Artykuł metodologiczny

Nawracające zakażenie dróg moczowych Escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego Gardnerella vaginalis u myszy

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61967

⸱

4 grudnia 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 2Center for Women’s Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 3Center for Cellular Imaging, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 5Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 6Fred Hutchinson Cancer Research Center, 7TESCAN USA, Inc., 8University of California San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

Pokazano mysi model przezcewkowej inokulacji uropatogennej E. coli (UPEC) w celu stworzenia utajonych wewnątrzkomórkowych zbiorników pęcherza moczowego, a następnie ekspozycji pęcherza moczowego na G. vaginalis w celu wywołania nawrotu UPEC UTI. Zademonstrowano również liczenie bakterii, cytologię moczu oraz utrwalanie i przetwarzanie pęcherza moczowego in situ w skaningowej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

Nawracające infekcje dróg moczowych (rUTI) wywołane przez uropatogenną Escherichia coli (UPEC) są powszechne i kosztowne. Poprzednie artykuły opisujące modele ZUM u samców i samic myszy zilustrowały procedury inokulacji bakteryjnej i liczenia w moczu i tkankach. Podczas początkowej infekcji pęcherza moczowego u myszy C57BL/6 UPEC tworzy utajone rezerwuary w komórkach nabłonka pęcherza moczowego, które utrzymują się po usunięciu bakteriurii UPEC. Model ten opiera się na tych badaniach w celu zbadania rUTI spowodowanego pojawieniem się UPEC w utajonych zbiornikach pęcherza moczowego. Bakteria układu moczowo-płciowego Gardnerella vaginalis jest używana jako wyzwalacz zakażenia układu moczowego w tym modelu, ponieważ jest często obecna w drogach moczowo-płciowych kobiet, zwłaszcza w kontekście dysbiozy pochwy, która jest związana z ZUM. Ponadto opisano metodę unieruchamiania pęcherza moczowego in situ, a następnie analizę tkanki pęcherza moczowego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), która może znaleźć zastosowanie w innych badaniach dotyczących pęcherza moczowego.

Wprowadzenie

Infekcje dróg moczowych (UTI) stanowią znaczne obciążenie zdrowotne na całym świecie, wpływając na jakość życia milionów ludzi każdego roku, zwłaszcza kobiet1. Uropatogenne Escherichia coli (UPEC) są najczęstszą przyczyną ZUM1. Wielu pacjentów (około 20-30%), u których rozwinie się ZUM, doświadczy nawrotu ZUM (rUTI) w ciągu 6 miesięcy, pomimo ustąpienia początkowej infekcji za pośrednictwem antybiotyków2. Niestety, aż 5% kobiet przed menopauzą cierpi na 3 lub więcej rUTI każdego roku3,4. Sekwencyjne epizody rUTI mogą być spowodowane utrzymywaniem się tego samego szczepu UPEC z indeksu case5,6,7,8. Dane z próbek pobranych od ludzi i modeli mysich sugerują, że zakażenie układu moczowego tego samego szczepu może być spowodowane przez UPEC znajdujący się w zbiornikach spoczynku w pęcherzu moczowym. U ludzi UPEC wykryto w komórkach nabłonka i biopsjach pęcherza moczowego pacjentów z ZUM9,10,11,12,13. Badania na myszach C57BL/6 wykazały, że niektóre szczepy UPEC mogą tworzyć spoczynkowe rezerwuary wewnątrzkomórkowe w pęcherzu moczowym, wykryte za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz homogenizacji i hodowli tkanki pęcherza moczowego, które utrzymują się przez miesiące po ustąpieniu bakteriurii14,15,16. Leczenie pęcherza moczowego środkami indukującymi złuszczanie nabłonka pęcherza moczowego (urotelium), np. siarczan protaminy17 lub chitozan18, wyzwalają pojawienie się UPEC ze zbiorników w celu wywołania rUTI. Dane te sugerują, że u kobiet posiadających rezerwuary UPEC w pęcherzu moczowym z powodu wcześniejszej infekcji, ekspozycja na pęcherz, która prowadzi do złuszczania dróg moczowych, może wywołać rUTI.

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że mikrobiota pochwy przyczynia się do infekcji dróg moczowych19,20. Gardnerella vaginalis jest częstym członkiem zarówno mikrobioty pochwy, jak i układu moczowego21,22,23,24,25,26,27,28,29. W pochwie obecność wysokiego poziomu G. vaginalis jest związana z dysbiozą mikrobiologiczną znaną jako bakteryjne zapalenie pochwy (BV), która dotyka ~30% kobiet30,31,32. Kobiety z BV są bardziej narażone na wystąpienie ZUM w porównaniu z kobietami, u których społeczność pochwy jest zdominowana przez Lactobacillus33,34,35,36,37. W modelach mysich G. vaginalis powoduje złuszczanie nabłonka zarówno w pochwie38, jak i w pęcherzu moczowym39. U myszy C57BL/6 zawierających zbiorniki pęcherza moczowego UPEC, dwie sekwencyjne ekspozycje pęcherza moczowego na G. vaginalis - ale nie na PBS - powodują ponowne pojawienie się UPEC z rezerwuarów, powodując UPEC rUTI. O pojawieniu się dowodów świadczy pojawienie się mian UPEC w moczu myszy, które wcześniej ustąpiły z bakteriurii UPEC, a następnie spadek miana homogenatu pęcherza UPEC przy uśmierceniu w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi narażonymi na PBS39. Co ciekawe, nie ma trwałej kolonizacji przez G. vaginalis w pęcherzu moczowym. W zdecydowanej większości przypadków dwie krótkie ekspozycje, z których każda zawierała mniej niż 12 (h) żywotnej G. vaginalis w moczu, są wystarczające, aby wywołać złuszczanie dróg moczowych i sprzyjać zakażeniu dróg moczowych.

Ten protokół opisuje mysi model rUTI spowodowany przez UPEC rezydujący w wewnątrzkomórkowych zbiornikach pęcherza, wykorzystujący inokulację pęcherza G. vaginalis do wywołania nawrotu. Postęp osiągnięty dzięki temu modelowi polega na tym, że G. vaginalis jest klinicznie istotnym biologicznym czynnikiem wyzwalającym rUTI w porównaniu z wcześniej stosowanymi środkami chemicznymi. Co więcej, stosunkowo krótkie przeżycie G. vaginalis w drogach moczowych myszy pozwala na zbadanie wpływu przejściowej ekspozycji na drobnoustroje na błonę dróg moczowych, która może wystąpić po aktywności seksualnej. Oprócz nakreślenia modelu rUTI, protokół ten opisuje również metody cytologii moczu oraz utrwalania pęcherza moczowego in situ i obrazowania nabłonka moczowego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).

Ten protokół nawracających UTI wywołanych przez G. vaginalis, wykorzystuje szczep UPEC UTI89 z kasetą odporną na kanamycynę (UTI89kanR)40. Nie wszystkie testowane szczepy UPEC były w stanie tworzyć wewnątrzkomórkowe społeczności bakteryjne podczas ostrej fazy infekcji u myszy41 i nie wiadomo jeszcze, czy wszystkie szczepy UPEC mają zdolność do tworzenia utajonych rezerwuarów wewnątrzkomórkowych. Tworzenie się zbiornika powinno zostać potwierdzone przed użyciem innych szczepów UPEC w modelu. W protokole tym wykorzystuje się spontaniczny izolat G. vaginalis oporny na streptomycynę, JCP8151BSmR38. Indukcja rUTI przez JCP8151BSmR wymaga dwóch kolejnych szczepień G. vaginalis, podanych w odstępie 12 godzin lub 7 dni (d)39. To, czy inne szczepy G. vaginalis wywołują złuszczanie i/lub UPEC rUTI, pozostaje do ustalenia w przypadku tego modelu. Konieczne jest stosowanie szczepów UPEC i G. vaginalis o znanej oporności na antybiotyki (takich jak kanamycyna lub spektynomycyna w przypadku UPEC i streptomycyna w przypadku G. vaginalis), ponieważ do płytek agarowych można dodawać antybiotyki, aby zapobiec wzrostowi endogennej mikroflory myszy, która w przeciwnym razie mogłaby zakłócać liczenie jednostek tworzących kolonie (CFU) w celu monitorowania infekcji. Jest to szczególnie ważne w przypadku hodowli próbek moczu, ponieważ mocz myszy często zawiera inne bakterie, które mogą przerastać na płytkach hodowlanych bez antybiotyków. Pochodzenie tych endogennych bakterii w moczu myszy jest nieznane, ale prawdopodobnie odzwierciedla bakterie okołocewkowe i moczowo-płciowe zebrane podczas zbierania moczu.

