Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kompleksowy, wysokowydajny protokół izolacji, hodowli, polaryzacji i charakterystyki glikolitycznej makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61959

⸱

7 lutego 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Nutrition and Food Science, Texas A&M University, 3Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza szczegółowych i kompleksowych metod izolacji, hodowli, polaryzacji i pomiaru glikolitycznego stanu metabolicznego żywych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM). Ten artykuł zawiera instrukcje krok po kroku z realistycznymi ilustracjami wizualnymi dotyczącymi przepływu pracy i oceny glikolitycznej BMDM w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Makrofagi są jednymi z najważniejszych komórek prezentujących antygen. Wiele podzbiorów makrofagów zostało zidentyfikowanych z unikalnymi sygnaturami metabolicznymi. Makrofagi są powszechnie klasyfikowane jako podtypy podobne do M1 (zapalne) i M2-podobne (przeciwzapalne). Makrofagi podobne do M1 to makrofagi prozapalne, które są aktywowane przez LPS i/lub cytokiny prozapalne, takie jak INF-γ, IL-12 i IL-2. Spolaryzowane makrofagi podobne do M1 są zaangażowane w różne choroby, pośrednicząc w obronie gospodarza przed różnymi bakteriami i wirusami. Jest to bardzo ważne dla badania makrofagów podobnych do M1 indukowanych przez LPS i ich stanów metabolicznych w chorobach zapalnych. Makrofagi podobne do M2 są uważane za makrofagi przeciwzapalne, aktywowane przez cytokiny i stymulatory przeciwzapalne. W stanie prozapalnym makrofagi wykazują zwiększoną glikolizę w funkcji glikolitycznej. Funkcja glikolityczną była aktywnie badana w kontekście glikolizy, zdolności glikolitycznej, rezerwy glikolitycznej, glikolizy kompensacyjnej lub kwasowości nieglikolitycznej przy użyciu analizatorów strumienia zewnątrzkomórkowego (XF).

Ten artykuł pokazuje, jak ocenić stany glikolityczne w czasie rzeczywistym za pomocą łatwych do wykonania kroków, gdy makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) oddychają, zużywają i produkują energię. Wykorzystując w tym protokole specyficzne inhibitory i aktywatory glikolizy, pokazujemy, jak uzyskać ogólnoustrojowy i kompletny obraz glikolitycznych procesów metabolicznych w komórkach oraz zapewnić dokładniejsze i bardziej realistyczne wyniki. Aby móc mierzyć wiele fenotypów glikolitycznych, zapewniamy łatwą, czułą, opartą na DNA metodę normalizacji do oceny polaryzacji BMDM. Hodowla, aktywacja/polaryzacja oraz identyfikacja fenotypu i stanu metabolicznego BMDM to kluczowe techniki, które mogą pomóc w badaniu wielu różnych rodzajów chorób.

W tym artykule spolaryzowaliśmy naiwne makrofagi M0 na makrofagi podobne do M1 i M2 odpowiednio za pomocą LPS i IL4, a także zmierzyliśmy kompleksowy zestaw parametrów glikolitycznych w BMDM w czasie rzeczywistym i podłużnie w czasie, używając analizy strumienia zewnątrzkomórkowego oraz aktywatorów i inhibitorów glikolitycznych.

Wprowadzenie

Makrofagi są jednymi z najbardziej krytycznych komórek wrodzonego układu odpornościowego podobnego do M1. Biorą udział w usuwaniu chorób zakaźnych, fagocytozy, prezentacji antygenu i regulacji stanu zapalnego2. Co więcej, makrofagi są potrzebne do regulowania innych komórek odpornościowych za pomocą różnych cytokin, które uwalniają3. Istnieje szerokie spektrum fenotypów makrofagów4. W zależności od sygnałów, na które narażone są makrofagi, polaryzują się one w kierunku różnych stanów zapalnych i metabolicznych5. Makrofagi wykazują zmiany metaboliczne w różnych chorobach, w zależności od tego, w jakiej tkance znajdują się makrofagi6. Spolaryzowane makrofagi mają zdolność przeprogramowywania lub przełączania swojego metabolizmu glikolitycznego, metabolizmu lipidów, metabolizmu aminokwasów i mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS)7,8. Klasycznie aktywowane makrofagi podobne do M1 i alternatywnie aktywowane makrofagi podobne do M2 to dwa najlepiej zbadane fenotypy makrofagów3. Nieaktywowane makrofagi w stanie spoczynku są określane jako makrofagi M0. Polaryzacja makrofagów M0 w kierunku fenotypu podobnego do M1 może być indukowana przez stymulację naiwnych BMDM za pomocą bakteryjnego lipopolisacharydu (LPS)9. Szlak sygnałowy PI3K-AKT-mTOR-HIF1a może być aktywowany w makrofagach w obecności cytokin zapalnych, interferonu gamma (IFN γ,) lub czynnika martwicy nowotworu (TNF)10. Makrofagi podobne do M1 mają zwiększony poziom metabolizmu glikolizy, obniżony poziom fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS), wytwarzając cytokiny zapalne zaangażowane w choroby zakaźne i zapalne8. Z drugiej strony, polaryzacja w kierunku fenotypu podobnego do M2 może być indukowana przez interleukinę (IL)-4, poprzez szlaki JAK-STAT, PPAR i AMPK lub przez (IL)-13 i TGFβ pathays11,12.

