Kompleksowy, wysokowydajny protokół izolacji, hodowli, polaryzacji i charakterystyki glikolitycznej makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza szczegółowych i kompleksowych metod izolacji, hodowli, polaryzacji i pomiaru glikolitycznego stanu metabolicznego żywych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM). Ten artykuł zawiera instrukcje krok po kroku z realistycznymi ilustracjami wizualnymi dotyczącymi przepływu pracy i oceny glikolitycznej BMDM w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Makrofagi są jednymi z najważniejszych komórek prezentujących antygen. Wiele podzbiorów makrofagów zostało zidentyfikowanych z unikalnymi sygnaturami metabolicznymi. Makrofagi są powszechnie klasyfikowane jako podtypy podobne do M1 (zapalne) i M2-podobne (przeciwzapalne). Makrofagi podobne do M1 to makrofagi prozapalne, które są aktywowane przez LPS i/lub cytokiny prozapalne, takie jak INF-γ, IL-12 i IL-2. Spolaryzowane makrofagi podobne do M1 są zaangażowane w różne choroby, pośrednicząc w obronie gospodarza przed różnymi bakteriami i wirusami. Jest to bardzo ważne dla badania makrofagów podobnych do M1 indukowanych przez LPS i ich stanów metabolicznych w chorobach zapalnych. Makrofagi podobne do M2 są uważane za makrofagi przeciwzapalne, aktywowane przez cytokiny i stymulatory przeciwzapalne. W stanie prozapalnym makrofagi wykazują zwiększoną glikolizę w funkcji glikolitycznej. Funkcja glikolityczną była aktywnie badana w kontekście glikolizy, zdolności glikolitycznej, rezerwy glikolitycznej, glikolizy kompensacyjnej lub kwasowości nieglikolitycznej przy użyciu analizatorów strumienia zewnątrzkomórkowego (XF).

Ten artykuł pokazuje, jak ocenić stany glikolityczne w czasie rzeczywistym za pomocą łatwych do wykonania kroków, gdy makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) oddychają, zużywają i produkują energię. Wykorzystując w tym protokole specyficzne inhibitory i aktywatory glikolizy, pokazujemy, jak uzyskać ogólnoustrojowy i kompletny obraz glikolitycznych procesów metabolicznych w komórkach oraz zapewnić dokładniejsze i bardziej realistyczne wyniki. Aby móc mierzyć wiele fenotypów glikolitycznych, zapewniamy łatwą, czułą, opartą na DNA metodę normalizacji do oceny polaryzacji BMDM. Hodowla, aktywacja/polaryzacja oraz identyfikacja fenotypu i stanu metabolicznego BMDM to kluczowe techniki, które mogą pomóc w badaniu wielu różnych rodzajów chorób.

W tym artykule spolaryzowaliśmy naiwne makrofagi M0 na makrofagi podobne do M1 i M2 odpowiednio za pomocą LPS i IL4, a także zmierzyliśmy kompleksowy zestaw parametrów glikolitycznych w BMDM w czasie rzeczywistym i podłużnie w czasie, używając analizy strumienia zewnątrzkomórkowego oraz aktywatorów i inhibitorów glikolitycznych.

