8. Przetnij na pół wiele struktur przecinających linię środkową. Obejmuje to ciało modzelowate, spoidło przednie, spoidło brzuszne, spoidło tylne, spoidło grzbietowe, nadsutkowe odtłuszczenie, spoidło górne sutkowe, spoidło górne colliculus, spoidło brzuszne fornix i okołokomorowe włókna wzgórza.
  9. Zachowaj szczególną ostrożność na tym etapie w linii środkowej lub w jej pobliżu, który może być częściowo zagrożony przez metodę podejścia grzbietowego. Wszystkie struktury kontrolne są zagrożone, jeśli nie zostaną wykonane ostrożnie.
  10. Usuń OB (klinowate i jaśniejsze kołaki) i dodatkowe opuszki węchowe, a następnie zbierz MPFC (obszar kory obręczy 1, kora przedlimbiczna, infralimbiczna, przyśrodkowa oczodołowa i wtórna kora ruchowa [M2]) i FCX za pomocą cięcia koronalnego, które jest wykonane 1 mm przed rodzajem ciała modzelowatego (Rysunek 4vii). Podziel powstały przekrój przez cięcie przystrzałkowe 1/3 odległości od powierzchni przyśrodkowej do bocznej, uzyskując MPFC przyśrodkowo, a resztę FCX bocznie. Kora obręczy jest mysim odpowiednikiem MPFC.
    UWAGA: Ten wycinek tkanki będzie również zawierał niewielką ilość M2 (wtórnej kory ruchowej) 17 i jest nieunikniony.
  11. Wykonaj cięcie koronalne na poziomie spoidła przedniego, co prowadzi do uwidocznienia pars przedniej kończyny spoidła przedniego w przekroju poprzecznym na powierzchni rostralnej powstałego odcinka koronalnego, podczas gdy część poprzeczna zostanie odsłonięta w powierzchni ogonowej przekroju Jest to punkt orientacyjny potwierdzający dla NAC18. VS składa się z NAC i OT.
    UWAGA: W spoidle przednim oprócz odcinka poprzecznego znajduje się kończyna przednia i nazywa się to spoidłem przednim, pars przednim.
  12. Częściowo przeciąć poziomo przez poprzeczną część spoidła przedniego od linii środkowej poniżej rogu przedniego komory bocznej, aby uwolnić jądro przegrody grzbietowo i VS brzusznie. Usuń niewielką ilość kory z bocznej powierzchni, z której zostaną usunięte NAC i OT.
  13. Oddziel rostralną część ST od leżącej nad nią kory za pomocą zakrzywionego skalpela wyciętego tuż na zewnątrz zewnętrznej torebki, uważając, aby nie uwzględnić tkanki prążkowia w próbce korowej. W tym momencie jądra przegrody /SE będą widoczne i można je łatwo pobrać z tego wycinka (Rysunek 4viii).
    UWAGA: Przednia i tylna granica PFM są zdefiniowane przez wyimaginowane płaszczyzny koronalne, które są zgodne odpowiednio z spoidłem przednim i ciałami sutkowymi. Limit środkowy jest zdefiniowany przez zewnętrzną klasę capsule18.
  14. Na bocznej powierzchni pozostałego półprzekroju międzymózgowia wykonaj częściowe poziome cięcie wzdłuż bruzdy nosa rozciągającej się doogonowo, ale tylko do wyimaginowanej płaszczyzny koronalnej na poziomie ciał sutkowych. Wykonać częściowe cięcie koronalne, rozciągające się przyśrodkowo 1 mm od bocznej powierzchni kory mózgowej w płaszczyźnie ciał sutkowych HY. W tym przypadku nacięcie przystrzałkowe w płaszczyźnie klauzury uwolni PFM (Rysunek 4ix i Rysunek 4x).
    UWAGA: Na przyśrodkowej powierzchni pozostałej półsekcji międzymózgowia widoczne będą liczne cechy anatomiczne, w tym ciała sutkowe, pęczek retrofleksyjny i prążek rdzeniowy. Widoczny będzie półkolisty wzór (grzbietowa wklęsła strona), który oznacza margines między wzgórzem a HY. HY można łatwo zidentyfikować w widoku przekroju środkowego na skrzyżowanie wzrokowe przednio-brzusznie i spoidło przednie oraz ciała sutkowe wraz z pęczkiem wstecznym z tyłu. Te ostatnie punkty orientacyjne zostały dobrze wyeksponowane w atlas17, a także w kontekście przodomózgowia myszy albinosów19.
  15. Wykonaj częściowe cięcie koronalne za ciałami sutkowymi, rozciągające się tylko tak daleko na bok, jak bruzda podwzgórza. W tym momencie przecięcie przystrzałkowe wzdłuż bruzdy podwzgórza uwalnia teraz HY .
