Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pobieranie próbek i przetwarzanie szczotkowania nosa za pomocą cyfrowej wideomikroskopii rzęskowej o dużej prędkości – adaptacja do pandemii COVID-19

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61949

⸱

7 listopada 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center, University of Liège, 2Department of ENT, University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit, University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics, University of British Columbia and British Columbia Children's Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology, University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège

W tym artykule

Podsumowanie

Aby zagwarantować skuteczną i wysokiej jakości analizę funkcjonalną rzęsek w celu diagnozy PCD, niezbędna jest precyzyjna i staranna metoda pobierania i przetwarzania nabłonka oddechowego. Aby kontynuować świadczenie usług diagnostycznych w kierunku PCD podczas pandemii COVID-19, protokół wideomikroskopii rzęskowej został zaktualizowany w celu uwzględnienia odpowiednich środków kontroli zakażeń.

Streszczenie

Pierwotna dyskineza rzęsek (PCD) to genetyczna ruchliwa ciliopatia, prowadząca do znacznej choroby otozynopłucnej. Diagnoza PCD jest często pomijana lub opóźniona z powodu wyzwań związanych z różnymi metodami diagnostycznymi. Wideomikroskopia rzęskowa, wykorzystująca cyfrową wideomikroskopię o dużej prędkości (DHSV), jedno z narzędzi diagnostycznych PCD, jest uważana za optymalną metodę przeprowadzania analizy czynnościowej rzęsek (CFA), obejmującej analizę częstotliwości uderzeń rzęsek (CBF) i wzorca dudnienia (CBP). Jednak DHSV nie ma ustandaryzowanej, opublikowanej procedury operacyjnej do przetwarzania i analizy próbek. Wykorzystuje również żywy nabłonek dróg oddechowych, co stanowi istotny problem w kontroli zakażeń podczas pandemii COVID-19. Aby kontynuować świadczenie usług diagnostycznych w czasie kryzysu zdrowotnego, protokół wideomikroskopii rzęskowej został dostosowany w celu uwzględnienia odpowiednich środków kontroli zakażeń.

Tutaj opisujemy poprawiony protokół pobierania próbek i laboratoryjnego przetwarzania próbek z układu oddechowego rzęsek, podkreślając adaptacje wprowadzone w celu dostosowania się do środków kontroli zakażeń COVID-19. Opisano reprezentatywne wyniki CFA z próbek szczotkowania nosa uzyskanych od 16 zdrowych osób, przetworzonych i przeanalizowanych zgodnie z tym protokołem. Ilustrujemy również znaczenie pozyskiwania i przetwarzania optymalnej jakości nabłonkowych pasków rzęskowych, ponieważ próbki niespełniające kryteriów selekcji jakościowej pozwalają obecnie na CFA, potencjalnie zmniejszając wiarygodność diagnostyczną i skuteczność tej techniki.

Wprowadzenie

Pierwotna dyskineza rzęsek (PCD) to dziedziczna niejednorodna ciliopatia ruchliwa, w której rzęski oddechowe są nieruchome, powolne lub dyskinetyczne, co prowadzi do upośledzenia klirensu śluzowo-rzęskowego i przewlekłej choroby oto-sino-płucnej1,2,3,4. Objawami klinicznymi PCD są przewlekły mokry kaszel i przewlekłe przekrwienie błony śluzowej nosa rozpoczynające się we wczesnym dzieciństwie, nawracające lub przewlekłe infekcje górnych i dolnych dróg oddechowych prowadzące do rozstrzeni oskrzeli oraz nawracające lub przewlekłe zapalenie ucha środkowego i zapalenie zatok5,6,7. Około połowa pacjentów z PCD ma wady lateralizacji narządów, takie jak situs inversus lub situs ambiguus. U niektórych pacjentów występują również problemy z niepłodnością spowodowaną nieruchomymi plemnikami u mężczyzn i nieruchomymi rzęskami w jajowodach u kobiet1,2,8. PCD występuje rzadko, ale częstość występowania jest trudna do zdefiniowania i waha się od 1:10 000 do 1:20 0009,10. Uważa się jednak, że rzeczywista częstość występowania PCD jest wyższa ze względu na trudności w diagnozie i brak podejrzenia klinicznego. Objawy PCD naśladują typowe objawy oddechowe innych ostrych lub przewlekłych chorób układu oddechowego, a wyzwania diagnostyczne związane z potwierdzeniem diagnozy są dobrze znane, co prowadzi do nieodpowiedniego leczenia i obserwacji2,5,9,11.

Wideomikroskopia rzęskowa, wykorzystująca cyfrową wideomikroskopię o dużej szybkości (DHSV), jest jednym z narzędzi diagnostycznych dla PCD4,8,12,13. DHSV jest uważana za optymalną metodę przeprowadzania rzęskowej analizy funkcjonalnej (CFA), obejmującej analizę częstotliwości uderzeń rzęsek (CBF) i wzorca dudnień (CBP)2,14,15,16. DHSV wykorzystuje żywy nabłonek dróg oddechowych, zwykle uzyskiwany z mycia nosa13.

W związku z obecną epidemią COVID-19, potwierdzenie diagnozy PCD jest teraz jeszcze ważniejsze, ponieważ dowody sugerują, że podstawowa choroba układu oddechowego może prowadzić do gorszych wyników po zakażeniu COVID-1917,18. Bezpieczna i skuteczna usługa diagnostyki PCD podczas obecnej pandemii pozwoli również pacjentom z potwierdzonym PCD na skorzystanie z dodatkowych środków ochronnych w porównaniu z populacją ogólną19.

Transmisja COVID-19 odbywa się głównie drogą kropelkową20. Wysoki potencjał transmisji od pacjentów bezobjawowych (lub z minimalnymi objawami) sugeruje wysokie miano wirusa w nosie sample20. Dodatkowo, jeśli cząsteczki wirusa zostaną rozpylone, pozostają w powietrzu przez co najmniej 3 godziny21. W związku z tym pracownicy służby zdrowia zajmujący się chorobami układu oddechowego są narażeni na wysoki rezerwuar wiremii podczas wykonywania opieki klinicznej i pobierania próbek do technik diagnostycznych22. Ponadto manipulacja żywymi próbkami oddechowymi naraża technika na zakażenie COVID-19. Chociaż wdrażane są zalecenia dotyczące najlepszych praktyk dla lekarzy chorób układu oddechowego i laryngologów opiekujących się pacjentami z COVID-1923, brakuje zaleceń dotyczących wykonywania DHSV podczas pandemii COVID-19.