Wprowadzenie

Makrofagi są jednymi z najbardziej krytycznych komórek wrodzonego układu odpornościowego podobnego do M1. Biorą udział w usuwaniu chorób zakaźnych, fagocytozy, prezentacji antygenu i regulacji stanu zapalnego². Co więcej, makrofagi są potrzebne do regulowania innych komórek odpornościowych za pomocą różnych cytokin, które uwalniają³. Istnieje szerokie spektrum fenotypów makrofagów⁴. W zależności od sygnałów, na które narażone są makrofagi, polaryzują się one w kierunku różnych stanów zapalnych i metabolicznych⁵. Makrofagi wykazują zmiany metaboliczne w różnych chorobach, w zależności od tego, w jakiej tkance znajdują się makrofagi⁶. Spolaryzowane makrofagi mają zdolność przeprogramowywania lub przełączania swojego metabolizmu glikolitycznego, metabolizmu lipidów, metabolizmu aminokwasów i mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS)^7,8. Klasycznie aktywowane makrofagi podobne do M1 i alternatywnie aktywowane makrofagi podobne do M2 to dwa najlepiej zbadane fenotypy makrofagów³. Nieaktywowane makrofagi w stanie spoczynku są określane jako makrofagi M0. Polaryzacja makrofagów M0 w kierunku fenotypu podobnego do M1 może być indukowana przez stymulację naiwnych BMDM za pomocą bakteryjnego lipopolisacharydu (LPS)⁹. Szlak sygnałowy PI3K-AKT-mTOR-HIF1a może być aktywowany w makrofagach w obecności cytokin zapalnych, interferonu gamma (IFN γ,) lub czynnika martwicy nowotworu (TNF)10. Makrofagi podobne do M1 mają zwiększony poziom metabolizmu glikolizy, obniżony poziom fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS), wytwarzając cytokiny zapalne zaangażowane w choroby zakaźne i zapalne⁸. Z drugiej strony, polaryzacja w kierunku fenotypu podobnego do M2 może być indukowana przez interleukinę (IL)-4, poprzez szlaki JAK-STAT, PPAR i AMPK lub przez (IL)-13 i TGFβ pathays^11,12.

W przeciwieństwie do makrofagów podobnych do M1, makrofagi podobne do M2 mają zmniejszoną glikolizę i zwiększoną OXPHOS oraz są zaangażowane w działania przeciwpasożytnicze i naprawcze tkanek^8,13. BMDM są szeroko stosowanym systemem do badania makrofagów, które pochodzą z komórek macierzystych szpiku kostnego. Glikoliza i OXPHOS to dwa wiodące szlaki produkcji energii w komórkach¹⁴. W oparciu o swoje mikrośrodowisko, BMDM mogą zdecydować się na użycie jednej z tych ścieżek; W niektórych przypadkach przełącz się z jednej na drugą lub użyj obu ścieżek¹⁴. W tym badaniu skupiliśmy się na metabolizmie glikolizy w aktywowanych makrofagach prozapalnych. Kiedy glukoza w cytoplazmie jest przekształcana w pirogronian, a następnie mleczan, komórki wytwarzają protony w pożywce, które powodują wzrost szybkości zakwaszenia w otaczającym środowisku komórek podobnych do M1⁵. Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego został użyty do pomiaru szybkości zakwaszenia pożywki komórkowej. Wyniki są podawane jako wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) lub wskaźnik wypływu protonów.

Zoptymalizowana, szybka i łatwa metoda dostępu do poziomów glikolizy w spolaryzowanych makrofagach jest niezbędna do określenia fenotypu glikolitycznego, zmian metabolitów oraz wpływu inhibitorów/aktywatorów i leków na spolaryzowane makrofagi. Metoda opisana w tym manuskrypcie została zoptymalizowana w celu dostarczenia informacji o określonych czynnikach glikolizy (glikoliza, pojemność glikoliczna, rezerwa glikoliczna i zakwaszenie nieglikolityczne), a także o metabolicznym przeprogramowaniu metabolizmu glikolitycznego. Inhibitor (2DG), który został użyty w tym badaniu, jest wyraźnie ukierunkowany na szlak glikolizy.

Ten zoptymalizowany protokół został zmodyfikowany i ulepszony w oparciu o połączenie opublikowanego protokołu¹⁶, analizę strumienia zewnątrzkomórkowego testów glikolitycznych w instrukcjach producenta oraz bezpośrednią komunikację z naukowcami z działu badań i rozwoju producenta.

Protokół

Myszy zostały humanitarnie uśmierzone zgodnie z wytycznymi Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC) oraz Amerykańskiego Stowarzyszenia Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (AALAS) oraz przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Naukowych Uniwersytetu Texas A&M (IACUC).

1. Pobieranie szpiku kostnego przez myszy i hodowla BMDM

1. Ofiaruj mysz (myszy C57Bl/6 w wieku 6-10 tygodni były w tym protokole) i połóż ją na jej brzusznej stronie, przetnij skórę i warstwę otrzewną i delikatnie oderwij nogi.
   UWAGA: Użyj ekspozycji na gaz CO₂ do eutanazji myszy.
2. Oddziel obie tylne nogi od biodra w dół, uważając, aby nie przeciąć kości.
3. Umieść całą nogę w pustej stożkowej probówce o pojemności 50 ml (ze stopami skierowanymi do góry, aby łatwo było ją później wyciągnąć) na lodzie i przystąp do zbierania obu nóg od myszy.