G. vaginalis jest fakultatywną bakterią beztlenową i dlatego ten protokół opisuje hodowlę G. vaginalis JCP8151BSmR w komorze beztlenowej. Jeśli komora beztlenowa nie jest dostępna, można zastosować inne metody utrzymania beztlenowych warunków wzrostu (takie jak woreczek GasPak w hermetycznym pojemniku). Alternatywnie, niektóre szczepy G. vaginalis (w tym JCP8151BSmR) będą rosły w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych (5% CO2 ). Tak jak użycie szczepów G. vaginalis innych niżJCP8151B SmR wymaga testów w celu zapewnienia, że bakterie zachowują się podobnie w tym modelu, zmieniające się warunki wzrostu wymagają empirycznego określenia idealnych czasów trwania hodowli (na płytkach i w płynie) i ekwiwalentów gęstości optycznej (OD)600 w celu osiągnięcia pożądanych stężeń żywotnego inokulum. Ponadto nie wiadomo, czy warunki wzrostu wpływają na patobiologię G. vaginalis.

Na koniec, rozważając, czy wykorzystać ten model, badacze powinni być świadomi, że może on wymagać większej liczby zwierząt w grupie niż typowe modele myszy UTI. Dzieje się tak częściowo dlatego, że indukcja rUTI wymaga, aby myszy ustąpiły bakteriurii UPEC spowodowanej początkową infekcją pęcherza. W związku z tym każda mysz, która nie usunie bakteriurii (fenotyp zwykle wskazujący na trwającą infekcję nerek), nie jest uwzględniana w fazie rUTI protokołu. Na liczbę myszy potrzebnych do zasilania tych badań wpływa również szybkość "spontanicznego" pojawiania się UPEC w moczu (średnio 12-14%). Wreszcie, różne szczepy myszy mają różne skłonności do rozwoju przewlekłej bakteriurii w porównaniu z tworzeniem rezerwuarów wewnątrzkomórkowych42,43. W przypadku stosowania w tym modelu szczepów myszy innych niż C57BL/6 należy potwierdzić, że zwierzęta rozwijają spoczynkowe zbiorniki wewnątrzkomórkowe UPEC.

Protokół

Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Waszyngtońskiego zatwierdził wszystkie infekcje i procedury u myszy w ramach protokołów nr 20170081, który wygasł 06/09/2020, oraz 20-0031, który wygasa 03/18/2023. Ogólna opieka nad zwierzętami była zgodna z wytycznymi The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals National Research Council oraz USDA Animal Care Resource Guide. Procedury eutanazji są zgodne z wytycznymi AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.

Schemat protokołu dla myszy: rezerwuar UPEC, ekspozycja na G. vaginalis, fazy rUTI, cytologia moczu, SEM.
Rycina 1. Schemat modelu mysiego. Oś czasu została wyróżniona, aby odzwierciedlić fazy lub procedury modelu opisane w protokole. Faza 1 (pomarańczowa): Tworzenie wewnątrzkomórkowych rezerwuarów UPEC. Myszy są inokulowane przez cewkę moczową szczepem UPEC, a następnie pobiera się próbki moczu i monitoruje eliminację bakteriurii. Do kolejnych faz przechodzą tylko myszy, u których nastąpiła eliminacja bakteriurii. Faza 2 (zielona): Ekspozycja pęcherza na G. vaginalis. Myszy są inokulowane przez cewkę moczową G. vaginalis dwukrotnie. Odstęp czasu między dwiema kolejnymi ekspozycjami wynosi albo 12 h (panel górny), albo 1 tydzień (wk; panel dolny), w zależności od planowanej analizy końcowej. Faza 3 (żółta): rUTI wywołane przez UPEC. Mocz jest pobierany codziennie po ekspozycji na G. vaginalis i monitorowany pod kątem bakteriurii UPEC. Dodatkowo, w punkcie końcowym eksperymentu można pobrać pęcherze i nerki w celu pomiaru miana UPEC w tkankach. W modelu z ekspozycją trwającą 1 tydzień, indukowane przez G. vaginalis wydostawanie się UPEC z rezerwuarów wewnątrzkomórkowych i następująca po nim eliminacja z dróg moczowych odzwierciedla się w spadku miana UPEC w tkance pęcherza (w porównaniu z myszami eksponowanymi na PBS, patrz Rycina 3D). Spadek miana w pęcherzu nie był widoczny w modelu z ekspozycją 12 h, prawdopodobnie dlatego, że wymagany jest więcej czasu, aby doszło do wystarczającego wydostania się bakterii z rezerwuarów i ich eliminacji, co znacząco obniżyłoby miana tkankowe. Procedura A: Cytologię moczu wykonuje się zazwyczaj 1 dpi (lub nawet wcześniej) podczas Fazy 1 w celu zbadania ostrej infekcji UPEC oraz podczas Fazy 3 w celu oceny zawartości PMN w moczu, co koreluje z wydostawaniem się UPEC. Próbki moczu pobrane w innych punktach czasowych mogą być analizowane w ten sam sposób. Procedura B: Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) pęcherza w celu zbadania złuszczania urothelium jest zazwyczaj wykonywana w modelu 12 h w 3 h po drugiej ekspozycji na G. vaginalis (15 h po podaniu pierwszej ekspozycji w czasie 0). Można oceniać również inne punkty czasowe, na przykład od 6 do 24 h po inokulacji UPEC, jak pokazano w Fazie 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

1. Tworzenie wewnątrzkomórkowych rezerwuarów spoczynkowych UPEC u myszy

  1. Przygotowanie cewników moczowych (nawiązanie do 44,45,46,47 w celu obejrzenia filmów z tego etapu).
    1. Przewlecz igły 30 G, tak aby długość rurki PE10 rozciągała się od nasady igły do kilku mm poza jej końcówkę. Należy uważać, aby nie przebić rurki końcówką igły. Alternatywnie można zastosować kaniule do dożylnego podawania leków u dzieci46.
    2. Umieść przygotowane cewniki w szalce Petriego i sterylizuj światłem UV przez co najmniej 30 min. Załóż pokrywkę szalki Petriego i zabezpiecz ją do czasu użycia.
  2. Przygotowanie inokulum UPEC (Dzień -3 do 0)
    1. Dzień -3: Wysiać szczep UTI89kanR z zamrożonego zapasu w -80 °C na płytkę z agarem Luria-Bertani (LB). Inkubować płytkę w 37 °C przez 18-24 h.
      UWAGA: Dodawanie kanamycyny do pożywki do wzrostu inokulum nie jest konieczne, ponieważ oporność na kanamycynę jest stabilnie zintegrowana w szczepie UTI89kanR.
    2. Dzień -2: Zaszczepić 20 mL bulionu LB w sterylnej kolbie o pojemności 125 mL pojedynczą kolonią UTI89kanR. Nie należy używać mniejszej kolby, ponieważ ta metoda hodowli jest istotna dla indukowania ekspresji pęli typu 1 UPEC, która jest niezbędna do adhezji do pęcherza.
    3. Inkubować statycznie (bez wytrząsania) w 37 °C przez 18-24 h. Nie dodawać antybiotyków do pożywki wzrostowej. Do rozpoczynania hodowli w cieczy używać wyłącznie świeżych kolonii z płytek LB (w wieku 18-24 h).
    4. Dzień -1: Przeszczepić UTI89kanR , pobierając 20 µL hodowli (ostrożnie zakręcić kolbą, aby resuspenderować osiadłe bakterie) i dodając do 20 mL świeżego bulionu LB w sterylnej kolbie 125 mL. Inkubować zgodnie z krokiem 2, z wyjątkiem ścisłego czasu trwania 18 h. Nie dodawać antybiotyków do pożywki wzrostowej.
    5. Dzień 0: Przenieść całą hodowlę do probówki 50 mL i wirować przy 3200 × g w wirówce nakławkowej przez 10 min w celu osadzenia bakterii. Odessać nadsącz i resuspenderować osad bakteryjny w 10 mL PBS.
    6. Dodać 100 µL skoncentrowanej zawiesiny bakteryjnej z kroku 4 do 900 μL PBS w kuwecie i wyznaczyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) za pomocą spektrofotometru wytarowanego za pomocą PBS. Pomnożyć wartość ze spektrofotometru przez 10 (aby uwzględnić rozcieńczenie), aby wyznaczyć OD600 zawiesiny (ODsuspension).
    7. Aby uzyskać pożądane stężenie inokulum 1 x 107 CFU w 50 µL, rozcieńczyć (lub skoncentrować) zawiesinę UTI89kanR korzystając z następującego równania, w którym pożądana wartość ODinoculum wynosi 0,35 (wartość może się różnić dla innych szczepów UPEC), a Y to wymagana objętość inokulum (100 µL na mysz, aby zapewnić zapas na eliminację pęcherzyków powietrza i wypełnienie cewników):
      X mL x ODsuspension = Y mL x ODinoculum
      Na przykład, jeśli wartość ODsuspension wynosi 4,7 i wymagane jest 5 mL inokulum:
      X mL × 4,7 = 5 × 0,35
      X = (5 × 0,35) / 4,7
      X = 0,372 mL
      Zatem należy dodać 372 μL zawiesiny bakteryjnej, aby przygotować 5 mL (objętość końcowa).
    8. Używając pipety wielokanałowej, przygotować seryjne rozcieńczenia inokulum 1:10 aż do 10-6 w sterylnym PBS na płytce 96-dołkowej. Nanieść pięć powtórzeń po 10 µL dla wszystkich 6 rozcieńczeń na płytkę LB oraz LB+kan, pozwolić kroplom wyschnąć i inkubować w 37 °C przez noc. Płytka LB bez antybiotyków służy do upewnienia się, że inokulum nie zostało zanieczyszczone innym organizmem (co objawiłoby się dodatkową morfologią kolonii, która nie występuje na płytce selekcyjnej z antybiotykiem kan). Oba typy płytek powinny dać taki sam wynik.
      UWAGA: Płytki powinny schnąć na blacie przez jeden dzień przed użyciem, aby absorbowały nanieszony płyn bez zlewania się plamek.
    9. Policzyć całkowitą liczbę kolonii we wszystkich plamkach rozcieńczenia z wyraźnie odróżnialnymi koloniami i użyć tej wartości do obliczenia rzeczywistej dawki inokulum zastosowanej w każdym eksperymencie. Nie należy polegać wyłącznie na wartościach OD600.
  3. Inokulacja UTI89kanR do pęcherzy znieczulonych myszy samic (Dzień 0)
    UWAGA: Nagrania wideo z tej procedury zostały opublikowane wcześniej44,46. W celu uzyskania dokładniejszego opisu należy zapoznać się z tymi pracami. Szczegóły dotyczące cewnikowania myszy znajdują się w sekcji 5 niniejszego protokołu.
    1. Znieczulić myszy poprzez inhalację izofluranem zgodnie z metodami zatwierdzonymi przez IACUC.
    2. W oczekiwaniu na znieczulenie myszy, napełnić strzykawkę tuberkulinową inokulum UTI89kanR , a następnie przymocować przygotowany cewnik. Nacisnąć tłok, aby usunąć powietrze z cewnika, a następnie zanurzyć końcówkę cewnika w sterylnym lubrykancie chirurgicznym.
    3. Ułożyć mysz na plecach i potwierdzić znieczulenie, mocno ściskając poduszkę stopy myszy i obserwując brak odruchu lub reakcji. Zlokalizować pęcherz (wyczuwalny jak ziarnko grochu w dolnej części brzucha) między palcami wskazazującymi obu rąk. Wycisnąć mocz, przesuwając palce ku sobie, aby zastosować delikatny ucisk na pęcherz.
    4. Wprowadzić cewnik przez cewkę moczową myszy do pęcherza i powoli podać 50 µL inokulum.
    5. Odczekać kilka sekund, a następnie ostrożnie usunąć cewnik, wyciągając go prosto. Przenieść mysz do klatki i monitorować do momentu wybudzenia z narkozy.
    6. Powtórzyć kroki 1.3.1 - 1.3.5 u kolejnych myszy, zmieniając cewnik pomiędzy każdą klatką (5 myszy). W razie potrzeby tę samą procedurę można zastosować do inokulacji grupy kontrolnej myszy za pomocą PBS, na przykład aby wykazać, że inny szczep G. vaginalis wywołuje rUTI (powyżej poziomu spontanicznego/tła).