W przeciwieństwie do makrofagów podobnych do M1, makrofagi podobne do M2 mają zmniejszoną glikolizę i zwiększoną OXPHOS oraz są zaangażowane w działania przeciwpasożytnicze i naprawcze tkanek8,13. BMDM są szeroko stosowanym systemem do badania makrofagów, które pochodzą z komórek macierzystych szpiku kostnego. Glikoliza i OXPHOS to dwa wiodące szlaki produkcji energii w komórkach14. W oparciu o swoje mikrośrodowisko, BMDM mogą zdecydować się na użycie jednej z tych ścieżek; W niektórych przypadkach przełącz się z jednej na drugą lub użyj obu ścieżek14. W tym badaniu skupiliśmy się na metabolizmie glikolizy w aktywowanych makrofagach prozapalnych. Kiedy glukoza w cytoplazmie jest przekształcana w pirogronian, a następnie mleczan, komórki wytwarzają protony w pożywce, które powodują wzrost szybkości zakwaszenia w otaczającym środowisku komórek podobnych do M15. Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego został użyty do pomiaru szybkości zakwaszenia pożywki komórkowej. Wyniki są podawane jako wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) lub wskaźnik wypływu protonów.

Zoptymalizowana, szybka i łatwa metoda dostępu do poziomów glikolizy w spolaryzowanych makrofagach jest niezbędna do określenia fenotypu glikolitycznego, zmian metabolitów oraz wpływu inhibitorów/aktywatorów i leków na spolaryzowane makrofagi. Metoda opisana w tym manuskrypcie została zoptymalizowana w celu dostarczenia informacji o określonych czynnikach glikolizy (glikoliza, pojemność glikoliczna, rezerwa glikoliczna i zakwaszenie nieglikolityczne), a także o metabolicznym przeprogramowaniu metabolizmu glikolitycznego. Inhibitor (2DG), który został użyty w tym badaniu, jest wyraźnie ukierunkowany na szlak glikolizy.

Ten zoptymalizowany protokół został zmodyfikowany i ulepszony w oparciu o połączenie opublikowanego protokołu16, analizę strumienia zewnątrzkomórkowego testów glikolitycznych w instrukcjach producenta oraz bezpośrednią komunikację z naukowcami z działu badań i rozwoju producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Myszy uśmiercono w sposób humanitarny zgodnie z wytycznymi Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) oraz American Association for Laboratory Animal Science (AALAS), stosując protokoły zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i korzystania ze zwierząt (IACUC) Texas A&M University.

1. Pobieranie szpiku kostnego myszy i hodowla BMDM

  1. Uśmierć mysz (w tym protokole zastosowano myszy C57Bl/6 w wieku 6–10 tygodni) i połóż ją na brzuchu, przetnij skórę oraz warstwę otrzewnej i delikatnie odchyl nogi.
    UWAGA: Do eutanazji myszy zastosuj ekspozycję na gaz CO2.
  2. Oddziel obie tylne nogi od stawu biodrowego w dół, uważając, aby nie przeciąć kości.
  3. Umieść całą nogę w pustej probówce stożkowej o pojemności 50 mL (stopami do góry, aby ułatwić późniejsze wyjęcie) na lodzie, a następnie przystąp do pobrania obu nóg z myszy.

2. Odsłonięcie kości udowej

UWAGA: Poniższe kroki należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza (kabinie bezpieczeństwa biologicznego).

