Nowoczesne urządzenie rozgrzewające/ograniczające do skutecznych iniekcji żył ogonowych w mysim modelu sepsy grzybiczej

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy skuteczną i efektywną metodę wstrzykiwania żył ogonowych gryzoni za pomocą unikalnie zaprojektowanego urządzenia rozgrzewającego/krępującego. Usprawniając inicjację procesów rozszerzania naczyń krwionośnych i ograniczania, protokół ten umożliwia dokładne i terminowe wstrzyknięcia dożylne dużym grupom zwierząt przy minimalnym stresie.

Streszczenie

W modelach gryzoni, iniekcje do żył ogonowych są ważnymi metodami dożylnego podawania środków eksperymentalnych. Zastrzyki do żył ogonowych zazwyczaj obejmują ogrzewanie zwierzęcia w celu rozszerzenia naczyń krwionośnych, co pomaga zarówno w identyfikacji naczyń krwionośnych, jak i umieszczeniu igły w świetle naczynia, jednocześnie bezpiecznie krępując zwierzę. Chociaż iniekcje do żył ogonowych są powszechnymi procedurami w wielu protokołach i nie są uważane za wysoce techniczne, jeśli są wykonywane prawidłowo, dokładne i konsekwentne zastrzyki mają kluczowe znaczenie dla uzyskania powtarzalnych wyników i zminimalizowania zmienności. Konwencjonalne metody wywoływania rozszerzenia naczyń krwionośnych przed wstrzyknięciem żył ogonowych zazwyczaj zależą od użycia źródła ciepła, takiego jak lampa grzewcza, elektryczne/ładowalne poduszki grzewcze lub wstępnie podgrzana woda o temperaturze 37 °C. Pomimo tego, że narzędzia te są łatwo dostępne w standardowych warunkach laboratoryjnych, wyraźnie cierpią z powodu słabej/ograniczonej zdolności termoregulacyjnej. Podobnie, chociaż różne formy urządzeń krępujących są dostępne na rynku, muszą być one używane ostrożnie, aby uniknąć urazów u zwierząt. Te ograniczenia obecnych metod tworzą niepotrzebne zmienne w eksperymentach lub skutkują różnymi wynikami między eksperymentami i/lub laboratoriami.

W tym artykule pokazujemy ulepszony protokół wykorzystujący innowacyjne urządzenie, które łączy niezależne, regulowane termicznie, ogrzewające urządzenie z regulowaną jednostką ograniczającą w jeden system do efektywnego, usprawnionego wstrzykiwania żył ogonowych. Przykładem, którego używamy, jest dożylny model grzybiczego zakażenia krwi, które prowadzi do sepsy. Aparat grzewczy składa się z odbijającej ciepło akrylowej skrzynki zainstalowanej z regulowanym automatycznym termostatem w celu utrzymania temperatury wewnętrznej na ustalonym progu. Podobnie, szerokość i wysokość stożka przytrzymującego stożek można regulować, aby bezpiecznie dostosować się do różnych rozmiarów gryzoni. Dzięki zaawansowanym i wszechstronnym funkcjom urządzenia, przedstawiona tutaj technika może stać się użytecznym narzędziem w wielu obszarach badawczych obejmujących modele gryzoni, które wykorzystują iniekcje do żył ogonowych.

Wprowadzenie

Wykorzystanie modeli zwierzęcych z udziałem gryzoni było podstawą badań biomedycznych. Liczne szczepy wsobne i niekrewniacze, a także linie genetycznie modyfikowane, są dostępne i rutynowo stosowane w laboratoriach na całym świecie. Iniekcja do żyły ogonowej jest jedną z podstawowych metod w modelach gryzoni wymagających dożylnego (dożylnego) podawania środków eksperymentalnych. Ogólnie rzecz biorąc, iniekcje dożylne mają duże zalety w porównaniu z innymi drogami podawania, takie jak wysokie wskaźniki wchłaniania poprzez ominięcie lokalnych tkanek i przewodu pokarmowego oraz wysoka tolerancja na roztwory o szerokim zakresie stężeń lub niefizjologiczne pH^1,2,3,4. Wśród innych żywotnych dróg dożylnych (np. żyły odpiszczelowe, zatoki żylne zaoczodołowe), żyły ogonowe są uważane za najbezpieczniejsze i najłatwiej dostępne naczynie krwionośne u gryzoni^2,3,5,6. W związku z tym iniekcja żył ogonowych jest szeroko stosowana w wielu modelach gryzoni, w tym w modelach chorób zakaźnych^7,8,9, transplantacja materiałów biologicznych^10,11, ocena terapii przedklinicznych^12,13 oraz analizy toksykologiczne^14,15.

Konsekwencja i dokładność dawkowania są kluczowym wymogiem w udanych iniekcjach do żył ogonowych. Co zaskakujące, ilościowa i jakościowa ocena iniekcji do żył ogonowych w literaturze sugeruje częste błędne iniekcje^16,17. Badanie wykazało, że dwanaście z trzydziestu wstrzyknięć wykonanych przez przeszkolonych wstrzykiwaczy pozostawiło ponad 10% wstrzykniętych dawek w tail¹⁸. Ponadto bezpieczeństwo i komfort zwierzęcia otrzymującego zastrzyki do żył ogonowych powinno być głównym problemem podczas zabiegu. Niewłaściwe unieruchomienie może prowadzić do urazów i szeregu patologii związanych ze stresem (np. utrata masy ciała, upośledzona odpowiedź immunologiczna), które mogą wprowadzać istotne zmienne w jakości próbki^19,20. Błędy te mogą powodować zwiększoną zmienność danych i słabą odtwarzalność, wpływając w ten sposób negatywnie na wyniki badania.