2. Monitorowanie eliminacji bakteriurii UPEC (dni od 1 do 28)

UWAGA: Film z procedury pobierania moczu został opublikowany wcześniej44.

  1. Pobrać mocz (minimum 10 µL) od wszystkich myszy poprzez palpację pęcherza zgodnie z opisem44 w 1. dniu po infekcji oraz co tydzień przez 4 tygodnie (7, 14, 21 i 28 dni po infekcji). Mocz należy poddać hodowli w ciągu kilku godzin od pobrania, aby monitorować infekcję UPEC. Mocz przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu wysiania. Mocz może być również wykorzystany do cytologii (patrz Sekcja 4). Sporadycznie, w przypadku silnego stanu zapalnego pęcherza, nie udaje się uzyskać 10 µL moczu; w takim przypadku można dodać PBS do objętości 10 µL, jednak miano bakterii w moczu oraz oceny cytologiczne muszą zostać odpowiednio skorygowane (np. jeśli zebrano tylko 5 µL moczu i dodano 5 µL PBS, miana i oceny należy pomnożyć przez 2).
  2. Za pomocą pipety wielokanałowej przygotować szereg rozcieńczeń 1:10 do 10-6 w sterylnym PBS na płytce 96-dołkowej. Używając wielokanałowej pipety P10, nanieść 10 μL z każdego z 6 rozcieńczeń z kolumny 1 w orientacji pionowej na lewej krawędzi płytki LB zawierającej odpowiedni marker selekcyjny antybiotyku. Wyrzucić końcówki.
  3. Powtórzyć wysiew z pozostałymi próbkami (kolumna 2, następnie kolumna 3 itd.). Na jednej płytce można zmieścić 5 próbek obok siebie. W ten sposób powstanie płytka z macierzą punktową 5 × 6, z rosnącymi rozcieńczeniami od góry do dołu i rosnącą liczbą próbek od lewej do prawej (Rysunek 2A).
  4. Pozostawić punkty do wyschnięcia na blacie, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia policzyć liczbę kolonii w najmniej rozcieńczonym punkcie, w którym kolonie są wyraźnie oddzielone (Rysunek 2B) i wykorzystać tę liczbę do obliczenia CFU/mL:
    liczba kolonii w pojedynczym punkcie moczu × czynnik rozcieńczenia × 100 = CFU/mL moczu
  5. Wykreślić miana UTI89kanR w moczu przy użyciu oprogramowania graficznego (Rysunek 2C). Zidentyfikować myszy, u których w 28. dniu nie wykryto UTI89kanR w moczu (~65-80% myszy C57BL/6). Myszy te posiadają uśpione rezerwuary wewnątrzkomórkowe i są wykorzystywane w kolejnej fazie eksperymentalnej do badania indukcji nawracającego ZUM. Myszy z bakteriami w moczu w 28. dniu nie są włączane do kolejnych etapów.

3. Narażenie pęcherza moczowego na G. vaginalis

  1. Przydziel myszy do grup narażenia (dzień 29). Głównym celem tego etapu jest uniknięcie sytuacji, w której wszystkie myszy z dłużej trwającym bakteriouremią znajdą się w jednej grupie narażenia, ponieważ nie jest znane, czy ma to wpływ na prawdopodobieństwo wystąpienia rUTI.
    1. Korzystając z danych o CFU w moczu (Rysunek 2D), podzielić myszy na grupy w zależności od punktu czasowego, w którym UTI89kanR bakteriurii nie stwierdzono więcej (Rycina 2E).
    2. Losowo przydziel myszy z każdej grupy do jednej z *G. vaginalis* lub grupy inokulowane PBS; np. połowa myszy, u których nastąpiło oczyszczenie przed 7. dniem, otrzymuje G. vaginalis a połowa otrzyma PBS; połowa myszy, u których doszło do oczyszczenia między 8. a 14. dniem, otrzyma *G. vaginalis* a połowa otrzyma PBS, itd. (tak jak w Rysunek 2E).
  2. Przygotuj G. vaginalis szczepionka (wszystkie etapy wykonane w komorze beztlenowej)
    UWAGA: Optymalny czas inkubacji kultur różni się w zależności od szczepów G. vaginalis, przy czym niektóre szczepy wchodzą w fazę stacjonarną, a nawet zaczynają obumierać szybciej niż inne. Jest to szczególnie istotne, biorąc pod uwagę, że zabite *G. vaginalis* (JCP8151B) nie był w stanie wywołać rUTI39Zatem czasy inkubacji dla danej szczepu powinny zostać określone empirycznie przed przeprowadzeniem eksperymentów na myszach. Nie wiadomo, czy inne/wszystkie szczepy *G. vaginalis* wywoła te same efekty w tym modelu.
    1. Posiew metodą kreskową *G. vaginalis* szczep z -80 °C zamrożony materiał zapasowy na płytkę NYCIII (bez antybiotyków). Inkubować płytkę w 37 °C beztlenowo przez 24 h.
    2. W komorze beztlenowej zaszczep 5 ml beztlenowego podłoża NYCIII za pomocą 1 μL pętlę pełną komórek (pojedyncza kolonia jest niewystarczająca) z płytki NYCIII i inkubować kulturę statycznie w 37 °C w warunkach beztlenowych przez 18 h. Nie dodawać antybiotyków do pożywki hodowlanej.
  3. Wyznaczyć OD600 kultury za pomocą spektrofotometru.
    1. Odwiruj określoną objętość (X) hodowli przy 9600 × g przez 1 min, a następnie odessać pożywkę. Obliczyć objętość (Y) PBS potrzebną do resuspensji osadu, aby uzyskać pożądany OD inokulum wynoszący 108 CFU w 50 μL korzystując z następującego równania:
      X ml × ODhodowla = Y ml × ODszczepionka oblicz Y
      Y = (X ml × ODhodowla) / ODszczepionka (do zasiewu)
      UWAGA: ODszczepionka dla JCP8151BSmR wynosi 5, jednak w przypadku innych musi zostać określone empirycznie G. vaginalis szczepy. Na przykład, podczas wirowania 3 ml JCP8151BSmR nocna hodowla płynna z pomiarem ODhodowla = 2,0: Y= (3 ml × 2,0) / 5,0; zatem resuspender osad w 1,2 ml PBS
    2. Resuspender osad bakteryjny w PBS do pożądanego stężenia. Wykonać rozcieńczenia seryjne i wysiać inokulum na podłoża (zgodnie z opisanym powyżej protokołem oznaczania CFU), aby określić rzeczywistą dawkę inokulum zastosowaną w każdym eksperymencie. Nie należy polegać wyłącznie na wartościach OD.
  4. W dniach 29–31 po inokulacji UPEC należy inokulować znieczulone myszy za pomocą G. vaginalis lub PBS, zgodnie z opisem w kroku 1.3 powyżej. Grupa kontrolna z PBS jest niezbędna, ponieważ sam proces cewnikowania pęcherza może spowodować uszkodzenia i złuszczanie urothelium, co mogłoby wywołać pewien stopień ponownego pojawienia się rezerwuaru UPEC. Myszom inokulowanym PBS służy zatem jako grupa kontrolna, do której G. vaginalisPorównuje się myszy inokulowane.
    UWAGA: Ostateczne oznaczenie bakteriurii UPEC w 28. dniu wymaga inkubacji płytki CFU przez noc. W związku z tym najwcześniejszy termin wykonania tego etapu to 29 dni po początkowej inokulacji UPEC. W razie potrzeby ekspozycję można przeprowadzić najpóźniej w 31. dniu. Badacze powinni zachować spójność między poszczególnymi eksperymentami.
  5. Powtórz przygotowanie inokulum w celu podania drugiej dawki *G. vaginalis* (lub kontrola w PBS) w wybranym punkcie czasowym, np. 12 h lub 1 tydzień po pierwszej inokulacji. Druga ekspozycja jest niezbędna, ponieważ pojedyncza inokulacja z G. vaginalis nie prowadzi do znaczącego pojawienia się UPEC39.