  1. Pobierz kość udową, odcinając piszczel z każdej nogi, a następnie usuń nożyczkami i papierem laboratoryjnym jak najwięcej tkanek otaczających kość udową.
  2. Umieść pobrane, „oczyszczone” kości udowe na płytce 10 cm zawierającej kawałek papieru laboratoryjnego nasyconego pożywką do hodowli tkankowych (TC) lub PBS. Umieść je na lodzie.
  3. Kontynuuj pobieranie kości udowych i usuwanie tkanek ze wszystkich kości przed przejściem do etapu płukania (Rysunek 1A).

3. Przepłukanie szpiku

  1. Aby wypłukać szpik z kości udowych, należy użyć strzykawki 3 mL wypełnionej pożywką TC lub PBS z igłą 23G. Wypełnij strzykawkę przed odsłonięciem szpiku.
  2. Użyj nożyczek, aby odsłonić szpik, odcinając końce kości udowej na obu nasadach.
  3. Wprowadź końcówkę igły do kości udowej i delikatnie wypłucz szpik do naczynia o średnicy 10 cm.
  4. Przesuń igłę przez całą długość kości udowej i płucz do momentu, aż kość stanie się biała. Zazwyczaj większość szpiku można wypłukać za pomocą 2-3 mL pożywki.
  5. Wypłucz wszystkie kości udowe i połącz szpik kostny w naczyniu. Użyj igły, aby rozbić wszelkie widoczne grudki. Przecedź szpik do probówki stożkowej 50 mL (Rycina 1A).

4. Lizowanie erytrocytów

  1. Wirować szpik przy 190 x g przez 10 min. Odessać supernatant.
  2. Resuspender osad w 4 mL buforu lizującego ACK za pomocą pipety. Pozostawić bufor do lizy RBC na 5 min w temperaturze pokojowej.
  3. Do zawiesiny szpiku dodać 4 mL pożywki TC RPMI-C 10% (RPMI 1640 -GlutaMAX) uzupełnionej o 2-merkaptoetanol, gentamicinę, streptomycynę oraz 10% FCS i wirować przy 1300 x g przez 10 min.
  4. Ponownie przefiltrować w celu usunięcia szczątków RBC i resuspender w niewielkiej objętości RPMI-C 10% w celu policzenia komórek.
  5. Policzyć komórki za pomocą licznika komórek (Rycina 1B). Do oznaczenia liczby i żywotności komórek w zawiesinie wykorzystano licznik Vi-Cell.

5. Wysiewanie i hodowla

  1. Do dowolnej liczby płytek 10 cm dodać po 10 mL pożywki RPMI-C 10% z dodatkiem 10 ng/mL M-CSF (czynnika stymulującego wzrost kolonii makrofagów, kluczowego regulatora proliferacji, różnicowania i przeżywalności monocytów/makrofagów).
  2. Dodaj odpowiednią objętość policzonych komórek w taki sposób, aby każda płytka 10 cm zawierała 1 x 106 komórki. Umieść płytki w 37 °C inkubator (zdefiniowany jako dzień 0).
  3. W 3. dniu do każdej płytki należy ostrożnie dodać 5 ml świeżej pożywki RPMI-C 10% + 10 ng/ml M-CSF.
    UWAGA: W 7. dniu BMDM powinny być gotowe do testów (Rysunek 1C).

6. Zbiór z płytek

  1. Użyj mikroskopu świetlnego, aby potwierdzić, że większość komórek przywarła do płytek.
  2. Ostrożnie odessij pożywkę. Następnie dodaj 3 mL PBS i delikatnie zakręć płytką. Dokładnie odessij płyn, aby usunąć wszelkie pozostałe nieprzylegające komórki.
  3. Dodaj do płytki 7-10 mL zimnego PBS, użyj pipety P1000 do przemycia dna płytek i zbierz wszystkie pozostałe komórki do probówki zbiorczej.
    UWAGA: Przechowuj probówki w lodzie, ponieważ makrofagi przylegają bardzo silnie i mogą przywrzeć do ścianek probówki. Jeśli komórki będą utrzymywane w niskiej temperaturze, ich adhezja będzie słabsza.
  4. Odwiruj, policz i wysiej komórki do eksperymentów (Rysunek 1D). W badaniu cytometrii przepływowej uzyskane komórki powinny być w >95% dodatnie dla CD11b i F4/80. (Polaryzację makrofagów określono poprzez barwienie markerami typu M1: CD38, TNF-a i MCP-1 oraz markerem typu M2: CD206.
    UWAGA: Kroki 6.1-6.3 wykonaj w komorze z laminarnym przepływem powietrza, a krok 6.4 na blacie laboratoryjnym. Przez cały czas trwania procedury zachowuj zasady aseptyki.