Aby kontynuować świadczenie usług diagnostycznych PCD, zapewniając jednocześnie bezpieczeństwo pracownikowi służby zdrowia (wykonującemu pobieranie próbek) i technikowi (wykonującemu przetwarzanie próbek), protokół wideomikroskopii rzęskowej musiał zostać dostosowany podczas pandemii COVID-19. Technika wideomikroskopii rzęskowej jest obecnie ograniczona do usług badawczych i specjalistycznych ośrodków diagnostycznych, ponieważ CFA wymaga rozległego szkolenia i doświadczenia. Ponadto obecnie brakuje standaryzacji i precyzyjnej procedury operacyjnej do przetwarzania i analizy próbek za pomocą DHSV4,13.

Celem tego artykułu jest opisanie standardowych procedur operacyjnych dla DHSV, ze szczególnym odniesieniem do środków kontroli zakażeń i bezpieczeństwa podczas pobierania i przetwarzania żywego nabłonka nosa. Pozwoli to na kontynuowanie wysokiej jakości diagnostyki i opieki nad PCD pomimo obecnej epidemii COVID-19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zgoda została uzyskana od komisji etyki szpitala wydziałowego w Liege oraz z Uniwersyteckiego Zakładu Higieny i Ochrony Zdrowia w Pracy.

1. Pobieranie próbek rzęskowego nabłonka dróg oddechowych

  1. Przed pobraniem próbek upewnij się, że pacjenci nie przechodzili infekcji przez co najmniej 4-6 tygodni oraz nie stosowali leków donosowych i wziewnych.
  2. Przygotuj suplementowane medium M199: uzupełnij pożywkę do hodowli komórek 199 (M199) (500 mL) roztworem antybiotyków (5 mL streptomycyny/penicyliny (50 μg/mL)) oraz roztworem przeciwgrzybiczym (5 mL amfoterycyny B (2,5 μg/mL)).
  3. Przygotuj 2 (po jednej dla każdej nozdrza) probówki stożkowe o pojemności 15 mL z nakrętkami i napełnij każdą z nich 3 mL suplementowanego medium M199.
  4. Przygotuj szczoteczkę do cytologii oskrzelowej (grubość: 2 mm, długość: 11 mm). Dotnij koniec drutu tak, aby szczoteczka miała około 15 cm długości (Rycina 1A,B). Do trzymania szczoteczki podczas wykonywania wymazu z nosa należy użyć kleszczy nosowych Weil-Blakesleya (Rycina 1B).
  5. Adaptacja do COVID-19: Unikaj przetwarzania próbki żywego nabłonka nosowego o nieznanym statusie w kierunku COVID-19; przeprowadź test w kierunku COVID-19 u pacjenta na 48 do 72 godzin przed wykonaniem wymazu z nosa do wideomikroskopii rzęsek. Test ten polega na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z próbki wymazu z nosogardzieli24,25. Ponieważ status pacjenta w zakresie COVID-19 jest w tym momencie nieznany, lekarz i personel muszą być odpowiednio chronieni23,26, w tym za pomocą maski FFP2, rękawiczek, osłony twarzy lub gogli oraz wodoodpornego fartucha z długimi rękawami. W przypadku niedostępności, niemożliwości lub wątpliwości co do wyniku testu PCR, całe przetwarzanie wymazów z nosa należy przeprowadzić w laboratorium biologicznego poziomu bezpieczeństwa L2. W przypadku pozytywnego statusu COVID-19 należy odroczyć diagnostykę PCD i rozważyć alternatywne metody opieki nad pacjentem.
    UWAGA: Pobieranie wymazu z nosogardzieli do testu na COVID-19 może wywołać wtórną dyskinezję rzęsek poprzez uszkodzenie rzęsek nabłonka oddechowego nosa27,28. Aby tego uniknąć, należy wprowadzić cienki bawełniany tampon do jamy nosowej aż do nosogardzieli pod kontrolą sztywnego endoskopu, unikając uszkodzenia małżowin nosowych lub przegrody. Następnie pobiera się próbkę z nosogardzieli i usuwa tampon pod kontrolą sztywnego endoskopu. Przy zastosowaniu odpowiedniego sprzętu, sztywna endoskopia 0° jest łatwo wykonywana u dorosłych i dzieci bez powodowania urazów.

2. Pozyskiwanie próbek rzęskowego nabłonka dróg oddechowych

Adaptacja do COVID-19: Nawet jeśli wynik testu na COVID-19 u pacjenta jest ujemny, ze względu na odsetek wyników fałszywie ujemnych, pacjent jest proszony o noszenie maski chirurgicznej na ustach podczas procedury, a lekarz zakłada rękawiczki, maskę FFP2 oraz przyłbicę.

