Artykuł metodologiczny

Synteza zależnych od pH pirazoli, imidazolu i izoindolonu dipirynonu przy użyciu podejścia kondensacyjnego Claisena-Schmidta

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61944

⸱

10 czerwca 2021

 ,  , 
1Department of Physical and Life Sciences, Nevada State College, 2Department of Humanities, Nevada State College

W tym artykule

Podsumowanie

Reakcja kondensacji Claisena-Schmidta jest ważną metodologią generowania sprzężonych z metyną bicyklicznych związków aromatycznych. Dzięki wykorzystaniu wariantu reakcji aldolowej, w którym pośredniczy zasada, można uzyskać dostęp do szeregu cząsteczek fluorescencyjnych i/lub biologicznie istotnych za pomocą ogólnie niedrogiego i prostego w obsłudze podejścia do syntezy.

Streszczenie

Sprzężone z metyną bicykliczne związki aromatyczne są powszechnymi składnikami szeregu biologicznie istotnych cząsteczek, takich jak porfiryny, dipyrrynony i farmaceutyki. Dodatkowo, ograniczona rotacja tych układów często prowadzi do powstania układów o wysokiej lub umiarkowanej fluorescencji, co obserwuje się w 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]pirymidyno-3-onach, ksantogorzałach, analogach piroloindolizydynodionu, analogach BODIPY oraz fenolowych i imidazolinonowych układach pierścieniowych białka zielonej fluorescencji (GFP). Manuskrypt ten opisuje niedrogą i prostą w obsłudze metodę przeprowadzania kondensacji Claisena-Schmidta w celu wygenerowania serii fluorescencyjnych analogów pirazolu/imidazolu/izoindolonu dipirynonu zależnych od pH. Chociaż metodologia ilustruje syntezę analogów dipirrynonu, można ją przetłumaczyć w celu wytworzenia szerokiej gamy sprzężonych bicyklicznych związków aromatycznych. Reakcja kondensacji Claisena-Schmidta zastosowana w tej metodzie jest ograniczona do nukleofilów i elektrofilów, które są enolizowane w warunkach zasadowych (składnik nukleofilowy) i aldehydów nieenolizowalnych (składnik elektrofilowy). Dodatkowo zarówno reagenty nukleofilowe, jak i elektrofilowe muszą zawierać grupy funkcyjne, które nie będą przypadkowo reagować z wodorotlenkiem. Pomimo tych ograniczeń metodologia ta oferuje dostęp do zupełnie nowych systemów, które mogą być wykorzystywane jako sondy biologiczne lub molekularne.

Wprowadzenie

Szereg sprzężonych systemów bicyklicznych, w których dwa pierścienie aromatyczne są połączone mostkiem monometynowym, ulega izomeryzacji poprzez rotację wiązania, gdy są wzbudzone fotonem (Rysunek 1A)1,2,3,4,5. Wzbudzony izomer na ogół rozluźnia się do stanu podstawowego poprzez procesy rozpadu nieradiacyjnego6. Jeśli bariera energetyczna dla rotacji wiązania zostanie zwiększona w wystarczająco dużym stopniu, możliwe jest ograniczenie lub zapobieżenie fotoizomeryzacji. Zamiast tego wzbudzenie fotoniczne powoduje wzbudzony stan singletowy, który często rozluźnia się poprzez fluorescencję, a nie rozpad nieradiacyjny (Rysunek 1B). Ograniczenie fotoizomeryzacji jest najczęściej osiągane poprzez mechaniczne ograniczenie rotacji wiązania wiązania poprzez wiązanie dwóch aromatycznych układów pierścieniowych wiązaniami kowalencyjnymi, blokując w ten sposób cząsteczkę w określonym stanie izomerycznym. Podejście to zostało wykorzystane do stworzenia kilku różnych fluorescencyjnych trójpierścieniowych analogów dipyrrynonu i dipirolemetanu, takich jak: 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]pirymidyno-3-ony (1), xanthoglows (2)6,7, analogi piroloindolizynydionu (3)8 i analogi BODIPY9 (4, Rysunek 2), w wyniku czego układy pierścieniowe pirolidyny i/lub pirolu są połączone łącznikami z metylenem, karbonylem lub difluorodifluorem boru. Zazwyczaj 1-4 posiadają ΦF > 0,7, co sugeruje, że systemy te są bardzo wydajne jako jednostki fluoroforowe.

