Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbki roślinnej do pomiaru zawartości nukleozydów/nukleotydów za pomocą HPLC-MS/MS

4.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61956

⸱

24 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, 2Department of Criminal Science and Technology, Nanjing Forest Police College, 3Department of Molecular Nutrition and Biochemistry of Plants, Institute of Plant Nutrition, Leibniz University Hannover

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tu opisano jest precyzyjna i możliwa do powtórzenia metoda ilościowego oceny nukleozydów/nukleotydów in vivo w roślinach. Ta metoda wykorzystuje HPLC-MS/MS.

Streszczenie

Nukleozydy/nukleotydy są budulcami kwasów nukleinowych, częściami kosubstratów i koenzymów, cząsteczkami sygnałowymi komórkowymi i nośnikami energii, które biorą udział w wielu czynnościach komórkowych. Opisujemy tutaj szybką i niezawodną metodę absolutnej kwalifikacji zawartości nukleozydów/nukleotydów w roślinach. W skrócie, 100 mg homogenizowanego materiału roślinnego zostało wyekstrahowane za pomocą 1 mL buforu ekstrakcyjnego (metanol, acetonitryl i woda w proporcji 2:2:1). Później, próbka została skoncentrowana pięciokrotnie w liofilizatorze, a następnie wstrzyknięta do HPLC-MS/MS. Nukleotydy zostały rozdzielone na kolumnie porowatego węgla grafitowego (PGC), a nukleozydy na kolumnie C18. Przemiany masowe każdego nukleozydu i nukleotydu były monitorowane za pomocą spektrometrii mas. Zawartość nukleozydów i nukleotydów została zmierzona w stosunku do ich zewnętrznych standardów (ESTD). Dzięki tej metodzie, naukowcy mogą łatwo określić ilość nukleozydów/nukleotydów w różnych roślinach.

Wprowadzenie

Nukleozydy/nukleotydy są centralnymi składnikami metabolicznymi we wszystkich organizmach żywych, które są prekursorami kwasów nukleinowych i wielu koenzymów, takich jak nikotynamidowe adenoinowe dinukleotydy (NAD) oraz ważne w syntezie makrocząsteczek takich jak fosfolipidy, glikolipidy i polisacharydy. Strukturalnie nukleozyd zawiera nukleobazę, która może być adeniną, guaniną, uracylem, cytozyną lub tyminą oraz część cukrowa, która może być rybozą lub deoksyrybozą1,2. Nukleotydy mają do trzech grup fosforanowych wiązanych z 5-węglową pozycją cząsteczki cukrowej nukleozydów3. Metabolizm nukleotydów w roślinach jest niezbędny dla kiełkowania nasion i wzrostu liści4,5,6. Aby lepiej zrozumieć ich fizjologiczne role w rozwoju roślin, należy ustalić metody absolutnego ilościowego określania różnych nukleozydów/nukleotydów in vivo.

Jedną z najczęściej stosowanych metod pomiaru nukleozydów/nukleotydów jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) połączona z detektorem ultrafioletowo-widocznym (UV-VIS)4,7,8,9,10,11. W 2013 roku, używając HPLC, Dahncke i Witte zmierzyli kilka rodzajów nukleozydów w Arabidopsis thaliana7. Zidentyfikowali zwiększoną zawartość guanozyny w mutantach z wstawką T-DNA, która cechuje się mutacją w genie deaminazy guanozynowej w porównaniu do roślin dzikich. Kolejny nukleozyd pirymidynowy, cytydyna, został również kwantifikowany u roślin za pomocą tej metody, co zaowocowało zidentyfikowaniem genu deaminazy cytydynowej4. Jednakże, oparta na detektorze UV metoda ta nie może łatwo odróżnić nukleozydów, które mają podobne widma i czasy retencjonowania, np. guanozynę lub zantozynę. Limit wykrywalności metody HPLC jest stosunkowo wysoki, dlatego często jest ona stosowana do pomiaru wysokiej zawartości nukleozydów in vivo, takich jak cytydyna, urydyna i guanozyna.