  1. Przygotowanie do pobierania wymazu z nosa
    1. Poproś pacjenta o wydmuchanie nosa.
    2. Wykonaj pobieranie wymazu z nosa pod kontrolą endoskopii nosowej lub metodą „na ślepo”. W przypadku stosowania endoskopii nosowej zbadaj obie nozdrza przed pobraniem wymazu (nie powtarzaj tej czynności, jeśli została wykonana 48–72 godziny wcześniej podczas wymazu z nosa w kierunku COVID-19). Badanie umożliwia weryfikację stanu błony śluzowej (silny stan zapalny może spowodować krwawienie podczas pobierania wymazu...), stanu małżowiny dolnej (np. w celu wykluczenia obecności telangiektazji) oraz sprawdzenie, czy przegroda nosowa jest prosta (Rysunek 1C).
    3. Poproś pacjenta o położenie się lub wygodne usiądnięcie z głową opartą o oparcie krzesła (ponieważ pobieranie wymazu z nosa wywołuje odruch odchylania głowy do tyłu). Drugi opiekun powinien podtrzymywać głowę podczas pobierania wymazu, zwłaszcza u dzieci.
    4. Przed pobraniem wymazu wstrząśnij szczoteczką w uzupełnionym medium M199 (nawilżenie szczoteczki zmniejsza podrażnienie podczas zabiegu).
      UWAGA: Szczoteczkę można nawilżyć w uzupełnionym medium M199; jeśli pacjent jest uczulony na antybiotyki (w uzupełnionym medium do hodowli komórkowej znajdują się penicylina i streptomycyna), nawilż szczoteczkę w soli fizjologicznej.
  2. Pobieranie wymazu z nosa
    1. Ostrożnie wprowadź szczoteczkę do nosa bez stosowania znieczulenia miejscowego lub ogólnego13. W przypadku stosowania endoskopii nosowej umieść endoskop u wejścia do nosa, aby zwizualizować dolną małżowinę nosową, a następnie wprowadź szczoteczkę cytologiczną do nosa. W przypadku pobierania wymazu „na ślepo”, wprowadź szczoteczkę do nosa, prowadząc ją wzdłuż dna nosa (Rysunek 1D).
      UWAGA: Niektóre ośrodki diagnostyczne stosują znieczulenie miejscowe za pomocą tamponu z nafazoliną w celu wykonania wymazu z nosa.
    2. Przesuwaj szczoteczkę kilka razy w przód i w tył nad tylną częścią dolnej małżowiny nosowej, a następnie wyjmij ją. Operator powinien wyczuć, że szczoteczka ociera nabłonek, a pacjent może odczuwać jednostronne łzawienie oka po stronie pobierania wymazu.
      UWAGA: Jeśli wymaz z nosa zostanie pobrany zbyt przednio, nie pozyskano będzie komórek rzęsatych, ponieważ przednia jama nosowa wyścielona jest przejściowym nabłonkiem nierzęsatym.
    3. Po pobraniu próbki natychmiast umieść materiał z wymazu w medium hodowlanym. Pozyskane pasma nabłonka oddechowego zostają oddzielone poprzez wstrząsanie szczoteczką w probówce zawierającej uzupełnione medium M199, a następnie zamknij probówkę (Rysunek 1E).
    4. Adaptacja do COVID-19: Nie oddzielaj pasm nabłonkowych poprzez wstrząsanie szczoteczką w uzupełnionym medium M199 bezpośrednio po pobraniu próbki. Umieść szczoteczkę w probówce, przetnij drut, aby szczoteczka w całości zmieściła się wewnątrz, i natychmiast zamknij probówkę. Umieść próbkę w szczelnej podwójnej torebce.

Cewnik i narzędzia chirurgiczne do umieszczania stentów; widok endoskopowy procesu stentowania; zastosowanie sprzętu laboratoryjnego.
Rysunek 1: Technika szczotkowania nosa.(A) Cała szczoteczka do cytologii oskrzeli (B) Przygotowanie do szczotkowania: końcówka drutu z włosiem zostaje odcięta (długość około 15 cm) i przytrzymana kleszczykami nosowymi Weil-Blakesley(C) Widok endoskopowy jamy nosowej: przegroda nosowa (1), małżowina dolna (2) i małżowina środkowa (3) (D) Szczotkowanie nosa wykonuje się w tylnej części małżowiny dolnej (2). Przegroda nosowa (1), małżowina środkowa (3). (E) Paski nabłonka oddechowego są uwalniane poprzez potrząsanie szczoteczką w uzupełnionej pożywce do hodowli komórkowej M199. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Przetwarzanie rzęsistego nabłonka dróg oddechowych

  1. Próbki z wymazów z nosa należy analizować pod mikroskopem w ciągu 9 godzin od pobrania, ponieważ zarówno CBF, jak i CBP są stabilne w tym przedziale czasowym (dane nieopublikowane).
  2. Należy użyć prostego lub odwróconego mikroskopu świetlnego z obiektywem imersyjnym x100 w kontraście fazowym lub interferencyjnym. Optymalnie mikroskop powinien być ustawiony na stole antywibracyjnym, ponieważ ruch rzęsek może być obarczony artefaktami wynikającymi z zewnętrznych drgań (np. pochodzących z blatu laboratoryjnego)13.

Adaptacja do COVID-19: Operator używa środków ochrony osobistej podczas przetwarzania wymazów z nosa, w tym maski FFP2, rękawiczek oraz wodoodpornego fartucha z długimi rękawami.

  1. Przygotuj komorę wizualizacyjną.
    1. Umieść paski nabłonka rzęsowanego w wykonanej laboratoryjnie otwartej komorze wizualizacyjnej, umożliwiając swobodne ruchy rzęsek podczas analizy pod mikroskopem. Komorę tę tworzy przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym (22 mm x 40 mm) a szkiełkiem przedmiotowym, oddzielona dwoma sąsiednimi kwadratowymi szkiełkami nakrywkowymi (20 mm x 20 mm), rozmieszczonymi w odległości 15 mm i przyklejonymi do szkiełka przedmiotowego12 (Rycina 2, Rycina 4A).

Adaptacja do COVID-19: Opisana powyżej komora wykonana w laboratorium jest otwarta i umożliwia wymianę gazów oraz wilgotności między próbką a otoczeniem13. W kontekście pandemii COVID-19 możliwe jest zastosowanie zamkniętej komory wizualizacyjnej z wykorzystaniem dwustronnie klejonego dystansera o grubości 0,25 mm (Rysunek 3, Rysunek 4B). Dystanser zostaje przyklejony do szkiełka przedmiotowego, a następnie na wierzchu dystansera przykleja się szkiełko nakrywowe (22 mm x 40 mm).