Indukcja rozszerzenia naczyń krwionośnych u zwierzęcia jest często konieczna podczas wykonywania iniekcji do żyły ogonowej ze względu na małą średnicę naczynia, szacowaną na 300 μm u myszy²¹. Rozszerzenie naczyń krwionośnych poprawia widoczność żył ogonowych i pomaga w osiągnięciu optymalnego ułożenia igły-żyła w świetle żylu. Laboratoria opisały różne metody, takie jak zanurzenie ogona w ciepłej wodzie²², ogrzewanie ogona za pomocą ciepłej zasłony, lampy lub suszarki do włosów^23,24, lub umieszczenie zwierzęcia w ciepłym otoczeniu za pomocą poduszki grzewczej, inkubatora lub pudełka połączonego z jednym z tych źródeł ciepła²⁵. Urządzenia mogą być wykonane samodzielnie do określonych celów lub dostępne u dostawców komercyjnych. Jednak wielu z nich nie ma zdolności termoregulacyjnych, a jeśli w ogóle, temperatura urządzenia jest źle utrzymywana i często podlega wahaniom temperatury pokojowej. Podobnie, użycie urządzenia krępującego jest konieczne w przypadku iniekcji do żyły ogonowej, ponieważ stosowanie znieczulenia nie jest zalecane^26,27. Opracowano kilka rodzajów urządzeń krępujących specyficznych dla laboratoriów lub komercyjnych. Zazwyczaj zwierzę umieszcza się w jednorazowej stożkowej tubie o pojemności 50 ml⁴, szczelinowych ściankach z pleksiglasu, tunelu lub stożku ²⁸, z których wszystkie pozwalają na duże odsłonięcie ogona, jednocześnie ograniczając ruchy zwierzęcia. Jednak większość ograniczników ma ograniczenia rozmiarowe ze względu na sztywność materiałów. Co więcej, nowoczesne urządzenia o wysokim stopniu złożoności, pomimo praktycznych i wyrafinowanych konstrukcji, nie wydają się być wykonalne do wstrzykiwań z udziałem dużych grup zwierząt²².

Mysie modele infekcji krwi i związanej z nią sepsy są doskonałym przykładem sytuacji wymagających użycia tej techniki. Spośród wszystkich mikrobiologicznych etiologii ciężkiej klinicznej sepsy, sepsa grzybicza jest często stanem śmiertelnym, ze śmiertelnością na poziomie >40% pomimo terapii przeciwgrzybiczej²⁹. W rzeczywistości zakażenie Candida albicans zostało zgłoszone jako czwarta najczęstsza przyczyna szpitalnego zakażenia krwi (kandydemia)^30,31. W kandydozie wewnątrzbrzusznej mikroorganizmy w przewodzie pokarmowym mogą rozprzestrzeniać się przez krwiobieg i powodować posocznicę wielodrobnoustrojową z jeszcze większą śmiertelnością^32,33,34. Ponieważ większość przypadków kandydemii szpitalnej wynika z zanieczyszczonych cewników linii centralnej lub urządzeń medycznych na stałe^35,36, inokulacja dożylna C. albicans przez wstrzyknięcie żyły ogonowej może ściśle odzwierciedlać rozwój sepsy u ludzi i była podstawową metodą w mysim modelu hematogennie rozsianej kandydozy^37,38. W tym modelu śmiertelność wyrażona w dniach może zostać wydłużona lub skrócona, dostosowując inokulum C. albicans i.v. class^39,40,41.

Ostatnio nasze laboratorium opracowało innowacyjny protokół optymalnie usprawnionego wstrzykiwania żyły ogonowej za pomocą innowacyjnego urządzenia wyposażonego w termoregulowaną jednostkę grzewczą, połączoną z regulowaną jednostką ograniczającą, w jednym wygodnym systemie. Protokół ten pozwala naukowcom na wykonywanie iniekcji do żył ogonowych w dokładny i terminowy sposób, podczas gdy zwierzęta mogą być bezpiecznie kondycjonowane i przytrzymywane do zabiegu przy minimalnym stresie. Zademonstrowane tu techniki, z wykorzystaniem zaawansowanego urządzenia ocieplającego i krępującego, mogą posłużyć jako użyteczne narzędzie w różnych obszarach badawczych wykorzystujących modele gryzoni.

Protokół

Wszystkie protokoły dla zwierząt, w tym wstrzykiwanie żył ogonowych i stosowanie urządzenia rozgrzewającego/krępującego, zostały sprawdzone i zatwierdzone przez lokalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (IACUC).

1. Przygotowanie

1. Zwierzęta należy zaaklimatyzować w pomieszczeniach inwentarskich przez co najmniej 1 tydzień i zapewnić im jedzenie i wodę ad libitum.
   UWAGA: Dla większości nowych użytkowników tej techniki wstrzykiwania preferowane mogą być odmiany zwierząt o białym lub jasnym futrze, ponieważ żyły ogonowe są łatwo widoczne przez skórę. Ciemne szczepy myszy (np. C57BL/6) lub szczurów (np. Brown Norway) mają głęboko pigmentowane ogony, co skutkuje słabym kontrastem kolorystycznym z żyłą. Zdecydowanie zaleca się, aby nowi użytkownicy przeszli odpowiednie szkolenie do momentu osiągnięcia biegłości.
2. Środki do iniekcji żył ogonowych
   1. Przygotować wszystkie badane czynniki i roztwory w sposób aseptyczny. Podczas podawania organizmów lub materiałów komórkowych należy zachować środki ostrożności na wszystkich etapach przetwarzania, aby utrzymać warunki wolne od pirogenów.
   2. Do wstrzykiwania żyły ogonowej należy używać wyłącznie soli fizjologicznej (0,9% w/v chlorku sodu) lub zrównoważonych roztworów soli, takich jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), jako nośników do wstrzykiwań do żyły ogonowej.
      UWAGA: Nigdy nie używaj wody, oleju ani lepkich roztworów ze względu na potencjalne ryzyko uszkodzenia naczyń krwionośnych. Szeroki zakres pH (4,5–8,0) jest tolerowany ze względu na buforujące działanie krwi i szybkie tempo przepływu krwi u gryzoni. Jednak silnie kwaśne lub zasadowe roztwory mogą powodować niepotrzebne uszkodzenie tkanek w miejscu wstrzyknięcia i należy tego unikać.
   3. Należy ograniczyć objętość i częstotliwość wstrzykiwania do minimum. Stosować zalecane objętości dla myszy i szczurów (odpowiednio ≤200 μl i ≤500 μl) w temperaturze ciała przed wstrzyknięciem, aby zminimalizować stres u zwierzęcia³.
   4. Upewnić się, że każde przygotowanie strzykawki i igły jest wolne od pęcherzyków powietrza w roztworze; jeśli pęcherzyki są obecne, należy je całkowicie oczyścić, aby zapobiec ryzyku zatoru.
      UWAGA: Zazwyczaj strzykawki o pojemności 1 ml z igłami 27 G, 1/2 cala są odpowiednie do większości wstrzyknięć do żył ogonowych.
   5. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE) wymaganych przez lokalny IACUC z minimalną ilością jednorazowych lub dedykowanych fartuchów oraz rękawic lateksowych lub nitrylowych. Stosowanie okularów ochronnych jest wysoce zalecane podczas wykonywania iniekcji do żyły ogonowej.
3. Urządzenie rozgrzewające i przytrzymujące
   1. Przed użyciem dokładnie sprawdź wszystkie komponenty, aby upewnić się, że urządzenie jest wolne od jakichkolwiek wad (Rysunek 1).
   2. Inicjalizacja urządzenia grzewczego (Rysunek 2A)
      1. Umieść urządzenie grzewcze na czystym, płaskim blacie i włącz urządzenie. Upewnij się, że wskaźnik zasilania termostatu lamp świeci na zielono. Umieść materiały ściółkowe w komorze grzewczej, aby obszar był suchy i zatrzymywał ciepło.
   3. Konfiguracja urządzenia przytrzymującego (Rysunek 2B)
      1. Umieść jednostkę przytrzymującą obok jednostki grzewczej i określ odpowiednie rozmiary stożków dla zwierzęcia. W razie potrzeby ręcznie wyreguluj szerokość podstawy giętkiego aluminiowego stożka, aby zapewnić zwierzęciu odpowiednie unieruchomienie. Alternatywnie zastąp stożek modelami dopasowanymi na zamówienie, aby pomieścić myszy lub szczury o różnych rozmiarach ciała.