Możliwe jest również ograniczenie fotoizomeryzacji za pomocą innych metod niż kowalencyjne łączenie systemów pierścieniowych. Na przykład pierścienie fenolowe i imidazolinonowe (Rysunek 2) białka zielonej fluorescencji (GFP) są ograniczone do rotacji przez środowisko białkowe; Restrykcyjne ustawienie zwiększa wydajność kwantową o trzy rzędy wielkości w porównaniu z tą samą jednostką chromoforu w Free Solution10. Uważa się, że rusztowanie białkowe GFP zapewnia barierę rotacyjną poprzez efekty steryczne i elektrostatyczne11. Niedawno nasza grupa we współpracy z grupą Odoh z University of Nevada w Reno odkryła kolejny system fluoroforowy, który wykazuje strukturalne podobieństwo do systemów xanthoglow opartych na dipyrynonie (Rysunek 2)12. Te analogi dipirynonu różnią się jednak od układu xanthoglow tym, że wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe, a nie wiązania kowalencyjne, hamują fotoizomeryzację i powodują fluorescencyjny układ bicykliczny. Ponadto analogi pirazolu, imidazolu i izoindolonu dipyrrynonu mogą wiązać się wodorem w stanach protonowanych i zdeprotonowanych; Deprotonacja powoduje przesunięcie ku czerwieni zarówno długości fal wzbudzenia, jak i emisji, prawdopodobnie z powodu zmiany elektronicznej natury układu. Chociaż doniesiono, że wiązania wodorowe zwiększają wydajność kwantową pomimo ograniczonej rotacji13,14,15,16, nie znamy żadnego innego systemu fluoroforowego, w którym ograniczona izomeryzacja służy jako tryb fluorescencji zarówno w stanie protonowanym, jak i zdeprotonowanym cząsteczki. Dlatego te zależne od pH fluorofory dipirynonu są pod tym względem wyjątkowe.

W tym filmie skupiamy się na syntezie i charakterystyce chemicznej serii analogów fluorescencyjnych dipyrrynonów. W szczególności nacisk położono na metodologię kondensacji Claisena-Schmidta, która została wykorzystana do skonstruowania całej serii analogów fluorescencyjnych. Reakcja ta polega na wytwarzaniu jonu enolanu winylu, w którym pośredniczy zasada, który atakuje grupę aldehydową, w celu wytworzenia alkoholu, który następnie ulega eliminacji. W przypadku serii analogów dipirynonu, pirolon/izoindolon jest przekształcany w enolan, aby ułatwić atak na grupę aldehydową przyłączoną do pierścienia pirazolowego lub imidazolowego (Rysunek 3); Po eliminacji powstaje w pełni sprzężony układ bicykliczny, połączony mostkiem metynowo-mostkowym. Warto zauważyć, że cała seria analogów dipirynonu może być skonstruowana z łatwo dostępnych materiałów komercyjnych i może być wytwarzana w jednej jednogarnkowej sekwencji reakcji, zwykle z umiarkowaną lub wysoką wydajnością (wydajność waha się od około 50-95%). Ponieważ większość analogów dipirrynonu ma charakter wysoce krystaliczny, do wytworzenia analitycznie czystych próbek wymagane jest bardzo niewielkie oczyszczanie poza standardowymi warunkami obróbki. W związku z tym ten system fluoroforowy wymaga tylko kilku kroków, aby uzyskać dostęp do łatwo dostępnych materiałów komercyjnych i może być zsyntetyzowany, oczyszczony i przygotowany do badań analitycznych lub biologicznych w stosunkowo krótkim czasie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ogólna procedura syntezy analogów dipirynonu 16-25

  1. Rozpuścić pirolon/izoindolon (1,00 mmol) i odpowiadający mu aldehyd pirazol/imidazol (1,00 mmol) w 5,0 ml etanolu w kolbie okrągłodennej.
  2. Dodać wodny roztwór KOH (24,0 mmol, 10 M, 2,40 ml) do kolby w jednej porcji.
  3. Wymieszać mieszaninę i refluksować do momentu potwierdzenia zakończenia reakcji przez TLC (zob. tabela 1 w celu uzyskania wykazu czasów reakcji). Zastosowano eluent TLC składający się z 10% metanolu w dichlorometanie i zaobserwowano, że analogi mają wartości Rf w zakresie od 0,62 do 0,86 lub w jego pobliżu. Nałożyć odpowiednią ilość smaru próżniowego lub użyć tulei z PTFE na styku złączy szklanych, aby zapobiec zatarciu szkła skraplacza i kolby okrągłodennej w wysokich temperaturach i warunkach podstawowych.
  4. Pozostawić mieszaninę reakcyjną do ostygnięcia do temperatury pokojowej i odparować substancje lotne pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.
  5. Schłodzić mieszaninę reakcyjną do temperatury 0 °C w łaźni lodowej.
  6. Zneutralizuj pozostałą oleistą mieszaninę, dodając kwas octowy (30,0 mmol, 1,70 ml) w jednej porcji.
  7. Oczyścić otrzymany materiał produktu za pomocą filtracji próżniowej (patrz krok 2a, dla związków: 17, 18, 20-22, 24 i 25) lub zastosować ekstrakcję ciecz-ciecz/chromatografię kolumnową (patrz krok 2b, dla związków: 16, 19 i 23).