Proces ekstrakcji szpiku kostnego myszy i hodowli komórek; schemat przygotowania zawiesiny komórkowej.
Rycina 1: Graficzny schemat hodowli makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BM-Derived Macrophages) myszy. (A) Pobranie kończyn, odsłonięcie kości udowej i płukanie szpiku; (B) Hemoliza (lizy RBC); (C) Wysianie i hodowla; (D) Zbiór komórek z płytek. Aby wyświetlić tę rycinę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.

7. Dzień przed analizą analizatorem przepływu metabolicznego: wysiew i polaryzacja komórek do testu glikolitycznego

  1. Rozgrzej analizator strumieni metabolicznych (Metabolic Flux Analyzer) do 37 °C, włączając urządzenie.
  2. Nawodnij kartridż, dodając 200 µL roztworu kalibracyjnego (Calibrant Solution), a następnie inkubuj kartridż przez noc w inkubatorze bez CO2 (Rysunek 2A). Wilgotność inkubatora bez CO2 nie ma znaczenia dla procesu nawadniania kartridża.
    1. Na godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu kilkukrotnie zanurzaj płytkę w górę i w dół, aby pomóc w usunięciu pęcherzyków powietrza.
  3. Zaprojektuj mapę płyty w oprogramowaniu, korzystając z domyślnego testu stresu glikolitycznego z szybką iniekcją (glycolysis stress test-acute injection), zgodnie z instrukcją testu.
    1. Kliknij ikonę oprogramowania, a następnie wybierz Glycolysis stress-acute injection test. W ikonie definicji grup wygeneruj nazwy grup.
  4. Przewidziano pięć cykli pomiarowych o czasie trwania 18 minut oraz cztery iniekcje. Zmień zawartość portów iniekcyjnych: port A na glukozę (Glucose), port B na oligomycynę (Oligomycin), port C na rotenon i antymycynę A (Rot/AA) oraz port D na 2DG.
  5. Resuspenduj komórki w pożywce RPMI-C 10% i wysiej 50k komórek na dołek, z wyjątkiem czterech narożników płyty (A1, A12, H1 i H12; dodaj samą pożywkę, bez komórek), do mikro-płytki analizatora strumieni metabolicznych do końcowej objętości 100 µL. Zazwyczaj do przeprowadzenia tego testu wymagane jest minimum 40k komórek.
  6. Pozostaw komórki w temperaturze pokojowej na 45 min, aby uniknąć efektu brzegowego. Efekt brzegowy polega na częściowym odparowaniu pożywki z obwodu płyty, co powoduje zmiany objętości i stężeń oraz zmniejsza żywotność komórek.
  7. Dodaj 10 ng/mL LPS, aby spolaryzować naiwne makrofagi w kierunku komórek typu M1, oraz dodaj 20 ng/ml IL-4, aby spolaryzować je w kierunku komórek typu M2. Użyj od 3 do 6 dołków na każdą warunkę (Rysunek 2B).
  8. Sprawdź komórki pod mikroskopem i umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 24 godziny.

Konfiguracja Seahorse XFe do polaryzacji komórek: schemat inkubacji i nawilżania w badaniu polarymetrycznym.
Rysunek 2: Graficzna prezentacja wysiewania i polaryzacji komórek. (A) Konfiguracja analizatora przepływu zewnątrzkomórkowego i nawilżanie wkładu; (B) Polaryzacja komórek i inkubacja przez noc. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

