Artykuł metodologiczny

Krystalizacja i oznaczanie strukturalne kompleksu enzyma:substrat za pomocą krystalografii szeregowej w uniwersalnym chipie mikroprzepływowym

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61972

⸱

20 marca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université de Strasbourg, Architecture et Réactivité de l’ARN, UPR 9002, CNRS, Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2Biochemistry and Molecular Biology, Institute for Biochemistry, Leipzig University, 3Paul Scherrer Institute, Swiss Light Source, 4European XFEL GmbH

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano wszechstronne urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia krystalizację enzymu za pomocą metody przeciwdyfuzyjnej, wprowadzenie substratu do kryształów poprzez moczenie, oraz określenie struktury 3D kompleksu enzym:substrat poprzez seryjną analizę kryształów wewnątrz chipa w temperaturze pokojowej.

Streszczenie

Przygotowanie dobrze dyfrakujących kryształów i postępowanie z nimi przed analizą rentgenowską to dwa kluczowe etapy badań biokrystalograficznych. Opisujemy wszechstronny układ mikroprzepływowy, który umożliwia wytwarzanie kryształów za pomocą wydajnej metody przeciwdyfuzji. Środowisko wolne od konwekcji zapewniane przez kanały mikroprzepływowe jest idealne do wzrostu kryształów i przydatne do dyfuzji substratu do miejsca aktywnego enzymu krystalicznego. Tutaj zastosowaliśmy to podejście do enzymu dodającego CCA psychrofilnej bakterii Planococcus halocryophilus w przedstawionym przykładzie. Po krystalizacji i dyfuzji/nasączeniu substratu, strukturę krystaliczną kompleksu enzym-substrat określono w temperaturze pokojowej za pomocą krystalografii szeregowej i analizy wielu kryształów bezpośrednio wewnątrz chipa. Cała procedura zachowuje rzeczywiste właściwości dyfrakcyjne próbek, ponieważ nie wymaga obróbki kryształów.

Wprowadzenie

Krystalografia to metoda do rozszyfrowywania architektury 3D makrocząsteczek biologicznych. To ostatnie jest ważne, aby zrozumieć, w jaki sposób enzym wybiera i przetwarza swoje substraty. Określenie struktury krystalicznej wymaga krystalizacji docelowej makrocząsteczki i kondycjonowania kryształów do ich analizy za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej1. Zarówno przygotowanie, jak i obróbka kryształów są kluczowymi, ale delikatnymi etapami, które mogą wpływać na jakość kryształów i właściwości dyfrakcyjne, a tym samym na rozdzielczość (tj. dokładność) uzyskanej struktury 3D. Aby ułatwić przygotowanie wysokiej jakości kryształów i wyeliminować niepotrzebne czynności związane z obsługą w celu zachowania ich właściwości dyfrakcyjnych, zaprojektowaliśmy przyjazne dla użytkownika i wszechstronne urządzenie mikroprzepływowe o nazwie ChipX2,3,4.

W tym artykule pokażemy, jak załadować roztwór białka do kanałów ChipX za pomocą konwencjonalnego materiału laboratoryjnego do przygotowania kryształów metodą przeciwdyfuzji. Ta metoda krystalizacji zapewnia skuteczne badanie przesiewowe przesycenia i potencjalnych warunków zarodkowania wzdłuż kanałów mikroprzepływowych zawierających roztwór enzymu ze względu na gradient stężeń generowany przez dyfuzję czynnika krystalizującego5,6.

Konfiguracja chipa jest prosta, wykorzystuje tylko standardowe pipety laboratoryjne i nie wymaga żadnego kosztownego sprzętu. Kiedy kryształy wyrosną w ChipX, ligandy enzymu mogą zostać wprowadzone przez dyfuzję. Dane dyfrakcyjne są następnie zbierane w temperaturze pokojowej na szeregu kryształów zawartych w kanałach chipa za pomocą synchrotronowego źródła promieniowania rentgenowskiego. Opisane tu badania strukturalne doprowadziły do wyznaczenia struktur enzymu dojrzewania tRNA w postaci apo oraz w kompleksie z analogiem jego substratu CTP wprowadzonego przez namaczanie. Białko to, zwane enzymem dodającym CCA, polimeryzuje ogon trójnukleotydowy CCA na końcu 3' tRNA. Porównanie dwóch obrazów 3D uzyskanych za pomocą krystalografii szeregowej ujawnia lokalne zmiany konformacyjne związane z wiązaniem liganda w warunkach, które są bardziej fizjologiczne niż te stosowane w kriokrystalografii. Protokół opisany w tym filmie ma ogólne zastosowanie do każdej biomolekuły, czy to białka, kwasu nukleinowego czy kompleksu wieloskładnikowego.