2. Procedura oczyszczania

  1. Poprzez filtrację próżniową
    1. Zamontuj lejek Hirscha na kolbie bocznej za pomocą dopasowanego gumowego adaptera.
    2. Nałóż kawałek okrągłej bibuły filtracyjnej na lejek Hirscha i lekko zwilż wodą dejonizowaną, aby umożliwić przyleganie do lejka.
    3. Podłącz źródło podciśnienia do bocznego ramienia kolby i upewnij się, że jest wystarczające uszczelnienie próżniowe, upewniając się, że żadne ze szklanych naczyń nie można rozsunąć pod próżnią.
    4. Kolbę zawierającą skrystalizowany produkt przelać przez filtr próżniowy i pozostawić do przefiltrowania. Opłucz kryształy 10 ml lodowatej wody dejonizowanej.
    5. Pozwól, aby przefiltrowane kryształy nadal schły na bibule filtracyjnej, nadal podłączone do źródła podciśnienia, po przefiltrowaniu wszystkich cieczy.
    6. Zebrać przefiltrowane kryształy i umieścić w kolbie okrągłodennej o pojemności 25 ml.
    7. Przymocuj kolbę okrągłodenną do złącza ze spiekanego szkła szlifowanego/adaptera linii próżniowej. Zabezpiecz szklane złącze złącza za pomocą zacisku Keck.
    8. Do żebrowanego końca adaptera szklanej linii wysokiego podciśnienia podłącz przewód próżniowy, który jest kierowany do pompy wysokiej próżni i odpowiednio schłodzić pułapkę próżniową (za pomocą chłodziwa, takiego jak ciekły azot lub suchy lód/aceton), aby skondensować wszelkie lotne substancje, które mogą wyparować z materiału krystalicznego. Włącz pompę wysokiej próżni, aby zapewnić całkowite odparowanie wszelkich śladowych ilości pozostałego rozpuszczalnika z kryształów.
    9. Pozostaw kryształy do wyschnięcia w wysokiej próżni przez co najmniej 1 godzinę. Wyjmij kolbę okrągłodenną z przewodu próżniowego/adaptera, wyłącz pompę wysokiej próżni i wyczyść syfon.
  2. Procedura oczyszczania za pomocą chromatografii kolumnowej
    1. Rozcieńczyć zawartość mieszaniny reakcyjnej poddanej działaniu kwasu octowego (z kroku 1.6) 10 ml wody dejonizowanej i przenieść do rozdzielacza rozdzielającego. Dodać 10 ml dichlorometanu do rozdzielacza rozdzielającego. Delikatnie wstrząśnij i odpowietrz rozdzielacz w celu oddzielenia dwóch warstw.
    2. Ekstrahować warstwę wodną, używając kolejnych porcji dichlorometanu (3 x 5 ml). Połączyć frakcje organiczne i wysuszyć przy użyciu bezwodnego Na2SO4. Zdekantować i usunąć wszystkie substancje lotne pod obniżonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.
    3. Rozcieńczyć pozostałość otrzymaną z etapu 2.2.2 5 ml CH2Cl2. Przeprowadzić chromatografię kolumnową z błyskiem, używając około 75 g żelu krzemionkowego. Eluować próbkę roztworem 10% metanolu w dichlorometanie.
    4. Zebrane frakcje rozpuszczalnika usunąć pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej. Przenieść stałą pozostałość do kolby okrągłodennej o pojemności 25 ml, używając około 10 ml CH2Cl2. Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.
    5. Wysuszyć pozostałość stałą w wysokiej próżni, jak opisano wcześniej w krokach 2.1.7 - 2.1.9.