2. Iniekcja żyły ogonowej

1. Regulacja aparatury
   1. Ustawianie temperatury wewnętrznej
      1. Za pomocą pokrętła sterującego ustaw termostat na żądaną temperaturę. Upewnij się, że wskaźnik grzejnika świeci na czerwono i że żarówka się świeci. Uważnie monitoruj wyświetlacz temperatury wewnętrznej, gdy żarówka jest zapalona (ogrzewanie). Termostat automatycznie dezaktywuje żarówkę po osiągnięciu temperatury docelowej, około 10–15 min.
         UWAGA: Ustawienie temperatury wyższej niż temperatura otoczenia aktywuje grzałkę. Ogólnie rzecz biorąc, zalecana temperatura w pomieszczeniu w standardowych warunkach wiwarium waha się od 20 do 26 °C, podczas gdy neutralna (tj. komfortowa) temperatura dla myszy laboratoryjnych wynosi od 30 do 32 °C⁴². Dlatego zaleca się, aby temperatura wewnętrzna komory grzewczej była nieco wyższa niż termoneutralność, w przybliżeniu 32–36 °C. Nigdy nie ustawiaj termostatu powyżej temperatury ciała.
   2. Ustawianie platformy przytrzymującej
      1. Za pomocą pokrętła regulacji wysokości dostosuj wysokość stożka do optymalnego poziomu dla użytkownika.
2. Obróbka cieplna (Rysunek 3A)
   1. Po osiągnięciu temperatury docelowej (32–36 °C) delikatnie przenieść zwierzęta z klatki do komory grzewczej.
      UWAGA: Obróbka cieplna przez 5–10 minut jest wystarczająca, aby wywołać rozszerzenie naczyń krwionośnych i poprawić widoczność żył ogonowych. Jednak zwierzęta mogą być bezpiecznie trzymane w komorze termoregulowanej przez cały czas trwania zabiegu (zwykle 20-30 minut bez oznak hipertermii). W komorze grzewczej może bezpiecznie pomieścić 4–6 myszy lub jednego szczura.
   2. Monitoruj zwierzę pod kątem wszelkich oznak ostrego stresu cieplnego (np. szybkiego oddychania, letargu, ucieczki podczas skakania).
      UWAGA: Zwierzęta wykazujące objawy hipertermii powinny zostać ponownie umieszczone w klatce i monitorowane do momentu wznowienia normalnej aktywności przed ponownym użyciem. Jeśli jest to spowodowane przekroczeniem optymalnego zakresu temperatury wewnętrznej, upewnij się, że urządzenie grzewcze jest wyłączone.
3. Etapy wtrysku
   1. Podnieś zwierzę za podstawę ogona i wyjmij je z komory grzewczej. Wprowadzić zwierzę do otworu w kształcie stożka jednostki przytrzymującej.
      UWAGA: Nigdy nie podnoś myszy z ogona; Może to spowodować poważne obrażenia. W przypadku myszy otyłych lub ciężarnych należy stosować alternatywne metody postępowania z nimi²⁸.
   2. Gdy zwierzę chwyta się przednimi kończynami dalszej krawędzi stożka, delikatnie pociągnij ogon do tyłu i przełóż ogon przez otwartą szczelinę. Zabezpiecz tylny koniec zwierzęcia u podstawy stożka tak, aby jedna tylna noga wystająca ze stożka była pokazana w pozycji godziny 12. Każda tylna noga może być wysunięta, ponieważ istnieją dwie boczne żyły, po jednej z każdej strony (Ryc. 3B).
   3. Chwyć ogon od połowy do dwóch trzecich długości ręką niedominującą między kciukiem a palcem wskazującym, lekko napinając żyłę boczną, aby utrzymać pozycję ogona i rozszerzenie naczyń krwionośnych.
      UWAGA: Zwiększona widoczność rozszerzonych żył dzięki obróbce cieplnej umożliwia użytkownikowi szybkie określenie miejsca wstrzyknięcia w celu uzyskania najlepszych wyników (Rysunek 4).
   4. Przetrzeć skórę w miejscu wstrzyknięcia gąbką z gazy lub podkładką zwilżoną 70% alkoholem. Czyść tak delikatnie i szybko, jak to możliwe, aby uniknąć podrażnień ogona.
      UWAGA: Procedura ta może zostać pominięta według uznania instytucjonalnego IACUC.
   5. Trzymać strzykawkę ręką dominującą i ustawić igłę równolegle do ogonka. Wbij igłę w kierunku przepływu krwi, skoś pod kątem 10–15° (Ryc. 5A–B) i się dalej w głąb światła żyły, penetrując 2–4 mm ( Rysunek 5C–D). Powoli wstrzykiwać roztwór.
      UWAGA: Jeśli wstrzyknięcie się powiedzie, nie powinien być wyczuwalny żaden opór na tłoku, a płyn może być widoczny przepływający przez żyłę. W przypadku oporu lub białych pęcherzy powyżej miejsca wstrzyknięcia, należy usunąć igłę i podjąć próbę drugiego wstrzyknięcia w miejsce powyżej pierwotnego umieszczenia igły. Nie należy próbować wstrzykiwać leku poniżej początkowego miejsca wstrzyknięcia, ponieważ płyn będzie uwalniany przez miejsce początkowe. Jeśli wstrzyknięcie jednej żyły bocznej nie powiedzie się, należy przestawić zwierzę na przeciwną stronę i podjąć więcej prób na żyle przeciwległej. Maksymalna liczba prób zależy od miejsca, w którym rozpoczyna się próbę wstrzyknięcia wzdłuż żyły i obrzęku, który może wystąpić w przypadku nieudanych prób. Zapoznaj się z instytucjonalnymi przepisami IACUC w przypadku błędnych wstrzyknięć i związanych z nimi urazów.
   6. Wyjąć igłę i mocno docisnąć kciukiem, aby zapobiec cofaniu się wstrzykniętego roztworu i (lub) krwi. Kontynuuj delikatne uciskanie czystą gazą/chusteczką lub chusteczką, aż krwawienie ustanie (Rysunek 6).
   7. Umieść zwierzę z powrotem w klatce i monitoruj przez co najmniej 5 minut. Upewnij się, że zwierzę wznowiło normalną aktywność bez dalszego krwawienia.