Protokół

1. Konfiguracja testów krystalizacji w ChipX

UWAGA: Urządzenie mikroprzepływowe ChipX można uzyskać od autorów. Opis chipa znajduje się w Rysunek 1. Roztwory zawierające krystalant (lub czynnik krystalizujący) używany do wywołania krystalizacji mogą być pochodzenia handlowego lub przygotowane przez eksperymentatora.

  1. Ładowanie próbki biomolekuły
    UWAGA: Objętość próbki faktycznie wymagana do przeprowadzenia indywidualnego testu przeciwdyfuzyjnego w prostym odcinku każdego kanału ChipX wynosi 300 nL. Jednak dla wygody sugerujemy załadowanie 5 μl, aby całkowicie wypełnić osiem kanałów, biorąc pod uwagę zmienną długość ich zakrzywionej sekcji i martwe objętości wlotu.
    1. Odmierzyć pipetę o pojemności 5 μl roztworów enzymatycznych za pomocą standardowej pipety i końcówki o pojemności 10 μl.
    2. Wprowadzić końcówkę pionowo do wlotu próbki i wstrzykiwać roztwór, aż osiem kanałów zostanie wypełnionych do ich przeciwległego końca (wejście do zbiornika krystalicznego).
    3. Wstrzyknąć 1 μl oleju parafinowego do wlotu próbki w celu odłączenia kanałów od siebie.
    4. Odzyskać dodatkowy roztwór w krystalicznym zbiorniku na końcu każdego kanału, używając standardowej pipety o pojemności 10 μl.
    5. Uszczelnij wlot próbki kawałkiem taśmy o wymiarach 1 cm x 1 cm.
  2. Ładowanie roztworów krystalizacyjnych
    1. Odmierzyć pipetą 5 μl roztworu krystalizacyjnego za pomocą standardowej pipety i końcówki o pojemności 10 μl. Pojemność zbiornika wynosi 10 μl, ale załadowanie tylko połowy pozwala uniknąć przepełnienia podczas uszczelniania taśmą i ułatwia dalsze dodawanie liganda do eksperymentów z namaczaniem. Jeżeli początkowe warunki krystalizacji uzyskano przez dyfuzję pary, należy zwiększyć stężenie krystalantu o współczynnik 1,5 - 2. Roztwory mogą być różne w każdym zbiorniku (w prezentowanym przypadku użyto 1 M wodorofosforanu dwuamonu, 100 mM octanu sodu, pH 4,5 w całym zbiorniku).
    2. Skierować końcówkę pipety w kierunku wejścia do kanału w lejkowatej części zbiornika, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas osadzania roztworu. Zapobiegłoby to kontaktowi między dwoma roztworami i krystalicznej dyfuzji do kanału.
    3. Wstrzyknąć krystaliczny roztwór do zbiornika.
    4. Uszczelnij zbiorniki kawałkiem taśmy o wymiarach 2,5 cm x 1 cm.
    5. Inkubuj chip w temperaturze 20 °C (temperaturę można regulować w zależności od celu, zwykle od 4 do 37 °C 4).

2. Znakowanie białek karboksyrodaminą do wykrywania fluorescencji

UWAGA: Ten krok jest opcjonalny. Należy to wykonać przed załadowaniem próbki, aby ułatwić wykrywanie kryształów w chipie za pomocą fluorescencji. Szczegółowa metoda znakowania śladowego fluorescencyjnego została opisana przez Puseya i współpracowników7. Wszystkie kroki odbywają się w temperaturze pokojowej.

  1. Rozpuścić 5 mg sproszkowanego estru karboksyrodaminy w 1 ml bezwodnego dimetyloformamidu, rozdzielić roztwór na 0,6 μl podwielokrotności przeznaczonych do przechowywania w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować 1 M roztwór podstawowy Na-boranu o pH 8,75.
  3. Rozcieńczyć podstawę, aby przygotować bufor reakcyjny przy 0,05 M pH Na-boranu 8,75.
  4. Przepłukać kolumnę odsalającą (7 kDa MWCO, 0,5 ml) 800 μl buforu reakcyjnego.
  5. Odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 1400 x g, usunąć filtrat.
  6. Powtórz tę operację dwukrotnie (kroki 2.4-2.5), aby umyć kolumnę.
  7. Umieścić 80 μl białka w buforze do przechowywania w kolumnie (białko można rozcieńczyć do 1 mg/ml, aby w razie potrzeby zwiększyć objętość).
  8. Odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 1400 x g. Ten etap ma na celu przeniesienie białka z buforu magazynującego do buforu reakcyjnego.
  9. Odzyskać przepływ (zawierający białko w buforze reakcyjnym) i wymieszać go z 0,6 μl roztworu karboksyrodaminy.
  10. Inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej.
  11. W międzyczasie przepłukać kolumnę 3 x buforem magazynującym, odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 1400 x g i wyrzucić filtrat.
  12. Umieścić roztwór reakcyjny na kolumnie.
  13. Odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 1400 x g i odzyskać przepływ (tj. roztwór znakowanego białka w buforze do przechowywania).
  14. Uzupełnić podstawowy roztwór białkowy o 0,1-1 % (w/w) znakowanego białka.
  15. Ustaw testy krystalizacji ChipX zgodnie z opisem w sekcji 1.
  16. Sprawdź obecność kryształów białka w testach, wzbudzając sondę fluorescencyjną źródłem światła o długości fali 520 nm.