4. Monitorowanie nawracających ZPI wywołanych przez UPEC

  1. Pobrać mocz od myszy w wybranych punktach czasowych po każdej inokulacji G. vaginalis (zalecane 1, 2 i 3 dni po inokulacji).
    1. Wykonać rozcieńczenia seryjne moczu i wysiać je na pożywki selektywne (np. LB+kanamycyna), aby oznaczyć liczbę CFU/mL szczepu UTI89kanR. W razie potrzeby rozcieńczenia moczu można wysiać również na pożywki selektywne (np. NYCIII + 1 mg/mL streptomycyny), aby oznaczyć liczbę CFU/mL G. vaginalis . Należy jednak pamiętać, że szczep G. vaginalis JCP8151BSmR został usunięty z moczu większości myszy do 12 h 39. W związku z tym, aby wykryć G. vaginalis u większości myszy, konieczne byłyby wcześniejsze punkty czasowe.
  2. W punkcie końcowym eksperymentu (np. 3 dni po drugiej inokulacji G. vaginalis ) uśmiercić myszy zgodnie z zatwierdzonymi metodami (np. poprzez zwichnięcie karku w znieczuleniu izofluranem lub inhalację CO2) oraz pobrać pęcherze moczowe i nerki do oznaczania CFU, zgodnie z opisem przedstawionym wcześniej 44,46.

5. Cytologia moczu

UWAGA: Procedurę tę można przeprowadzić w dowolnym punkcie czasowym, w którym wymagana jest wizualizacja komórek i/lub bakterii obecnych w moczu. Jak wskazano na Rysunku 1, cytologię moczu wykonuje się zazwyczaj w 1 dpi (lub nawet wcześniej) podczas Fazy 1 w celu zbadania ostrej infekcji UPEC oraz podczas Fazy 3 w celu oceny obecności komórek polimorfonuklearnych (PMN) w moczu wykazującym pojawienie się UPEC.

  1. Do kasety cytofunnel z dołączonym filtrem i szkiełkiem dodaj 10 µL moczu i 90 µL PBS. (Najprostszą metodą jest wykorzystanie pozostałości rozcieńczeń 1:10 z płytki 96-dołkowej użytej do hodowli moczu; próbki te można wykorzystać do 24 h po hodowli moczu, jeśli były przechowywane w 4 °C). Umieść kasety w cyto-wirówce i wiruj przy 600-800 x g przez 6 min z wysokim przyspieszeniem.
  2. Wyjmij szkiełka i pozostaw do wyschnięcia na noc. Następnego dnia zabarw preparaty za pomocą zestawu do barwienia hematologicznego (np. Wrighta, Giemsy, w tym utrwalacza) zgodnie z protokołem producenta.
  3. Przeanalizuj szkiełka pod mikroskopem świetlnym pod kątem obecności PMN i komórek nabłonkowych. W razie potrzeby można je ocenić za pomocą jakościowej skali punktowej w oparciu o liczebność każdego typu komórek w każdym polu widzenia przy dużym powiększeniu (np. 0=brak, 1=nieliczne, 2=umiarkowane, 3=liczne). Upewnij się, że osoba analizująca szkiełka nie zna przypisania do grup eksperymentalnych, aby zminimalizować potencjalne błędy systematyczne.

6. Obrazowanie pęcherzy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

UWAGA: Tę procedurę można przeprowadzić w dowolnym punkcie czasowym, w którym wymagana jest wizualizacja urothelium. Jak wskazano na Rysunku 1 (fioletowe ramki), interakcje UPEC-urothelium najlepiej wizualizować między 6 h a 24 h po inokulacji UPEC w fazie tworzenia zbiorników, natomiast złuszczanie urothelium wywołane przez G. vaginalis najlepiej wizualizować między 3 h a 12 h po drugiej ekspozycji na G. vaginalis.

