Obrazowanie poklatkowe żywych komórek in vitro w celu zbadania migracji komórek w kierunku narządu Cortiego

Podsumowanie

W tym badaniu prezentujemy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii konfokalnej do obserwacji komórek poruszających się w kierunku uszkodzonej tkanki poprzez inkubację ex vivo z nabłonkiem ślimaka zawierającym narząd Cortiego.

Streszczenie

Aby zbadać wpływ mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) na regenerację i leczenie komórek, ta metoda śledzi migrację MSC i zmiany morfologiczne po wspólnej hodowli z nabłonkiem ślimaka. Narząd Cortiego został unieruchomiony na plastikowym szkiełku nakrywkowym poprzez naciśnięcie części błony Reissnera powstałej podczas sekcji. MSCs zamknięte w szklanym cylindrze migrowały w kierunku nabłonka ślimaka po usunięciu cylindra. Ich dominującą lokalizację zaobserwowano w modiolusie narządu Cortiego, ustawionym w kierunku podobnym do włókien nerwowych. Jednak niektóre MSCs były zlokalizowane w obszarze rąbka i wykazywały poziomo wydłużony kształt. Ponadto migracja w obszar komórek rzęsatych została zwiększona, a morfologia MSCs zmieniła się na różne formy po leczeniu kanamycyną. Podsumowując, wyniki tego badania wskazują, że kokultura MSCs z nabłonkiem ślimaka będzie przydatna do opracowywania terapii poprzez przeszczep komórek oraz do badań nad regeneracją komórek, które mogą badać różne warunki i czynniki.

Wprowadzenie

Utrata słuchu może wystąpić wrodzenie lub postępować pod wpływem kilku czynników, w tym starzenia się, leków i hałasu. Niedosłuch jest często trudny do leczenia, ponieważ przywrócenie upośledzonej funkcji jest bardzo wymagające, gdy komórki rzęsate odpowiedzialne za słyszenie zostaną uszkodzone¹. Według Światowej Organizacji Zdrowia szacuje się, że utrata słuchu dotyczy 461 milionów ludzi na całym świecie, co stanowi 6,1% populacji świata. Wśród osób z utratą słuchu 93% stanowią dorośli, a 7% dzieci.

Podjęto szereg prób leczenia utraty słuchu; w szczególności obiecującą metodą terapeutyczną okazało się podejście regeneracyjne z wykorzystaniem MSC. W przypadku uszkodzenia tkanki, MSC są naturalnie uwalniane do układu krwionośnego i migrują do miejsca urazu, gdzie wydzielają różne cząsteczki, tworząc mikrośrodowisko sprzyjające regeneracji². W związku z tym istotne jest opracowanie metody leczenia uszkodzonych tkanek poprzez migrację zewnętrznie implantowanych MSC do organów docelowych i ich późniejszą sekrecję cząsteczek wywołujących silną regulację immunologiczną, angiogenezę oraz działanie przeciwapoptotyczne, aby usprawnić przywrócenie funkcji uszkodzonych komórek^3,4,5.

Proces homingu, w którym MSC migrują do uszkodzonych tkanek, może stanowić najważniejszą przeszkodę do pokonania. MSC posiadają systemowy mechanizm homingu, obejmujący sekwencyjne etapy tetheringu/toczenia, aktywacji, zatrzymania, transmigracji/diapedezy oraz migracji^6,7,8. Obecnie podejmowane są wysiłki w celu zidentyfikowania sposobów usprawnienia tych etapów. Przetestowano różne strategie, w tym modyfikacje genetyczne, inżynierię powierzchni komórkowych, priming in vitro oraz naprowadzanie magnetyczne^6,7. Ponadto podjęto kilka prób promowania ochrony i regeneracji słuchowych komórek rzęskowych poprzez kierowanie MSC do miejsca uszkodzenia ślimaka. Jednakże śledzenie MSC in vivo jest czasochłonne, pracochłonne i wymaga wysoko specjalistycznych umiejętności⁹.