  16. Pociągają za sobą wywinięcie komory bocznej w celu odsłonięcia dodatkowych połączeń wewnątrzlimbicznych i pozostałych elementów układu limbicznego. Patrząc na przyśrodkową powierzchnię pozostałej półsekcji międzymózgowia, zakrzywione kleszcze będą najlepszym rozwiązaniem, ponieważ pozwalają technikowi manipulować innymi delikatnymi sekcjami otoczenia używanymi do przecinania sklepienia i są wprowadzane do bocznej komory i delikatnie rozszerzane, używając rozwarstwienia w celu otwarcia komory i obrócenia HC 90° od płaszczyzny pionowej do poziomej. Może być konieczne użycie ostrza #11 do przekroju tętnicy naczyniówkowej / splotu naczyniówkowego, ponieważ spiczasta końcówka może pomóc w precyzyjnych cięciach.
  17. Obróć CNG o 90° (ale w kierunku przeciwnym do HC), aby znaleźć się w płaszczyźnie poziomej. Za pomocą kleszczy delikatnie obróć HC o kolejne 180° na zewnątrz i na boki, co sprawi, że wewnętrzna powierzchnia ERC będzie widoczna i skierowana do góry.
  18. Promieniowanie przypominające wachlarz włókien mielinizowanych powstające z ERC będzie można zaobserwować zbieganie się, tworząc wiązkę kątową, w tym ścieżkę perforacji i jej przyłączenie do HC. Obróć wzgórze i MB o 180° grzbietowo, aby brzusznie odsłonić AY.
  19. W razie potrzeby podnieś przewód wzrokowy, aby odsłonić przyczep końcowy prążkowia, ponieważ będzie on zawierał pasma włókien biegnących wzdłuż bocznego brzegu powierzchni komorowej wzgórza do AY i sprawi, że kontury AY będą wyraźne.
    UWAGA: HC i sklepienie będą wyraźnie widoczne w całości, zagnieżdżone w komorze bocznej i można je łatwo wyjąć. Komora boczna będzie wyłożona pia mater i widoczne będą wachlarzowate początki ścieżki perforantowej przez bardzo przezroczysty aspekt subpialny ERC20.
  20. Zewnętrzna powierzchnia przyśrodkowego ERC będzie miała widoczną, wyraźną warstwę dużych komórek piramidalnych. Ponadto istotną cechą przyśrodkowego ERC będzie gęsta konwergencja włókien barwiących Golgiego. W tej procedurze preparacji, po przecięciu komory bocznej, włókna te będą łatwo widoczne na powierzchni przyśrodkowej przez pia mater, która wyściela wewnętrzne powierzchnie komór, tworząc bardzo wyraźną strukturę przypominającą wachlarz
    21. .
  21. Zauważ, że włókna gromadzą się podskórnie, opadają i opuszczają brzuszny ERC, rozciągają się do tyłu, a następnie wznoszą się pionowo, aby perforować HC. Ta przypominająca wachlarz struktura w ERBN zostanie wykorzystana do zdefiniowania marginesów na potrzeby sekcji. Identyfikacja i usuwanie w kolejności struktur AY, ERC, CNG i HC.
    UWAGA: Zdefiniowanie dobrego punktu orientacyjnego do rozwarstwienia AY będzie kluczem do następnego kroku, a skrzyżowanie na tylnym brzegu, gdzie prążek końcowy spotyka się z AY, będzie dobrym punktem.
  22. W tym momencie pozostałe struktury obejmują wzgórze i MB. Potwierdź identyfikację wzgórza poprzez wizualizację prążkowia rdzenia na jego powierzchni grzbietowej rozciągającej się w płaszczyźnie rostrocaudalnej w linii środkowej. Całkowicie oddziel wzgórze od śródmózgowia za pomocą koronalnego cięcia ogonowego do habenuli i rostralnego do górnej części coliculi. Na tym etapie zapisywany jest ROC.
  23. W tym momencie należy kompletnie zebrać wszystkie obszary mózgu i natychmiast (po uzyskaniu każdego z nich) przechowywać próbki zamrożone do czasu dalszego przetwarzania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasze zrozumienie złożonej struktury i funkcji mózgu szybko ewoluuje i poprawia się. Mózg składa się z wielu odrębnych regionów, a zbudowanie mapy molekularnej może pomóc nam lepiej zrozumieć, jak działa mózg. W tym artykule omówiliśmy rozbiór mózgu myszy na wiele odrębnych regionów (Tabela 1). W tym protokole struktury są identyfikowane na podstawie krytycznych punktów orientacyjnych i osiąga się to poprzez utrzymywanie tkanki wilgotnej roztworem soli fizjologicznej, zachowując jej wytrzymałość do natyc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mózg ssaków jest złożonym narządem złożonym z szeregu morfologicznie odrębnych i funkcjonalnie unikalnych komórek o różnych sygnaturach molekularnych i wielu regionach, które pełnią wyspecjalizowane i dyskretne funkcje. Opisana tutaj procedura preparacji może mieć wiele celów w zależności od wymagań laboratorium. W naszym laboratorium oceniliśmy transkrypcję w wielu regionach mózgu pobranych od myszy narażonych na PTSD, takie jak stres16 . Chcielibyśmy dalej badać wpływ tła genetycznego szczepu