2. Ekspozycja kości udowej

UWAGA: Wykonaj następujące kroki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

1. Zbierz kość udową, odcinając kość piszczelową od każdej nogi i usuń jak najwięcej tkanki otaczającej kość udową za pomocą nożyczek i papieru laboratoryjnego.
2. Pobrane, "oczyszczone" kości udowe umieścić na 10-centymetrowej płytce zawierającej kawałek bibuły laboratoryjnej nasączonej pożywką do hodowli tkankowych (TC) lub PBS. Umieść je na lodzie.
3. Kontynuuj pobieranie kości udowych i usuwanie tkanki ze wszystkich kości udowych przed przejściem do etapu płukania (Rysunek 1A).

3. Płukanie szpiku

1. Aby przepłukać szpik z kości udowych, należy użyć strzykawki o pojemności 3 ml wypełnionej pożywką TC lub PBS z igłą 23G. Napełnić strzykawkę przed odsłonięciem szpiku.
2. Użyj nożyczek, aby odsłonić szpik, przecinając sam koniec kości udowej na obu nasadach.
3. Wprowadzić końcówkę igły do kości udowej i delikatnie wypłukać szpik do naczynia o średnicy 10 cm.
4. Przeprowadź igłę przez całą długość kości udowej i spłukuj, aż kolor kości zmieni się na biały. Zwykle większość szpiku można wypłukać za pomocą 2-3 ml pożywki.
5. Wypłucz wszystkie kości udowe i szpik kostny w naczyniu. Użyj igły, aby rozbić wszelkie widoczne grudki. Odcedź szpik do stożkowej probówki o pojemności 50 ml (Rysunek 1A).

4. Liza RBC

1. Wirować szpik przy 190 x g przez 10 min. Odessać supernatant.
2. Zawiesić osad w 4 ml buforu do lizy ACK za pomocą pipety. Pozwól, aby bufor do lizy RBC działał przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Dodać 4 ml pożywki TC RPMI-C 10% (RPMI 1640 -GlutaMAX) uzupełnionej 2-merkaptoetanolem, gentamycyną, streptomycyną i 10% FCS do zawiesiny szpiku i wirować z prędkością 1300 x g przez 10 min.
4. Odcedź ponownie, aby usunąć zanieczyszczenia RBC i ponownie zawiesić w małej objętości RPMI-C 10% w celu zliczenia.
5. Policz komórki za pomocą licznika komórek (Rysunek 1B). Licznik Vi-Cell został użyty do określenia liczby i żywotności komórek w zawiesinie.

5. Poszycie i kultura

1. Dodaj 10 ml RPMI-C 10% + 10 ng/mL M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor, niezbędny regulator proliferacji, różnicowania i przeżycia monocytów/makrofagów) do dowolnej liczby 10 cm płytek.
2. Dodaj odpowiednią objętość zliczonych komórek, tak aby każda płytka o długości 10 cm zawierała 1 x 10⁶ komórek. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C (zdefiniowanej jako dzień 0).
3. W dniu 3 delikatnie dodaj 5 ml świeżego RPMI-C 10% + 10 ng/mL M-CSF do każdej płytki.
   UWAGA: W dniu 7 BMDM powinny być gotowe do testów (Rysunek 1C).

6. Żniwo z talerzy

1. Użyj mikroskopu świetlnego, aby potwierdzić, że większość komórek przylega do płytek.
2. Delikatnie zassać podłoże. Następnie dodaj 3 ml PBS i delikatnie zakręć płytką. Odessaj to dobrze, aby usunąć wszelkie pozostałe nieprzylegające komórki.
3. Dodaj 7-10 ml zimnego PBS do płytki, użyj pipety P1000, aby umyć spód płytek i zbierz wszystkie pozostałe komórki do probówki zbiorczej.
   UWAGA: Trzymaj probówki na lodzie, ponieważ makrofagi bardzo ściśle przylegają i przylegają do wnętrza tuby. Gdyby komórki były zimne, byłyby mniej ściśle przylegające.
4. Komórki wirujące, zliczające i płytkowe do eksperymentów (Rysunek 1D). Stosując cytometrię przepływową, wynikowe komórki powinny być >95% dodatnie dla CD11b i F4/80. (polaryzację makrofagów określono przez barwienie markerami podobnymi do M1 CD38, TNF-a i MCP-1 oraz M2-podobnymi markerami CD206.
   UWAGA: Wykonaj kroki 6.1-6.3 w komorze bezpieczeństwa biologicznego i wykonaj krok 6.4 na blacie stołu. Utrzymuj techniki aseptyczne przez cały czas trwania procedury.