  1. Fiksacja pęcherza moczowego in situ
    1. Przygotuj utrwalacz bezpośrednio przed pobraniem pęcherza, dodając glutaraldehyd (stężenie końcowe 2,5%) i paraformaldehyd (stężenie końcowe 2%) do buforu kakodylanowego sodu o stężeniu 0,15 M z dodatkiem 2 mM CaCl2.2 przy pH 7,4. Należy używać paraformaldehydu i glutaraldehydu z nowo otwartych ampułek szklanych, ponieważ oba utrwalacze utleniają się z czasem w otwartych pojemnikach.
      OSTRZEŻENIE: Glutaraldehyd jest toksyczny, drażniący dla dróg oddechowych i żrący; paraformaldehyd jest łatwopalny, rakotwórczy, drażniący i toksyczny dla rozrodczości; k lodylan sodu jest toksyczny i rakotwórczy.
    2. Aby przygotować 50 ml roztworu utrwalającego, należy dodać 6,25 ml 16% paraformaldehydu, 2 ml 50% glutaraldehydu oraz 16,75 ml wody ulticzystej do 25 ml 0,3 M roztworu kdakodylanu sodu o pH 7,4 z dodatkiem 4 mM CaCl2.2.
    3. Podgrzać przygotowany utrwalacz do 37 °C przed podaniem do pęcherzy moczowych.
    4. Napełnić strzykawkę tuberkulinową z końcówką typu slip-tip utrwalaczem i przymocować do jej końca kaniulę, tak aby ścięcie igły było skierowane w stronę przeciwną do oznaczeń na strzykawce. Odciąć nadmiar rurki w odległości 1–2 mm od końcówki igły, uważając, aby nie odsłonić jej czubka. Delikatnie potrząsnąć strzykawką, aby usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie nacisnąć tłok w celu usunięcia powietrza i napełnienia kaniuli utrwalaczem nad probówką do mikrocentryfugi, aby zebrać utrwalacz do późniejszej właściwej utylizacji.
    5. Zanurzyć mysz w narkozie i poddać eutanazji przy użyciu zatwierdzonej metody (np. poprzez zwichnięcie szyjowe pod narkozą). Umieścić mysz na powierzchni sekcyjnej z unieruchomionymi kończynami (za pomocą gumek recepturek lub pinezek). Rozciąć obszar miednicy myszy za pomocą pęsety i nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić pęcherz moczowy. Ostrożnie odsunąć przyległą tkankę tłuszczową, pozostawiając pęcherz w miejscu.
    6. Trzymając strzykawkę w dominującej ręce, skieruj igłę w dół, tak aby skos igły oraz podziałka strzykawki były skierowane w stronę przeciwną do badacza. Zanurz końcówkę cewnika w sterylnym lubrykancie.
    7. Umieść końcówkę cewnika przy ujściu cewki moczowej, trzymając korpus strzykawki w odległości, pod kątem 30-45° kąt nad ciałem myszy.
    8. Wywierając nacisk w dół i wykonując końcówką bardzo niewielki ruch zgodnie z ruchem wskazówek zegara, należy delikatnie wprowadzić cewnik do cewki moczowej. W momencie wprowadzenia końcówki cewnika do cewki moczowej należy odchylić strzykawkę w stronę ogona myszy, kontynuując przesuwanie cewnika w głąb cewki moczowej, aż korpus strzykawki znajdzie się równolegle do powierzchni roboczej. Cały trzon igły cewnika (z wyłączeniem podstawy) powinien zostać wprowadzony do ciała myszy, tak aby końcówka cewnika znajdowała się w świetle pęcherza moczowego.
    9. Powoli podaj 50-80 µL utrwalacza, co powoduje nadmuchanie pęcherza niczym balon. Pozostawić cewnik w miejscu i lekko unieść strzykawkę, kierując końcówkę do góry.
    10. Drugą ręką otwórz kleszczyki hemostatyczne i wsuń jedno z ramion pod igłę cewnika w miejscu przecięcia z cewką moczową. Przymknij częściowo kleszczyki, aż zetkną się one z igłą.
    11. Powoli wysuń igłę cewnika z pęcherza moczowego, jednocześnie całkowicie zaciskając i blokując kleszczyki hemostatyczne, aby zapobiec utracie utrwalacza.
    12. Chwyć kleszczyki hemostatyczne tak, aby znajdowały się równolegle do powierzchni roboczej, na której spoczywa pęcherz. Delikatnie unieś pęcherz i ostrożnie przetnij tkankę pod kleszczykami (po przeciwnej stronie pęcherza), aby usunąć pęcherz wraz z przymocowanymi do niego kleszczykami.
    13. Umieść pęcherz wraz z przymocowanym zaciskiem chirurgicznym w probówce Falcon zawierającej podgrzany utrwalacz. Upewnij się, że pęcherz jest całkowicie zanurzony w cieczy i nie przylega do ścianek probówki. Inkubuj w 4 °C przez 24 h.
  2. Obróbka pęcherza moczowego i obrazowanie z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)
    1. Przetnij pęcherz strzałkowo za pomocą czystej, dwustronnej żyletki, a następnie wykonaj drugie cięcie stycznie do kleszczyków hemostatycznych, aby uwolnić pęcherz. W wyniku tego powstaną dwa półkoliste „kubki” z pęcherza. Jeśli na zewnętrznej stronie pęcherza pozostały jakieś tkanki tłuszczowe, należy je delikatnie usunąć.
    2. Przepłucz połówki pęcherza trzykrotnie (po 10 min każda) w buforze z kodylanem sodu (0,15 M, pH 7,4).
    3. Barwić tkankę 1% czwórmiączkiem osmu w 0,15 M buforze kakodylowym przez 1 h w temperaturze pokojowej. Osmi jest wrażliwy na światło, dlatego ten etap należy przeprowadzić, owijając naczynie do barwienia folią w celu zapewnienia ciemności.
      OSTRZEŻENIE: Tetratlenek osmu jest toksyczny i działa żrąco na skórę. Ten etap należy przeprowadzić w dygestorium, używając rękawic.
    4. Przepłucz obie połowy pęcherza trzykrotnie (po 10 min każdorazowo) w wodzie ultrapurej. Podczas tych etapów na powierzchni wody może pojawić się olej osmowany. Odessaj go lub usuń za pomocą papierowego ręcznika, aby zapobiec zanieczyszczeniom podczas etapów suszenia.
    5. Odwodnij tkanki, zanurzając je w serii roztworów etanolu o rosnącym stężeniu (50, 70, 90, 100 i 100%) na 10 min w każdym z nich.
    6. Osusz utrwaloną tkankę za pomocą suszarki punktu krytycznego, przeprowadzając 12 cykli CO22 wymiany przy najniższej prędkości. Pozostałe ustawienia należy ustawić na wolne, z wyjątkiem etapu odgazowywania, który należy ustawić na szybki.
    7. Przeciąć każdą połowę pęcherza ponownie za pomocą czystej, dwustronnej żyletki, aby uzyskać łącznie 4 fragmenty; pozwoli to zmniejszyć krzywiznę preparatu w celu wydajniejszego napylania, ułatwi obrazowanie w SEM oraz odsłonić tkankę, która mogła się zwinąć podczas suszenia.
    8. Przyklej fragmenty pęcherza do przewodzącej węglowej taśmy adhezyjnej na aluminiowym stubie, a następnie za pomocą wykałaczki nałóż niewielką ilość kleju srebrowego wokół dolnego kontaktu, dbając o to, aby nadmiar kleju nie przeniknął na wewnętrzną powierzchnię pęcherza.
    9. Użyj wysokopróżniowego napylacza do napylenia na uchwyty z próbkami warstwy irydu o grubości 6 nm. Jeśli próbki nadal będą wykazywać efekt ładowania, należy zapewnić ścieżkę przewodzącą do powierzchni za pomocą farby srebrowej, a następnie napylić dodatkowe 4 nm irydu.
    10. Obrazuj próbki przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego. Choć warunki mogą się różnić w zależności od użytego mikroskopu, w przypadku Zeiss Merlin FE-SEM z detektorem elektronów Everharta-Thornleya (SE2) dobre wyniki uzyskano przy napięciu przyspieszającym 3 KeV, prądzie wiązki 200 pA i odległości roboczej 12–13 mm.

Wyniki

Po inokulacji miana UPEC są wykrywalne w moczu (Rysunek 2B). Brak wysiewu próbek moczu na podłoża selekcyjne zawierające kanamycynę prawdopodobnie doprowadzi do przerostu endogennej mikrobioty myszy kontaminującej mocz. Poziom bakteriurii UPEC będzie prawdopodobnie wysoki w dniu 1. i może wzrosnąć w ciągu pierwszego tygodnia, a następnie zmaleć w późniejszych punktach czasowych (Rysunek 2C). Około 65-80% myszy nie będzie wykazywać obecności UPEC w moczu do 28. dnia po inokulacji (dpi) (Rysunek 2C, zielone koło). Myszy te mogą być wykorzystane w kolejnych etapach modelu. Myszy, u których utrzymuje się bakteriuria (Rysunek 2C, czerwona elipsa), powinny zostać wyeliminowane z eksperymentu.

Dwie sekwencyjne ekspozycje na G. vaginalis podane w odstępie 12 h (Rysunek 3A) lub 1 tyg. (Rysunek 3B) prowadzą do wydostania się UPEC z rezerwuarów wewnątrzkomórkowych, co wywołuje nawracającą bakteriurię. Zarówno poziom bakteriurii UPEC (test Manna-Whitneya), jak i odsetek myszy wykazujących rUTI wywołane przez UPEC (dokładny test Fishera) są znacznie wyższe u myszy eksponowanych na G. vaginalis w porównaniu z grupą kontrolną PBS. Analiza cytologiczna moczu wykazała obecność PMN w moczu myszy eksponowanych na G. vaginalis, u których stwierdzono wydostanie się UPEC (Rysunek 3C). W modelu z dwiema ekspozycjami podanymi w odstępie 1 tyg., miana UPEC w tkance pęcherza są niższe u myszy eksponowanych na G. vaginalis w porównaniu do grupy PBS (Rysunek 3D), co prawdopodobnie wynika z wydostania się UPEC z rezerwuarów i następującego po tym oczyszczenia organizmu z bakterii.

Wizualizacja utrwalonej in situ tkanki pęcherza za pomocą SEM wykazuje duże powierzchowne komórki parasolowe urothelium wyściełające powierzchnię pęcherza u myszy kontrolnych eksponowanych wyłącznie na PBS (Rycina 4A). Eksfoliacja urothelium przejawia się utratą powierzchownych komórek parasolowych, odsłaniając mniejsze, podścielające je przejściowe komórki nabłonkowe u myszy eksponowanych na G. vaginalis (Rycina 4B). Wkrótce po inokulacji UPEC, podczas tworzenia się rezerwuarów wewnątrzkomórkowych, UPEC są widoczne na urothelium oraz w postaci filamentów wychodzących z eksfoliujących komórek (Rycina 4C).