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Pani Seshmalini Srinivasan, Panu Stephenowi Butlerowi i Pani Pameli Spellman za pomoc w eksperymentach oraz Pani Dana Youssef za redakcję rękopisu. Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony USAMRDC. Fundacja Genewska przyczyniła się do tych prac i była wspierana przez fundusze z Dyrekcji III Obszaru Badawczego Medycyny Wojskowej i Operacyjnej za pośrednictwem Biura Badawczego Armii Stanów Zjednoczonych.

Zastrzeżenie:

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nożyczki Brain Removal
DeaverSklep chirurgiczny RobozRS-67625,5" proste ostre/ostre
Nożyczki DeaverSklep chirurgiczny RobozRS-67635,5" zakrzywione ostre/ostre
Delikatne nożyczki operacyjneSklep chirurgiczny RobozRS-67034,75 "zakrzywione ostre/ostre
Delikatne nożyczki operacyjneSklep chirurgiczny RobozRS-67024,75 "proste ostre/ostre
Lekkie nożyczkioperacyjne Sklep chirurgiczny RobozRS-67535" zakrzywiona Sharp/Sharp
Micro szpatułka, promień i stożkowe płaskie końcelustrzane wykończenie ze stali nierdzewnej
Nożyczki operacyjne 6,5"Roboz Surgical StoreRS-6846zakrzywione ostre/ostre
Kleszcze do tkanekSklep chirurgiczny RobozRS-81604,5 "1X2 zęby 2mm szerokość końcówki
Rongeur (opcjonalnie)Sklep chirurgiczny RobozRS-8321 wiele stylów do wyboruLempert Rongeur 6,5" 2X8mm
Rozwarstwienie przysadki mózgowej
rękojeść skalpelaSklep chirurgiczny RobozRS-9843Rękojeść skalpela #3 Solidna 4"
i ostrzaSklep chirurgiczny RobozRS-9801-11Sterylne ostrza skalpela: # 11 Pudełko 100 40 mm
Super cienkie kleszcze InoxRoboz Sklep chirurgicznyRS-4955rozmiar końcówki 0,025 X 0,005 mm
< mocny> Dyssekcja mózgu< / silny>
A Wizjer powiększającyPenn Tool Col40-178-62,2x Zewnętrzne i 3,3-krotne wewnętrzne powiększenie soczewki, Prostokątna lupa
Sekcja zimna płytaCellpath.comJRI-0100-00AZimna płyta i podstawa góry lodowej
Kleszcze Graefe, pełna krzywizna bardzo delikatnaSklep chirurgiczny RobozRS-51380,5 mm Końcówka 4 " (10 cm) długości
Lekkie nożyczki operacyjneSklep chirurgiczny RobozRS-67535-calowy zakrzywiony ostry/ostry
uchwyt skalpelaSklep chirurgiczny RobozRS-9843 (powtórzone powyżej)Rękojeść skalpela #3 Solidna 4
i ostrza (zwłaszcza #11)Sklep chirurgiczny RobozRS-9801-11 (powtórzone powyżej)Sterylne ostrza skalpela:#11 Pudełko 100 40mm
SzpatułkaAmazonMS-SQRD9-4Dwustronna szpatułka kwadratowa i okrągła
szczypce do tkanekRoboz Surgical StoreRS-8160 (powtórzone powyżej)4,5 "zęby 1X2
"

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  2. Ackerman, S. Major Structures and Functions of the Brain. 2, National Academies Press. US. (1992).
  3. P, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
  4. Paramvir, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
  5. Javed, K., Reddy, V., et al. Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , Treasure Island. (2020).
  6. Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Pessoa, L. Understanding brain networks and brain organization. Physics of Life Reviews. 11 (3), 400-435 (2014).
  9. Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
  10. Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
  11. Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  12. Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
  13. Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125(2011).
  14. Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474(2020).
  15. Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14(2015).
  16. Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
  17. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , Elsevier Academic Press. (2008).
  18. Franklin, K., Paxinos, G. The Coronal Plates and Diagrams. , Academic Press. (2019).
  19. Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
  20. Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. Histologie Du Système Nerveux de L'homme Et Des Vertébrés. Anglais. , Oxford University Press. (1995).
  21. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuromethods. 57, 13-26 (2011).
  22. Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474(2020).
  23. Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
  24. Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
  25. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
  26. Rajmohan, V., Mohandas, E. The limbic system. Indian Journal of Psychiatry. 49 (2), 132-139 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse Brain DissectionBrain Region IsolationNeuroanatomical LandmarksCerebral Cortex RemovalCerebellum DissectionHypothalamus SeparationThalamus IsolationAmygdala ExtractionHippocampus DissectionSeptal Nuclei Identification

Related Articles