8. Dzień analizy: Przygotowanie pożywki XF i związku

  1. Uzupełnić 100 mL pożywki testowej XF RPMI (pH 7,4) o 2 mM glutaminy.
  2. Przefiltrować pożywkę za pomocą systemu filtracji próżniowej 0,2 µm w celu sterylizacji.
  3. Umieścić pożywki testowe w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C na 20 min.
  4. Wyjąć płytki z komórkami z inkubatora (37 °C, 5% CO2). Przemyć komórki dwukrotnie pożywką testową, a następnie zastąpić poprzednią pożywkę pożywką testową do końcowej objętości 180 µL.
  5. Używając mikroskopu, upewnić się, że we wszystkich studzienkach znajdują się konfluentne komórki i zaznaczyć wszelkie studzienki z zarysowaniami powstałymi podczas pipetowania. W przypadku wystąpienia zarysowań, usunąć taką płytkę przed analizą.
  6. Umieścić płytkę z komórkami w inkubatorze bez CO2 na 45 min (Rycina 3A).
  7. Przygotować roztwory zapasowe glukozy (100 mM), oligomycyny (100 µM), Rot/AA (50 µM) i 2DG (500 mM), wykorzystując odpowiednie związki oraz pożywkę testową (Tabela 1).
  8. Przygotować 10-krotą mieszaninę wtryskową każdego związku, używając pożywki testowej (Tabela 2).
Roztwory zapasowe do wstrzykiwań (dołączone do zestawów)Dodać pełne podłoże do analizy (ml)Końcowe stężenie roztworu zapasowego (μM)
Glukoza3100 tys.
Oligomycyna0.72100
2-DG3100 tys.

Tabela 1. Roztwory do iniekcji

Porty w kartridżuRoztwory zapasoweDodaj objętość roztworu zapasowegoDodaj pożywkę do analizyStężenie końcowe wstrzykiwanych roztworów (10x)Dodaj tę objętość do wyznaczonego portu (μL)Stężenie końcowe po wstrzyknięciu do każdej studzienki
AGlukoza (100 mM)3000 μL + 0 μL100 mM2010 mM
BOligomycyna (100 μM)300 μL + 2700 μL10 μM221.0 μM
CRotenon/Antymycyna A (50 μM)300 μL + 2700 μL5 μM250.5 μM
D2-DG (500 mM)300 μL + 0 μL500 mM2850 mM

Tabela 2. Końcowe stężenia wstrzykiwane

9. Dzień analizy: Wykonanie ostrego testu glikolitycznego na spolaryzowanych makrofagach

  1. Otwórz w oprogramowaniu zapisany szablon testu stresu glikolitycznego (ostre wstrzyknięcie). Domyślny test Acute Glyco-Stress Test przewiduje 3 minuty mieszania i pomiaru przed każdym wstrzyknięciem.
  2. Sprawdź szablon oraz szczegóły testu, a po przygotowaniu kliknij Run i postępuj zgodnie z instrukcjami domyślnego testu. Należy jednak pamiętać, że wszystkie parametry można dostosować.
  3. Wyjmij kartridż z czujnikami (Sensor Cartridge) z inkubatora bez CO2, zdejmij pokrywkę i włóż go do urządzenia w taki sposób, aby studzienka A1 płytki kartridża znajdowała się w lewym górnym rogu panelu wkładania maszyny. Zazwyczaj kalibracja trwa od 20 do 45 min.
  4. Po zakończeniu kalibracji urządzenie wysunie płytkę zawierającą roztwór kalibracyjny i zatrzyma kartridż z czujnikami. Usuń płytkę z kalibrantem.
  5. Wyjmij płytkę z komórkami z inkubatora bez CO2, zdejmij pokrywkę płytki i włóż ją do maszyny. Kliknij Run (Rycina 3B).
  6. Po zakończeniu testu maszyna wysunie płytkę z komórkami oraz kartridż z czujnikami.
  7. Odbierz pożywkę z płytki i zamroź ją w temperaturze -20 °C w celu późniejszej normalizacji.
  8. Do normalizacji liczby komórek użyj komercyjnego zestawu do analizy proliferacji komórek (np. CyQUANT).
  9. Dodaj 1 mL Związku B lub buforu lizującego do 19 mL destylowanej wody wolnej od nukleaz.
  10. Do powyższego roztworu dodaj 100 µL Związku A lub roboczego roztworu GR.
  11. Upewnij się, że komórki na płytce są rozmrożone, a następnie dodaj 200 µL roztworu do każdej studzienki.
  12. Inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).
  13. Zmierz fluorescencję przy długości fali wzbudzenia 480 nm i emisji 520 nm za pomocą czytnika płytek.
  14. Wykonaj normalizację komórek w panelu normalizacyjnym oprogramowania.
  15. Znormalizuj komórki na podstawie liczby komórek naiwnych makrofagów (Rycina 3C). Przyjmij średnią liczbę naiwnych makrofagów jako 1 (dzieląc liczbę komórek w każdej studience przez średnią liczbę naiwnych makrofagów) i zastosuj to do wszystkich makrofagów.