3. Obserwacja kryształów

UWAGA: Z urządzeniem ChipX można obchodzić się bez specjalnej ostrożności, nawet z kryształami w środku, chyba że temperatura musi być kontrolowana.

  1. Użyj dowolnego mikroskopu stereoskopowego, aby sprawdzić wynik testów krystalizacji w ChipX. Jego podstawa ma standardowe wymiary szkiełek mikroskopowych i jest kompatybilna z dowolnym systemem i uchwytem do szkiełek.
  2. Sprawdzić zawartość kanałów mikroprzepływowych, zaczynając od zbiornika, w którym stężenie krystalicznych jest najwyższe, do wlotu próbki, gdzie stężenie krystalantu jest najniższe. Materiał ChipX jest przezroczysty dla światła widzialnego, kompatybilny z użyciem polaryzatorów, a także z oświetleniem UV do identyfikacji kryształów białkowych za pomocą wewnętrznej fluorescencji tryptofanu8.
  3. Rejestruj pozycje kryształów za pomocą etykiet wytłoczonych wzdłuż kanałów lub zaznacz lokalizacje kryształów trwałym markerem, rysując kolorowe kropki obok nich na powierzchni chipa.

4. Moczenie kryształów z ligandami

UWAGA: Ta procedura jest opcjonalna. Służy do wprowadzania ligandów, substratów enzymatycznych lub ciężkich atomów do kryształów i powinien być przeprowadzany co najmniej 24-48 godzin przed analizą rentgenowską, aby umożliwić dyfuzję związku wzdłuż kanałów i do kryształów.

  1. Delikatnie usuń taśmę uszczelniającą ze zbiorników.
  2. Dodać do 5 μl roztworu liganda do jednego lub kilku zbiorników za pomocą mikropipety o pojemności 10 μl (w przykładzie dodano 3 μl 10 mM roztworu trifosforanu cytydyny-5'-[(α,β)-metyleno] (CMPcPP), aby uzyskać końcowe stężenie 3,75 mM). CMPcPP jest niehydrolizowalnym analogiem CTP, naturalnego substratu enzymu.
  3. Uszczelnij zbiorniki kawałkiem taśmy o wymiarach 2,5 cm x 1 cm.
  4. Inkubować chip w kontrolowanej temperaturze przez 24-48 godzin, aby umożliwić dyfuzję liganda wzdłuż kanałów chipa.

5. Analiza kryształów metodą krystalografii szeregowej

UWAGA: Ta część protokołu musi być dostosowana w zależności od konfiguracji linii badawczej i właściwości dyfrakcyjnych kryształów. Podano jedynie ogólne wskazania do analizy krystalograficznej na podstawie doświadczeń przeprowadzonych na linii X06DA (SLS, Villigen, Szwajcaria).

