Method Article

Pobieranie próbek i przetwarzanie szczotkowania nosa za pomocą cyfrowej wideomikroskopii rzęskowej o dużej prędkości – adaptacja do pandemii COVID-19

DOI:

10.3791/61949

⸱

November 7th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center, University of Liège, 2Department of ENT, University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit, University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics, University of British Columbia and British Columbia Children's Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology, University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zagwarantować skuteczną i wysokiej jakości analizę funkcjonalną rzęsek w celu diagnozy PCD, niezbędna jest precyzyjna i staranna metoda pobierania i przetwarzania nabłonka oddechowego. Aby kontynuować świadczenie usług diagnostycznych w kierunku PCD podczas pandemii COVID-19, protokół wideomikroskopii rzęskowej został zaktualizowany w celu uwzględnienia odpowiednich środków kontroli zakażeń.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotna dyskineza rzęsek (PCD) to genetyczna ruchliwa ciliopatia, prowadząca do znacznej choroby otozynopłucnej. Diagnoza PCD jest często pomijana lub opóźniona z powodu wyzwań związanych z różnymi metodami diagnostycznymi. Wideomikroskopia rzęskowa, wykorzystująca cyfrową wideomikroskopię o dużej prędkości (DHSV), jedno z narzędzi diagnostycznych PCD, jest uważana za optymalną metodę przeprowadzania analizy czynnościowej rzęsek (CFA), obejmującej analizę częstotliwości uderzeń rzęsek (CBF) i wzorca dudnienia (CBP). Jednak DHSV nie ma ustandaryzowanej, opublikowanej procedury operacyjnej do przetwarzania i analizy próbek. Wykorzystuje również żywy nabłonek dróg oddechowych, co stanowi istotny problem w kontroli zakażeń podczas pandemii COVID-19. Aby kontynuować świadczenie usług diagnostycznych w czasie kryzysu zdrowotnego, protokół wideomikroskopii rzęskowej został dostosowany w celu uwzględnienia odpowiednich środków kontroli zakażeń.

Tutaj opisujemy poprawiony protokół pobierania próbek i laboratoryjnego przetwarzania próbek z układu oddechowego rzęsek, podkreślając adaptacje wprowadzone w celu dostosowania się do środków kontroli zakażeń COVID-19. Opisano reprezentatywne wyniki CFA z próbek szczotkowania nosa uzyskanych od 16 zdrowych osób, przetworzonych i przeanalizowanych zgodnie z tym protokołem. Ilustrujemy również znaczenie pozyskiwania i przetwarzania optymalnej jakości nabłonkowych pasków rzęskowych, ponieważ próbki niespełniające kryteriów selekcji jakościowej pozwalają obecnie na CFA, potencjalnie zmniejszając wiarygodność diagnostyczną i skuteczność tej techniki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotna dyskineza rzęsek (PCD) to dziedziczna niejednorodna ciliopatia ruchliwa, w której rzęski oddechowe są nieruchome, powolne lub dyskinetyczne, co prowadzi do upośledzenia klirensu śluzowo-rzęskowego i przewlekłej choroby oto-sino-płucnej1,2,3,4. Objawami klinicznymi PCD są przewlekły mokry kaszel i przewlekłe przekrwienie błony śluzowej nosa rozpoczynające się we wczesnym dzieciństwie, nawracające lub przewlekłe infekcje górnych i dolnych dróg oddechowych prowadzące do rozstrzeni oskrzeli oraz nawracające lub przewlekłe zapalenie uch....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzyskano zgodę od komisji etyki szpitala w Liège oraz Uniwersyteckiego Wydziału Higieny i Ochrony Zdrowia w Pracy.

