Obrazowanie poklatkowe żywych komórek in vitro w celu zbadania migracji komórek w kierunku narządu Cortiego

Podsumowanie

W tym badaniu prezentujemy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii konfokalnej do obserwacji komórek poruszających się w kierunku uszkodzonej tkanki poprzez inkubację ex vivo z nabłonkiem ślimaka zawierającym narząd Cortiego.

Streszczenie

Aby zbadać wpływ mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) na regenerację i leczenie komórek, ta metoda śledzi migrację MSC i zmiany morfologiczne po wspólnej hodowli z nabłonkiem ślimaka. Narząd Cortiego został unieruchomiony na plastikowym szkiełku nakrywkowym poprzez naciśnięcie części błony Reissnera powstałej podczas sekcji. MSCs zamknięte w szklanym cylindrze migrowały w kierunku nabłonka ślimaka po usunięciu cylindra. Ich dominującą lokalizację zaobserwowano w modiolusie narządu Cortiego, ustawionym w kierunku podobnym do włókien nerwowych. Jednak niektóre MSCs były zlokalizowane w obszarze rąbka i wykazywały poziomo wydłużony kształt. Ponadto migracja w obszar komórek rzęsatych została zwiększona, a morfologia MSCs zmieniła się na różne formy po leczeniu kanamycyną. Podsumowując, wyniki tego badania wskazują, że kokultura MSCs z nabłonkiem ślimaka będzie przydatna do opracowywania terapii poprzez przeszczep komórek oraz do badań nad regeneracją komórek, które mogą badać różne warunki i czynniki.

Wprowadzenie

Utrata słuchu może wystąpić wrodzona lub może być spowodowana stopniowo przez kilka czynników, w tym starzenie się, narkotyki i hałas. Ubytek słuchu jest często trudny do leczenia, ponieważ bardzo trudno jest przywrócić upośledzoną funkcję po uszkodzeniu komórek rzęsatych odpowiedzialnych za słuch¹. Według Światowej Organizacji Zdrowia szacuje się, że 461 milionów ludzi na całym świecie ma ubytek słuchu, co stanowi 6,1% światowej populacji. Spośród osób z ubytkiem słuchu 93% to dorośli, a 7% to dzieci.

Próbowano wielu podejść do leczenia ubytku słuchu; w szczególności, podejście regeneracyjne z wykorzystaniem MSC okazało się obiecującym sposobem leczenia. Gdy tkanka jest uszkodzona, MSCs są naturalnie uwalniane do układu krążenia i migrują do miejsca urazu, gdzie wydzielają różne cząsteczki, tworząc mikrośrodowisko, które sprzyja regeneracji². Dlatego ważne jest, aby opracować metodę leczenia uszkodzonych tkanek poprzez migrację zewnętrznie zagnieżdżonych MSCs do narządów docelowych, a następnie ich wydzielanie cząsteczek, które powodują silną regulację immunologiczną, angiogenezę i antyapoptozę w celu przywrócenia funkcji uszkodzonych komórek^3,4,5.

Proces naprowadzania, w którym MSCs migrują do uszkodzonych tkanek, może być najważniejszą przeszkodą do pokonania. MSC mają systemowy mechanizm naprowadzania z sekwencyjnymi krokami tetheringu/rollingu, aktywacji, aresztowania, transmigracji/diapedezy i migracji^6,7,8. Obecnie trwają prace nad określeniem sposobów usprawnienia tych kroków. Przetestowano różne strategie, w tym modyfikację genetyczną, inżynierię powierzchni komórki, gruntowanie in vitro i naprowadzanie magnetyczne^6,7. Ponadto podjęto kilka prób promowania ochrony i regeneracji słuchowych komórek rzęsatych poprzez naprowadzanie MSCs na miejsce uszkodzonego ślimaka. Jednak śledzenie MSCs in vivo jest czasochłonne i pracochłonne oraz wymaga wysoce specjalistycznych umiejętności⁹.