Aby rozwiązać ten problem opracowano metodę obserwacji homingu MSC w ślimaku za pomocą konfokalnej mikroskopii poklatkowej, która pozwala na fotografowanie migracji komórek w ciągu kilku godzin (Rysunek 1). Metoda ta została opracowana na początku 20^th wieku i stała się ostatnio potężnym narzędziem do badania migracji specyficznych komórek.

Rycina 1: Abstrakt graficzny. (A) Po przytwierdzeniu wypreparowanego narządu Cortiego do plastikowego szkiełka nakrywkowego za pomocą pęsety, szkiełko jest umieszczane w 35 mm szalce do mikroskopii konfokalnej z szklanym dnem, a następnie (B) pozycjonowany jest szklany cylinder. (C) Po wypełnieniu wnętrza szklanego cylindra pożywką, (D) poza cylinder ostrożnie dodaje się MSCs znakowane GFP wraz z pożywką. (E) Po inkubacji przez noc, (F) szklany cylinder jest usuwany, a obrazy są rejestrowane za pomocą mikroskopu konfokalnego. Skróty: GFP = zielone białko fluorescencyjne; MSCs = mezenchymalne komórki macierzyste. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

Wszystkie protokoły badawcze z wykorzystaniem myszy ICR zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Yonsei University at Wonju College of Medicine. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z Kodeksem Etyki Światowego Stowarzyszenia Lekarzy. W niniejszym protokole ciężarne myszy ICR utrzymywano w 12/12 h cyklu światło/ciemność z wolnym dostępem do pożywienia i wody.

1. Disekcja ślimaków

1. Zesterylizować komorę z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek, włączając światło ultrafioletowe na ok. 30 min, a przed użyciem spryskać wszystkie powierzchnie 70% etanolem. Pozostawić powierzchnie do wyschnięcia.
2. Umieścić narzędzia do sekcji w 70% etanolu na 10 min, a następnie osuszyć przed użyciem.
3. Za pomocą skalpela przeprowadzić dekapitację myszy postnatalnych w wieku 3-4 dni (Ryc. 2A).
4. Umieścić czaszkę pod stereomikroskopem w komorze z laminarnym przepływem powietrza i namoczyć tkankę w 70% etanolu.
5. Szybko przepłukać tkankę w roztworze do sekcji tkanek (1x zrównoważony roztwór soli Hanksa, 1 mM HEPES), aby usunąć etanol.
6. Naciąć linię środkową czaszki za pomocą skalpela chirurgicznego (Ryc. 2B,C).
7. Odsłonić czaszkę, odciągając skórę w kierunku przednim i przecinając zewnętrzny przewód słuchowy ucha (Ryc. 2D).
8. Wyciąć od przedniej do tylnej części czaszki wzdłuż linii oczu (Ryc. 2E).
9. Otworzyć czaszkę i usunąć przedmózgowie, móżdżek oraz pień mózgu za pomocą pęsety tępej (Ryc. 2F,G).
10. Za pomocą mikropęsety oddzielić ślimaka od kości skroniowej (Ryc. 2H).
11. Przenieść ślimaki do szalki Petriego zawierającej roztwór do sekcji tkanek.
12. Ostrożnie wypreparować całą torebkę kostną ślimaka, pozostawiając jedynie wewnętrzną tkankę miękką ślimaka (Ryc. 2I,J).
13. Uchwycić modiolus ślimaka jedną pęsetą, a przewód ślimaka drugą pęsetą, a następnie powoli rozdzielić obie tkanki (Ryc. 2K).
14. Usunąć prążek naczyniowy oraz błonę tectorialną poprzez ich delikatne odwarstwienie (Ryc. 2L,M).
15. Umieścić wysterylizowane plastikowe szkiełko nakrywką w nowym roztworze do sekcji tkanek, a następnie położyć organ Corti na szkiełku nakrywce o średnicy 9 mm, upewniając się, że błona podstawna jest skierowana w dół (Ryc. 2N-P).
16. Unieruchomić tkankę, dociskając pęsetą błonę Reissnera i pozostałą tkankę modiolus do szkiełka nakrywki (Ryc. 2N-P).
17. Przenieść szkiełko nakrywkowe z osadzoną tkanką do centrum naczynia konfokalnego o średnicy 35 mm.
18. Umieścić szklany cylinder klonujący na naczyniu tak, aby eksplant ślimaka znajdował się w centrum naczynia, a następnie dodać do wnętrza cylindra 100 µL pożywki do hodowli eksplantów (DMEM/F12, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% suplementu N2, ampicylina (10 µg/mL))¹⁰ (Ryc. 2Q).
19. Wysiać 5 × 10³ komórek MSC pochodzących z szpiku kostnego myszy, oznaczonych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), w 2 mL pożywki hodowlanej (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% suplementu N2, 10 µg/mL ampicyliny) poza szklanym cylindrem (Ryc. 2R).
    1. Gdy MSC osiągną 80-90% konfluencji, przeprowadzić pasażowanie komórek, odrywając je za pomocą trypsyny i kwasu etylenodiaminotetraoctowego.
20. Ostrożnie przenieść naczynie konfokalne do inkubatora z nawilżaczem i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂.
21. Odssać całą pożywkę z wnętrza i z zewnątrz cylindra, a następnie usunąć szklany cylinder z naczynia konfokalnego.
22. Dodać 2 mL świeżej pożywki do naczynia konfokalnego i inkubować naczynie z hodowlą tkankową w inkubatorze z nawilżaczem do momentu rozpoczęcia analizy.

Rycina 2. Disekcja ślimaka myszy oraz kokultura narządu Cortiego i MSCs. (A) Dekapitacja myszy, (B) i (C) pośrodkowe cięcie strzałkowe głowy, (D) i (E) cięcie wieńcowe mózgu, (F) i (G) usunięcie mózgu i kości skroniowej, (H) ślimak, (I) usunięcie kostnej ściany ślimaka, (J) izolacja ślimaka, (K) oddzielenie przewodu ślimaka od modiolusa, (L) oddzielenie stria vascularis (SV) i więzadła spiralnego (SL) od narządu Cortiego, (M) usunięcie błony tectorialnej, (N-P) mocowanie ślimaka na plastikowym szkiełku nakrywkowym, (Q) rozmieszczenie szkiełka nakrywkowego i szklanego cylindra w szalce konfokalnej, (R) inokulacja MSCs. Biały pasek skali (A-E) = 1 cm; pomarańczowy pasek skali (F, G, P) i żółty pasek skali (H,I) = 1 mm; zielony pasek skali (J-O) = 0.5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Obrazowanie time-lapse

1. W eksperymentach przedstawionych w niniejszym opracowaniu należy zastosować system mikroskopii konfokalnej z inkubatorem stołowym.
2. Włącz mikroskop konfokalny, lampę fluorescencyjną oraz komputer.
3. Ustaw warunki w inkubatorze nadstołowym umieszczonym na stoliku mikroskopu konfokalnego na 37 °C oraz 5% CO2₂ atmosfera
4. Umieść naczynie z próbką w uchwycie do naczyń, przykryj je pokrywą mocującą, a następnie zamknij komorę górną pokrywą grzejną.
5. Dostosuj powiększenie i ostrość, aby zlokalizować narząd Cortiego oraz MSC w polu widzenia.
6. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazów. W sekcji zlokalizuj opcja, wybierz a obiektyw Plan-Apochromat 20x (apertura numeryczna 0,8) oraz a obszar kadrowania 0,5x.
7. Pod Akwizycjakliknij w inteligentna konfiguracja i wybierz EGFP.
8. Otwórz kanał zakładka poniżej Akwizycjai ustawić moc lasera do 0.2%, the otwór przypominający szpilkę Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 44 µm, the główny poziom wzmocnienia Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 750 V, oraz wzmocnienie cyfrowe do 1.0.
9. Kliknij w ESID pod układ obrazowania, a następnie ustawić wzmocnienie ESID do 4 oraz wzmocnienie cyfrowe Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 7.5.
10. Kliknij w Kafelki i palik w celu przygotowania 210 płytek.
11. Otwórz Strategia skupienia i wybierz tryb koncentracji.
12. Pod szeregi czasoweustawić czas trwania do 24 h oraz odstęp Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 10 min.
13. Pod Akwizycja, ustaw rozmiar klatki do 512 x 512 pikseli, prędkość skanowania do 8, the kierunek do dwukierunkowy, the uśrednianie Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 4x, oraz bitów na piksel Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 16.
14. Kliknij w rozpocznij eksperyment aby rozpocząć eksperyment.