3. Mysi model grzybiczego zakażenia krwi i sepsy

1. Szczepy myszy
   1. Aklimatyzuj samice szwajcarskich myszy niehodowlanych Webster w wieku 6 tygodni zgodnie z instytucjonalnie zalecanymi wytycznymi. Alternatywnie, użyj szczepów wsobnych/genetycznie zmodyfikowanych (np. tło C57BL/6) dla tego protokołu ze zmodyfikowanymi inokulantami (patrz UWAGA).
      UWAGA (zobacz Dyskusję w celu uzyskania szczegółów): Żyły ogonowe myszy z ciemnym futrem są często mniej widoczne niż tych z jaśniejszym futrem ze względu na głęboko pigmentowany ogon (Rysunek 4). Istnieje różna podatność na sepsę/śmiertelność grzybicza wśród różnych szczepów myszy. Wykorzystanie szczepów myszy innych niż Swiss Webster może wymagać dodatkowej optymalizacji protokołu poprzez uwzględnienie odpowiednich czynników (np. tła genetycznego, wieku, płci, wielkości ciała), które mogą wpływać na status immunologiczny gospodarza. Na przykład śmiertelne wyzwanie u myszy C57BL/6 zazwyczaj wymaga wyższej dawki szczepionki (do 10 razy), aby osiągnąć poziom śmiertelności obserwowany u szwajcarskich myszy Webster.
2. mikroorganizmy
   1. W przypadku śmiertelnego prowokacji (sepsa) zamrożone zapasy Candida albicans szczep DAY185 (lub szczepy z wyboru) należy umieścić na agarze z dekstrozą Sabouraud i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2 dni.
   2. Przenieść pojedynczą kolonię do 10 ml bulionu z ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą i hodować do stacjonarnej fazy wzrostu przez 18 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem.
3. Roztwory inokulum
   1. W dniu śmiertelnego wyzwania zbierz kulturę bulionową i umyj osad 3 razy przez odwirowanie (800 × g) w sterylnym PBS.
   2. Zidentyfikuj żywe komórki drożdży przez wykluczenie niebieskiego barwnika trypana i policz za pomocą hemocytometru. Dostosuj stężenie komórek do 1 x 10⁶ komórek/ml w sterylnym PBS w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Każde zwierzę otrzyma 100 μL roztworu inokulum. Przygotować nadmiar objętości inokulum (>500 μl), aby umożliwić potencjalną utratę podczas procedury wstrzykiwania. Końcowe inokulum to 1 x 10⁵ komórek na mysz. Objętość inokulum można zwiększyć do 200 μl, odpowiednio dostosowując stężenie komórek.
      UWAGA: Roztwór inokulum grzybów musi być przechowywany w temperaturze pokojowej przed wstrzyknięciem. Podgrzanie roztworu inokulum do temperatury ciała może wywołać zmianę morfologiczną z komórek drożdży na strzępki. Z drugiej strony, podawanie w bolusie dożylnym roztworów zimna może szybko obniżyć temperaturę ciała zwierzęcia i należy tego unikać.
4. Inokulacja dożylna
   1. Ogrzać zwierzęta i wywołać rozszerzenie naczyń krwionośnych, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w punkcie 2.
   2. Wstrzyknąć 100 μl roztworu inokulum do żyły ogonowej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 27 G, 1/2 cala.
5. Monitorowanie po inokulacji
   1. Monitoruj zwierzęta pod kątem następujących oznak zachorowalności wywołanej sepsą: i) aspekt sierści (np. gładka, potargana), ii) aktywność (np. swobodne poruszanie się, brak reakcji), iii) postawa (np. zgarbiony, sztywny), iv) zachowanie (np. powolne, brak przemieszczenia), v) ruchy klatki piersiowej (np. normalny oddech, duszność), vi) powieki (np. otwarte, zamknięte)⁴³.
6. Ocena sepsy
   1. Oceń zaobserwowaną chorobowość zgodnie ze zmodyfikowanym wynikiem oceny klinicznej sepsy u myszy (M-CASS) w czteropunktowej skali ocen od 0 do 3 w każdej kategorii: 0, normalna; 1, łagodna; 2, umiarkowana; 3, ciężka⁴³.
7. Protokół fakultatywny: Szczepienie przeciwko posocznicy grzybiczej
   1. Czternaście dni przed śmiertelnym wyzwaniem zaszczepić myszy szczepem Candida dubliniensis Wü284 lub atenuowanymi szczepami C. albicans, takimi jak mutant Δefg1 / Δcph1 (1x10⁵ komórek na mysz), jak opisano w sekcjach 3.2–3.4 zamiast C. albicans DAY185.
   2. Przeprowadzić śmiertelną prowokację u zaszczepionych myszy, jak opisano w punktach 3.2–3.4, i monitorować objawy chorobowości wywołanej sepsą opisane w punktach 3.5–3.6.