  1. Montaż ChipX na goniometrze linii badawczej
    UWAGA: Plik do drukowania 3D uchwytu ChipX znajduje się w ref4.
    1. Wyłącz kriodyszę linii badawczej. Analizę tutaj przeprowadza się w temperaturze pokojowej.
    2. Zamontuj ChipX na dedykowanym uchwycie z kanałem zawierającym kryształy do analizy umieszczonym pośrodku uchwytu. ChipX holder4 nie wymaga żadnej ani dodatkowej części, ponieważ został zaprojektowany tak, aby zapewnić idealne dopasowanie do ChipX.
    3. Przymocuj uchwyt do goniometru.
  2. Gromadzenie danych
    1. Zorientuj najgrubszą warstwę (górna warstwa, Rysunek 1) ChipX (w tej orientacji etykiety wzdłuż kanałów są bezpośrednio czytelne za pomocą kamery centrującej linii badawczej), w kierunku bezpośredniej wiązki i najcieńszej powierzchni za kryształem, aby zminimalizować tłumienie sygnału dyfrakcyjnego, jak opisano w ref3.
    2. Aby uniknąć kolizji ChipX z otaczającym materiałem (beamstop, kolimator), należy ograniczyć ruchy goniometru w zakresie ±30° (0° odpowiada kanałom prostopadłym do wiązki promieniowania rentgenowskiego).
    3. Znajdź pozycję kryształów za pomocą etykiet wytłoczonych wzdłuż kanałów.
    4. Wybierz pozycję kryształu.
    5. Wyśrodkuj kryształ za pomocą standardowej siatki/rastrowej siatki o niskiej dawce lub procedury 1-kliknięcia (film pokazuje przykład przesiewania siatki).
    6. Zbieraj dane dyfrakcyjne w zakresie -30° / +30°.
    7. Uruchom ponownie procedurę w krokach 5.2.4-5.2.6 na innym krysztale w tym samym kanale po translacji chipa.
    8. Ręcznie wyrównaj kolejny kanał ChipX na środku uchwytu i kontynuuj zbieranie danych na kryształach obecnych w tym kanale.
    9. Użyj standardowych pakietów i procedur krystalograficznych do przetwarzania i scalania danych, a następnie do rozwiązywania i udoskonalania struktury.

Wyniki

Opisany tutaj chip mikrofluidyczny został zaprojektowany w celu umożliwienia łatwego przygotowania testów krystalizacji oraz analizy kryształów w temperaturze pokojowej. Procedura opisana powyżej oraz w filmie została zastosowana w ramach charakterystyzacji strukturalnej enzymu dodającego sekwencję CCA z bakterii psychrofilnej Planococcus halocryophilus. Enzym ten należy do kluczowej rodziny polimeraz katalizujących sekwencyjne przyłączanie sekwencji 3' CCA do tRNA przy wykorzystaniu CTP i ATP9,10.

Układ scalony został najpierw wykorzystany do przygotowania kryształów enzymu do analizy strukturalnej metodą przeciwdyfuzji. W tym celu roztwór enzymu wprowadzono do ośmiu kanałów mikroprzepływowych (komór krystalizacyjnych) poprzez pojedynczą iniekcję w wlocie dla próbek układu (patrz Rysunek 1). Enzym zastosowano w stężeniu 5,5 mg/mL w buforze do przechowywania zawierającym 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 200 mM NaCl oraz 5 mM MgCl2. Etap ten wykonano ręcznie za pomocą standardowej mikropipety 10 µL. Następnie w zbiornikach na przeciwległym końcu kanałów umieszczono roztwory krystalizacyjne (100 mM octanu sodu pH 4,5, 1 M wodorofosforanu diamonu).

Procedura ładowania jest prosta i nie trwa dłużej niż pięć minut (Rysunek 2). Następnie substancja krystalizująca dyfunduje do kanałów, tworząc gradient stężenia, który inicjuje nukleację i wzrost kryształów. Gradient ten ewoluuje dynamicznie i obejmuje kontinuum stanów nasycenia5,6 aż do osiągnięcia stanu równowagi stężenia substancji krystalizującej pomiędzy kanałami a rezerwuarem. Testy krystalizacji są zazwyczaj monitorowane pod mikroskopem w okresie od 2 do 4 tygodni w celu śledzenia wzrostu kryształów. Bipiramidalne kryształy enzymu dodającego CCA pojawiły się w kanałach po kilku dniach inkubacji w temperaturze 20 °C (Rysunek 3). Opcjonalne znakowanie fluorescencyjne7 białka znacznie ułatwia identyfikację kryształów białkowych i ich odróżnienie od kryształów soli (Rysunek 4).

Wykorzystano środowisko dyfuzyjne w kanałach układu mikroprzepływowego do dostarczenia substratu do enzymu odpowiedzialnego za wzrost kryształów. W niniejszym przypadku do roztworów w zbiornikach dodano CMPcPP, analog CTP, w końcowym stężeniu 3,75 mM (Rysunek 5). Dodanie to wykonano dwa dni przed analizą krystalograficzną, aby umożliwić CMPcPP dotarcie do centrum katalitycznego enzymu i jego zajęcie, co zostało później potwierdzone przez strukturę kryształu (patrz poniżej).