3. Akwizycja absorpcji molowej i badania UV/VispK A dla analogów 16-25

  1. Tworzenie złożonych roztworów podstawowych do spektrofotometrii UV/Vis dla analogów 16 - 25.
    1. Odważyć 10 μmol wybranego analogu dipirrynonu (16-25) i dodać go do kolby miarowej o pojemności 10 ml.
    2. Dodać DMSO do oznaczenia 10,0 ml na kolbie miarowej.
      UWAGA: Jeśli związek nie rozpuści się całkowicie, podgrzej kolbę za pomocą opalarki i w razie potrzeby zamieszaj kolbę, aby całkowicie rozpuścić związek.
  2. Przygotuj roztwory soli fizjologicznej buforowane fosforanami (PBS) o różnych poziomach pH. Analogi scharakteryzowano w PBS o pH od około 4 do 15.
    1. Używając butli objętościowej o pojemności 1 l, utwórz 1 l roztworu podstawowego PBS, rozcieńczając 100 ml PBS (x100) w 900 ml wody dejonizowanej.
    2. Przenieść 50 ml przygotowanego roztworu podstawowego PBS (etap 3.2.1) do zlewki o pojemności 100 ml i dodać mieszadło magnetyczne. Następnie, używając skalibrowanego pH-metru do monitorowania zmian pH, miareczkować bufor PBS wodnym roztworem 1,0 M NaOH (w celu uzyskania o pH > 7,0) lub 1,0 M HCl (w celu uzyskania o pH < 7,0).
      UWAGA: Aby uzyskać dane, które skutkują dobrze zdefiniowaną krzywą miareczkowania, zalecamy generowanie pH w odstępach co 0,1 jednostki pH w ± 0,5 od przewidywanego punktu przegięcia i przyrostach o 0,5 poza przewidywanym punktem przegięcia.
  3. Uzyskać widma absorpcji molowej dla analogów 16 - 25 w roztworach PBS (pH 7,0) i 1,0 M NaOH (pH 14,0).
    1. Przygotować "ślepą próbę" za pomocą czystej i suchej kuwety kwarcowej, a następnie dodać 2,0 ml roztworu podstawowego PBS (pH 7,0) lub wodnego roztworu 1,0 M NaOH do kuwety za pomocą mikropipety 100 - 1000 μl.
      UWAGA: Dla integralności procesu pozyskiwania danych z roztworu ślepej próby ważne jest upewnienie się, że w roztworze kuwety nie ma pęcherzyków powietrza i dokładne przetarcie boków kuwety chusteczką Kim, aby zapobiec rozpraszaniu światła wynikającemu z kurzu lub zanieczyszczeń na zewnątrz kuwety. Jeśli bąbelki utrzymują się, delikatnie i kilkakrotnie postukaj kuwetą w ręcznik papierowy położony na twardej powierzchni.
    2. Za pomocą spektrofotometru UV/Vis wyślepić wybrany roztwór dla zakresu 200 - 800 nm.
    3. Do drugiej czystej i suchej kuwety kwarcowej dodać 2,00 ml PBS (pH 7,0) lub 1,0 M NaOH (pH 14), a następnie 10 μl roztworu podstawowego analogu dipiranonu (16 - 25) (patrz krok 3.1) za pomocą mikropipety o pojemności 5-50 μl. Umieść nakrętkę na kuwecie i dobrze wstrząśnij, a także odwróć kuwetę.
      UWAGA: Dla integralności procesu pozyskiwania danych roztworu próbki ważne jest upewnienie się, że w roztworze kuwety nie ma pęcherzyków powietrza i dokładne wytarcie boków kuwety chusteczką Kim, aby zapobiec rozpraszaniu światła wynikającemu z kurzu lub zanieczyszczeń na zewnątrz kuwety. Jeśli bąbelki utrzymują się, delikatnie i kilkakrotnie postukaj kuwetą w ręcznik papierowy położony na twardej powierzchni.
    4. Za pomocą spektrofotometru UV/Vis należy uzyskać widmo absorpcyjne dla roztworu analogu dipirrynonu dla zakresu 200 - 800 nm.
    5. Do tej samej kuwety dodać dodatkowe 10 μl roztworu podstawowego analogu dipirynonu i powtórzyć kroki 3.3.3 i 3.3.4.
    6. Powtarzać krok 3.3.5 do momentu, gdy do kuwety zostanie dodanych łącznie 50 μl roztworu podstawowego analogu dipirrynonu w celu uzyskania co najmniej pięciu punktów danych długości fali wzbudzenia. Powtarzać kroki 3.3.1-3.3.6 aż do uzyskania wszystkich roztworów podstawowych 16-25 zarówno w PBS (pH 7,0), jak i w 1,0 M NaOH.
  4. Uzyskać wartości absorpcji molowej dla 16 - 25 w PBS (pH 7,0) i 1,0 M NaOH za pomocą analizy regresji liniowej o najlepszym dopasowaniu.
    1. Korzystając z programu do tworzenia wykresów, takiego jak GraphPad Prism 7, wykreśl zmierzoną absorbancję (oś y) w stosunku do stężenia analogu dipyrrinonu (oś x). Utwórz najlepiej dopasowaną analizę regresji liniowej dla pięciu wykreślonych punktów. Należy obserwować zależność liniową, a analiza statystyczna powinna wykazać wartość R2 ≥ 0,98.
    2. Powtórzyć krok 3.4.1 dla analogów 16 - 25 w PBS (pH 7,0) i 1,0 M NaOH.
    3. Obliczyć absorpcję molową dla 16 - 25 w PBS (pH 7,0) i 1,0 M NaOH, korzystając z ekstrapolowanej wartości nachylenia z najlepiej dopasowanej krzywej liniowej.
  5. Określ wartości pKa w 16 - 25 badaniach z użyciem spektrofotometrii UV/VIS
    1. Do czystej i suchej kuwety kwarcowej przenieść 1 900 μl buforu PBS o wybranym poziomie pH (przygotowanym w kroku 3.2) za pomocą mikropipety o pojemności 100 - 1000 μl.
      UWAGA: Zauważyliśmy, że podczas przechowywania w niektórych może tworzyć się biały osad. Aby upewnić się, że bufor jest całkowicie jednorodny i jeśli widoczny jest jakikolwiek osad, należy użyć filtracji grawitacyjnej w celu usunięcia osadu bezpośrednio przed użyciem. Patrz uwaga po kroku 3.3.1.
    2. Za pomocą spektrofotometru UV/Vis należy wykonać ślepe próby usunięcia wybranego roztworu buforowego PBS dla zakresu 200 - 800 nm.
    3. Do drugiej czystej i suchej kuwety kwarcowej przenieś 1 900 μl wybranego buforu PBS, a następnie dodaj 100 μl wybranego analogowego roztworu podstawowego za pomocą mikropipety o pojemności 5-50 μl. Umieść nakrętkę na kuwecie i dobrze wstrząśnij, a także odwróć kuwetę.
      UWAGA: Patrz poprzednia uwaga po kroku 3.3.3.
    4. Za pomocą spektrofotometru UV/Vis uzyskaj widmo absorpcyjne dla analogu dipyrrynonu dla zakresu 200 - 800 nm.
    5. Powtórz kroki 3.5.1 - 3.5.4 dla 16 - 25 w każdym z PBS wygenerowanych w kroku 3.2.
  6. Określ wartościpK a dla 16 - 25 za pomocą funkcji najlepszego dopasowania krzywej sigmoidalnej.
    1. Korzystając z programu do tworzenia wykresów, narysuj wykres zmierzonej absorbancji w funkcji długości fali (nm) dla 16 - 25 przy różnych poziomach pH.
    2. Wybierz długość fali między 380-415 nm, gdzie przy niższych poziomach pH (< 7,0) absorbancja jest mała (0-0,1 jednostki), a przy wyższym pH (> 12,0) absorbancja jest znacznie większa (0,8-1,0 jednostek). Wykreślić absorbancję przy wybranej długości fali w funkcji pH.
    3. Korzystając z funkcji krzywej sigmoidalnej, wygeneruj krzywą najlepszego dopasowania dla każdego z analogów 16 - 25. Należy podać ekstrapolowane pH w połowie wysokości krzywej. Jest to podawana wartośćpK a.