Analiza wzrostu bakterii: tworzenie kolonii na agarze, seria rozcieńczeń, oś czasu infekcji myszy, wykres danych.
Rysunek 2. Monitorowanie miana UPEC w moczu podczas Fazy 1 (tworzenie rezerwuaru). (A) Schemat wysiewu jednostek tworzących kolonie (CFU). (B) Reprezentatywne zdjęcie miana UPEC w moczu na podłożu LB+kanamycyna. Czarne okręgi wskazują kropki z próbkami moczu, które należy policzyć w celu obliczenia CFU/mL. (C) Przebieg czasowy bakteriurii UPEC u myszy C57BL/6. Każda linia reprezentuje pojedynczą mysz, śledząc miano UPEC w moczu w czasie. Linia przerywana wskazuje granicę wykrywalności (1000 CFU/mL). Czerwna elipsa wskazuje cztery myszy (z 20), u których nie ustąpiła bakteriuria UPEC, a zatem nie zostałyby one wykorzystane w modelu rUTI indukowanego przez G. vaginalis. Z kolei zielony okrąg wskazuje myszy, u których bakteriuria UPEC ustąpiła i które przeszły do kolejnych faz. (D) Tabela z danymi wykorzystanymi do sporządzenia wykresu w panelu C. Kolor żółty: wykrywalne CFU; kolor zielony: brak CFU. (E) Randomizacja myszy do grup ekspozycyjnych na podstawie punktu czasowego, w którym CFU UPEC nie były już wykrywane w moczu („Dzień ustąpienia”). Numery myszy w lewej kolumnie panelu D są tymi samymi numerami myszy podanymi w panelu E. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Ilościowe oznaczenie UPEC, analiza testem Manna-Whitneya; wykresy i obraz mikroskopowy; badanie infekcji pęcherza moczowego.
Rysunek 3. G. vaginalis wywołuje rUTI przez UPEC. Miana UPEC w moczu po dwóch sekwencyjnych ekspozycjach dróg moczowych na PBS (koła) lub G. vaginalis (Gvag; kwadraty) podanych w odstępie 12 h (A) lub 1 tyg. (B). Każdy symbol reprezentuje pojedynczą mysz. Wykreślono najwyższe wartości CFU/mL UPEC wykryte u każdej myszy między 1. a 3. dobą po drugiej ekspozycji. Myszy bez wykrywalnej bakteryurii zaznaczono na granicy wykrywalności (linia przerywana). (C) Analiza cytologiczna moczu wykazująca UPEC (groty strzałek) oraz komórki wielojądrzaste (PMN) (strzałki). Pasek skali = 20 μm. (D) Miana UPEC w tkankach pęcherza moczowego pobranych 3 dni po dwóch sekwencyjnych ekspozycjach dróg moczowych podanych w odstępie 1 tyg. Każdy symbol reprezentuje inną mysz, a wartości zerowe wykreślono na granicy wykrywalności (linia przerywana). Na wykresach A, B i D ramki odpowiadają pierwszemu i trzeciemu kwartalowi, zaznaczono medianę, a wąsy obejmują zakres od minimum do maksimum. Testy U Manna-Whitneya * P < 0.05; ** P < 0.01; **** P < 0.0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Skaningowa mikroskopia elektronowa struktur powierzchni pęcherza; analiza mikrograficzna wzorów komórkowych.
Rysunek 4. Analiza SEM pęcherzy utrwalonych in situ. Pęcherze pobrano od myszy 3 h po dwóch ekspozycjach (w odstępie 12 h) na PBS (A) lub G. vaginalis (C). Linie przerywane ilustrują pojedynczą komórkę nabłonka moczowego, która jest mniejsza w pęcherzach eksponowanych na G. vaginalis, ponieważ duże komórki powierzchniowe uległy złuszczeniu, odsłaniając leżący pod nimi nabłonek przejściowy. (B) Pęcherz pobrany 6 h po początkowym zaszczepieniu UPEC, podczas Fazy 1 modelu, wykazujący złuszczanie urothelium i pozakomórkowe UPEC. (D) Przykład nierozpuszczalnych kropel tłuszczu obecnych na powierzchni pęcherza. Paski skali wynoszą 20 μm na głównych obrazach i 2 μm w powiększeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Pierwszy krytyczny krok w tym modelu ma na celu identyfikację myszy, które nie usunęły bakteriurii UPEC podczas pierwotnej fazy ZUM. Myszy te muszą zostać usunięte z eksperymentu, ponieważ w przeciwnym razie zakłóciłyby wskaźniki bakteriurii UPEC po ekspozycji na G. vaginalis. Po początkowym zaszczepieniu UPEC mocz powinien być pobierany co tydzień w celu monitorowania klirensu bakteryjnego. Około 65-80% myszy C57BL/6 usunie infekcję UTI89kanR w ciągu 4 tygodni. Inne wsobne szczepy myszy mają różne skłonności do klirensu UPEC 42,43 i tworzenia zbiornika, a zatem mogą nie być odpowiednie dla tego modelu. Drugim krytycznym punktem jest to, że badania empiryczne wykazały, że dwie sekwencyjne inokulacje G. vaginalis (w odstępie 12 godzin lub 1 tygodnia) są konieczne, aby wywołać znaczące pojawienie się rezerwuaru powyżej spontanicznego pojawienia się tła, które występuje u myszy kontrolnych narażonych tylko na PBS. Inne okresy czasu między dwiema sekwencyjnymi ekspozycjami nie zostały przetestowane, ale mogą dać podobne wyniki. Należy zauważyć, że zmniejszenie miana pęcherza moczowego UPEC zaobserwowano tylko w modelu, w którym ekspozycję na G. vaginalis podano w odstępie 1 tygodnia39. Chociaż można podać więcej niż dwie ekspozycje, dowody empiryczne sugerują, że samo wielokrotne cewnikowanie zwiększa pojawianie się, co może zakłócić interpretację wyników lub wymagać większej liczby zwierząt do rozróżnienia różnic między grupami narażenia a grupą kontrolną. Wreszcie, metoda mocowania pęcherza moczowego in situ składa się z kilku krytycznych etapów. Wymagana jest pewna umiejętność, aby zapewnić, że utrwalacz pozostanie w zaciśniętych pęcherzach. Opróżnione pęcherze będą trudniejsze do zobrazowania za pomocą SEM. Ważne jest również, aby zachować bardzo delikatność podczas wstrzykiwania utrwalacza do pęcherza moczowego, ponieważ zeskrobanie nabłonka dróg moczowych za pomocą cewnika zawierającego utrwalacz może wywołać złuszczanie dróg moczowych niezależnie od tego, co jest wywoływane przez G. vaginalis. Wszystkie stężenia wymienione w koktajlu utrwalającym są stężeniami końcowymi. Niewłaściwe proporcje tych czynników mogą skutkować niewystarczającym utrwaleniem i pęcznieniem lub kurczeniem się komórek. Utrwalacze należy ogrzać do temperatury fizjologicznej, aby uniknąć szoku temperaturowego w komórkach i tkankach. Ocieplenie zapewnia również nieznaczną poprawę szybkości dyfuzji utrwalaczy przez błony plazmatyczne. Chociaż barwienie osmem można często pominąć w przypadku próbek przygotowanych do analizy SEM, jest to niezbędny krok w tym protokole, aby ustabilizować lipidy i zapobiec pękaniu błon komórkowych podczas suszenia w punkcie krytycznym.

Protokół ten może być modyfikowany w celu przetestowania innych szczepów UPEC i/lub G. vaginalis pod kątem ich zdolności do tworzenia rezerwuarów i wywoływania ich pojawiania się. Można również dodać inne czynniki eksperymentalne, takie jak narażenie na inne bakterie pochwy (np. Lactobacillus crispatus PVAS100) lub zabity termicznie G. vaginalis, z których żaden nie wykazuje patologii w tym modelu39. Przy wyborze innych szczepów bakteryjnych do testowania, ważne jest, aby wykazać stały wzrost, tak aby standardowe stężenie inokulum mogło być stosowane we wszystkich eksperymentach. Wzrost JCP8151BSmR został zoptymalizowany w komorze beztlenowej. Szczep ten mógłby być prawdopodobnie uprawiany w beztlenowym systemie GasPak, ale wymagałoby to optymalizacji, aby zapewnić solidny wzrost bakterii. Na koniec może być możliwe zmodyfikowanie czasu niektórych kroków w modelu. Na przykład, mocz może być zbierany we wcześniejszych punktach czasowych podczas fazy tworzenia zbiornika UPEC w celu monitorowania reakcji CFU lub gospodarza. W modelu tym nie zaobserwowano niekorzystnego wpływu pobierania próbek moczu we wczesnych punktach czasowych (3, 6, 12 hpi) na postęp infekcji lub tworzenie rezerwuarów. Donoszono, że pojawienie się zbiorników UPEC następuje po dwóch JCP8151B dawkachSmR podanych 12 godzin lub 1 tygodniu, ale inne odstępy czasu nie zostały jeszcze przetestowane. Możliwe jest również skrócenie całkowitego czasu trwania modelu poprzez skrócenie fazy tworzenia się zbiornika UPEC do 2 tygodni (zamiast 4 tygodni), ponieważ wiele myszy usuwa bakteriurię do tego czasu. W poprzednich badaniach oceniających pojawienie się UPEC po ekspozycji pęcherza moczowego na chemiczne środki złuszczające stosowano 1 lub 2 tygodnie fazy tworzenia zbiornika UPEC17,18. Jednak skrócenie czasu usuwania bakteriurii UPEC może odbywać się kosztem konieczności uboju większej liczby zwierząt z doświadczenia. Wreszcie, analizę SEM pęcherza moczowego można przeprowadzić w dodatkowych punktach czasowych, aby obserwować czas trwania działania G. vaginalis na nabłonek dróg moczowych.

Jeśli chodzi o rozwiązywanie problemów, należy wziąć pod uwagę kilka ważnych kwestii, szczególnie w odniesieniu do analizy SEM pęcherza moczowego. W zależności od użytego tła myszy i ilości obecnego stanu zapalnego, niektóre pęcherze będą miały bardzo cienkie ścianki. Pęcherze te mają tendencję do zwijania się bardziej podczas wysychania w punkcie krytycznym i mogą powodować kształt przypominający muszlę cowrie. Jeśli tak się stanie, najlepszą metodą jest przecięcie pęcherza w kształcie muszli na pół wzdłuż zwiniętego interfejsu, a następnie drugi raz, aby usunąć większość zwisającej tkanki. Cięcie działa najlepiej za pomocą obosiecznej żyletki pokrytej PTFE. Nadmiar tłuszczu może czasami rozpuszczać się podczas etapów barwienia osmu. Może to spowodować powstawanie niepożądanych nierozpuszczalnych kropelek tłuszczu, które mogą nie zmyć się podczas etapów płukania i odwadniania i które mogą osadzać się na powierzchni pęcherza podczas późniejszego suszenia. Kropelki te mogą wyglądać zarówno jako małe kule, jak i struktury przypominające dysk rozrzucone po próbce (ryc. 4D). Można to złagodzić, upewniając się, że jak najwięcej tkanki tłuszczowej zostanie usunięte z okolic pęcherza. Powłokę irydową można zastąpić platyną, ale grubość powinna być ograniczona do minimum, aby zmniejszyć maskowanie drobnych szczegółów strukturalnych. Zdecydowanie zaleca się stosowanie stolika obrotowego podczas powlekania.