Wytworzyliśmy uchwyt do chipa (Rysunek 6) z kwasu polimlekowego przy użyciu drukarki 3D. Uchwyt umożliwia montaż chipa na goniometrach z wykorzystaniem standardowych głowic magnetycznych. Dzięki temu chip może być łatwo pozycjonowany i przesuwany w wiązce promieni X, aby ustawić kryształy w pozycji dyfrakcyjnej. Strategia zbierania danych musi zostać dostosowana w zależności od charakterystyki linii wiązki oraz właściwości kryształu. W przypadku enzymu dodającego CCA dane zbierano na liniach wiązek X06DA i X10SA w Swiss Light Source (SLS), przy długości fali promieniowania X wynoszącej 1,0 Å i z użyciem detektorów pikselowych Pilatus 2M-F oraz 6M odpowiednio. Dla każdego kryształu w temperaturze pokojowej zebrano dane z zakresu rotacji 30-60° z obrazami co 0,1° lub 0,2° i czasem ekspozycji 0,1 s (patrz Tabela 1). Częściowe zestawy danych przetwarzano indywidualnie i obcinano w momencie, gdy rozdzielczość wzorów dyfrakcyjnych zaczęła spadać z powodu uszkodzeń radiacyjnych (wykrytych poprzez spadek stosunku sygnału do szumu Równanie równowagi statycznej ⟨|σ(l)|⟩, reprezentacja symboliczna, użytek edukacyjny, koncepcja fizyczna. i CC1/2, a także wzrost Rmeas w powłoce wysokiej rozdzielczości). Pełne zestawy danych odtworzono poprzez scalenie danych z 5 kryształów (Tabela 1). Struktury kryształów wyznaczono metodą wymiany molekularnej, korzystając ze standardowych pakietów krystalograficznych i procedur przetwarzania danych11 oraz uszlachetniania12. Porównanie struktur enzymu oraz jego kompleksu z CMPcPP ujawnia lokalną adaptację konformacyjną, która towarzyszy wiązaniu substratu w centrum aktywnym enzymu dodającego CCA (Rysunek 7).

Schemat urządzenia mikrofluidycznego; kanały, wlot próbki, zbiorniki opisane do analizy płynów.
Figura 1: Konstrukcja ChipX. Chip składa się z górnej warstwy wykonanej z COC (grubość: 1 mm), w której odciśnięto osiem kanałów mikrofluidycznych i zbiorników. Cały chip jest uszczelniony warstwą COC (grubość: 0,1 mm). Wszystkie kanały są połączone z pojedynczym wlotem po lewej stronie w celu jednoczesnej iniekcji próbek oraz z poszczególnymi zbiornikami po prawej stronie, do których naniesione są roztwory krystalizacyjne. Kanały, które stanowią właściwe komory krystalizacji chipa, mają długość 4 cm i przekrój 80 µm x 80 µm. Etykiety (A1, A2, A3 itd.) wytłoczone wzdłuż kanałów ułatwiają pozycjonowanie kryształów pod mikroskopem oraz przygotowanie listy próbek do gromadzenia danych. ChipX ma rozmiar standardowego szkiełka przedmiotowego (7,5 cm x 2,5 cm). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Schemat procesu krystalizacji białek z wykorzystaniem chipa mikroprzepływowego do precyzyjnego mieszania roztworów.
Rysunek 2: Przygotowanie testów krystalizacji w ChipX. 1) Nanieść 5-6 µL roztworów enzymu za pomocą standardowej pipety 10 µL i końcówki. 2) Wprowadzić końcówkę pionowo do wlotu próbki i wstrzyknąć roztwór do ośmiu kanałów. 3) Nabrać 1 µL oleju parafinowego. 4) Wprowadzić końcówkę pionowo do wlotu próbki i wstrzyknąć olej w celu odseparowania od siebie kanałów. 5) Uszczelnić wlot kawałkiem taśmy. 6) Nabrać 5 µL roztworu krystalizacyjnego za pomocą standardowej pipety 10 µL i końcówki. Roztwory w każdym zbiorniku mogą być różne (np. z zestawu przesiewowego). 7) Skierować końcówkę pipety w stronę wejścia do kanału w lejkowatej części zbiornika (aby uniknąć powstania pęcherzyka powietrza podczas nanoszenia roztworu) i wstrzyknąć roztwór krystalizacyjny do zbiornika. 8) Uszczelnić zbiorniki kawałkiem taśmy i inkubować chip w kontrolowanej temperaturze. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Proces krystalografii na obrazach z mikroskopu; sekwencja wzrostu kryształów, widoczne paski skali.
Rycina 3: Kryształy enzymu dodającego CCA, wyhodowane metodą przeciwdyfuzji w kanałach mikrofluidycznych ChipX. Pasek skali wynosi 0.1 mm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Schemat badania wiązania białek, przedstawiający proces pipetowania roztworu liganda na chipie mikromacierzy.
Rysunek 4: Procedura namaczania kryształów. 1) Ostrożnie usuń taśmę z rezerwuarów. 2) Nanieś do 5 µL roztworu liganda za pomocą mikropipety 10 µL. 3) Dodaj ligand do jednego lub kilku rezerwuarów. 4) Ponownie zabezpiecz rezerwuary kawałkiem taśmy i inkubuj chip w kontrolowanej temperaturze przez 24-48 h przed rozpoczęciem zbierania danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment krystalograficzny; obraz mikroskopowy struktur krystalicznych, pokazany schemat cząsteczkowy.
Rysunek 5: Śladowe znakowanie fluorescencyjne odróżnia kryształy białka (po lewej) od kryształów soli (po prawej). Roztwór enzymu dodającego CCA zawierał 0,4 % (w/w) białka znakowanego karboksyrodaminą. Po prawej stronie kryształy są oświetlone źródłem światła o długości fali 520 nm, a obraz został wykonany z użyciem filtra dolnoprzepustowego 550 nm (LP550); (wstawka) struktura estru sukcynimidylowego karboksyrodaminy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ krystalografii rentgenowskiej, schemat i sprzęt do analizy strukturalnej, badania dyfrakcyjnego.
Rycina 6: (Po lewej) Rysunek uchwytu ChipX oraz (po prawej) ChipX zamontowany na goniometrze linii wiązki X06DA w SLS (Villigen, Szwajcaria) do seryjnej analizy kryształów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dopasowanie struktury białka z mapą gęstości elektronowej; wizualizacja oddziaływań aminokwasowych.
Rycina 7: Porównanie centrum aktywnego enzymu dodającego CCA w formie apo (kolor różowy) oraz w kompleksie z analogiem CTP (kolor zielony). Mimo że ogólna konformacja enzymu nie uległa zmianie, wiązanie ligandu CMPcPP wiąże się z niewielką reorganizacją łańcuchów bocznych w centrum aktywnym. Mapa gęstości elektronowej 2Fo-Fc (kolor niebieski) została wyrysowana dla poziomu 1,2 sigma. Mapa różnicowej gęstości elektronowej wyrysowana dla poziomu 4 sigma (kolor zielony) potwierdza obecność ligandu w centrum aktywnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Skrystalizowana próbkaenzym dodający CCAenzym dodający CCA + CMPcPP
Analiza kryształów
Linia wiązki promieniowania rentgenowskiegoSLS – X06DASLS – X10SA 
Długość fali (Å)1.0001.000
Temperatura (K)293293
DetektorPilatus 2M-FPilatus 6M
Odległość kryształ-detektor (mm)300400
Zebrane kryształy614
Wybrane kryształy55
zakres obrotu na obraz (°)0.10.2
Czas ekspozycji na obraz (s)0.10.1
Liczba wybranych obrazów1000540
Całkowity zakres obrotu (°)100108
Grupa przestrzennaP43212P43212
a, c (Å)71.5, 293.871.4, 293.6
Średnia mozaikowość (°)0.040.04
Zakres rozdzielczości (Å)46 – 2.54 (2.6 – 2.54)48 – 2.3 (2.4 – 2.3)
Całkowita liczba refleksów176105 (9374)232642 (32937)
Liczba unikalnych refleksów23922 (1598)34862 (4066)
Kompletność (%)90.6 (84.6)99.5 (100.0)
Redundancja7.5 (6.0)6.7 (8.1)
Równanie równowagi statycznej ⟨|σ(l)|⟩, reprezentacja symboliczna, zastosowanie edukacyjne, pojęcie fizyczne.8.1 (1.3)6.9 (0.7)
Rpom (%) §18.6 (126.0)18.0 (231.2)
CC1/2 (%) £98.7 (55.0)98.7 (46.9)
Ogólny czynnik B z wykresu Wilsona (Ų)2)57.460.6
Udoskonalenie krystalograficzne
Liczba refleksji, zbiór roboczy / zbiór testowy23583 / 118034840 / 3405
Końcowe Rcryst (%) / Rwolny (%)18.8 / 21.420.0 / 22.9
Liczba atomów innych niż wodór: całkowita / białko / ligand / rozpuszczalnik2998 / 2989 / 0 / 93057 / 2989 / 29 / 10
Odchylenia r.m.s. dla wiązań (Å) / kątów (°)0.009 / 1.230.010 / 1.22
Średnie czynniki B (Ų2): całkowity / białko / ligand / rozpuszczalnik60.1 / 60.1 / 0 / 52.762.5 / 62.6 / 60.1 / 55.5 
Wykres Ramachandrana: obszary najbardziej preferowane (%) / dopuszczalne (%)98.1 / 1.997.2 /  2.8
Id PDB6IBP6Q52

Tabela 1: Statystyki zbierania i udoskonalania danych

§ Niezależna od redundancji wartość Rmeas = Σhkl(N/N-1)1/2Σi | Ii(hkl)- (hkl)>| / ΣhklΣi Ii(hkl), gdzie N oznacza wielokrotność danych 17.

Dane o niskim stosunku w zewnętrznej powłoce (<2.0) zostały uwzględnione na podstawie kryterium CC1/2 (korelacja między dwiema losowymi połowami zbioru danych > 50%), zgodnie z propozycją Karplusa i Diederichsa 18.

Dyskusja

Obecne protokoły w biokrystalografii obejmują przygotowanie kryształów przy użyciu metod takich jak dyfuzja parowa lub partia13, 14 i przeniesienie ich do mikropętli w celu chłodzenia kriogenicznego15, 16 przed wykonaniem analizy dyfrakcyjnej w strumieniu azotu w warunkach kriogenicznych. W przeciwieństwie do tego, bezpośrednie chłodzenie kryształów nie jest możliwe w ChipX3 , a kryształy nie mogą być ekstrahowane z ich kanału mikroprzepływowego, co może być postrzegane jako ograniczenia tej konfiguracji. Jednak protokół opisany w artykule zapewnia w pełni zintegrowany potok do oznaczania struktur krystalicznych w temperaturze pokojowej (tj. w bardziej fizjologicznych warunkach). Mimo że gromadzenie danych w temperaturze pokojowej powoduje wzrost uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem19, efekt ten jest równoważony przez szybki czas zbierania danych (na każdym krysztale zbierany jest maksymalnie obrót o 60°) oraz przez łączenie kilku częściowych zestawów danych. Zarówno konstrukcja, jak i materiał ChipX zostały zoptymalizowane w celu zmniejszenia rozpraszania tła i tłumienia sygnału dyfrakcyjnego3, a gromadzenie danych można przeprowadzić na kryształach o wymiarach odpowiadających połowie rozmiaru kanałów (40 μm)4.

Podsumowując, główne zalety protokołu są następujące. Kryształy są wytwarzane w środowisku wolnym od konwekcji (kanały mikroprzepływowe), co jest bardzo korzystne dla wzrostu kryształów wysokiej jakości. Metoda przeciwdyfuzji zaimplementowana w ChipX jest bardzo skuteczna w przesiewaniu krajobrazu przesycenia; Dyfuzja krystalikantów do kanału chipowego tworzy falę koncentracji i przesycenia, która pomaga określić odpowiednie warunki zarodkowania i wzrostu5. Kryształy nigdy nie są poddawane bezpośredniej obróbce, ale są analizowane in situ, wewnątrz chipa, co pozwala zachować ich rzeczywiste właściwości dyfrakcyjne (tj. nie zmienia mozaikowości kryształów przez oddziaływanie fizyczne lub kriochłodzenie)20. Analiza dyfrakcyjna jest przeprowadzana na serii kryształów rozmieszczonych wzdłuż kanałów chipowych z niską ekspozycją na dawkę w celu zminimalizowania uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, a pełny zestaw danych jest składany przez połączenie częściowych danych z serii. Standardowa powierzchnia i prosta konstrukcja ChipX pozwolą w przyszłości na pełną automatyzację zbierania danych in situ przy użyciu urządzeń synchrotronowych lub XFEL. Wszystkie kroki protokołu są wykonywane w ChipX. Z punktu widzenia eksperymentatora, konfiguracja chipa jest prosta i łatwa do wykonania przy użyciu standardowych pipet i nie wymaga żadnego dodatkowego sprzętu. Przypominające drzewo połączenie kanałowe na wlocie próbki minimalizuje martwe objętości w systemie, co jest ważne podczas pracy z próbkami, które są trudne do oczyszczenia lub które są dostępne tylko w ograniczonej ilości.