4. Akwizycja wydajności kwantowej i badania fluorescencji

  1. Tworzenie roztworów podstawowych do badania fluorescencji dla analogów dipirynonu 16 - 18 i 20 - 25.
    1. Korzystając z analogowego roztworu podstawowego dipirynonu utworzonego w kroku 3.1, przeprowadzić rozcieńczenie roztworu podstawowego, dodając 10 μl roztworu podstawowego do kolby miarowej o pojemności 1 ml za pomocą mikropipety o pojemności 2 - 20 μl, a następnie dodać bufor PBS (pH 7,0) do oznaczenia 1 ml. Umieścić nakrętkę na kolbie miarowej i dobrze wymieszać, odwracając i potrząsając kolbą. Ten rozcieńczony roztwór podstawowy zostanie użyty do wygenerowania widm fluorescencyjnych i będzie określany jako fluorescencyjny roztwór podstawowy.
    2. Powtórz krok 4.1.1 dla analogów 16 - 18 i 20 - 25.
  2. Uzyskanie widm emisji fluorescencji w różnych stężeniach, dla analogów 16 - 18 i 20 - 25. Dla wszystkich analogów innych niż 18 należy uzyskać pięć widm dla każdego analogu w roztworach o pH 7 i 14 w stężeniach: 19,96, 39,84, 59,64, 79,37 i 99,01 nM. Dla analogu 18 uzyskaj pięć widm w roztworze o pH 7 w stężeniach: 49.75, 99.01, 147.8, 196.1 i 243.9 nM. W roztworze o pH 14 uzyskać pięć widm dla analogu 18 w stężeniach: 99,01, 196,1, 291,3, 384,6, 476,2 nM.
    1. Do przezroczystej czterostronnej kuwety kwarcowej dodać 3,00 ml PBS (pH 7,0) lub 1,0 NaOH za pomocą mikropipety 100 -1,000 μl w trzech odstępach co 1,000 μl.
      UWAGA: Patrz uwaga po kroku 3.3.1.
    2. Za pomocą fluorometru i oprogramowania do fluorometru FluorEssence uzyskaj widmo emisyjne dla wybranego roztworu i oznacz je jako roztwór "ślepy".
    3. Do tej samej kuwety dodać 6 μl podstawowego roztworu fluorescencji dla wybranego analogu dipirynnonu (część 4.1) za pomocą mikropipety o pojemności 0,5-10 μl. Umieść nakrętkę na kuwecie i dobrze wymieszaj, odwracając i delikatnie potrząsając kuwetą.
      UWAGA: Patrz uwaga po kroku 3.3.3.
    4. Za pomocą fluorometru uzyskaj widmo emisyjne dla wybranego roztworu związku, używając λmax abs jako długości fali wzbudzenia. Intensywność wzbudzenia mierzono w zakresie 200 nm, zaczynając od 15 nm poza długością fali wzbudzenia (zazwyczaj wymagany jest zakres 200 nm, aby intensywność fluorescencji powróciła do wartości wyjściowej).
    5. Powtarzać czynności 4.2.3-4.2.4 aż do dodania do kuwety łącznie 30 μl podstawowego roztworu fluorescencji.
    6. Powtórzyć kroki 4.2.1 - 4.2.5 dla analogów 16 - 25 w PBS (pH 7,0) i 1,0 M NaOH,
      UWAGA: Stężenia w kuwecie zmieniono dla analogu 18, a dane uzyskano za pomocą: 2,0 ml PBS z pięcioma kolejnymi przyrostami 10 μl fluorescencyjnego roztworu podstawowego dla obojętnego (protonowanego 18) roztworu i 2,0 ml 1,0 M NaOH z pięcioma przyrostami po 20 μl dodanego złożonego roztworu podstawowego dla roztworu zasadowego (deprotonowanego 18).
  3. Określ wydajność kwantową za pomocą metody Williamsa, A. T. i wsp.17
    1. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego (tj. Microsoft Excel), zaimportuj dane (punkty danych intensywności emisji) dla widm emisji dla pojedynczego analogu dipirynonu (pobranego w PBS [pH 7,0] lub 1,0 M NaOH) przy różnych poziomach stężeń.
    2. Zaimportować punkty danych z widm emisji dla roztworu "ślepej" (kroki 4.2.1–4.2.2) i odjąć "ślepe" punkty danych intensywności emisji od punktów danych dotyczących intensywności emisji, na odpowiednich długościach fal, uzyskanych przy różnych poziomach stężeń.
    3. Przenieś "puste" skorygowane punkty danych intensywności emisji do programu do tworzenia wykresów, takiego jak GraphPad Prism 7, i wykreśl emisję w funkcji długości fali. Obliczyć pole pod krzywą dla każdej z krzywych uzyskanych przy różnych poziomach stężenia analogu dipirrynonu.
    4. Postępując zgodnie z techniką opisaną przez Williamsa, AT i wsp., obliczyć ekstrapolowaną wartość absorbancji dla każdego z różnych poziomów stężenia analogu dipirrynonu. Osiąga się to poprzez pomnożenie obliczonej wartości absorpcji molowej (z najlepiej dopasowanej analizy regresji liniowej, patrz krok 3.4) przez każde stężenie analogu dipyrrynonu użyte w krokach 4.2.3-4.2.5.
    5. Korzystając z programu do tworzenia wykresów, takiego jak GraphPad Prism 7, utwórz wykres ekstrapolowanej absorbancji analogu (oś x) w stosunku do obliczonego obszaru pod każdą krzywą stężenia (krok 4.3.4) dla długości fali emisji odpowiadającej największej wartości emisji. Należy zaobserwować zależność liniową z r2 ≥ 0,96.
    6. Wykonaj kroki analogiczne do 3.1-3.4 i 4.1-4.3.5 dla chininy w 0,5 M H2SO4 (ΦF = 0,55)18 i antracenu w etanolu (ΦF = 0,27)18, 19, aby uzyskać dane do norm.
    7. Wartości wydajności kwantowej dla 16 - 25 w PBS (pH 7,0) i 1,0 M NaOH należy uzyskać, korzystając z ekstrapolowanych nachyleń uzyskanych z kroków 4.3.5 i 4.3.6 w następującym równaniu:
      Φx = Φst(Gradx/Gradst)(η2x/η2st)
      gdzie Φst oznacza wydajność kwantową wzorca, Φx oznacza wydajność kwantową niewiadomej, Grad jest nachyleniem najlepszego dopasowania liniowego, a η jest współczynnikiem załamania światła użytego rozpuszczalnika (współczynnik współczynnika załamania światła obliczono przy użyciu η = 1,36 dla etanolu i η = 1,35 dla 0,5 M H2SO4).
    8. Należy podać wydajność kwantową dla 16 - 18 i 20 - 25 w PBS (pH 7,0) i 1,0 M NaOH jako średnią Φx uzyskaną dla chininy i antracenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reakcja kondensacji Claisena-Schmidta umożliwiła otrzymanie analogów dipyrryniononu (16-25, Rysunek 4) przy użyciu procedury jednoimiennej (one-pot) opisanej w sekcji protokołu (patrz krok 1). Analogi 16-25 zostały otrzymane poprzez kondensację pyrrolinonu 9, bromizoindolonu 10 lub izoindolonu 11 z 1H-imidazol-2-karboksaldehydem (12), 1H-im...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podejście kondensacyjne Claisena-Schmidta zapewnia dość solidny sposób generowania fluoroforów pirazolu, imidazolu i izoindolonu dipyrrynonu za pomocą stosunkowo uproszczonego operacyjnie protokołu. Chociaż synteza fluorescencyjnych analogów dipirynonu była przedmiotem tego badania, należy zauważyć, że podobne warunki można zastosować do dostępu do innych bicyklicznych układów pierścieniowych połączonych metyną, takich jak dipirynony 23,24,25 i addukty pirolowo-furanowe