1. Pobieranie próbek nabłonka rzęskowego układu oddechowego

  1. Przed pobraniem próbki upewnij się, że pacjenci są wolni od infekcji przez co najmniej 4-6 tygodni oraz wolni od leków donosowych i wziewnych.
  2. Przygotuj uzupełniony preparat M199: Suplement Pożywki do hodowli komórkowych 199 (M199) (500 ml) z roztworem antybiotyku (5 ml streptomycyny/penicyliny (50 μg/ml)) i roztworem przeciwgrzybiczym (5 ml amfoterycyny B (2,5 μg/ml)).
  3. Przygotować 2 stożkowe probówki o pojemności 15 ml (po jednej na każ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zilustrować skuteczność techniki, prezentujemy wyniki CFA w serii 16 zdrowych dorosłych ochotników (5 mężczyzn, przedział wiekowy 22-54 lata).

Próbki do szczotkowania nosa od 14 (4 mężczyzn, przedział wiekowy 24-54 lata) z ogólnej liczby 16 ochotników dostarczyły wystarczająco odpowiednich krawędzi nabłonka, które spełniały kryteria wyboru potrzebne do wykonania CFA. Z tych 14 próbek szczotkowania nosa zarejestrowano łącznie 242 orzęsione brzegi, a 212 krawędzi spełniało określone kryteria.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie standardowej procedury operacyjnej CFA przy użyciu próbek z nosa, z dostosowaniami dokonanymi w celu uwzględnienia odpowiednich względów kontroli zakażeń podczas pandemii COVID-19. Diagnostyka PCD jest trudna i obecnie wymaga panelu różnych testów diagnostycznych, zgodnie z międzynarodowymi zaleceniami, w tym pomiaru tlenku azotu w nosie, CFA przy użyciu DHSV, ultrastrukturalnej analizy rzęsek za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), znakowania białek rzęskowych .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy ci nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier i wszystkim członkom zespołu centrum diagnostycznego PCD Paris-Est za ich dyspozycyjność i serdeczne powitanie podczas wizyty w ich centrum diagnostycznym PCD oraz za liczne wymiany informacji. Dziękujemy również Robertowi Hirstowi i wszystkim członkom zespołu w centrum PCD w Leicester za ich powitanie, czas, rady i wiedzę.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki stożkowe 15 mlFisherScientific35209615 ml Polipropylenowa rurka stożkowa o wysokiej przejrzystości z pokrywką
Amfoterycyna BLONZA17-836ERoztwór przeciwgrzybiczy
Kleszczyki do nosa Blakesleya-weilaNOVO SURGICALE7739-12Służy do trzymania szczoteczki do szczotkowania nosa
Szczoteczka do cytologii oskrzeliCONMED129Służy do nosa szczotkowanie
Wacik bawełnianyNUOVA APTACA2150/SGUżywany do testów COVID-19
Cyfrowa szybka kamera wideomikroskopowaIDTeu Innowacja w ruchuCrashCam Mini 1510
Szkiełkoszklane ThermoScientific12372098Szkiełka mikroskopowe używane do tworzenia komory wizualizacji
Podgrzewane pudełko KomórkiIBIDI w ostrości10918Służy do podgrzewania próbka
Mikroskop światła odwróconegoZeissAXIO Vert.A1
Grzałka obiektywuTOKAI HITTPiE-LHSłuży do podgrzewania oleju immersyjnego
soczewki Medium 199 (M199), HEPESTermoFisher Scientific12340030Cell Culture Medium
Motion Studio X64IDT Motionwersja 2.14.01Oprogramowanie
OilFischerScientific, Carl Zeiss
Szkiełko nakrywkowe prostokątneVWR631-0145Służy do zakrycia studzienki wizualizacji
Podkładka dystansowa (Ispacer) 0,25 mmSunjinlabIS203Służy do tworzenia hermetycznej zamkniętej komory wizualizacyjnej
Szkiełko nakrywkowekwadratowe VWR631-0122Służy do tworzenia zbudowanej w laboratorium otwartej komory wizualizacyjnej
Streptomycyna/PenicylinaFisherScientific, Gibco11548876Roztwór antybiotyków
11825153

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ciliary VideomicroscopyDigital High Speed VideomicroscopyNasal Brushing SamplingCiliary Functional AnalysisCiliary Beat FrequencyCiliary Beat PatternPrimary Ciliary DyskinesiaInfection Control MeasuresEpithelial Ciliated StripsVideo Analysis Software

Related Articles