Rysunek 1: Graficzny przebieg pracy hodowli szpiku kostnego myszy z makrofagami pochodzącymi od BM. (A) Pobieranie nóg, odsłonięcie kości udowej i płukanie szpiku; b) liza RBC; C) Posiewanie i hodowla; (D) Pobieranie komórek z płytek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Dzień przed testem analizatora strumienia metabolicznego: wysiewanie i polaryzacja komórek do testu glikolitycznego

1. Rozgrzej analizator strumienia metabolicznego do 37 °C, włączając urządzenie.
2. Uwodnić wkład, dodając 200 μl roztworu Calibrant i inkubować wkład w inkubatorze bez zawartości_{CO2 przez} noc (Rysunek 2A). Wilgotność w inkubatorze bez_{CO2 nie} ma znaczenia dla nawodnienia wkładu.
   1. Na godzinę przed eksperymentem zanurz płytkę kilka razy w górę i w dół, co pomoże usunąć pęcherzyki powietrza.
3. Zaprojektuj mapę płytki w oprogramowaniu w domyślnym teście stresu glikolizy - ostrym wstrzyknięciu, postępując zgodnie z instrukcjami testu.
   1. Kliknij ikonę oprogramowania, a następnie kliknij Test ostrego wstrzyknięcia w stresie glikolizy. Na ikonie definicji grupy wygeneruj nazwy grup.
4. Składa się z pięciu cykli pomiarowych trwających 18 minut i czterech wstrzyknięć. Zmień wstrzyknięcie portu A na glukozę, port B na oligomycynę, port C na rotenon i antymycynę A (Rot / AA), a port D na 2DG.
5. Ponownie zawieś komórki w podłożu RPMI-C 10% i wysiewaj 50 tys. komórek na dołek, z wyjątkiem czterech krawędzi płytki (A1, A12, H1 i H12; Dodać tylko pożywkę, bez komórek) w mikropłytce analizatora strumienia metabolicznego do końcowej objętości 100 μl. Zwykle do przeprowadzenia tego testu wymagane jest co najmniej 40 tys. komórek.
6. Pozostaw komórki w temperaturze pokojowej na 45 minut, aby uniknąć efektu krawędzi komórek. Efekt krawędziowy występuje, gdy podłoże z całego obwodu płytki częściowo odparowuje, co powoduje zmiany objętości i stężenia oraz zmniejsza żywotność komórek.
7. Dodaj 10 ng / ml LPS, aby spolaryzować naiwne makrofagi w kierunku komórek podobnych do M1 i dodaj 20 ng / ml IL-4, aby spolaryzować je w kierunku komórek podobnych do M2. Użyj co najmniej 3 do 6 dołków na warunek (Rysunek 2B).
8. Sprawdzić komórki pod mikroskopem i umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na 24 godziny.

Rysunek 2: Graficzna demonstracja zasiewania i polaryzacji komórek. (A) Konfiguracja analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego i uwodnienie wkładu; (B) Polaryzacja komórek i inkubacja przez noc. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