Wyniki

Temperatura wewnątrz komory grzewczej jest stale wykrywana przez wewnętrzny czujnik i automatycznie regulowana przez termostat. Po pierwsze, pokrętło sterujące termostatu zostało ustawione na 78, 85, 90 lub 95 °F (26, 29, 32 lub 95 °C), aby wybrać ustawione temperatury. Po włączeniu grzałki (Rysunek 7, żółte kropki), emisja ciepła przez żarówkę gwałtownie podniosła temperaturę wewnętrzną w ciągu pierwszych 5–15 minut, w zależności od ustawionej temperatury. Grzałka dezaktywowała żarówkę, jeśli wykryta temperatura wewnętrzna przekroczyła ustawioną temperaturę (szare kropki). Początkowe temperatury szczytowe powinny wzrosnąć do 5–7 °C powyżej ustawionych temperatur we wszystkich grupach, aby zrównoważyć utratę temperatury podczas przenoszenia zwierząt. Następnie urządzenie automatycznie powtarza cykl grzewczy i utrzymuje komorę grzewczą w ustawionej temperaturze.

Przykład danych eksperymentalnych uzyskanych przez udane iniekcje do żył ogonowych przy użyciu obecnego protokołu jest pokazany w Rysunek 8. W mysim modelu kandydozy krwioobiegu skutkującej sepsą, prowokacja dożylna Candida albicans (1 x 10⁵ komórek na mysz) u szwajcarskich myszy Webster spowodowała szybki początek sepsy i rozprzestrzenianie się organizmów, prowadząc do wysokiej śmiertelności w ciągu 3-4 dni (otwarte kropki) (Figura 8A). W przeciwieństwie do tego, zwierzęta mogą być chronione przed sepsą poprzez wcześniejsze dożylne szczepienie wstępne/szczepienie szczepem drożdży awirulentnych, Candida dubliniensis, osiągając >95% przeżycia po śmiertelnym prowokacji dożylnie zjadliwym C. albicans (stałe kropki). Te wyniki w postępującej śmiertelności w porównaniu z ochroną za pośrednictwem szczepionki uzyskano w sposób powtarzalny w czterech niezależnych eksperymentach (Rysunek uzupełniający 1). Podobną ochronę można osiągnąć przy użyciu innych awirulentnych szczepów drożdży, takich jak atenuowane mutanty C. albicans (Δefg1/Δcph1) (dane nie pokazane). Sepsa może być również monitorowana i skorelowana ze śmiertelnością; nieszczepione zwierzęta ze śmiertelną infekcją miały znaczny wzrost zachorowalności wywołanej sepsą, podczas gdy grupa szczepiona wykazywała minimalne objawy po śmiertelnym prowokacji (Figura 8B).

Rysunek 1: Opis urządzenia do ogrzewania i krępowania gryzoni. (A) przedstawia widok zewnętrzny urządzenia grzewczego, które składa się z:

1. Osłona termostatu – podnieś do góry za uchwyt, aby odsłonić termostat
2. Obudowa elektryczna – trwale uszczelniona dla ochrony
3. Pokrywa komory – podnoszona do góry podczas przenoszenia zwierzęcia do/z
4. Komora grzewcza – wyjmowana, przed użyciem przykryj podłogę pościelą
5. Urządzenie przytrzymujące – chowane razem z urządzeniem grzewczym, gdy nie jest używane
6. Włącznik zasilania – wbudowany przełącznik kołyskowy dla głównych funkcji włączania/wyłączania
7. Przewód zasilający – napięcie/prąd: 120V/10A

(B) pokazuje wnętrze urządzenia grzewczego:

1. Żarówka – moc świetlna 100 W
2. Osłona ochronna żarówki – zdejmowana w celu wymiany żarówki
3. Sonda czujnika temperatury – umieszczona wewnątrz komory
4. Wewnętrzny termometr temperatury – umieszczony wewnątrz komory w celu monitorowania temperatury

(C) pokazuje elementy termostatu urządzenia grzewczego:

1. Termometr temperatury wewnętrznej
2. Termostat – automatycznie reguluje pracę grzałki
3. Dźwignia regulacji wartości zadanej – minimalna/maksymalna: 78 °F/108 °F (25 °C/42 °C)
4. Wskaźnik zasilania termostatu – zielone światło sygnalizuje normalną pracę
5. Wskaźnik grzałki termostatu – świeci na czerwono podczas cyklu ogrzewania

(D) pokazuje elementy urządzenia krępującego:

1. Stożek – giętka blacha aluminiowa przeznaczona do unieruchamiania gryzoni
2. Kanał ogonowy – ukształtowany tak, aby umożliwić płynne ustawienie ogona
3. Podnośnik stożkowy – zapewnia stabilne podnoszenie podstawy stożka
4. Pokrętło regulacji wysokości – przeznaczone do ręcznej regulacji wysokości
5. Podnośnik nożycowy – zakres wysokości od 45 do 140 mm (1,77-5,52")
6. Płyta nośna - zainstalowana z gumowymi nóżkami, aby zapewnić stabilność Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Urządzenie do ogrzewania i krępowania gryzoni. (A) Przed użyciem obie części urządzenia umieszcza się obok siebie na czystym blacie stołu. (B) Po włączeniu urządzenia grzewczego termostat aktywuje grzałkę. Żarówka pozostaje zapalona i emituje ciepło, dopóki komora grzewcza nie osiągnie ustawionej temperatury. Urządzenie grzewcze automatycznie powtarza cykl grzewczy, aby utrzymać temperaturę wewnętrzną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Myszy (C57BL/6) umieszczone w urządzeniu rozgrzewającym i krępującym. (A) Myszy poddawane obróbce cieplnej w celu rozszerzenia naczyń krwionośnych. Zwierzęta (4-6 myszy na zabieg) są przenoszone z klatki do komory grzewczej urządzenia i poddawane obróbce cieplnej przez co najmniej 5-10 minut. (B) Mysz unieruchomiona do wstrzyknięcia żyły ogonowej. Mysz jest przenoszona z komory grzewczej do stożkowego otworu urządzenia przytrzymującego, a jej ogon przechodzi przez otwartą szczelinę. Mysz jest delikatnie ciągnięta do tyłu do dalszej krawędzi stożka, aż podstawa ogona dotrze do końca stożka. Gdy zwierzę jest przyciągane do podstawy stożka z delikatnym obrotem bocznym, jedna tylna noga jest ustawiana do góry tak, aby wystawała z otwartej szczeliny, umożliwiając ustawienie bocznej żyły ogonowej na godzinie 12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Identyfikacja bocznych żył ogonowych u myszy. (A) Ogon nieleczonej myszy szwajcarskiej Webster. Mysz umieszcza się w urządzeniu krępującym bez uprzedniej obróbki cieplnej w celu rozszerzenia naczyń krwionośnych. Boczną żyłę ogonową można zidentyfikować jako cienkie ciemne naczynie, które przebiega pod skórą. (B) Ogon szwajcarskiej myszy Webster traktowany urządzeniem rozgrzewającym przez 10 minut. Mysz poddana obróbce cieplnej jest przytrzymywana do wstrzyknięcia żyły ogonowej. Boczna żyła ogonowa jest łatwo widoczna przez skórę ze względu na powiększoną średnicę naczynia spowodowaną rozszerzeniem naczyń krwionośnych. (C) Ogon myszy C57BL/6 traktowany urządzeniem rozgrzewającym przez 10 minut i skrępowany do wstrzyknięcia żyły ogonowej. Rozszerzenie naczyń krwionośnych zwiększa widoczność żyły ogonowej przez głęboko pigmentowaną skórę, chociaż żyła nie jest tak łatwo widoczna, jak u jasnych szwajcarskich myszy Webster ze względu na słaby kontrast kolorystyczny z żyłą. Czerwone strzałki oznaczają położenie bocznej żyły ogonowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Wstrzyknięcie żyły ogonowej wykonane u myszy poddanych obróbce cieplnej (Swiss Webster). (A–B) Wkłucie igły do żyły ogonowej bocznej w miejscu wstrzyknięcia. Igła (27 G, 1/2 cala) jest umieszczona równolegle do żyły ogonowej ze skosem do góry i skierowana w stronę przepływu krwi i włożona. (C–D) Umieszczenie igły w żyle ogonowej i wstrzyknięcie. Końcówka igły jest dalej wysunięta 2–4 mm w głąb światła żyły. Kciuk umieszcza się na tłoku strzykawki, a żądaną objętość dozuje się powoli, równomiernie i powoli. Owalne koła wskazują miejsca wstrzyknięcia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Procedura po wstrzyknięciu. (A) Obszar krwawienia w miejscu wstrzyknięcia. Krwawienie i cofanie się wstrzykniętego roztworu występują natychmiast po wyjęciu igły. Można to zminimalizować, stosując mocne uciskanie kciukiem w miejscu wstrzyknięcia. (B) Tworzenie się skrzepów krwi w miejscu wstrzyknięcia. Delikatne uciskanie czystą gazą/chusteczką ułatwia krzepnięcie krwi w ranie po wstrzyknięciu. Strzałki oznaczają miejsca wstrzyknięcia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Temperatura wewnętrzna komory grzewczej podczas użytkowania. Urządzenie grzewcze zostało aktywowane w celu ogrzewania w wyznaczonych ustawionych temperaturach. Komora grzewcza urządzenia była monitorowana pod kątem temperatury powietrza wewnętrznego, a cykle grzewcze (żarówka włączona/żółte kropki, wyłączone/szare kropki) były rejestrowane przez 45 minut. Pomarańczowy obszar wskazuje optymalny zakres temperatur do indukcji rozszerzenia naczyń krwionośnych u gryzoni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 8: Śmiertelność z powodu sepsy a ochrona zależna od szczepionki po śmiertelnym prowokacji Candida albicans. Myszy (8-tygodniowe szwajcarskie samice Webster) zostały zaszczepione dożylnie żywym awirulentem Candida dubliniensis Wü284 (Cd), a następnie śmiertelnej prowokacji dożylnej C. albicans typu dzikiego DZIEŃ 185 (1 x 10⁵ komórek na mysz) 14 dni później. (A) Śmiertelność oceniano w ciągu 10 dni po śmiertelnym prowokacji. (B) Zwierzęta były monitorowane pod kątem zachorowalności na sepsę i oceniane zgodnie ze zmodyfikowanym wynikiem oceny klinicznej sepsy u myszy (M-CASS)⁴³. Dane są skumulowane z 4 niezależnych eksperymentów z 10 myszami w grupie i analizowane za pomocą testu logarytmicznego Mantela-Coxa. p < 0,0001. SEM, błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Powtarzalność śmiertelności z powodu sepsy i przeżycia za pośrednictwem szczepionki z powodu prowokacji Candida albicans we krwi. Każdy panel reprezentuje dane z czterech niezależnych eksperymentów zawartych w skumulowanym wyniku pokazanym na Rysunek 8A. Każdy eksperyment został przeprowadzony na 10 myszach w grupie i przeanalizowany za pomocą testu log-rank Mantela-Coxa. Ca, Candida albicans. Cd, Candida dubliniensis. p < 0,0001. p < 0,01. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Dyskusja

Konsekwentne i dokładne dozowanie jest kluczowym wymogiem dla wiarygodności eksperymentu w modelach zwierzęcych. Jest to szczególnie ważne w przypadkach podawania dożylnego, gdzie ogólnoustrojowa biodostępność wstrzykiwanych leków jest znacznie wyższa/szybsza niż w przypadku innych dróg podania³. W związku z tym błędy w iniekcji do żyły ogonowej mogą mieć szkodliwy wpływ na wyniki badania. Historycznie rzecz biorąc, wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.), a nie dożylnie, było najczęstszą metodą dostępu ogólnoustrojowego u gryzoni ze względu na prostotę techniczną i wygodę. Jednak drogi podania stają się bardziej kluczowe przy przekładaniu odczytów przedklinicznych ze zwierząt na warunki kliniczne. W związku z tym istnieje potrzeba ciągłego doskonalenia protokołów leczenia gryzoni, które mogłyby ułatwić skuteczne wstrzyknięcie żyły ogonowej.