Jednym z ograniczeń tego modelu jest to, że wymaga on dużej liczby myszy. Tylko 65-80% myszy C57BL/6 usunie bakteriurię UPEC i będzie nadawać się do późniejszej inokulacji G. vaginalis lub PBS (patrz ryc. 2C). Aby uzyskać 10-12 myszy na grupę (inokulacja G. vaginalis vs. PBS), ~30 myszy powinno być początkowo zainfekowanych UPEC. Co więcej, prawdopodobnie konieczne będzie przeprowadzenie wielu eksperymentów w celu uzyskania kontrprób biologicznych niezbędnych do wykrycia istotności statystycznej. Gdy ekspozycje podawano w odstępie 1 tygodnia, pojawienie się UPEC wystąpiło u 14% myszy narażonych na PBS (Figura 3B). Tak więc wykrycie znacznego wzrostu UPEC rUTI u myszy narażonych na kontakt z G. vaginalis w porównaniu z kontrolami PBS (zasilanymi na poziomie 0,8; alfa = 0,05 [jednostronnie]) wymaga przetestowania łącznej sumy co najmniej 40 myszy dla każdej grupy ekspozycji. Dodatkową kwestią jest to, że eksperymenty te są kosztowne i pracochłonne. Myszy muszą być monitorowane co tydzień pod kątem klirensu UPEC, a czas trwania eksperymentu wynosi 4-5 tygodni w zależności od tego, czy G. vaginalis podaje się dwa razy w ciągu 12 godzin, czy dwa razy w odstępie 1 tygodnia. SEM jest pracochłonny i może być kosztowny, w zależności od dostępności mikroskopu i opłat za serwis. Przygotowanie całego pęcherza moczowego do SEM dostarcza obfitego materiału do analizy, ale wadą jest to, że analiza każdego pęcherza może być czasochłonna. W związku z tym jest prawdopodobne, że tylko ograniczona liczba pęcherzy może być analizowana przez SEM w porównaniu z wyższą liczbą zwierząt używaną do określania miana moczu i tkanek. Ponadto uzyskanie wysokiej jakości obrazów zakrzywionych powierzchni "bańek" pęcherza moczowego wymaga umiejętności ze względu na cienie, które mogą utrudniać widoczność. Chociaż SEM pęcherza moczowego jest przydatnym narzędziem do wizualizacji złuszczania urotelialnego, ta metoda jest w dużej mierze jakościowa. Ponieważ próbka jest utrwalona w okrągłym kształcie i ze względu na zastosowanie aldehydu glutarowego w utrwalaczu, badania przesiewowe w kierunku bakterii wykazujących ekspresję fluorescencji za pomocą mikroskopii świetlnej nie są możliwe. Barwienie immunologiczne i barwniki chemiczne są niekompatybilne z tym procesem ze względu na zastosowanie aldehydu glutarowego, który sieciuje większość antygenów i osm, a także maskuje miejsca antygenu i ciemni tkankę. To powiedziawszy, technika SEM jest przydatna w przypadku parametrów, które można ocenić ilościowo bez użycia dodatkowych sond, takich jak rozmiar komórki48,49.

Model ten oferuje kilka zalet wykraczających poza wcześniej opisane metody. Pozwala to na zbadanie mechanizmów UPEC rUTI spowodowanych wydostaniem się z rezerwuarów pęcherza moczowego, w przeciwieństwie do ponownego wprowadzenia do pęcherza moczowego ze źródła zewnętrznego. Inne modele rUTI spowodowane wydostaniem się ze zbiorników pęcherza moczowego wykorzystują środki chemiczne (siarczan protaminy lub chitozan) w celu wywołania złuszczania urotelialnego17,18, które nie byłyby wyzwalaczami rUTI u kobiet. G. vaginalis jest rozpowszechnioną bakterią układu moczowo-płciowego, którą wykryto w moczu pobranym bezpośrednio z pęcherza moczowego poprzez cewnikowanie lub aspirację nadłonową u niektórych kobiet23,26. Fakt ten, w połączeniu ze znanym związkiem między BV (w którym G. vaginalis zarasta w pochwie) a ZUM, sugeruje, że G. vaginalis jest klinicznie prawdopodobnym czynnikiem wyzwalającym rUTI. Wreszcie, metoda mocowania pęcherza moczowego in situ zachowuje ultrastrukturę pęcherza moczowego i ogranicza uszkodzenia, zapewniając, że warstwy pęcherza moczowego nie oddzielają się od siebie. Poprzednie metody wizualizacji nabłonka dróg moczowych tradycyjnie polegały na tym, że użytkownik aseptycznie zbierał, przecinał, rozciągał i przypinał pęcherz moczowy do tacki preparacyjnej przed zanurzeniem rozciągniętego pęcherza w utrwalaczu48. Ta metoda daje bardzo płaską próbkę, ale nie zapewnia równomiernego ani naturalnego rozciągania tkanki i może powodować nadmierne i niedostateczne rozciąganie obszarów (co skutkuje silnie pomarszczoną tkanką) i może powodować oddzielanie się warstwy pęcherza. Ponadto te fizyczne manipulacje pęcherza moczowego w celu rozciągnięcia i przygwożdżenia tkanki mogą powodować uszkodzenia, w tym złuszczanie dróg moczowych. Inną metodą jest zanurzenie nienaruszonych pęcherzy w utrwalaczu przed zatopieniem w parafinie i pobraniem cienkich skrawków za pomocą mikrotomu. Cienkie przekroje są nieocenione w eksperymentach immunohistochemicznych w celu zbadania lokalizacji bakterii i białek gospodarza, ale cienkie przekroje nie pozwalają na wizualizację powierzchni urotelialnej. Ta metoda SEM pozwala na jednoczesne zbadanie powierzchni całego pęcherza moczowego.

Jak opisano, przyszłe zastosowania tego modelu obejmują testowanie innych szczepów UPEC w celu określenia, czy tworzą one rezerwuary wewnątrzkomórkowe oraz testowanie innych szczepów G. vaginalis w celu oceny, czy wywołują one złuszczanie i pojawienie się UPEC powodujące zakażenie układu moczowego. Inne szczepy myszy poza myszami C57BL / 6 mogą być również testowane, chociaż myszy z dużą skłonnością do rozwoju przewlekłego zapalenia pęcherza moczowego (takie jak myszy na tle C3H) nie są zalecane, ponieważ zbyt wiele myszy musiałoby zostać usuniętych z eksperymentu. Dodatkową zaletą myszy C57BL/6 jest to, że na rynku dostępnych jest wiele szczepów z nokautem genetycznym. Takie szczepy dają możliwość zbadania czynników żywicielskich zaangażowanych w tworzenie się zbiorników i/lub powstawanie.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów w związku z tym badaniem.

Podziękowania

Autorzy dziękują Lynne Foster za pomoc techniczną w eksperymentach z infekcjami, Jamesowi Fitzpatrickowi z Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) za dostęp do SEM, Scottowi Hultgrenowi za szczep UTI89kanR UPEC oraz Davidowi Hunstadowi za krytyczną lekturę manuskryptu.