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Z.R.W. i N.B. dziękują NIH (2P20 GM103440-14A1) za hojne finansowanie, a także Jungjae Koh i University of Nevada, Las Vegas za pomoc w zdobyciu 1H i 13C NMR. Dodatkowo chcielibyśmy podziękować studentom mediów wizualnych NSC, Arnoldowi Placencia-Floresowi, Aubry Jacobsowi i Alistairowi Cooperowi za ich pomoc w procesach filmowania i animacji w częściach kinematografii tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-etylo-4-metylo-3-pirolino-2-oneCombi-Blocks [ 766-36-9]Żółty odczynnik stały
izoindolin-1-onArkPharm [ 480-91-1]Odczynnik w postaci stałej w kolorze złamanej bieli
5-bromoisoindolin-1-oneCombi-Blocks [ 552330-86-6]Różowy stały odczynnik
2-formyloimidazolCombi-Blocks [ 10111-08-7 ]Odczynnik w postaci stałej białawej
Imidazol-4-karbaldehydArkPharm [ 3034-50-2]Odczynnik stały
1-H-pirazolo-4-karbaldehydOakwood Chemicals [ 35344-95-7]Odczynnik stały
1-H-pirazolo-5-karbaldehydMatrix Scientific [ 3920-50-1]Odczynnik stały
Stałe granulki KOHBeanTown Chemicals[1310-58-3]Białe stałe granulki
Siliflash Silica GelScilicycleR12030BDrobny biały proszek
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (x10)GrowcellsMRGF-6235Bezbarwna półprzezroczysta ciecz
Beckman Coulter DU-800 UV/Vis Spektrofotometr i oprogramowanieBeckman CoulterPrzyrząd do spektroskopiiN/A
Spektrofluorometr Fluoromax-4Horiba ScientificN/APrzyrząd do spektroskopii
FluorEssence Oprogramowanie do fluoremetrii V3.5Oprogramowanie do spektroskopiiHoriba ScientificN/A
Mikropipeta Finnpipette II (rozmiary: 100-1,000, 20-200 i 0,5-10 &mikro; L)FischerbrandN/AEquipment
Wilmad-LabGlass Parownik obrotowy (model: WG-EV311-V-PLUS)SP SciencewareN/AEquipment
Pompa próżniowa DuoSeal (numer modelu: 1405)Sprzęt WelchN/A
GraphPad Prism 4GraphPadN/AOprogramowanie do analizy danych
SympHony pH-metr (model: Sb70P)VWRN/ASprzęt
i oprogramowanie