Proces przygotowania szkiełka mikroskopowego, sekwencja czterech paneli, szkiełka super frost, barwienie histologiczne.
Rycina 2: Montaż otwartej komory wykonanej w laboratorium. (A) Dwa kwadratowe szkiełka nakrywkowe (20 mm x 20 mm) zostają umieszczone na szkiełku przedmiotowym. (B) Kwadratowe szkiełka nakrywkowe są oddzielone od siebie w odległości około 15 mm i przyklejone do szkiełka przedmiotowego. (C) Przestrzeń między dwoma sąsiadującymi kwadratowymi szkiełkami nakrywkowymi zostaje wypełniona niewielką próbką (około 60 μL) nabłonka rzęskowego w suplementowanym medium M199. (D) Długie prostokątne szkiełko nakrywkowe (22 mm x 40 mm) zostaje umieszczone na dwóch sąsiadujących kwadratowych szkiełkach nakrywkowych, przykrywając komorę. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Schemat metody chromatografii z szkiełkami przedmiotowymi i odczynnikiem; wizualizacja działania kapilarnego.
Rysunek 3: Montaż zamkniętej komory przy użyciu dwustronnie klejącego dystansera. (A) Szkiełko przedmiotowe i dwustronnie klejący dystanser. (B) Warstwa ochronna zostaje usunięta z jednej strony dystansera, a następnie dystanser zostaje przyklejony do szkiełka przedmiotowego. (C) Warstwa ochronna zostaje usunięta z drugiej strony dwustronnie klejącego dystansera, a następnie do wnętrza dystansera wprowadza się niewielką próbkę (około 60 μL) nabłonka rzęsowanego w suplementowanym medium M199. (D) Długie prostokątne szkiełko zakryweczne (22 mm x 40 mm) zostaje przyklejone do dystansera, zamykając komorę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ mikroskopowy, preparat na szkiełku; schemat przedstawia obiektywy mikroskopowe i komorę wizualizacyjną.
Rysunek 4: Schemat przedstawiający główne komory wizualizacyjne wykorzystywane do przeprowadzania wideomikroskopii rzęsek przy użyciu cyfrowej wideomikroskopii wysokich prędkości (DHSV). (A) Technika otwartej wiszącej kropli: próbka z rzęskami jest zawieszona w kropli pożywki hodowlanej w otwartej komorze utworzonej przez oddzielenie szkiełka podstawowego od szkiełka nakrywnego za pomocą dwóch sąsiednich szkiełek nakrywnych. (B) Technika zamkniętej wiszącej kropli: próbka z rzęskami jest zawieszona w kropli pożywki hodowlanej w zamkniętej komorze utworzonej przez przekładkę umieszczoną pomiędzy szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywnym. Przekładka przylega ściśle zarówno do szkiełka podstawowego, jak i nakrywnego. Opracowano i zmodyfikowano na podstawie pracy Kempeneers i wsp.13. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Kontrola temperatury
    1. Owinięcie mikroskopu folią bąbelkową (Rycina 5A,B).
    2. Mocowanie grzałki obiektywu wokół obiektywu za pomocą rzepa (Rycina 5C).
    3. Włączenie kontrolera grzałki obiektywu na 1 godzinę przed wykonaniem kontrolnej weryfikacji temperatury.
    4. Włączenie mikroskopu i sprawdzenie poprawności jego ustawienia, ponieważ ilość światła przechodzącego przez próbkę może zmienić temperaturę na szkiełku.
    5. Włączenie kontrolera podgrzewanej komory (Rycina 5D).
    6. Sprawdzenie przed uruchomieniem, czy sonda referencyjna działa prawidłowo. Należy przytrzymać końcówkę sondy referencyjnej między palcami; powinna ona zmierzyć temperaturę ciała.
    7. Nanieś wolne medium na środek szkiełka, pomiędzy dwa sąsiednie kwadratowe szkiełka cover-slip (20 mm x 20 mm) przyklejone do niego.
    8. Umieszczenie końcówki sondy referencyjnej w suplementowanym M199. Przykrycie prostokątnym szkiełkiem cover-slip (22 mm x 40 mm). Należy upewnić się, że sonda jest całkowicie otoczona medium (w przeciwnym razie temperatura mogłaby spaść).
    9. Adaptacja do COVID-19: Aby przeprowadzić kontrolę temperatury w zamkniętej komorze przy użyciu dystanssera, należy wyciąć otwór w jednej z jego ścian (otwór ten musi być tej samej wielkości co sonda referencyjna). Przyklej dystansser do szkiełka przedmiotowego, nanieś wolne medium na środek dystanssera. Wprowadź końcówkę sondy referencyjnej do roztworu przez otwór w dystansserze, a następnie przyklej prostokątne szkiełko cover-slip (22 mm x 40 mm) na dystansserze.
    10. Umieszczenie szkiełka w podstawie podgrzewanej komory. Zamknięcie komory pokrywą.
    11. Nałożenie oleju na obiektyw imersyjny.
    12. Umieszczenie podgrzewanej komory na stoliku mikroskopu.
    13. Regulacja temperatury podstawy i pokrywy (temperatura pokrywy powinna być o 2 °C wyższa niż temperatura podstawy, aby uniknąć kondensacji), tak aby sonda referencyjna w medium wskazywała 37 °C.
    14. Odczekanie 5 minut (czas wymagany do podniesienia temperatury próbki do 37 °C).
    15. Regulacja obiektywu poprzez przesuwanie go w stronę szkiełka, aż końcówka soczewki dotknie szkiełka cover-slip.
    16. Przesunięcie obiektywu w taki sposób, aby w mikroskopie widoczny był środek sondy.
      UWAGA: Należy upewnić się, że sonda jest widoczna na ekranie komputera (aby sprawdzić działanie systemu kamer przed obserwacją próbki rzęsionej). Podczas obserwacji środka sondy ekran jest całkowicie czarny.
    17. Regulacja temperatury grzałki obiektywu (aby zrekompensować utratę ciepła, gdy obiektyw imersyjny styka się ze szkiełkiem cover-slip). Należy upewnić się, że w momencie stykania się obiektywu ze szkiełkiem cover-slip, sonda referencyjna w medium wskazuje 37 °C.
      UWAGA: Idealnie jest pracować w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze, tak aby ustawienia temperatury nie ulegały zmianie. Jeśli temperatura w pomieszczeniu nie jest kontrolowana, należy przeprowadzać tę kontrolę temperatury codziennie przed wykonaniem wideomikroskopii rzęsek.
    18. Po sprawdzeniu temperatury należy wyjąć szkiełko z podgrzewanej komory.
    19. Oczyszczenie szkiełka i końcówki sondy referencyjnej alkoholem i odłożenie ich.
    20. Oczyszczenie soczewki izopropanolem i chusteczkami do czyszczenia soczewek za pomocą ruchów okrężnych.

Układ mikroskopowy, eksperyment obrazowy, zbliżenie na soczewki, analiza optyczna w laboratorium badawczym.
Rycina 5: Sprzęt używany w laboratorium DHSV. (A) Mikroskop wyposażony w obiektyw fazowy 100x z imersją olejową, umieszczony na stole antywibracyjnym, aby zapobiec powstawaniu artefaktów podczas analizy funkcjonalnej rzęsek wywołanych przez wibracje zewnętrzne. (B) Mikroskop jest otoczony folią bąbelkową, aby zapobiec utracie ciepła do powietrza otaczającego. (C) Obiektyw imersyjny powoduje utratę ciepła; można temu zapobiec, stosując grzałkę obiektywu (strzałki). (D) Próbka jest podgrzewana za pomocą komory grzewczej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

4. Przygotowanie próbek rzęsistego nabłonka dróg oddechowych

  1. Delikatnie potrząśnij probówką, aby rzęski rozprzestrzeniły się w całej jej objętości (aby zapobiec przywieraniu rzęsek do innych pasm rzęseczkowych, śluzu lub zanieczyszczeń, co uniemożliwiłoby im swobodne ruchy).
    UWAGA: Ten krok jest niezbędny do uzyskania „optymalnych krawędzi” nabłonka rzęsowanego (Rycina 12).
  2. Pobrać około 50 μL nabłonka rzęskowego w suplementowanym medium M199 z połowy probówki za pomocą pipety.
  3. Umieść próbkę w zbudowanej w laboratorium komorze (pomiędzy dwiema sąsiadującymi kwadratowymi szkiełkami nakrywkowymi (20 mm x 20 mm)) i przykryj prostokątnym szkiełkiem nakrywkowym (22 mm x 40 mm). Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
  4. Adaptacja do COVID-19: Kroki 4.1-4.3 należy przeprowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Procedura w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    1. Włącz dygestorium mikrobiologiczne na 10 minut przed przygotowaniem próbki (aby upewnić się, że środowisko jest sterylne).
    2. Przed przystąpieniem do pracy zdezynfekować całą komorę bezpiecznej pracy mikrobiologicznej 70% etanolem.
    3. Wszystkie niezbędne materiały należy zdezynfekować 70% etanolem przed umieszczeniem ich w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego.
    4. Otwórz 15-mililitrowe probówki stożkowe zawierające próbki tylko raz, pracując w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego, a następnie uwolnij paski nabłonka, poruszając szczoteczką (używając kleszczy nosowych Weil-Blakesley) w uzupełnionym medium M199.
    5. Przyklej przekładkę do szkiełka przedmiotowego i usuń warstwę ochronną z dwustronnej taśmy klejącej przekładki.
    6. Delikatnie potrząśnij probówką, aby rzęski rozprzestrzeniły się w całej jej objętości.
    7. Za pomocą pipety pobrać z połowy probówki niewielką próbkę nabłonka rzęsek w uzupełnionym medium M199 (około 60 μL) i wypełnić przestrzeń dystansową.
    8. Przyklej prostokątną lamellkę (22 mm x 40 mm) do dystansera, aby zamknąć komorę.
    9. Zdezynfekuj preparat przed wyjęciem go z komory bezpieczeństwa mikrobiologicznego.
    10. Wyjmij preparat ze szkiełka z komory bezpiecznej szafy mikrobiologicznej.
    11. Zmień rękawiczki podczas opuszczania komory bezpieczeństwa biologicznego.
    12. Przed wyłączeniem komory bezpieczeństwa biologicznego po zakończeniu pracy należy odczekać 10 minut (aby upewnić się, że środowisko wewnątrz komory jest sterylne przed zamknięciem drzwi).
  5. Umieść preparat w uchwycie podgrzewanego bloku. Zamknij podgrzewany blok pokrywą.
  6. Nanieś olej na obiektyw imersyjny.
  7. Umieść podgrzewaną komorę na stole mikroskopu.
  8. Włącz inkubator oraz podgrzewacz obiektywu.
    UWAGA: Grzałka obiektywu musi zostać włączona na 1 godzinę przed użyciem.
  9. Dostosuj ustawienia temperatury komory grzewczej oraz kontrolerów grzałki obiektywu zgodnie z wartościami uzyskanymi w kroku 3.4.
  10. Odczekać 5 minut (czas wymagany do podniesienia temperatury próbki do 37 °C (przy zastosowaniu z góry określonych ustawień zarówno dla komory grzewczej, jak i grzałki obiektywu).
  11. Zbliż obiektyw do preparatu, aż końcówka soczewki dotknie szkiełka nakrywki.

5. Wizualizacja orzęsłych krawędzi dróg oddechowych

  1. Przymocuj szybkomiejszą kamerę wideo do mikroskopu, podłącz kamerę do komputera i włącz kamerę.
  2. Włącz komputer.
  3. Podłącz cyfrową szybkomiejszą kamerę do wideomikroskopii do komputera za pomocą oprogramowania (tak, aby obraz widziany przez okulary został wyświetlony na monitorze).
    1. Otwórz oprogramowanie, a następnie automatycznie otworzy się Menu główne (Rysunek 6A).
      UWAGA: Oprogramowanie to program używany w laboratorium do akwizycji i przetwarzania obrazów. System umożliwia nagrywanie sekwencji wideo i ich odtwarzanie z ograniczoną częstotliwością klatek lub klatka po klatce. Można go pobrać bezpłatnie.
    2. Otwórz zakładkę Kamera (Rysunek 6A).
    3. Gdy pojawi się okno Filtr wyliczania kamer, wybierz OK (Rysunek 6B).
    4. Wybierz Odśwież listę; zaznacz nazwę kamery; wybierz Interfejs: Expert, a następnie wybierz Otwórz (Rysunek 6C).
    5. Na pasku sterowania kamerą u góry zakotwiczonego menu dialogowego wybierz Live (Rysunek 6D).
    6. Wybierz Play, aby wyświetlić obraz, i Stop, aby zakończyć podgląd (Rysunek 6D).

Interfejs konfiguracji kamery do przechwytywania danych; opcje akwizycji obrazu i odtwarzania na schemacie oprogramowania.
Rysunek 6: Opis użytkowania oprogramowania: wizualizacja drgających krawędzi oddechowych na monitorze.(A) Menu główne pojawia się bezpośrednio po uruchomieniu oprogramowania. (B) Zamknij Filtr wyliczania kamer. (C) Wybierz kamerę i zaznacz Interfejs: Ekspert. (D) Tryb na żywo pozwala na wizualizację na monitorze obrazu widzianego przez mikroskop. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Dostosuj ustawienia akwizycji kamery (w prawym górnym rogu) (Rysunek 7).
    1. W sekcji Acquisition Settings wybierz Camera, a następnie dostosuj częstotliwość klatek: Rate (Hz): 500 (patrz poniżej) (Rysunek 7A).
    2. W sekcji Acquisition Settings wybierz Camera, a następnie dostosuj obszar zainteresowania (ROI) (Rysunek 7A).
      UWAGA: ROI jest obliczane przy użyciu skali graduowanej oglądanej przez obiektyw imersyjny x100 i rzutowanej na monitor, aby zdefiniować liczbę pikseli odpowiadającą 50 µm (ponieważ celem jest rejestracja rzęsek na krawędziach o długości około 50 µm (patrz poniżej)).
    3. W sekcji Acquisition Settings wybierz Record, a następnie dostosuj czas trwania filmu oraz całkowitą liczbę zarejestrowanych klatek (czas trwania 2 sekund odpowiada 1000 klatkom, jeśli wybrana częstotliwość klatek wynosi 5OO Hz) (Rysunek 7B).
      UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że minimalna długość filmu wynosząca 2 sekundy jest niezbędna do przeprowadzenia pełnej analizy zarówno CBF, jak i CBP.
    4. Wybierz File, a następnie Save Camera Cfg, aby zapisać nowe ustawienia akwizycji (wprowadź nazwę, a w razie potrzeby komentarz do tej nowej konfiguracji) (Rysunek 7C,D).
    5. Aby otworzyć tę nową konfigurację kamery, wybierz File, a następnie Load Camera Cfg (Rysunek 7C).

Interfejs graficzny konfiguracji kamery; opcje menu, ustawienia akwizycji, częstotliwość klatek; proces konfiguracji obrazowania.
Rysunek 7: Opis korzystania z oprogramowania: dostosowanie ustawień akwizycji kamery do rejestracji wideo bijących krawędzi rzęskowatych.(A) W ustawieniach akwizycji Camera należy dostosować obszar zainteresowania (ROI) oraz częstotliwość klatek dla rejestracji wideo (Rate). (B) W ustawieniach akwizycji Record należy dostosować czas trwania nagrania wideo (liczba klatek wymagana dla wybranego czasu trwania nagrania, zgodnie z wcześniej wybraną częstotliwością klatek). (C) Te nowe ustawienia konfiguracji kamery można zapisać za pomocą funkcji Save camera Cfg. Funkcja Load Camera Cfg umożliwia ponowne otwarcie zapisanych ustawień konfiguracji do dalszego użytku. (D) Nowym ustawieniom konfiguracji kamery można nadać nazwę i w razie potrzeby dodać komentarz. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Spójrz przez okulary i wyszukaj komórki lub zanieczyszczenia w próbce, a następnie ustaw ostrość.
  2. Upewnij się, że obraz jest widoczny na monitorze, a następnie popraw jego jakość, regulując kondensator (oraz pryzmat DIC w przypadku użycia obiektywu do kontrastu interferencyjnego) i w razie potrzeby ponownie ustaw ostrość.
  3. Wyszukaj pasma nabłonka rzęskowego.

6. Wybór rzęskowych krawędzi dróg oddechowych

UWAGA: Układ doświadczalny umożliwia obserwację bijących rzęsek w trzech różnych płaszczyznach: w profilu bocznym, bijących bezpośrednio w stronę obserwatora oraz z góry (Rysunek 8).

Proces deformacji błony komórkowej, schemat z widoku z boku, przedstawiający różne kierunki przykładania siły.
Rycina 8: Technika DHSV pozwala na obserwację uderzeń rzęsek w trzech różnych płaszczyznach. (A) w profilu bocznym, (B) uderzeń skierowanych bezpośrednio w stronę obserwatora oraz (C) z widoku bezpośrednio z góry. Przedrukowano z Kempeneers et al.16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Rejestruj tylko nienaruszone, nieprzerwane krawędzie nabłonka rzęskowego o długości co najmniej 50 μm.
  2. W przypadku zapisów wykonanych w profilu bocznym określ jakość krawędzi zgodnie z systemem punktacji według Thomasa i wsp.29 (Rysunek 9). Do analizy funkcjonalnej rzęsek wykorzystuj wyłącznie krawędzie prawidłowe (Rysunek 9A) lub krawędzie z niewielkimi wypustkami (Rysunek 9B). Wyklucz pojedyncze komórki (Rysunek 9E).

Obrazy mikroskopowe przedstawiające detale rzęsek; struktury komórek biologicznych w badaniu mikroskopowym.
Rycina 9: Reprezentacyjny obraz systemu oceny według Thomasa i wsp.29 dla różnych stopni jakości rzęskowych krawędzi nabłonkowych.(A) Krawędź prawidłowa: zdefiniowana jako nienaruszony, jednolity pas nabłonka rzęskowego o długości > 50 μm (B) Krawędź rzęskowa z niewielkimi wypustkami: zdefiniowana jako krawędź o długości > 50 μm, z komórkami wystającymi poza linię krawędzi nabłonkowej, ale bez żadnego punktu błony apikalnej komórki wystającego powyżej wierzchołków rzęsek sąsiednich komórek (C) Krawędź rzęskowa z dużymi wypustkami: zdefiniowana jako krawędź o długości > 50 μm, z komórkami wystającymi poza linię krawędzi nabłonkowej, z co najmniej jednym punktem błony apikalnej komórki wystającym powyżej wierzchołków rzęsek sąsiednich komórek (D) Izolowana komórka rzęskowa: zdefiniowana jako jedyna komórka rzęskowa na krawędzi nabłonkowej o długości > 50 μm (E) Pojedyncze komórki: zdefiniowane jako komórki rzęskowe, które nie mają kontaktu między sobą ani z żadnym innym typem komórek. Pasek skali: 5,5 μm. Powtórzone z Thomas et al.29 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Wykonaj analizę CFA, wykorzystując wyłącznie rzęski wolne od śluzu i zanieczyszczeń, poruszające się w profilu wybranym dla rejestrowanej krawędzi. Wybieraj tylko takie urzęsione krawędzie, które pozwalają na ocenę co najmniej 2 CBF i CBP (patrz poniżej) wzdłuż krawędzi.
  2. Do analizy CFA wykorzystuj tylko próbki, w których co najmniej 6 krawędzi porusza się w profilu bocznym i spełnia powyższe kryteria; analizuj maksymalnie 20 krawędzi w profilu bocznym.
  3. Wykorzystaj co najmniej 1 dodatkową krawędź rzęsek poruszających się z poziomu powyżej profilu obserwatora, aby scharakteryzować CBP.

7. Rejestracja krawędzi rzęsionej

  1. Nagraj krawędź bijących rzęsek, ustawiając częstotliwość odświeżania kamery na 500 klatek na sekundę, i wyświetl obraz na monitorze o wysokiej rozdzielczości. Minimalna częstotliwość odświeżania wynosząca 400 Hz jest niezbędna do analizy zarówno CBF, jak i CBP13. Nagraj jedną krawędź z częstotliwością 30 klatek na sekundę, aby ocenić wydajność usuwania cząstek.
  2. Wybierz opcję Live na pasku sterowania kamerą w górnej części zakotwiczonego menu dialogowego (Rysunek 6D)
  3. Wybierz Play, aby wyświetlić obraz, oraz Stop, aby zakończyć podgląd (Rysunek 6D)
  4. Aby nagrać krawędź, naciśnij Record (Rysunek 6D). Aby przejrzeć nagranie przed zapisaniem, przejdź do paska sterowania kamerą w górnej części zakotwiczonego menu dialogowego i wybierz Playback. Wybierz Play, aby odtworzyć nagrane wideo, oraz Stop, aby zakończyć odtwarzanie (Rysunek 10A).
    UWAGA: Przed zapisaniem należy zakończyć podgląd nagranej krawędzi.