Dodatkowo, chromatografia gazowa połączona ze spektrometrią mas (GC-MS) może być również wykorzystywana do pomiaru nukleozydów. Dzięki temu Hauck i wsp. z powodzeniem zmierzyli urydynę i kwas moczową, który jest metabolitem ścieżki katabolicznej nukleozydów, w nasionach A. thaliana12. Jednakże, GC jest zwykle używana do oddzielania związków lotnych, ale nie nadaje się dla substancji termicznie nietrwałych. Dlatego chromatografia cieczowa połączona ze spektrometrią mas (LC-MS/MS) jest prawdopodobnie bardziej odpowiednią i dokładną techniką analityczną do in vivo identyfikacji, separacji i ilościowego określania nukleozydów/nukleotydów13,14. Kilka wcześniejszych badań doniosło, że kolumna HILIC może być użyta do separacji nukleozydów i nukleotydów15,16 oraz że oznaczniki wewnętrzne z oznaczeniem izotopowym były używane do ilościowego określania związków17. Jednakże, oba składniki są stosunkowo drogie, szczególnie komercyjne standardy z oznaczeniem izotopowym. Przedstawiamy tutaj ekonomicznie stosowną metodę LC-MS/MS do pomiaru nukleozydów/nukleotydów. Ta metoda została już z powodzeniem zastosowana do ilościowego określania różnych nukleozydów/nukleotydów, w tym ATP, N6-metylo-AMP, AMP, GMP, urydyny, cytydyny i pseudourydyny1,5,6,18, u roślin i Drosophila. Co więcej, metoda opisana tutaj może być również zastosowana u innych organizmów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1 Uprawa roślin i zbieranie materiałów

  1. Upewnij się, że nasiona Arabidopsis są sterylizowane w 70% etanolu przez 10 min i zasiadne na płytkach agarowych, które zostały przygotowane z połową stężenia składników odżywczych Murashige i Skoog.
  2. Inkubaować płytki zawierające nasiona Arabidopsis w ciemności w 4 °C przez 48 h, a następnie przenieść je do kontrolowanego pomieszczenia z warunkami wzrostu, w którym panuje 16 h światła o natężeniu 55 μmol m-2 s-1 w 22 °C i 8 h ciemności w 20 °C.
  3. Zbierz 100 mg dwutygodkowych sadzonek (waga świeża) i zamroź w ciekłym azocie do ekstrakcji metabolitów.
    ​UWAGA: Badacze powinni odpowiednio zakładać rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny, aby uniknąć skażenia ludzkimi tkankami podczas zbierania materiałów.

2 Ekstrakcja nukleozydów/nukleotydów

  1. Zmiel 100 mg mrożonych tkanek roślinnych z 7-8 stalowymi kulkami w wstępnie schłodzonym młynku mieszarki przez 5 min z częstotliwością 60 Hz.
  2. Przygotuj roztwór ekstrakcyjny, który zawiera metanolol, acetonitryl i wodę w proporcji 2:2:1.
  3. Ponownie zawieś zhomogenizowane materiały (w tym większość metabolitów, ale nie białka) w 1 ml roztworu ekstrakcyjnego.
  4. Centryfuguj wynikający roztwór przy 12 000 x g przez 15 min w 4 °C.
  5. Przenieś 0,5 ml zawiesiny do nowej 1,5 ml epruwetki i zamroź w ciekłym azocie.
  6. Wyparuj zamrożoną próbkę w zamrażalniku i ponownie zawieś w 0,1 ml 5% acetonitrylu i 95% wody.
  7. Centryfuguj wynikający roztwór (0,1 ml) przy 40 000 x g przez 10 min w 4 °C. Zaladuj surnatę do fiolki do pomiaru LC-MS/MS.

3 Pomiar LC-MS/MS

  1. Przygotuj 10 mM bufor octanu amonowego, rozpuszczając 1,1 g octanu amonu w 2 L podwójnie zjonizowanej wody (faza ruchoma A). Ustaw pH na 9,5 za pomocą 10% octanu i kwasu octowego.
  2. Przygotuj 2 L ultraczystego 100% metanolu (faza ruchoma B1) do pomiaru nukleozydów. Przygotuj również 2 L ultraczystego 100% acetonitrylu (faza ruchoma B2) do pomiaru nukleotydów.
  3. Wstrzyknij 0,02 ml wstępnie przygotowanej ekstrakcji metabolitów każdej próbki z kroku 2.7 do układu HPLC z dwoma pompami (LC) sprzężonym z potrójnym spektrometrem mas (MS).
    UWAGA: Układ HPLC zawiera kolumnę C18 (50 x 4,6 mm, wielkość cząsteczki 5 μm; pracującą w 25 °C) buferowaną fazą ruchomą A i B1 (Rysunek 1A) do separacji nukleozydów i używa porowatej kolumny węglowej (PGC) (50 x 4,6 mm, wielkość cząsteczki 5 μm; pracującą w 25 °C) z fazą ruchomą A i B2 (Rysunek 1B) do separacji nukleotydów. Każda próbka była wstrzykiwana trzykrotnie dla replikacji technicznej.
  4. Zaprogramuj metodę tak, jak pokazano w Tabeli 1 dla kolumny C18 i metodę tak, jak pokazano w Tabeli 2 dla kolumny PGC. Ustaw przepływ na 0,65 ml min-1.
    UWAGA: Przejścia masowe (Tabela 3) były monitorowane przez spektrometr mas. Warunki analizy widma masowego ośmiu nukleozydów i pięciu nukleotydów, w tym kanonicznych i zmodyfikowanych, są wymienione w Tabeli 3.
  5. Zapisz obszary szczytów każdego związku docelowego (Rysunek 1).

4 Generowanie krzywych kalibracyjnych standardowych

  1. Złącz sześć ekstrakcji próbek, które zostały wykonane zgodnie z opisem w sekcji 2 i przemieszaj je. Następnie podziel je na sześć ekstrakcji (takiej samej objętości) ponownie, aby uzyskać każde tło.
  2. Dodaj sześć różnych stężeń każdego standardu do tych sześciu ekstrakcji, odpowiednio, i wstrzyknij je jeden po drugim zgodnie z krokiem 3.3.
  3. Zapisz obszary szczytów każdego standardu w różnych stężeniach za pomocą przejść masowych, jak opisano w krokach 3.4 i 3.5.
  4. Narysuj krzywą sześciu punktów, wykreślając obszar szczytu względem nominalnego stężenia każdego standardu.
    UWAGA: Obszary szczytów nukleozydów/nukleotydów zapisanych w kroku 3.5 powinny znajdować się w zakresie krzywych kalibracyjnych standardowych.
  5. Oblicz równanie prostej dla każdego związku standardowego: Y = aX + b

5 Kwantyfikacja metabolitów

  1. Oblicz zawartość metabolitów, używając obszaru szczytu zapisanego w kroku 3.5 i równania z kroku 4.5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tu pokażemy identyfikację i ilościową ocenę N1-metyloadenozyny, znanego zmodyfikowanego nukleozydu, w 2-tygodniowych sadzonkach Arabidopsis typu dzikiego (Col-0) jako przykład. Profil spektrometrii masowej wskazuje, że jony produktów generowane z N1-metyloadenozyny standardowej mają 150 m/z i 133 m/z (Rysunek 2A), a ten sam profil jest również obserwowany w ekstrakcji Col-0 (Rysunek 2B). Ze względu na wysoką...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Organizmy zawierają różne nukleozydy/nukleotydy, w tym kanoniczne i aberracyjne. Jednak pochodzenie i metaboliczne punkty końcowe, szczególnie zmodyfikowane nukleozydy, są nadal niejasne. Co więcej, obecne rozumienie funkcji i homeostazy metabolizmu nukleozydów/nukleotydów nadal wymaga poszerzenia i badań. Aby je zbadać, należy zastosować precyzyjną i standardową metodę identyfikacji i ilościowego oznaczania tych metabolitów. Tutaj opisano protokół wykorzystujący widmo masowe do wykrywania nukleozydów/nukleotydów. Biorąc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych sporów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

To dzieło było finansowo wspierane przez Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (KJQN202060), Narodowe Fundusze Nauki Przyrodniczej Chin (31900907), Fundusz Nauki Przyrodniczej Prowincji Jiangsu (BK20190528), Międzynarodowe Centrum Inżynierii Genetycznej i Biotechnologii (CRP/CHN20-04_EC) dla M.C. oraz Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (LGZD202004) dla X.L.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
acetonitrileSigma-Aldrich1000291000
adenosineSigma-AldrichA9251-1G
ammonium acetateSigma-Aldrich73594-100G-F
AMPSigma-Aldrich01930-5G
CMPSigma-AldrichC1006-500MG
cytidineSigma-AldrichC122106-1G
GMPSigma-AldrichG8377-500MG
guanosineSigma-AldrichG6752-1G
Hypercarb columnThermo Fisher Scientific GmbH35005-054630
IMPSigma-Aldrich57510-5G
inosineSigma-AldrichI4125-1G
methanolSigma-Aldrich34860-1L-R
N1-methyladenosineCarbosynthNM03697
O6-methylguanosineCarbosynthNM02922
Murashige and Skoog MediumDuchefa BiochemieM0255.005
Polaris 5 C18A columnAgilent TechnologiesA2000050X046
pseudouridineCarbosynthNP11297
UMPSigma-AldrichU6375-1G
uridineSigma-AldrichU3750-1G

Bibliografia

  1. Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
  2. Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
  3. Witte, C. -P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
  4. Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
  5. Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
  6. Chen, M., Witte, C. -P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
  7. Dahncke, K., Witte, C. -P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
  8. Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
  9. Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
  10. Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
  11. Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
  12. Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
  13. Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
  14. Zong, S. -Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
  15. Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
  16. Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
  17. Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
  18. Baccolini, C., Witte, C. -P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie nukleozyd w i nukleotyd wanaliza HPLC MS MSbufor do ekstrakcji metanol acetonitryl wodakolumna z porowatego grafiturozdzia na kolumnie C18przej cia spektrometrii masowejkalibracja standardem zewn trznymzag szczanie liofilizatoremrozcieranie tkanek w ciek ym azocie

Powiązane artykuły