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation (Graduate Research Fellowship to VPO#DGE - 1143954), przez Center for Women's Infectious Disease Research w Washington University School of Medicine (Nagroda za badania pilotażowe dla NMG), przez American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) i #14POST20020011 (NMG), oraz przez National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) i NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, projekt II PI:ALL) oraz K01 DK110225-01A1 (NMG). Niektóre z badań na zwierzętach przeprowadzono w placówce wspieranej przez grant NCRR C06 RR015502. Centrum Obrazowania Komórkowego Uniwersytetu Waszyngtońskiego (WUCCI; gdzie przeprowadzono SEM) i MSJ były wspierane przez Washington University School of Medicine, Children's Discovery Institute of Washington University i St. Louis Children's Hospital (CDI-CORE-2015-505), Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) oraz National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły 30G x 1/2BD305106do cewników
5 1/2 "prosty kleszcz hemostatMcKesson487377in situ mocowanie pęcherza
ACE 600 NapylarkaLeicaSEM Przetwarzanie próbek
SEM TedPella16111Przetwarzanie próbek SEM
Chlorek wapniaEMS12340In situ Mocowanie pęcherza
Przewodzący klej węglowy Tab Ted Pella16084-1Przetwarzanie próbek SEM
Przewodząca srebrnafarba Ted Pella16034Przetwarzanie próbek SEM
CPD 300 Suszarka do punktów krytycznychPrzetwarzanie próbek Leica
SEM Metalowy klips cytolejkowySimportM964Bcytospunowa analiza moczu
EtanolEMS15050Przetwarzanie próbek SEM
Glukoza& nbsp;SigmaG7528dla NYCIII G. vaginalis podłoże wzrostowe
aldehyd glutarowyEMS16320in situ mocowanie pęcherza
Zestaw do barwienia Hema 3Fisher23123869cytospun analiza moczu
HEPESCellgro 25-060-Cldla NYCIII G. vaginalis podłoże wzrostowe
irydTed Pella91120SEM przetwarzanie próbek
izofluoranznieczulenie myszy
kanamycynaGibco11815024dodać do płytek selektywnych UPEC LB (50 ug / ml)
Agar Luria-BertaniBDDF0445174płytki
wzrostowe UPECRosół Luria-BertaniPożywkawzrostowa BDDF0446173
Merlin FE-SEMSkaningowy mikroskop elektronowyZeiss
Oczyszczacz wody Milli-QMilliporeIQ-7000SEM Przetwarzanie próbek
NaCl SigmaS3014dla pożywki wzrostowej NYCIII G. vaginalis
Mikroskop Olympus Vanox AHBT3Olympuscytospun analiza moczu
tetratlenek osmuEMS19170SEM przetwarzanie próbek
paraformaldehyduEMS15710in situ rurki polietylenowe do mocowania pęcherza
moczowego Intramedic427401do cewników
Proteose Peptone #3 Rybacy DF-122-17-4dla NYCIII G. pochwy podłoża wzrostowego
Żyletka z podwójną krawędzią pokryta PTFE PęcherzeEMS72000do SEM
Shandon CytocentrifugeThermo ScientificA78300002cytospun do analizy moczu
Filtr cytolejkowy ShandonM965FWDVcytospunowa analiza moczuShandon
Podwójny cytolejekSimportM964-1Dcytospunowa analiza moczu
Podwójne cytoszkiełka Shandon (powlekane)Thermo Scientific5991055cytospunowa analiza moczu
trójwodny kakodylan soduEMS12310in situ spektrofotometr do utrwalania pęcherza
BioChrom80-3000-45mierzący bakteryjną streptomycynę OD600
Gibco11860038dodać do G. vaginalis płytki selektywne NYCIII (1 mg/ml)
strzykawka z końcówką tuberkulinową309659do cewników
Ekstrakt drożdżowy FisherDF0127-17-9do podłoża wzrostowego NYCIII G. vaginalis
aluminium moczowego UPEC tnące

Bibliografia

  1. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1-13 (2014).
  2. Foxman, B. Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors. American Journal of Public Health. 80 (3), 331-333 (1990).
  3. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113, Suppl 1A 5-13 (2002).
  4. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
  5. Ikaheimo, R., et al. Recurrence of urinary tract infection in a primary care setting: analysis of a 1-year follow-up of 179 women. Clinical Infectious Diseases. 22 (1), 91-99 (1996).
  6. Russo, T. A., Stapleton, A., Wenderoth, S., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Chromosomal restriction fragment length polymorphism analysis of Escherichia coli strains causing recurrent urinary tract infections in young women. Journal of Infectious Diseases. 172 (2), 440-445 (1995).
  7. Luo, Y., et al. Similarity and divergence of phylogenies, antimicrobial susceptibilities, and virulence factor profiles of Escherichia coli isolates causing recurrent urinary tract infections that persist or result from reinfection. Journal of Clinical Microbiology. 50 (12), 4002-4007 (2012).
  8. Schreiber, H. L. t, et al. Bacterial virulence phenotypes of Escherichia coli and host susceptibility determine risk for urinary tract infections. Science Translational Medicine. 9 (382), (2017).
  9. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), 329(2007).
  10. Elliott, T. S., Reed, L., Slack, R. C., Bishop, M. C. Bacteriology and ultrastructure of the bladder in patients with urinary tract infections. Journal of Infection. 11 (3), 191-199 (1985).
  11. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections. Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).
  12. Robino, L., et al. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).
  13. De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. 431 (21), 4368-4379 (2019).
  14. Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
  15. Kerrn, M. B., Struve, C., Blom, J., Frimodt-Moller, N., Krogfelt, K. A. Intracellular persistence of Escherichia coli in urinary bladders from mecillinam-treated mice. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 383-386 (2005).
  16. Eto, D. S., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Actin-gated intracellular growth and resurgence of uropathogenic Escherichia coli. Cellular Microbiology. 8 (4), 704-717 (2006).
  17. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
  18. Blango, M. G., Ott, E. M., Erman, A., Veranic, P., Mulvey, M. A. Forced resurgence and targeting of intracellular uropathogenic Escherichia coli reservoirs. PLoS One. 9 (3), 93327(2014).
  19. Gilbert, N. M., Lewis, A. L. Covert pathogenesis: Transient exposures to microbes as triggers of disease. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007586(2019).
  20. Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Roles of the vagina and the vaginal microbiota in urinary tract infection: evidence from clinical correlations and experimental models. GMS Infectious Diseases. 8, (2020).
  21. Janulaitiene, M., et al. Prevalence and distribution of Gardnerella vaginalis subgroups in women with and without bacterial vaginosis. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 394(2017).
  22. Fredricks, D. N. Molecular methods to describe the spectrum and dynamics of the vaginal microbiota. Anaerobe. 17 (4), 191-195 (2011).
  23. Hilt, E. E., et al. Urine is not sterile: use of enhanced urine culture techniques to detect resident bacterial flora in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 52 (3), 871-876 (2014).
  24. Klein, S., et al. Significant increase in cultivation of Gardnerella vaginalis, Alloscardovia omnicolens, Actinotignum schaalii, and Actinomyces spp. in urine samples with total laboratory automation. European Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 37 (7), 1305-1311 (2018).
  25. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome in urgency urinary incontinence. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 341(2015).
  26. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome: a comparison of women with and without urgency urinary incontinence. mBio. 5 (4), 01283(2014).
  27. Gottschick, C., et al. The urinary microbiota of men and women and its changes in women during bacterial vaginosis and antibiotic treatment. Microbiome. 5 (1), 99(2017).
  28. Malki, K., et al. Genomes of Gardnerella Strains Reveal an Abundance of Prophages within the Bladder Microbiome. PLoS One. 11 (11), 0166757(2016).
  29. Kramer, H., et al. Diversity of the midstream urine microbiome in adults with chronic kidney disease. International Urology and Nephrology. 50 (6), 1123-1130 (2018).
  30. Allsworth, J. E., Peipert, J. F. Prevalence of bacterial vaginosis: 2001-2004 National Health and Nutrition Examination Survey data. Obstetrics & Gynecology. 109 (1), 114-120 (2007).
  31. Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4680-4687 (2011).
  32. Hillier, S. L. Diagnostic microbiology of bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 169 (2), Pt 2 455-459 (1993).
  33. Amatya, R., Bhattarai, S., Mandal, P. K., Tuladhar, H., Karki, B. M. Urinary tract infection in vaginitis: a condition often overlooked. Nepal Medical College Journal. 15 (1), 65-67 (2013).
  34. Harmanli, O. H., Cheng, G. Y., Nyirjesy, P., Chatwani, A., Gaughan, J. P. Urinary tract infections in women with bacterial vaginosis. Obstetrics & Gynecology. 95 (5), 710-712 (2000).
  35. Sharami, S. H., Afrakhteh, M., Shakiba, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology. 27 (3), 252-254 (2007).
  36. Hillebrand, L., Harmanli, O. H., Whiteman, V., Khandelwal, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 186 (5), 916-917 (2002).
  37. Sumati, A. H., Saritha, N. K. Association of urinary tract infection in women with bacterial vaginosis. Journal of Global Infectious Diseases. 1 (2), 151-152 (2009).
  38. Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539(2013).
  39. Gilbert, N. M., O'Brien, V. P., Lewis, A. L. Transient microbiota exposures activate dormant Escherichia coli infection in the bladder and drive severe outcomes of recurrent disease. PLoS Pathogens. 13 (3), 1006238(2017).
  40. Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Uropathogenic Escherichia coli flagella aid in efficient urinary tract colonization. Infection and Immunity. 73 (11), 7657-7668 (2005).
  41. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).
  42. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathogens. 6 (8), 1001042(2010).
  43. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and Immunity. 66 (6), 2798-2802 (1998).
  44. Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (100), e52892(2015).
  45. Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A Murine Model for Escherichia coli Urinary Tract Infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 159-175 (2016).
  46. Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432(2017).
  47. Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral induction of mouse urinary tract infection. Journal of Visualized Experiments. (42), e2070(2010).
  48. O'Brien, V. P., et al. A mucosal imprint left by prior Escherichia coli bladder infection sensitizes to recurrent disease. Nature Microbiology. 2, 16196(2016).
  49. O'Brien, V. P., Dorsey, D. A., Hannan, T. J., Hultgren, S. J. Host restriction of Escherichia coli recurrent urinary tract infection occurs in a bacterial strain-specific manner. PLoS Pathogens. 14 (12), 1007457(2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nawracaj ce zaka enia dr g moczowychmodel mysiskaningowa mikroskopia elektronowafiksacja p cherza moczowegocytologia moczurezerwuary wewn trzkom rkowebakterie uropatogenne
Nawracające zakażenie dróg moczowych Escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego Gardnerella vaginalis u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.