Kluczowym postępem w obecnym protokole jest innowacyjne termoregulowane urządzenie rozgrzewające, które umożliwia skuteczną indukcję rozszerzenia naczyń krwionośnych u gryzoni, co znacznie poprawia widoczność żył ogonowych i wyrównanie igieł. Metody ogrzewania, które są słabo termoregulowane (np. lampy), miejscowe leki rozszerzające naczynia krwionośne lub drażniące skórę (np. ksyleny) są nie tylko zawodne, ale także niebezpieczne dla zwierzęcia i należy ich unikać⁴⁴. W przeciwieństwie do innych konwencjonalnych metod, takich jak zanurzanie ogona w ciepłej wodzie, zdolność autoregulacji tego urządzenia może bezpiecznie kondycjonować wiele zwierząt jednocześnie. Ponadto protokół ten jest dodatkowo wzmocniony dzięki zastosowaniu optymalnie zaprojektowanego urządzenia krępującego i umożliwiającego szybkie i bezpieczne unieruchomienie zwierzęcia w pozycji, która najlepiej pokazuje boczną żyłę ogonową.

Przezroczyste formaty rurek widoczne w wielu obecnych krępach, choć praktycznie dobrze zaprojektowane, wymagają więcej czasu na obchodzenie się z każdym zwierzęciem, co wydłuża proces krępowania⁴⁵. Może to być bardziej problematyczne w przypadku szczepów gryzoni o cechach agresywnych, które oferują ograniczoną współpracę^46,47. W przeciwieństwie do tego, częściowo zamknięta stożkowa konstrukcja urządzenia przytrzymującego umożliwia szybkie ułożenie zwierzęcia i pomaga zminimalizować czas trwania unieruchomienia. Uproszczony protokół wykorzystujący innowacyjny, wysoce zoptymalizowany system ocieplania/krępowania przyspiesza procedurę wstrzykiwania, umożliwiając szybkie i skuteczne dawkowanie dużym grupom zwierząt. W naszym laboratorium zazwyczaj wykonujemy całą procedurę wstrzykiwania 30 myszy, od obróbki cieplnej do monitorowania po wstrzyknięciu, w ciągu 1 godziny przy użyciu tego protokołu.

Pomimo zaawansowanych funkcji, urządzenie to ma pewne oczywiste wady: pierwszą z nich jest koszt urządzenia i rutynowa wymiana żarówki w komorze grzewczej. Jednak oprócz skuteczności i szybkości wstrzykiwań, urządzenie jest trwałe do wielokrotnego użytku i kompatybilne z większością popularnych środków dezynfekujących, co pozwala na dokładne czyszczenie urządzenia między użyciami. Razem kompensuje to początkową inwestycję. Ponadto, w sytuacjach o ograniczonej przestrzeni roboczej, wadą tego protokołu może być wymóg wydzielonej powierzchni stołu wystarczająco dużej, aby umieścić dwie jednostki obok siebie podczas wykonywania iniekcji. Ponieważ jednak urządzenie może być szeroko stosowane w kilku protokołach dla gryzoni, w tym wstrzyknięciach dożylnych, możliwe jest, że urządzenie może służyć jako podstawowe narzędzie, podobne do innych wspólnych urządzeń wiwariowych, takich jak waporyzatory izofluranowe. Niezależnie od tego, obie jednostki są łatwe do przenoszenia i można je łączyć i przechowywać, gdy nie są używane.

Opisany w tym protokole model dożylnie śmiertelnej prowokacji mysiej posocznicy grzybiczej ściśle naśladuje infekcje krwi C. albicans u ludzi i był szeroko stosowany do badania zjadliwości grzybów, testowania skuteczności terapii przeciwgrzybiczych i charakteryzowania odpowiedzi immunologicznej gospodarza na infekcję 37,39,48. Aby osiągnąć powtarzalną infekcję, inokulacja dożylna poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej jest najważniejszym krokiem protokołu zapewniającym dokładne dostarczanie organizmów do krwiobiegu. W rzeczywistości zwierzęta reagują bardzo różnie na różne poziomy wyzwań związanych z Candida i.v.; Podanie zbyt małej ilości inokulum spowoduje niepożądane spontaniczne wyzdrowienia, podczas gdy zwierzęta otrzymujące zbyt wysokie dawki przedwcześnie umrą. Specyficzne okno wielkości inokulum dla danego organizmu w celu wywołania stałego poziomu sepsy/śmiertelności w dużej mierze zależy zarówno od szczepów grzybów, jak i szczepów myszy.

Obecny protokół wykorzystujący szwajcarskie myszy Webster w inokulum 1 x 10⁵ C. albicans typu dzikiego w sposób powtarzalny indukował początek zachorowalności na sepsę w ciągu 1 dnia, a następnie postępującą śmiertelność prowadzącą do 100% śmiertelności w ciągu 5-7 dni. W przeciwieństwie do tego, szczepionki wyższe niż 1 x 10⁵ zazwyczaj prowadzą do przyspieszonych zgonów (tj. 1-2 dni przy 1 x 10⁶, 3-4 dni przy 5 x 10⁵), a te niższe niż 1 x 10⁵ są subletalne. Zgodnie z licznymi doniesieniami w literaturze, stosowanie gatunków Candida innych niż albicans zamiast C. albicans skutkuje znacznie zmniejszoną śmiertelnością^40,49. Ponadto wybór szczepów myszy, a nawet pochodzenie kolonii, może mieć znaczący wpływ na wyniki infekcji ze względu na różną podatność między szczepami myszy, jak donoszą inni 39,40,41,50,51,52,53,54,55^. W związku z tym oba te czynniki powinny być brane pod uwagę przy projektowaniu eksperymentów.

Po śmiertelnym prowokacji dożylnie komórki grzybów szybko rozprzestrzeniają się w krwiobiegu i zaczynają atakować wiele narządów, wśród których najbardziej dotknięte są nerki⁴¹. Inne dotknięte narządy to mózg, śledziona i szpik kostny^48,56. Niezależnie od tego, ostra sepsa jest ostateczną przyczyną zgonu we wczesnych punktach czasowych³⁷. Jak wykazano w reprezentatywnych wynikach, nasilenie sepsy można ocenić ilościowo za pomocą mysiego wyniku oceny klinicznej sepsy (M-CASS) na podstawie wykazanych objawów sepsy u zwierząt prowokowanych^43,57. Wśród kilku zastępczych markerów śmiertelnej sepsy, hipotermia została zasugerowana jako krytyczny predyktor rychłej śmierci zarówno w klinicznej, jak i eksperymentalnej sepsie 43,58,59.