Bibliografia

  1. Abbandonato, G., et al. Cis-trans photoisomerization properties of GFP chromophore analogs. European Biophysics Journal. 40 (11), 1205-1214 (2011).
  2. Funakoshi, H., et al. Spectroscopic studies on merocyanine photoisomers. IV. Catalytic isomerization of photoisomers of merocyanine derivatives in protic solvents. Nippon Kagaku Kaishi. (9), 1516-1522 (1989).
  3. Puzicha, G., Shrout, D. P., Lightner, D. A. Synthesis and properties of homomologated and contracted dipyrrinone analogs of xanthobilirubic acid. Journal of Heterocyclic Chemistry. 27 (7), 2117-2123 (1990).
  4. Bonnett, R., Hamzetash, D., Asuncion Valles, M. Propentdyopents [5-(2-oxo-2H-pyrrol-5-ylmethylene)pyrrol-2(5H)-ones] and related compounds. Part 2. The Z E photoisomerization of pyrromethenone systems. Journal of the Chemical Society, Perkins Transactions. 1 (6), 1383-1388 (1987).
  5. Tikhomirova, K., Anisimov, A., Khoroshutin, A. Biscyclohexane-Annulated Diethyl Dipyrrindicarboxylates: Observation of a Dipyrrin Form with Absent Visible Absorption. European Journal of Organic Chemistry. 2012 (11), 2201-2207 (2012).
  6. Brower, J. O., Lightner, D. A. Synthesis and spectroscopic properties of a new class of strongly fluorescent dipyrrinones. Journal of Organic Chemistry. 67 (8), 2713-2716 (2002).
  7. Woydziak, Z. R., Boiadjiev, S. E., Norona, W. S., McDonagh, A. F., Lightner, D. A. Synthesis and Hepatic Transport of Strongly Fluorescent Cholephilic Dipyrrinones. Journal of Organic Chemistry. 70 (21), 8417-8423 (2005).
  8. Jarvis, T., et al. Pyrrole β-amides: Synthesis and characterization of a dipyrrinone carboxylic acid and an N-Confused fluorescent dipyrrinone. Tetrahedron. 74 (14), 1698-1704 (2018).
  9. Bodio, E., Denat, F., Goze, C. BODIPYS and aza-BODIPY derivatives as promising fluorophores for in vivo molecular imaging and theranostic applications. Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. 23, 1159-1183 (2019).
  10. Acharya, A., et al. Photoinduced Chemistry in Fluorescent Proteins: Curse or Blessing. Chemical Reviews. 117 (2), 758-795 (2017).
  11. Romei, M. G., Lin, C. -Y., Mathews, I. I., Boxer, S. G. Electrostatic control of photoisomerization pathways in proteins. Science. 367 (6473), 76-79 (2020).
  12. Benson, N., Suleiman, O., Odoh, S. O., Woydziak, Z. Ryrazole, Imidazole, and Isoindolone Dipyrrinone Analogues: pH-Dependent Fluorophores That Red-Shift Emission Frequencies in a Basic Solution. Journal of Organic Chemistry. 84 (18), 11856-11862 (2019).
  13. Xie, P., Gao, G., Liu, J., Jin, Q., Yang, G. A New Turn on Fluorescent Probe for Selective Detection of Cysteine/Homocysteine. Journal of Fluorescence. 25 (5), 1315-1321 (2015).
  14. Alty, I. G., et al. Intramolecular Hydrogen-Bonding Effects on the Fluorescence of PRODAN Derivatives. Journal of Physical Chemistry A. 120 (20), 3518-3523 (2016).
  15. Yang, Y., Li, D., Li, C., Liu, Y. F., Jiang, K. Hydrogen bond strengthening induces fluorescence quenching of PRODAN derivative by turning on twisted intramolecular charge transfer. Spectrochimica Acta, Part A. 187, 68-74 (2017).
  16. Zhang, L., Liu, J., Gao, J., Zhang, F., Ding, L. High solid fluorescence of a pyrazoline derivative through hydrogen bonding. Molecules. 22 (8), 1(2017).
  17. Williams, A. T. R., Winfield, S. A., Miller, J. N. Relative fluorescence quantum yields using a computer-controlled luminescence spectrometer. Analyst. 108 (1290), 1067-1071 (1983).