3. Modyfikacja plików obrazów

1. W sekcji przetwarzanie (processing) kliknij zszywanie (stitching), a następnie ustaw minimalne nakładanie (minimal overlay) na 5% oraz maksymalne przesunięcie (maximal shift) na 10%.
2. Kliknij eksport filmu (movie export), ustaw opcję nieskompresowany (uncompressed) i ustaw prędkość (speed) na 7,5.

4. Immunobarwienie

1. Ostrożnie odessać medium, a następnie dwukrotnie przemyć próbkę fosforanem buforowanym solą (PBS) przez 5 min.
2. Utrwalić próbkę w 4% formalinie w PBS przez 15 min, a następnie przemyć próbkę 3 razy PBS przez 5 min.
3. Przeprowadzić permeabilizację próbki w 0,1% Triton X-100 w PBS przez 10 min, a następnie przemyć 3 razy PBS przez 5 min.
4. Dodać 250 µL odczynnika phalloidin-iFluor 647 (rozcieńczenie 1:1000 w PBS) i inkubować próbkę przez 1 h w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
5. Przemyć próbkę 3 razy PBS przez 5 min.
6. Przenieść szkiełko nakrywkowe na szkiełko przedmiotowe i dodać 2 krople medium montażowego.
7. Ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe na preparat.
8. Zapieczętować szkiełko nakrywkowe bezbarwnym lakierem do paznokci i przechowywać w 4 °C w ciemności do momentu obserwacji komórek.
9. Wykonać obrazowanie preparatu za pomocą mikroskopu konfokalnego z odpowiednim filtrem przy wzbudzeniu/emisji (Ex/Em)=650/665 nm dla faloidyny oraz Ex/Em=488/507 nm dla EGFP.

Wyniki

Migrację MSC in vitro w trybie trójwymiarowym oceniano za pomocą systemu Transwell lub tradycyjną metodą gojenia ran (wound healing), aby obserwować migrację w trybie dwuwymiarowym (2D)¹¹. Organ Corti jest złożoną strukturą składającą się z różnych komórek, takich jak komórki Boettchera, komórki Claudiusa, komórki Deitersa, komórki filarowe, komórki Hensenowe, zewnętrzne komórki rzęsiste, wewnętrzne komórki rzęsiste, włókna nerwowe, błona podstawna oraz błona siate...

Dyskusja

Przeszczepianie MSCs do uszkodzonych miejsc w celu wspomagania regeneracji uszkodzonych komórek było szeroko badane, a efekt terapeutyczny jest oczywisty. Doniesiono, że przeszczepienie i późniejsze różnicowanie MSCs przywraca słuch u szczurów z ubytkiem słuchu wywołanym przez kwas 3-nitropropionowy¹³. Chociaż Lee i wsp. zastosowali MSC u ludzi przezżylnie, nie osiągnęli żadnej znaczącej poprawy słuchu¹⁴. Do niedawna przeprowadzono blisko 12 eksperymentów mających na celu p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10X PBS Bufor	GenDEPOT	P2100-104
4% Formalina	T& I	BPP-9004
Ampicylina	sigma	A5354-10ml
BSA	sigma	A4503-100G
czasza konfokalna	SPL	200350
konfokalny	ZEISS	LSM800
szkiełko nakrywkowe	SPL	20009
DMEM/F12	Gibco	10565-018
Surowica bydlęca	płodu Thermo Fisher 16140071
naukowy Fluorsheild z DAPI	sigma	F6057
Kleszcz	Dumont	0508-L5-P0
HBSS	Thermo Fisher naukowy	14065056
HEPES	Thermo Fisher naukowy	suplement 15630080
N2	Gibco	17502-048
abcam	ab176759
Inkubator Stage Top	TOKAI Mysie	WELSX
Strain C57BL/6 z	cyagenem	MUBMX-01101
Triton X-100	sigma	Zobacz materiał T8787

mikroskop Phalloidin-iFluor 647 meszenchymalne komórki macierzyste HIT GFP TGL