Podsumowując, podejście lab-on-a-chip wdrożone w ChipX upraszcza i skutecznie miniaturyzuje proces krystalizacji poprzez przeciwdyfuzję i określanie struktury krystalicznej, umożliwiając przejście od próbki do jej struktury 3D w jednym urządzeniu. Ma szerokie zastosowanie i oferuje przyjazne dla użytkownika, ekonomiczne rozwiązanie do rutynowych seryjnych badań biokrystalograficznych w temperaturze pokojowej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Swiss Light Source (Villigen, Szwajcaria) za przydzielenie czasu wiązki do projektu na liniach badawczych X10SA (PXII) i X06DA (PXIII), Alexandrze Bluhm za jej wkład w udoskonalenie konstrukcji, Clarissie Worsdale za nagranie lektora oraz François Schnellowi (Université de Strasbourg) za pomoc w montażu wideo i SFX. Prace te były wspierane przez francuskie Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Uniwersytet w Strasburgu, konsorcjum LabEx "NetRNA" (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), finansowanie studiów doktoranckich dla R.dW z inicjatywy doskonałości (IdEx) Uniwersytetu w Strasburgu w ramach francuskiego programu narodowego "Investissements d'Avenir", sfinansowanie doktoranckie dla K.R. z Uniwersytetu Francusko-Niemieckiego (UFA-DFH, Nr dotacji CT-30-19), Deutsche Forschungsgemeinschaft (grant nr Mo 634/10-1). Autorzy skorzystali z programu współpracy PROCOPE Hubert Curien (francuskie Ministerstwo Spraw Zagranicznych i Deutscher Akademischer Austauschdienst).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop stereoskopowy Aksjoskop A1Obserwacja ZeissCrystal  (Krok 3)
Ester sukcynimidylowy karboksyrodaminyInvitrogenC-6157Znakowanie białek (krok 2)
CMPcPPJena BioscienceNU-438Namaczanie kryształów (krok 4)
Krystalicznie czysta taśma uszczelniającaHampton researchHR3-511Uszczelnienie ChipX  (krok 1)
Olej parafinowyHampton researchHR3-411ChipX ładowanie  (krok 1)
Ultimaker 2 extended+Ultimaker- Reprezentatywne wyniki
Źródło światła UVXtal Concepts GmbhXtalLight100cObserwacja kryształów  (Krok 3)
Kolumna odsalająca wirowa Zeba 7K MWCOThermoFisher Scientific89882Etykietowanie białek  (Krok 2)
Drukarka 3D

Bibliografia

  1. Giegé, R., Sauter, C. Biocrystallography: past, present, future. HFSP Journal. 4 (3-4), 109-121 (2010).
  2. Dhouib, K., et al. Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis. Lab on a Chip. 9 (10), 1412-1421 (2009).
  3. Pinker, F., et al. ChipX: A Novel Microfluidic Chip for Counter-Diffusion Crystallization of Biomolecules and in Situ Crystal Analysis at Room Temperature. Crystal Growth & Design. 13 (8), 3333-3340 (2013).
  4. de Wijn, R., et al. A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography. IUCrJ. 6 (3), 454-464 (2019).
  5. García-Ruiz, J. M. A supersaturation wave of protein crystallization. Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 149-155 (2001).
  6. Otálora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., García-Ruiz, J. M. Counterdiffusion methods applied to protein crystallization. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).
  7. Pusey, M., Barcena, J., Morris, M., Singhal, A., Yuan, Q., Ng, J. Trace fluorescent labeling for protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (7), 806-814 (2015).
  8. Meyer, A., Betzel, C., Pusey, M. Latest methods of fluorescence-based protein crystal identification. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (2), 121-131 (2015).
  9. Betat, H., Rammelt, C., Mörl, M. tRNA nucleotidyltransferases: ancient catalysts with an unusual mechanism of polymerization. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (9), 1447-1463 (2010).
  10. Ernst, F. G. M., Erber, L., Sammler, J., Jühling, F., Betat, H., Mörl, M. Cold adaptation of tRNA nucleotidyltransferases: A tradeoff in activity, stability and fidelity. RNA Biology. 15 (1), 144-155 (2018).
  11. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  12. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  13. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein Crystallization for X-ray Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (47), e2285(2011).
  14. Sauter, C., Lorber, B., McPherson, A., Giegé, R. Crystallization - General Methods. International Tables of Crystallography, Vol. F, Crystallography of Biological Macromolecules. Arnold, E., Himmel, D. M., Rossmann, M. G. , 99-120 (2012).
  15. Garman, E. "Cool" crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage. Current Opinion in Structural Biology. 13 (5), 545-551 (2003).
  16. Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4001(2012).
  17. Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4 (4), 269-275 (1997).
  18. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  19. de la Mora, E., Coquelle, N., Bury, C. S., Rosenthal, M., Holton, J. M., Carmichael, I., Garman, E. F., Burghammer, M., Colletier, J. -P., Weik, M. Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 4142-4151 (2020).
  20. Nave, C. A. Description of Imperfections in Protein Crystals. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 54 (5), 848-853 (1998).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

dyfuzja przeciwpr dowametoda krystalizacjidyfrakcja rentgenowskawzrost kryszta wtemperatura pokojowaanaliza in situPlanococcus halocryophilus
Krystalizacja i oznaczanie strukturalne kompleksu enzyma:substrat za pomocą krystalografii szeregowej w uniwersalnym chipie mikroprzepływowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.