Schemat procedury analizy metabolizmu komórkowego: przemywanie komórek, inkubacja, podanie związków, analiza danych.
Rysunek 3: Dzień analizy: przygotowanie pożywki i związków oraz przeprowadzenie analizy. (A) Przygotowanie komórek do analizy; (B) Przygotowanie związków, kalibracja i przeprowadzenie analizy; (C) Normalizacja i analiza danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Glikoliza i mitochondrialna fosforylacja oksydacyjna to dwie główne ścieżki produkcji ATP w komórkach (Rycina 4A). Niektóre komórki mają zdolność przełączania się między tymi dwiema ścieżkami w celu zaspokojenia zapotrzebowania energetycznego. Przekształcanie glukozy w pirogronian w cytoplazmie nazywane jest glikolizą. Pirogronian ma dwa możliwe losy; zostaje albo przekształcony w mleczan, albo dalej metabolizowany w cyklu TCA, a ostatecznie przez łańcuch tra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jak wspomniano wcześniej, analizator strumienia zewnątrzkomórkowego może dostarczać w czasie rzeczywistym informacji o dwóch głównych szlakach wytwarzania energii w komórkach, mierząc OCR (wskaźnik zużycia tlenu), wskaźnik aktywności mitochondrialnej OXPHOS i ECAR (wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego), który jest wskaźnikiem glikolizy. Makrofagi mogą wykorzystywać obie ścieżki, w zależności od ich mikrośrodowiska. Mogą również zmieniać swoje ścieżki produkcji energii17,18

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Pani Joannie Rocha za pomoc redakcyjną. Prace były częściowo wspierane przez National Institutes of Health (NIH) R01DK118334 (dla dr Sun i Alaniz) oraz (NIH) R01A11064Z (dla dr Jayaramana i Alaniza).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły 23GVWRBD305145
2-merkaptoetanolLife Technologies21985023
50ml Rurka stożkowaVWR21008-951
ACK Bufor do lizyThermo Fisher ScientificA1049201Może to być laboratoryjny
zestaw do testów wytrzymałościowych glikolizy Agilent Seahorse XFAgilent Technologies103020-100
Instrukcja obsługi zestawu do testów wysiłkowych glikolizy Agilent Seahorse XFAgilent Technologies103020-400
Zestaw do oznaczania szybkości glikolitycznej Agilent Seahorse XFAgilent Technologies103344-100
Instrukcja obsługi zestawu do oznaczania szybkości glikolity Agilent Seahorse XFAgilent Technologies103344-100
Alexa Fluor 488 przeciwciało anty-mysie CD206 (MMR)BioLegend141710
przeciw myszom CD11b eFluor450 100ugeBioscience48-0112-82
BD 3ML - STRZYKAWKAVWRDopuszczalne są również inne strzykawki
Licznik komórek-Vi-CELL- Kompletny system XRBECKMAN COULTER Life Sciences731050Komórki można również liczyć ręcznie
Sitko do komórek-70µ mVWR10199-656
CyQUANT Zestaw do oznaczania proliferacji komórekThermo Fisher ScientificC7026
F4/80 przeciwciało monoklonalne (BM8) pe-cyjaninina7eBioscience25-4801-82
Płodowa surowica bydlęcaLife Technologies16000-044
Cytometr przepływowy: BD LSFRFortessa X-20BD656385
Kim WipesVWR82003-822
LPS-SM ultraczysty (tlrl-smpls) 5 mgInvivogentlrl-smlps
MCSFPeprotech315-02
Mysi IL-4Peprotech214-14
PE Szczur Anti-Mouse CD38BD Biosciences553764
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Life Technologies15140122
Szalka Petriego 100mm x 15 mmFisher ScientificF80875712
RPMI, Glutamax, HEPESInvitrogen72400-120
Seahorse Calibrant SolutionAgilent Technologies103059-000
Seahorse XF 200mM Roztwór glutaminyAgilent Technologies103579-100
Seahorse XF Zestaw do oznaczania szybkości glikolitycznejAgilent Technologie103344-100
Seahorse XFe96 FluxPaksAgilent Technologies102416-100
XF Zestaw do testów wytrzymałościowych glikolizyAgilent Technologies103020-100
XF RPMI Medium, pH 7,4 bez fenolu CzerwonyAgilent Technologies103336-100
BD309657