8. Dzień testu: XF Przygotowanie podłoża i związku

1. Uzupełnij 100 ml pożywki testowej XF RPMI (pH 7,4) z 2 mM glutaminy.
2. Filtruj i sterylizuj media za pomocą systemu filtrów próżniowych 0,2 μm.
3. Umieścić pożywkę do oznaczania w łaźni wodnej o temperaturze 37^°C na 20 minut.
4. Usunąć posiane komórki z inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Dwukrotnie przemyć komórki pożywką do oznaczania i zastąpić poprzednią pożywkę pożywką do końcowej objętości 180 μl.
5. Użyj mikroskopu, aby upewnić się, że wszystkie studzienki mają zlewające się komórki i zaznacz wszystkie studzienki, które mają zadrapania od pipetowania. Jeśli są jakieś zadrapania, usuń tę płytkę przed analizą.
6. Umieść płytkę zawierającą komórki w inkubatorze bez emisji_CO2 na 45 minut (Rysunek 3A).
7. Wykorzystanie związków i pożywki do oznaczania do wytworzenia roztworów podstawowych glukozy (100 mM), oligomycyny (100 μM), Rot/AA (50 μM) i 2DG (500 mM) (Tabela 1).
8. Wykonać 10-krotną mieszaninę do wstrzykiwań każdego związku za pomocą pożywki do oznaczania (Tabela 2).

pkt. szt.

Zapasy iniekcyjne (dostarczane w zestawach)	Dodać kompletną pożywkę do oznaczania (ml)	Końcowe stężenie zapasów (μM)
glukoza	3	100 tys.
Oligomycyna	0,72	100
2-DG	3	100 tys.

Tabela 1. Zapasy iniekcyjne

Porty na kartridżu	Roztwory podstawowe	Dodawanie wolumenu zapasów	Dodawanie pożywki testowej	Końcowe stężenie iniekcji (10x)	Dodaj ten wolumin do wyznaczonego portu (μL)	Końcowe stężenie po wstrzyknięciu do każdej studzienki
ZA	Glukoza (100 mM)	3000 μL + 0 μL		100 mM	20	10 mM
W	Oligomycyna (100 μM)	300 μL + 2700 μL		10 μM	22 Rozdział 22	1,0 μM
Z	Rotenon/ Antymycyna A (50 μM)	300 μL + 2700 μL		5 μM	25	0,5 μM
D	2-DG (500 mM)	300 μL + 0 μL		500 mM	28	50 mM

Tabela 2. Końcowe stężenia wtrysku

9. Dzień testu: Przeprowadzenie ostrego testu glikolitycznego na spolaryzowanych makrofagach

1. Otwórz zapisany szablon testu stresu glikolizy (ostra iniekcja) z oprogramowania. Domyślny test ostrego stresu gliko-stresowego obejmuje 3 minuty mieszania i pomiaru przed każdym wstrzyknięciem.
2. Sprawdź szablon i szczegóły testu, a gdy będziesz gotowy, kliknij Uruchom i postępuj zgodnie z instrukcjami domyślnego testu. Jednak wszystkie parametry można dostosować.
3. Wyjmij wkład czujnika z inkubatora bez_CO2, zdejmij pokrywę i włóż do przyrządu w taki sposób, aby wgłębienie A1 płytki wkładu wpadło w lewy górny róg panelu wkładania urządzenia. Zazwyczaj kalibracja trwa od 20 do 45 minut.
4. Po zakończeniu kalibracji urządzenie wysunie płytkę zawierającą roztwór kalibru i przytrzyma wkład czujnika. Usuń kaliber zawierający płytkę.
5. Wyjmij płytkę celi z inkubatora bez emisji_CO2, zdejmij pokrywę płytki i włóż ją do urządzenia. Kliknij na Uruchom (Rysunek 3B).
6. Po zakończeniu testu maszyna wysunie płytkę ogniwa i wkład czujnika.
7. Wyjąć podłoże z płytki i zamrozić je w temperaturze -20 °C w celu dalszej normalizacji.
8. Użyj komercyjnego zestawu do testowania proliferacji komórek (np. CyQUANT) do normalizacji komórek.
9. Dodaj 1 ml związku B lub buforu do lizy do 19 ml wody destylowanej bez nukleaz.
10. Dodać 100 μl roztworu roboczego Związku A lub GR do wyżej wymienionego roztworu.
11. Upewnij się, że komórki na płytce są rozmrożone, a następnie dodaj 200 μl roztworu do każdej studzienki.
12. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
13. Zmierz fluorescencję w długościach fal wzbudzenia 480 nm i emisji 520 nm za pomocą czytnika płytek.
14. Znormalizuj komórki w panelu normalizacji oprogramowania.
15. Normalizuj komórki na podstawie liczby komórek pierwotnych makrofagów (Rysunek 3C). Rozważ średnią naiwnych makrofagów jako 1 (dzieląc liczbę komórek każdej studzienki przez średnią liczbę komórek naiwnych makrofagów) i zastosuj je do wszystkich makrofagów.