Aby rozwiązać ten problem, opracowano metodę obserwacji naprowadzania MSCs w ślimaku za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej, która fotografuje migrację komórek w ciągu kilku godzin (Rysunek 1). Został opracowany na początku XX wieku i ostatnio stał się potężnym narzędziem do badania migracji określonych komórek.

Rysunek 1: Streszczenie graficzne. (A) Po przyklejeniu wypreparowanego organu Cortiego na plastikowym szkiełku nakrywkowym za pomocą kleszczy, szkiełko nakrywkowe umieszcza się na konfokalnym mikroskopijnym naczyniu o średnicy 35 mm ze szklanym dnem, a następnie umieszcza się szklany cylinder. (C) Po napełnieniu wnętrza szklanego cylindra pożywką, (D) MSC z oznaczeniem GFP są ostrożnie dodawane na zewnątrz butli. (E) Po całonocnej inkubacji, (F) szklany cylinder jest usuwany, a obrazy są wykonywane za pomocą mikroskopu konfokalnego. Skróty: GFP = zielone białko fluorescencyjne; MSCs = mezenchymalne komórki macierzyste.

Protokół

Wszystkie protokoły badań z udziałem myszy ICR zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Yonsei w Wonju College of Medicine. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z Kodeksem Etycznym Światowego Stowarzyszenia Lekarzy. W tym protokole ciężarne myszy ICR były trzymane w 12/12-godzinnym cyklu światło/ciemność ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody.

1. Rozwarstwienie ślimaka

1. Wysterylizuj kaptur do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, włączając światło ultrafioletowe na ~30 minut, a przed użyciem spryskaj wszystkie powierzchnie 70% etanolem. Pozostaw powierzchnie do wyschnięcia.
2. Umieść narzędzia do preparowania w 70% etanolu na 10 minut i wysusz przed użyciem.
3. Użyj ostrza operacyjnego, aby odciąć głowę 3-4-dniowym myszom w wieku poporodowym (Ryc. 2A).
4. Umieść czaszkę pod mikroskopem stereoskopowym w kapturze z przepływem laminarnym i namocz tkankę w 70% etanolu.
5. Szybko namocz tkankę w roztworze do rozwarstwiania tkanek (1x Zbilansowany roztwór soli Hanka, 1 mM HEPES), aby usunąć etanol.
6. Przetnij linię środkową czaszki za pomocą ostrza chirurgicznego (Rysunek 2B,C).
7. Odsłoń czaszkę, ciągnąc skórę do przodu i przecinając zewnętrzny kanał słuchowy ucha (Rysunek 2D).
8. Przeciąć od przedniej do tylnej części czaszki w poprzek linii oczu (Ryc. 2E).
9. Otwórz czaszkę i usuń przodomózgowie, móżdżek i pień mózgu za pomocą kleszczy (Rysunek 2F,G).
10. Za pomocą mikrokleszczyków oddziel ślimak od kości skroniowej (Ryc. 2H).
11. Przenieść ślimak na szalkę Petriego zawierającą roztwór do wypreparowania tkanek.
12. Ostrożnie przeciąć całą torebkę ślimakową, pozostawiając tylko wewnętrzną tkankę miękką ślimaka (Rysunek 2I,J).
13. Przytrzymaj modiolus ślimaka kleszczami, a przewód ślimakowy kolejną parą kleszczyków i powoli oddziel dwie tkanki (Rysunek 2K).
14. Usuń prążki, naczynia krwionośne i błonę tektorialną, delikatnie je odrywając (Rysunek 2L, M).
15. Umieść wysterylizowane plastikowe szkiełko nakrywkowe w nowym roztworze do rozwarstwiania tkanek, a następnie umieść narząd Cortiego na szkiełku nakrywkowym o średnicy 9 mm, upewniając się, że błona podstawna jest skierowana w dół (Ryc. 2N-P).
16. Unieruchomić tkankę, dociskając błonę Reissnera i pozostałą tkankę modiolus do szkiełka nakrywkowego za pomocą kleszczy (Rysunek 2N-P).
17. Przenieść szkiełko nakrywkowe z osadzoną tkanką do środka naczynia konfokalnego o średnicy 35 mm.
18. Umieść szklany cylinder do klonowania na szalce, z eksplantatem ślimakowym umieszczonym na środku naczynia i dodaj 100 μl pożywki hodowlanej z eksplantatów (DMEM/F12, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% suplementu N2, ampicyliny (10 μg/ml))¹⁰ wewnątrz cylindra (Rysunek 2Q).
19. Płytka 5 × 10³ komórki MSC znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) pochodzące ze szpiku kostnego myszy w 2 ml pożywki hodowlanej (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% suplementu N2, 10 μg/ml ampicyliny) na zewnątrz szklanego cylindra (Rysunek 2R).
    1. Gdy MSCs są w 80-90% zlewane, należy je przepuścić, odłączając je kwasem trypsyna-etylenodiaminotetraoctowym.
20. Ostrożnie przenieść naczynie konfokalne do nawilżonego inkubatora i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2
.
21. Zassać całe medium wewnątrz i na zewnątrz cylindra, a następnie wyjąć szklany cylinder z naczynia konfokalnego.
22. Dodać 2 ml świeżej pożywki hodowlanej do naczynia konfokalnego i inkubować naczynie do hodowli tkankowych w wilgotnym inkubatorze, aż będzie gotowe do analizy.