Chociaż nie przeprowadzono żadnych formalnych badań w celu bezpośredniego porównania myszy wsobnych i niekrewniaczych w tym modelu, dane uzyskane z obecnego protokołu przy użyciu niekrewniaczych szwajcarskich myszy Webster są wyjątkowo powtarzalne pod względem różnych parametrów sepsy, pomimo przypuszczalnej heterogeniczności genetycznej. Ogólnie rzecz biorąc, wzorzec śmiertelności, który przypada w ciągu 3-5 dni, jest mocnym modelem ostrej sepsy, o czym świadczy szybki wzrost zachorowalności na sepsę i poziom markerów stanu zapalnego w ciągu kilku godzin po poletalnym prowokacji^50,51. W przypadku dłuższych okresów przeżycia (7–10 dni) śmiertelność jest prawdopodobnie wynikiem obciążenia mikrobiologicznego prowadzącego do śmiertelnego uszkodzenia tkanek w narządach docelowych i ośrodkowym układzie nerwowym. Wybór sepsy lub obciążenia mikrobiologicznego może być stosowany w razie potrzeby do oceny funkcji immunologicznych lub odpowiedzi na schematy przeciwzapalne lub terapie/szczepionki przeciwgrzybicze, w zależności od zastosowanego inokulum.

Oprócz modelu śmiertelnego prowokacji dożylnej, wewnątrzbrzuszne zakażenie C. albicans u myszy za pomocą prowokacji i.p. może również prowadzić do rozsianej kandydozy i późniejszej sepsy, chociaż jednoczesne zaszczepienie patogenem bakteryjnym, Staphylococcus aureus, synergistycznie zwiększa śmiertelność w porównaniu z monoinfekcją C. albicans 51,60,61. W modelu i.p. lethal challenge znacznie wyższa inokulacja mikrobiologiczna (1,75 x 10⁷ C. albicans/8 x 10⁷ S. aureus na mysz) jest wymagana do wywołania wielobakteryjnego zapalenia otrzewnej i rozprzestrzenienia się organizmów z jamy brzusznej do krwiobiegu. Podobnie, zakażenie przewodu pokarmowego C. albicans u myszy leczonych środkami immunosupresyjnymi i / lub uszkadzającymi błony śluzowe prowadzi do translokacji komórek grzyba do krwiobiegu i powoduje posocznicę grzybiczą^62,63. Pomimo charakterystycznych dróg inokulacji, mechanizm wynikającej z sepsy grzybiczej jest w dużej mierze analogiczny między trzema modelami choroby, obejmując niekontrolowaną ogólnoustrojową odpowiedź prozapalną na Candida, która prowadzi do niewydolności narządowej 37,51,61. Podobnie u ludzi to właśnie ten proces odpowiedzi gospodarza, a nie tylko kandydemia, powoduje wysoką zachorowalność/śmiertelność związaną z hematogennie rozsianą kandydozą nabytą w placówkach opieki zdrowotnej^64,65.

Korzystając z obecnego modelu sepsy grzybiczej, wykazujemy tutaj, że ochronę przed śmiertelnym zakażeniem C. albicans można osiągnąć poprzez dożylne szczepienie wstępne/szczepienie C. dubliniensis (avirulent) lub atenuowane mutanty C. albicans, przy jednoczesnym znacznym zmniejszeniu zachorowalności na sepsę. W ochronie pośredniczą wrodzone komórki supresorowe Gr-1 ⁺ pochodzące z szpiku, które wydają się być indukowane w szpiku kostnym jako forma wytrenowanej odporności wrodzonej^66,67. Trwają prace nad poszerzeniem wiedzy na temat tej nowej formy wrodzonej ochrony immunologicznej przed zakażeniami krwi C. albicans.

Podsumowując, innowacyjne urządzenie do ocieplania/krępowania gryzoni odegrało zasadniczą rolę w zwiększaniu naszej zdolności do wykonywania iniekcji dożylnych w ramach zakrojonych na szeroką skalę wielogrupowych badań na zwierzętach w wydajny i skuteczny sposób. W związku z tym ukuliśmy termin Mouse a Minute dla tego urządzenia. Specyfikacje urządzenia są dostępne u autora korespondencyjnego na żądanie w przypadku zamówienia podobnego urządzenia. Zademonstrowane tu techniki mogą posłużyć jako użyteczne narzędzie w modelach gryzoni wykorzystujących iniekcje do żył ogonowych w szerokim zakresie obszarów badawczych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Candida albicans szczep DAY185	Carnegie Melon University	N/A	dostarczony przez laboratorium Aarona Mitchella
Candida albicans szczep efg1Δ/Δ cph1Δ/Δ	Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Tennessee	N/A	dostarczone przez laboratorium Glen Palmer
Candida dubliniensis szczep Wü 284	Trinity College, Dublin, Irlandia	Nie dotyczy dostarczone	przez laboratorium Gary'ego Morana
Myszy	Charles River Laboratories	551NCICr:SW	Samica Swiss Webster; 6-8 tygodniowe
myszy	Charles River Laboratories	556NCIC57BL/6	Samica C57BL/6; 6-8 tygodni
Igły, 27G, ½-in	Becton Dickinson	305109	mogą być zastąpione od innych dostawców
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	GE	SH30028.02	można zastąpić u innych dostawców Urządzenie
do ogrzewania i krępowania gryzoni (Mouse a Minute)	LSU Health	na zamówienie niestandardowe	Mysz na minutę jest dostępna do niestandardowego zamówienia w LSU Health
Sabouraud agar dekstrozowy (SDA)	Becton Dickinson	211584	można zastąpić u innych dostawców
Strzykawki, 1 ml	Becton Dickinson	309659	można zastąpić u innych dostawców
Roztwór błękitu trypanowego	Sigma	T8154
Drożdżowy bulion dekstronowy peptonowy (YPD)	Fisher Scientific	BP2469	można zastąpić u innych dostawców