Interfejs oprogramowania do obrazowania; ustawienia akwizycji wideo, opcje zapisywania plików, sterowanie odtwarzaniem, zarządzanie danymi.
Rycina 10: Opis użytkowania oprogramowania. (A) tryb odtwarzania. Aby przejrzeć zarejestrowaną sekwencję wideo bijącego brzegu rzęsistego, wybierz Playback Mode. Wybierz Play, aby wyświetlić obraz, i Stop, aby zakończyć podgląd. Częstotliwość klatek można dostosować w celu usprawnienia analizy funkcji rzęsek (B, C) Zapisywanie nagrań wideo bijących brzegów rzęsistych (B) Aby zapisać wideo, wybierz File, a następnie Save Acquisitions. (C) Wpisz nazwę zarejestrowanego wideo i wybierz miejsce, w którym wideo zostanie zapisane. Upewnij się, że nagranie jest zapisywane jako plik .RAW (D) wybór nagrania bijących brzegów rzęsistych do analizy: Aby otworzyć nagranie wideo, wybierz File, następnie Open, a potem Images. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Zapisz wideo w bazie danych (Rysunek 10B,C).
    1. Otwórz zakładkę File w lewym górnym rogu, a następnie wybierz save acquisitions (Rysunek 10B).
    2. W oknie Save acquisitions wprowadź nazwę nagranego wideo i upewnij się, że nagranie jest zapisywane w formacie pliku RAW (Rysunek 10C).
  2. Po zapisaniu wideo powróć do trybu podglądu na żywo (przejdź do paska sterowania kamerą w górnej części zamocowanego menu dialogowego i wybierz live) (Rysunek 6D).
  3. Powtórz procedurę, aby nagrać liczbę krawędzi spełniających kryteria wyboru wymagane do CFA.
    UWAGA: Z jednego preparatu można nagrać kilka bijących krawędzi rzęskowych spełniających kryteria wyboru w maksymalnym czasie 20 minut od przygotowania preparatu (aby uniknąć wysychania). Jeśli po 20 minutach nie uda się uzyskać wystarczającej liczby krawędzi spełniających kryteria wyboru, przygotuj nowy preparat.
  4. Wyjmij preparat z podgrzewanego pojemnika.
  5. Zdejmij prostokątne szkiełko nakrywki i wyrzuć je do odpowiedniego pojemnika na niebezpieczne odpady medyczne.
  6. Oczyść preparat (z dwoma przyklejonymi kwadratowymi szkiełkami nakrywkami) za pomocą 70% etanolu i papieru chłonnego. Po oczyszczeniu preparat może być ponownie użyty.
  7. Adaptacja do COVID-19: Umieść preparat wraz z nakrywką i dystansem w szczelnym worku, zdejmij rękawiczki oraz maseczkę i włóż je do tego samego szczelnego worka. Umieść szczelny worek w odpowiednim pojemniku na niebezpieczne odpady medyczne.

8. Analiza funkcjonalna rzęsek

  1. Przygotowanie wstępne do ręcznej oceny CBF i CBP
    1. Uruchom oprogramowanie.
    2. Otwórz menu File w lewym górnym rogu, następnie wybierz Open, a potem Images (Rysunek 10D).
    3. Wybierz wideo do analizy.
    4. Przejdź do paska sterowania kamerą na górze zakotwiczonego menu dialogowego i wybierz Playback (Rysunek 10A). Wybierz Play, aby wyświetlić nagrane wideo, oraz Stop, aby zakończyć odtwarzanie.
  2. Ręczna analiza częstości uderzeń rzęsek (CBF)
    1. Przeprowadź ocenę CBF, wykorzystując wyłącznie krawędzie boczne.
    2. Podziel rzęsiste krawędzie na około 5 sąsiednich obszarów, z których każdy ma wielkość około 10 μm (Rysunek 11).
    3. Zidentyfikuj i zwizualizuj rzęski lub grupy rzęsek przy zmniejszonej liczbie klatek na sekundę; w każdym obszarze wykonuje się maksymalnie 2 pomiary CBF, co daje łącznie maksymalnie 10 pomiarów CBF wzdłuż każdej krawędzi (Rysunek 11).
    4. Zapisz liczbę klatek potrzebną do wykonania 5 cykli uderzeń przez grupę rzęsek.
    5. Przelicz wartość na CBF za pomocą prostego obliczenia: (CBF = częstotliwość nagrywania klatek (Hz) / (liczba klatek dla 5 uderzeń) x 5)13,16,30. Rzęski nieruchome raportuje się jako CBF równe 0 Hz13.
      UWAGA: Dostosuj liczbę klatek podczas odtwarzania nagranych filmów (Rysunek 10A). Jest to szczególnie przydatne, gdy analizowane rzęski uderzają bardzo powoli. Zwiększenie liczby klatek pomaga określić, czy rzęski uderzają bardzo powoli, czy są nieruchome.
    6. Dla każdej próbki oblicz średnie CBF jako średnią (SD) lub (95% CI) wszystkich wartości CBF zarejestrowanych w profilu bocznym, wliczając rzęski statyczne.

Obraz mikroskopowy, przekrój poprzeczny włosa, analiza struktury włókien, skala powiększenia 20 µm, badanie materiału.
Rysunek 11: Reprezentatywny obraz brzegu o optymalnej jakości oraz podział na 5 obszarów w celu przeprowadzenia analizy CFA. Brzeg nabłonka migawkowego o optymalnej jakości zostaje podzielony na 5 sąsiednich obszarów, z których każdy ma wymiar 10 μm. W każdym obszarze wykonuje się maksymalnie 2 pomiary CBF (oraz 2 oceny CBP), co daje łącznie maksymalnie 10 pomiarów CBF (oraz ocen CBP) wzdłuż każdego brzegu. Pasek skali = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Ręczna analiza wzorca ruchów rzęsek (CBP)
    1. W celu oceny markerów dyskinezji należy stosować wyłącznie profil boczny; do charakterystyki typu CBP należy wykorzystać płaszczyzny skierowane w stronę obserwatora oraz widok z góry13. Istnieją różne metody i skale oceny CBP. Poniżej opisano metodę stosowaną w laboratorium wraz z definicjami markerów dyskinezji.
    2. Procentowy udział każdego odrębnego CBP w próbce
      1. Dla każdej rzęski lub grupy rzęsek zidentyfikowanych i wykorzystanych do pomiaru CBF (Rysunek 11), należy przeprowadzić analizę CBP przy zredukowanej liczbie klatek na sekundę: porównać dokładną drogę, jaką pokonują rzęski podczas pełnego cyklu uderzenia, z prawidłowym CBP zaobserwowanym w analizie DHSV12,30.
      2. Każdej analizowanej rzęsce lub grupie rzęsek przypisać odrębny CBP (prawidłowy, nieruchomy, sztywny, okrężny, asynchroniczny (nieskoordynowane uderzenia rzęsek) lub dyskinetyczny13).
      3. Dla każdej próbki obliczyć procentowy udział każdego odrębnego CBP w próbce; CBP przypisany do próbki to przeważający zaobserwowany CBP.
    3. Obliczyć 3 markery dyskinezji.
      1. Obliczyć indeks nieruchomości (IMI): procent rzęsek nieruchomych w próbce (liczba CBF=0/całkowita liczba odczytów CBF w próbce X 100). IMI należy przedstawić jako średnią (SD) lub (95% CI)1,16,31.
      2. Obliczyć wynik dyskinezji (DKS). Każdą krawędź rzęsistą podzielić na kwadranty i określić liczbę kwadrantów z rzęskami dyskinetycznymi (lub uderzającymi w sposób nieprawidłowy). Pozwala to na obliczenie DKS w zakresie od 0 do 4 (0: prawidłowy CBP na całej krawędzi; 1: nieprawidłowy CBP w ≤ 25% rzęsek; 2: nieprawidłowy CBP w ≤ 50% rzęsek; 3: nieprawidłowy wzorzec uderzeń w ≤ 75% rzęsek; 4: nieprawidłowy CBP we wszystkich rzęskach). Dla próbki oblicza się medianę DKS (rozstęp międzykwartylowy)16,29.
      3. Obliczyć procent prawidłowych uderzeń: definiowany jako procent rzęsek z prawidłowym CBP w próbce (liczba prawidłowych odczytów CBP/całkowita liczba odczytów CBP dla próbki x100).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zilustrować wydajność tej techniki, przedstawiamy wyniki CFA w serii 16 zdrowych dorosłych ochotników (5 mężczyzn, w wieku od 22 do 54 lat).

Próbki z wymazów z jam nosowych pobrane od 14 (4 mężczyzn, przedział wiekowy 24-54 lata) z łącznej liczby 16 ochotników dostarczyły wystarczającej liczby odpowiednich brzegów nabłonkowych spełniających kryteria wyboru niezbędne do przeprowadzenia CFA. Z tych 14 próbek z wymazów nosowych zarejestrowano łącznie 242 brzegi rzęskowane, z czego 212 brzegów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie standardowej procedury operacyjnej CFA przy użyciu próbek z nosa, z dostosowaniami dokonanymi w celu uwzględnienia odpowiednich względów kontroli zakażeń podczas pandemii COVID-19. Diagnostyka PCD jest trudna i obecnie wymaga panelu różnych testów diagnostycznych, zgodnie z międzynarodowymi zaleceniami, w tym pomiaru tlenku azotu w nosie, CFA przy użyciu DHSV, ultrastrukturalnej analizy rzęsek za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), znakowania białek rzęskowych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy ci nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier i wszystkim członkom zespołu centrum diagnostycznego PCD Paris-Est za ich dyspozycyjność i serdeczne powitanie podczas wizyty w ich centrum diagnostycznym PCD oraz za liczne wymiany informacji. Dziękujemy również Robertowi Hirstowi i wszystkim członkom zespołu w centrum PCD w Leicester za ich powitanie, czas, rady i wiedzę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki stożkowe 15 mlFisherScientific35209615 ml Polipropylenowa rurka stożkowa o wysokiej przejrzystości z pokrywką
Amfoterycyna BLONZA17-836ERoztwór przeciwgrzybiczy
Kleszczyki do nosa Blakesleya-weilaNOVO SURGICALE7739-12Służy do trzymania szczoteczki do szczotkowania nosa
Szczoteczka do cytologii oskrzeliCONMED129Służy do nosa szczotkowanie
Wacik bawełnianyNUOVA APTACA2150/SGUżywany do testów COVID-19
Cyfrowa szybka kamera wideomikroskopowaIDTeu Innowacja w ruchuCrashCam Mini 1510
Szkiełkoszklane ThermoScientific12372098Szkiełka mikroskopowe używane do tworzenia komory wizualizacji
Podgrzewane pudełko KomórkiIBIDI w ostrości10918Służy do podgrzewania próbka
Mikroskop światła odwróconegoZeissAXIO Vert.A1
Grzałka obiektywuTOKAI HITTPiE-LHSłuży do podgrzewania oleju immersyjnego
soczewki Medium 199 (M199), HEPESTermoFisher Scientific12340030Cell Culture Medium
Motion Studio X64IDT Motionwersja 2.14.01Oprogramowanie
OilFischerScientific, Carl Zeiss
Szkiełko nakrywkowe prostokątneVWR631-0145Służy do zakrycia studzienki wizualizacji
Podkładka dystansowa (Ispacer) 0,25 mmSunjinlabIS203Służy do tworzenia hermetycznej zamkniętej komory wizualizacyjnej
Szkiełko nakrywkowekwadratowe VWR631-0122Służy do tworzenia zbudowanej w laboratorium otwartej komory wizualizacyjnej
Streptomycyna/PenicylinaFisherScientific, Gibco11548876Roztwór antybiotyków
11825153

Bibliografia

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , Supplement 1 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122(2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics - The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797(2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76(2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O'Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11(2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78(2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, Suppl 1 15(2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418(2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205(2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14(2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a, Ammons, B. a, Wyatt, T. a All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, Pt 2 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cyfrowa szybka wideomikroskopiaanaliza funkcjonalna rzęsekczęstotliwość uderzeń rzęsekwzorzec uderzeń rzęsekpierwotne dyskinezje rzęsekśrodki kontroli zakażeńnabłonkowe paski rzęsioneoprogramowanie do analizy wideo
Pobieranie próbek i przetwarzanie szczotkowania nosa za pomocą cyfrowej wideomikroskopii rzęskowej o dużej prędkości – adaptacja do pandemii COVID-19
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.