Rysunek 3: Dzień testu: przygotowanie podłoża i związku oraz przeprowadzenie testu. (A) Przygotowanie komórek do testu; (B) przygotowanie, kalibracja i przeprowadzenie testu związków; (C) Normalizacja i analiza danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Glikoliza i mitochondrialna fosforylacja oksydacyjna to dwie główne ścieżki produkcji ATP w komórkach (Rysunek 4A). Niektóre komórki mają zdolność przełączania się między tymi dwoma ścieżkami, aby zaspokoić swoje zapotrzebowanie na energię. Konwersja glukozy do pirogronianu w cytoplazmie nazywana jest glikolizą. Pirogronian ma dwa losy; zostanie albo przekształcony w mleczan, albo dalej metabolizowany w cyklu TCA i ostatecznie przez łańcuch transportu elektronów (ETC) ...

Dyskusja

Jak wspomniano wcześniej, analizator strumienia zewnątrzkomórkowego może dostarczać w czasie rzeczywistym informacji o dwóch głównych szlakach wytwarzania energii w komórkach, mierząc OCR (wskaźnik zużycia tlenu), wskaźnik aktywności mitochondrialnej OXPHOS i ECAR (wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego), który jest wskaźnikiem glikolizy. Makrofagi mogą wykorzystywać obie ścieżki, w zależności od ich mikrośrodowiska. Mogą również zmieniać swoje ścieżki produkcji energii^17,18

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igły 23G	VWR	BD305145
2-merkaptoetanol	Life Technologies	21985023
50ml Rurka stożkowa	VWR	21008-951
ACK Bufor do lizy	Thermo Fisher Scientific	A1049201	Może to być laboratoryjny
zestaw do testów wytrzymałościowych glikolizy Agilent Seahorse XF	Agilent Technologies	103020-100
Instrukcja obsługi zestawu do testów wysiłkowych glikolizy Agilent Seahorse XF	Agilent Technologies	103020-400
Zestaw do oznaczania szybkości glikolitycznej Agilent Seahorse XF	Agilent Technologies	103344-100
Instrukcja obsługi zestawu do oznaczania szybkości glikolity Agilent Seahorse XF	Agilent Technologies	103344-100
Alexa Fluor 488 przeciwciało anty-mysie CD206 (MMR)	BioLegend	141710
przeciw myszom CD11b eFluor450 100ug	eBioscience	48-0112-82
BD 3ML - STRZYKAWKA	VWR		Dopuszczalne są również inne strzykawki
Licznik komórek-Vi-CELL- Kompletny system XR	BECKMAN COULTER Life Sciences	731050	Komórki można również liczyć ręcznie
Sitko do komórek-70µ m	VWR	10199-656
CyQUANT Zestaw do oznaczania proliferacji komórek	Thermo Fisher Scientific	C7026
F4/80 przeciwciało monoklonalne (BM8) pe-cyjaninina7	eBioscience	25-4801-82
Płodowa surowica bydlęca	Life Technologies	16000-044
Cytometr przepływowy: BD LSFRFortessa X-20	BD	656385
Kim Wipes	VWR	82003-822
LPS-SM ultraczysty (tlrl-smpls) 5 mg	Invivogen	tlrl-smlps
MCSF	Peprotech	315-02
Mysi IL-4	Peprotech	214-14
PE Szczur Anti-Mouse CD38	BD Biosciences	553764
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140122
Szalka Petriego 100mm x 15 mm	Fisher Scientific	F80875712
RPMI, Glutamax, HEPES	Invitrogen	72400-120
Seahorse Calibrant Solution	Agilent Technologies	103059-000
Seahorse XF 200mM Roztwór glutaminy	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF Zestaw do oznaczania szybkości glikolitycznej	Agilent Technologie	103344-100
Seahorse XFe96 FluxPaks	Agilent Technologies	102416-100
XF Zestaw do testów wytrzymałościowych glikolizy	Agilent Technologies	103020-100
XF RPMI Medium, pH 7,4 bez fenolu Czerwony	Agilent Technologies	103336-100