Rysunek 2. Sekcja ślimaka myszy i kokultura narządu Cortiego i MSC. (A) Dekapitacja myszy, (B) i (C) strzałkowe rozwarstwienie głowy w linii środkowej, (D) i (E) wycięcie czołowe mózgu, (F) i (G) usunięcie mózgu i kości skroniowej, (H) ślimak, (I) usunięcie kostnej ściany ślimaka, (J) izolacja ślimaka, (K) oddzielenie przewodu ślimakowego od modiolus, (L) oddzielenie prążkowia naczyniowego (SV) i więzadła spiralnego (SL) od narządu Cortiego, (M) usunięcie błony tektorialnej, (N-P) utrwalenie ślimaka na plastikowym szkiełku nakrywkowym, (Q) umiejscowienie szkiełka nakrywkowego i szklanego cylindra w naczyniu konfokalnym, (R) inokulacja MSC. Biała skala (A- E) = 1 cm; pomarańczowa (F, G, P) i żółta podziałka liniowa (H,I) = 1 mm; zielony pasek skali (J-O) = 0,5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Obrazowanie poklatkowe

1. Do przedstawionych tutaj eksperymentów należy użyć systemu mikroskopii konfokalnej z systemem inkubatora stage top.
2. Włącz mikroskop konfokalny, światło fluorescencyjne i komputer.
3. Ustawić warunki inkubatora stage-top umieszczonego na stoliku mikroskopu konfokalnego na 37 °C i 5% atmosfery_CO2
.
4. Umieść naczynie na próbkę w naczyniu mocującym naczynie, przykryj pokrywką mocującą naczynie i zamknij komorę górną pokrywą grzałki.
5. Dostosuj powiększenie i ostrość, aby zlokalizować narząd Cortiego i MSC w polu widzenia.
6. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazu. W opcji lokalizacji wybierz obiektyw planapochromatyczny o powiększeniu 20x (przysłona numeryczna 0,8) i obszar kadrowania 0,5x.
7. W sekcji Pozyskiwanie kliknij inteligentną konfigurację i wybierz EGFP.
8. Otwórz zakładkę kanału w obszarze Akwizycja i ustaw moc lasera na 0.2%, otwór na 44 μm, wzmocnienie główne na 750 V, a wzmocnienie cyfrowe na 1.0.
9. Kliknij ESID w ustawieniach obrazowania i ustaw wzmocnienie ESID na 4, a wzmocnienie cyfrowe na 7.5.
10. Kliknij na Kafelki i stakuj, aby wyprodukować 210 płytek.
11. Otwórz strategię ostrości i wybierz tryb ostrości.
12. W obszarze szeregi czasowe ustaw czas trwania na 24 godziny, a interwał na 10 minut.
13. W obszarze Akwizycja ustaw rozmiar klatki na 512 x 512 pikseli, szybkość skanowania na 8, kierunek na dwukierunkowy, uśrednianie na 4x, a liczbę bitów na piksel na 16.
14. Kliknij Rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć eksperyment.

3. Modyfikacja pliku graficznego

1. W sekcji przetwarzania kliknij ścieg i ustaw minimalną nakładkę na 5%, a maksymalne przesunięcie na 10%.
2. Kliknij eksport filmu, ustaw nieskompresowany i ustaw prędkość na 7,5.

4. Barwienie immunologiczne

1. Ostrożnie zassać pożywkę i przepłukać próbkę dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) przez 5 minut.
2. Utrwalić próbkę 4% formaliną w PBS przez 15 minut i przemyć próbkę 3 razy PBS przez 5 minut.
3. Próbkę należy przepuszczać w 0,1% Triton X-100 w PBS przez 10 minut i myć 3 razy PBS przez 5 minut.
4. Dodać 250 μl odczynnika phalloidyna-iFluor 647 (rozcieńczenie 1:1000 w PBS) i inkubować próbkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
5. Przemyć próbkę 3 razy PBS przez 5 minut.
6. Przenieś szkiełko nakrywkowe na szkiełko podstawowe i dodaj 2 krople roztworu montażowego.
7. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku.
8. Uszczelnić szkiełko nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności, aż do zaobserwowania komórek.
9. Zobrazuj szkiełko za pomocą mikroskopu konfokalnego z odpowiednim filtrem przy wzbudzeniu/emisji (Ex/Em)=650/665 nm dla falloidyny i przy Ex/Em=488/507 nm dla EGFP.

Wyniki

Migracja in vitro MSCs w trybie trójwymiarowym została oceniona za pomocą systemu Transwell lub tradycyjnej metody gojenia ran w celu obserwacji migracji w trybie dwuwymiarowym (2D)¹¹. Narząd Cortiego jest złożoną strukturą złożoną z różnych komórek, takich jak komórki Boettchera, komórki Klaudiusza, komórki Deitera, komórki filarowe, komórki Hensena, zewnętrzne komórki rzęsaste, wewnętrzne komórki rzęsate, włókna nerwowe, błona podstawna i blaszka siatkowata

Dyskusja

Przeszczepianie MSCs do uszkodzonych miejsc w celu wspomagania regeneracji uszkodzonych komórek było szeroko badane, a efekt terapeutyczny jest oczywisty. Doniesiono, że przeszczepienie i późniejsze różnicowanie MSCs przywraca słuch u szczurów z ubytkiem słuchu wywołanym przez kwas 3-nitropropionowy¹³. Chociaż Lee i wsp. zastosowali MSC u ludzi przezżylnie, nie osiągnęli żadnej znaczącej poprawy słuchu¹⁴. Do niedawna przeprowadzono blisko 12 eksperymentów mających na celu p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10X PBS Bufor	GenDEPOT	P2100-104
4% Formalina	T& I	BPP-9004
Ampicylina	sigma	A5354-10ml
BSA	sigma	A4503-100G
czasza konfokalna	SPL	200350
konfokalny	ZEISS	LSM800
szkiełko nakrywkowe	SPL	20009
DMEM/F12	Gibco	10565-018
Surowica bydlęca	płodu Thermo Fisher 16140071
naukowy Fluorsheild z DAPI	sigma	F6057
Kleszcz	Dumont	0508-L5-P0
HBSS	Thermo Fisher naukowy	14065056
HEPES	Thermo Fisher naukowy	suplement 15630080
N2	Gibco	17502-048
abcam	ab176759
Inkubator Stage Top	TOKAI Mysie	WELSX
Strain C57BL/6 z	cyagenem	MUBMX-01101
Triton X-100	sigma	Zobacz materiał T8787