Bibliografia

  1. Rosowski, E. E. Determining macrophage versus neutrophil contributions to innate immunity using larval zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 13 (1), (2020).
  2. Martinez-Pomares, L., Gordon, S. The Autoimmune Diseases. , Elsevier. 191-212 (2020).
  3. Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1 (LPS+) vs. classically and M2- (LPS–) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in immunology. 10, 1084(2019).
  4. Barrett, T. J. Macrophages in atherosclerosis regression. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (1), 20-33 (2020).
  5. Ni, Y., et al. Adipose tissue macrophage phenotypes and characteristics: the key to insulin resistance in obesity and metabolic disorders. Obesity. 28 (2), 225-234 (2020).
  6. Chu, C., et al. Modulation of foreign body reaction and macrophage phenotypes concerning microenvironment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 108 (1), 127-135 (2020).
  7. Batista-Gonzalez, A., Vidal, R., Criollo, A., Carreño, L. J. New insights on the role of lipid metabolism in the metabolic reprogramming of macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 2993(2020).
  8. Kang, S., Kumanogoh, A. The spectrum of macrophage activation by immunometabolism. International Immunology. , (2020).
  9. Shi, Y., et al. M1 But Not M0 Extracellular Vesicles Induce Polarization of RAW264. 7 Macrophages Via the TLR4-NFκB Pathway In Vitro. Inflammation. , 1-9 (2020).
  10. Zhang, L., Li, S. Lactic acid promotes macrophage polarization through MCT-HIF1α signaling in gastric cancer. Experimental Cell Research. 388 (2), 111846(2020).
  11. Geng, T., et al. CD137 signaling induces macrophage M2 polarization in atherosclerosis through STAT6/PPARδ pathway. Cellular Signalling. , 109628(2020).
  12. Liu, Q., et al. Combined blockade of TGf-β1 and GM-CSF improves chemotherapeutic effects for pancreatic cancer by modulating tumor microenvironment. Cancer Immunology & Immunotherapy. , 1-16 (2020).
  13. Rigoni, T. S., et al. RANK Ligand Helps Immunity to Leishmania major by Skewing M2 Into M1 Macrophages. Frontiers in Immunology. 11, 886(2020).
  14. Viola, A., Munari, F., Sánchez-Rodríguez, R., Scolaro, T., Castegna, A. The metabolic signature of macrophage responses. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  15. Ivashkiv, L. B. The hypoxia–lactate axis tempers inflammation. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 85-86 (2020).
  16. Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424(2015).
  17. Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial dysfunction prevents repolarization of inflammatory macrophages. Cell reports. 17 (3), 684-696 (2016).
  18. Liu, P. S., Ho, P. C. Metabolic Signaling. , Springer. 173-186 (2019).
  19. Wang, F., et al. Glycolytic stimulation is not a requirement for M2 macrophage differentiation. Cell metabolism. 28 (3), 463-475 (2018).
  20. Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. Quantifying Cellular ATP Production Rate Using Agilent Seahorse XF Technology. , Agilent Technologies, Inc. (2018).
  21. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464(2015).
  22. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1847 (2), 171-181 (2015).
  23. Yang, S., et al. Macrophage polarization in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 501, 142-146 (2020).
  24. Hörhold, F., et al. Reprogramming of macrophages employing gene regulatory and metabolic network models. PLoS Computational Biology. 16 (2), e1007657(2020).
  25. Han, X., Ma, W., Zhu, Y., Sun, X., Liu, N. Advanced glycation end products enhance macrophage polarization to the M1 phenotype via the HIF-1α/PDK4 pathway. Molecular and Cellular Endocrinology. , 110878(2020).
  26. Müller, E., et al. Toll-like receptor ligands and interferon-γ synergize for induction of antitumor M1 macrophages. Frontiers in Immunology. 8, 1383(2017).
  27. Soto-Heredero, G., Gómez de las Heras, M. M., Gabandé-Rodríguez, E., Oller, J., Mittelbrunn, M. Glycolysis–a key player in the inflammatory response. The FEBS Journal. , (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Polaryzacja makrofagów do fenotypu M1polaryzacja makrofagów do fenotypu M2analiza przepływów zewnątrzkomórkowychnormalizacja oparta na DNAprotokół hodowli makrofagówaktywacja LPSstymulacja IL4fenotypowanie metaboliczne

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.