  18. Eaton, D. F. Reference materials for fluorescence measurement. Pure and Applied Chemistry. 60 (7), 1107-1114 (1988).
  19. Dawson, W. R., Windsor, M. W. Fluorescence yields of aromatic compounds. Journal of Physical Chemistry. 72 (9), 3251-3260 (1968).
  20. Zhang, X. -F., Zhang, J., Lu, X. The Fluorescence Properties of Three Rhodamine Dye Analogues: Acridine Red, Pyronin Y and Pyronin B. Journal of Fluorescence. 25 (4), 1151-1158 (2015).
  21. Zanker, V., Rammensee, H., Haibach, T. Measurements of the relative quantum yields of the fluorescence of acridine and fluorescein dyes. Zeitschrift für Angewandte Physik. 10, 357-361 (1958).
  22. Mujumdar, R. B., Ernst, L. A., Mujumdar, S. R., Lewis, C. J., Waggoner, A. S. Cyanine dye labeling reagents: Sulfoindocyanine succinimidyl esters. Bioconjugate Chemistry. 4 (2), 105-111 (1993).
  23. Battersby, A. R., Dutton, C. J., Fookes, C. J. R. Synthetic studies relevant to biosynthetic research on vitamin B12. Part 7. Synthesis of (±)-bonellin dimethyl ester. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions. 1 (6), 1569-1576 (1988).
  24. Pfeiffer, W. P., Lightner, D. A. (m.n)-Homorubins: syntheses and structures. Monatschfte für Chemie. 145 (11), 1777-1801 (2014).
  25. Huggins, M. T., Musto, C., Munro, L., Catalano, V. J. Molecular recognition studies with a simple dipyrrinone. Tetrahedron. 63 (52), 12994-12999 (2007).
  26. Groselj, U., et al. Synthesis of Spiro-δ2-Pyrrolin-4-One Pseudo Enantiomers via an Organocatalyzed Sulfa-Michael/Aldol Domino Sequence. Advanced Synthesis & Catalyst. 361 (22), 5118-5126 (2019).
  27. El-Shwiniy, W. H., Shehab, W. S., Mohamed, S. F., Ibrahium, H. G. Synthesis and cytotoxic evaluation of some substituted pyrazole zirconium(IV) complexes and their biological assay. Applied Organometallic Chemistry. 32 (10), (2018).
  28. Murray, L., O'Farrell, A. -M., Abrams, T. Preparation of indolinone compounds for treatment of excessive osteolysis. US Patent. , US20040209937A1 (2004).
  29. Lozinskaya, N. A., et al. Synthesis and biological evaluation of 3-substituted 2-oxindole derivatives as new glycogen synthase kinase 3β inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 27 (9), 1804-1817 (2019).
  30. Montforts, F. P., Schwartz, U. M. A directed synthesis of the chlorin system. Liebigs Annalen der Chemie. (6), 1228-1253 (1985).
  31. Uddin, M. I., Thirumalairajan, S., Crawford, S. M., Cameron, T. S., Thompson, A. Improved synthetic route to C-ring ester-functionalized prodigiosenes. Synlett. (17), 2561-2564 (2010).
  32. Brower, J. O., Lightner, D. A., McDonagh, A. F. Aromatic congeners of bilirubin: synthesis, stereochemistry, glucuronidation and hepatic transport. Tetrahedron. 57 (37), 7813-7827 (2001).
  33. Clift, M. D., Thomson, R. J. Development of a Merged Conjugate Addition/Oxidative Coupling Sequence. Application to the Enantioselective Total Synthesis of Metacycloprodigiosin and Prodigiosin R1. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14579-14583 (2009).
  34. Brower, J. O., Lightner, D. A., McDonagh, A. F. Synthesis of a New Lipophilic Bilirubin. Conformation, Transhepatic Transport and Glucuronidation. Tetrahedron. 56 (40), 7869-7883 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Synteza dipyrynonufluorofory zale ne od pHenolat winylogowyfluorescencyjne analogi dipyrynonurefuks z wodorotlenkiem potasucienkowarstwowa chromatografiaszybka chromatografia kolumnowaspektroskopia UV Visspektroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły