W obecnym badaniu, wyrażenie dwóch dalszych komponentów sygnalizacyjnych szlaku PINK, cytoprotekcyjnej kalcyneuryny i proapoptotycznego CHOP, za pomocą specyficznych shRNA. W przeciwny sposób modulują one podatność pierwotnych neuronów korowych na atrofię neurytów po indukcji stresu retikulum endoplazmatycznego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Modulacja molekularna przez specyficzne shRNA dostarczane przez lentiwirusa w neuronach zestresowanych retikulum endoplazmatycznym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nagromadzenie niesfałdowanych białek w retikulum endoplazmatycznym (ER), spowodowane jakimkolwiek stanem stresu, wyzwala odpowiedź na niesfałdowane białko (UPR) poprzez aktywację wyspecjalizowanych czujników. UPR próbuje najpierw przywrócić homeostazę; Ale jeśli uszkodzenie utrzymuje się, sygnalizacja indukuje apoptozę.
Istnieje coraz więcej dowodów na to, że długotrwały i nierozwiązany stres ER przyczynia się do wielu stanów patologicznych, w tym chorób neurodegeneracyjnych. Ponieważ UPR kontroluje los komórki poprzez przełączanie między procesami cytoprotrotacyjnymi i apoptotycznymi, konieczne jest zrozumienie zdarzeń definiujących to przejście, a także elementów zaangażowanych w jego modulację.
Ostatnio wykazaliśmy, że nieprawidłowa akumulacja gangliozydów GM2 powoduje wyczerpanie zawartości ER Ca2+, co z kolei aktywuje PERK (kinazę podobną do PKR), jeden z czujników UPR. Ponadto sygnalizacja PERK uczestniczy w atrofii neurytów i apoptozie indukowanej przez akumulację GM2. W związku z tym opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam molekularnie modulować ekspresję dalszych komponentów PINK, a tym samym zmieniać podatność neuronów na atrofię neurytyczną.
Przeprowadziliśmy dekautację ekspresji kalcyneuryny (cytoprotekcyjnej) i CHOP (proapoptotycznej) w hodowlach neuronów kory mózgowej szczurów. Komórki zostały zakażone specyficznym shRNA dostarczonym przez lentiwirusa, a następnie potraktowane GM2 w różnym czasie, utrwalone i wybarwione immunologicznie przeciwciałem anty-MAP2 (białko związane z mikrorurkami 2). Później obrazy komórek zarejestrowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, a całkowity wzrost neurytów oceniono za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów w domenie publicznej ImageJ. Hamowanie ekspresji tych składników sygnalizacyjnych PERK wyraźnie umożliwiło przyspieszenie lub opóźnienie atrofii neurytycznej wywołanej stresem ER.
To podejście może być wykorzystane w modelach stresu ER w systemach komórkowych do oceny podatności neuronów na atrofię neurytów.
Wprowadzenie
Stres retikulum endoplazmatycznego (ER) definiuje się jako każde zaburzenie, które zagraża zdolności do fałdowania białek w organelli. Nagromadzenie niesfałdowanych białek w świetle ER aktywuje sygnał kaskady transdukcji zwany odpowiedzią niesfałdowanego białka (UPR). Ten złożony szlak sygnałowy jest koordynowany przez trzy czujniki stresu: PERK (kinaza ER podobna do kinazy białkowej RNA [PKR]) IRE1 (enzym wymagający inozytolu 1) i ATF6 (aktywowany czynnik transkrypcyjny 6). Wszystkie razem starają się przywrócić homeostazę. Ale jeśli stres utrzymuje się, UPR ostatecznie indukuje śmierć komórki przez apoptozę1.
PERK, białko transbłonowe ER, po stresie ER, prowadzi do fosforylacji eukariotycznego czynnika inicjacji-2 alfa (eIF2α), zmniejszając globalną syntezę białek, a tym samym obciążenie białkami w klasie ER2. Wykazaliśmy, że kalcyneuryna A / B (CNA / B), heterodimer Ca2 + fosfataza, bezpośrednio wiąże cytozolową domenę PERK, zwiększając jej autofosforylację i znacznie zwiększając hamowanie translacji białek i żywotności komórek3,4. Co ciekawe, CNA/B występuje obficie w mózgu ssaków, wyróżniając dwie izoformy podjednostki A CN: α i β.
W warunkach długotrwałego stresu ER, szlak sygnałowy PERK jest jedyną gałęzią UPR, która pozostaje aktywna, pośrednicząc w ten sposób zarówno w odpowiedzi pro-survivalowej, jak i apoptotycznej. W fazie przewlekłej jednym z głównych dalszych zdarzeń jest indukcja czynnika transkrypcyjnego, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homologous protein)5. Przewlekły stres ER jest również coraz częściej uznawany za częsty czynnik przyczyniający się do szerokiego zakresu zaburzeń patologicznych, w tym chorób neurodegeneracyjnych6. Ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób UPR może ułatwiać sygnalizację cytoprotekcyjną zamiast śmierci komórki 7. Jednak obecnie niewiele wiadomo o dokładnym mechanizmie kontrolującym przejście między tymi dwiema fazami UPR.
Ostatnio odkryliśmy, że w hodowanych neuronach gangliozyd GM2 gromadzi się w błonach ER i powoduje zubożenie wapnia w światło. To z kolei aktywuje sygnalizację PERK, która pośredniczy w atrofii neurytów i apoptozie 8. W tym badaniu nagromadzenie GM2 w hodowanych neuronach jest wykorzystywane jako model systemu komórkowego atrofii neurytów wywołanej stresem ER. W szczególności manipuluje się dwoma wyrażeniami czynnika PERK, CN-AΑ i CHOP, które przełączają przejście między wczesnymi/ochronnymi zdarzeniami a fazą przewlekłą/apoptozą. Aby to osiągnąć, odpowiednie geny są wyciszane; w ten sposób pierwotne hodowle neuronów korowych są zakażone specyficznym shRNA dostarczanym przez lentiwirusa. Analiza Western blot ujawnia znaczne obniżenie poziomów ekspresji CN-Aα i CHOP w porównaniu z komórkami kontrolnymi, które są zakażone lentiwirusem przenoszącym zakodowane shRNA. Po tym zabiegu neurony są poddawane różnym czasom inkubacji egzogennego GM2, utrwalonego i wybarwionego immunologicznie przeciwciałem przeciwko białku 2 (MAP2) przeciwko mikrotubulom9. Obrazy uzyskuje się za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Całkowity wzrost neurytów jest oceniany w stosunku do całkowitej liczby komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury na zwierzętach są wykonywane zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Przewodnika Narodowego Instytutu Zdrowia dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych. Zgody na przeprowadzenie badania udziela Komisja ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki (CICUAL) INIMEC-CONICET-UNC (uchwały nr 014/2017 B i 006/2017 A).
1. Pierwotne hodowle neuronów korowych szczurów
- Znieczulenie ciężarnych szczurów E18 Wistar w komorze CO2 mieszaniną 80% CO2 / 20% O2 przez 60 s ekspozycji, a następnie poświęcenie, a następnie zwichnięcie kręgów szyjnych.
- Wykonaj następujące czynności w okapie z przepływem laminarnym. Ekstrahuj encefalon z zarodków za pomocą kleszczy w stylu # 3 i prostych, ostrych małych nożyczek sprężynowych (tabela materiałów) do roztworu Hanksa w naczyniach do hodowli komórkowych.
- Wypreparuj tkankę pod 20-krotnym szkłem powiększającym, używając dwóch kleszczy z cienką końcówką w stylu #5, oddzielających korę czołową od opon mózgowych. Przenieś korę czołową do stożkowej rurki o pojemności 15 ml i inkubuj tkankę z 3-4 ml trypsyny-EDTA (0,25%) przez 15 minut, w temperaturze 37 °C w celu trawienia chemicznego.
- Po strawieniu rozcieńczyć go 3-4 ml zmodyfikowanej pożywki orła (DMEM) firmy Dulbecco oraz 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Następnie umyj go 3 razy roztworem soli Hanks bez Ca2+/Mg2+ i 0,1% glukozy przez odwirowanie (3000 g przez 5 min).
- Mechanicznie zdysocjuj tkankę 10 razy, pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki o pojemności 1000 μl, w DMEM plus 10% FCS (tabela materiałów). Następnie odwirować homogenat o stężeniu 100 x g przez 1 minutę, zebrać supernatant i uzupełnić pozostałą objętość do 1000 μl.
- Zawiesinę komórkową należy roztoczyć na szalkach do hodowli komórkowych o gęstości 520 komórek/mm2 z 2 ml DMEM zawierającego 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% dodatku niezbędnych aminokwasów (patrz tabela materiałów). Następnie inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku z 5% CO2 przez 2 godziny.
- Usuwanie materii organicznej i powlekanie poli-L-lizyną szalek z kultur komórkowych
- Usuń materię organiczną, umieszczając materiał szklany w komorze reakcyjnej i dodaj 96% alkoholu etylowego, aby prawie pokryć materiał. Następnie dodawaj 68% (w/v) kwasu azotowego kropla po kropli, aż zaczną pojawiać się brązowo-zielonkawe bąbelki. Gdy to nastąpi, częściowo przykryj pojemnik i pozwól reakcji kontynuować, aż wybuch ustanie.
UWAGA: Usuń materię organiczną pod kabiną ekstrakcji gazu, aby uniknąć narażenia na szkodliwe gazy. - Przed pokryciem poli-L-lizyną przepłucz okulary sterylną wodą Mili-Q około dziesięć razy. Następnie inkubować szklanki i szalki hodowlane z 0,1 μg/μl poli-L-lizyny przez 4 godziny przed ich użyciem. Po inkubacji przepłukać okulary sterylną wodą Mili-Q około dziesięć razy.
- Usuń materię organiczną, umieszczając materiał szklany w komorze reakcyjnej i dodaj 96% alkoholu etylowego, aby prawie pokryć materiał. Następnie dodawaj 68% (w/v) kwasu azotowego kropla po kropli, aż zaczną pojawiać się brązowo-zielonkawe bąbelki. Gdy to nastąpi, częściowo przykryj pojemnik i pozwól reakcji kontynuować, aż wybuch ustanie.
- Usuwanie materii organicznej i powlekanie poli-L-lizyną szalek z kultur komórkowych
- Aby umożliwić różnicowanie komórek nerwowych, zmień pożywkę na pożywkę neurobazalną bez surowicy, z suplementem bez surowicy (tabela materiałów). Przechowywać kultury w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do czasu poddania działaniu substancji chemicznej.
2. Produkcja lentiwirusa
UWAGA: Oligonukleotydy zawierające sekwencje ukierunkowane na 3'UTR izoformy CN-Aα lub CHOP oraz z sekwencjami nieukierunkowanymi (scrambles) są wymienione w Tabeli 1.
- Do wyżarzania wymieszaj dwa jednoniciowe oligonukleotydy z komplementarnymi sekwencjami w równych ilościach molowych, używając buforu do wyżarzania (10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
- Ogrzewać w temperaturze 95 °C przez 2 minuty, a następnie powoli schładzać, przenosząc próbki z bloku grzewczego lub łaźni wodnej na stół o temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć otrzymany produkt [krótki RNA spinki do włosów (shRNA) ze spoistymi końcami] do końcowego stężenia 0,5 μM, podzielić je na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Sklonuj wstawkę shRNA do wektora lentiwirusowego pLKO.3G, z GFP jako zielonym markerem fluorescencyjnym. W tym celu należy strawić 1 μg wektora z enzymami restrykcyjnymi EcoRI i PacI, mieszając w sterylnej probówce: 2 μL 10x buforu enzymu restrykcyjnego (100 mM bis-Tris propan-HCl, pH 6,5, 100 mM MgCl2, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej), 1 μL z 1 μg/μL pLKO.3G, 0,5 μl 10 U/μL ECoRI, 0,5 μl PacI (10 U/μL) i 16 μL sterylnej wody jonizowanej.
- Delikatnie wymieszać, pipetując. Inkubować reakcję przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Trawienie przez noc jest na ogół niepotrzebne i może powodować degradację DNA.
- Delikatnie wymieszać, pipetując. Inkubować reakcję przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C.
- W celu podwiązania wymieszać strawiony wektor i wprowadzić w stosunku molowym 3:1 i inkubować go z ligazą T4 i buforem ligazy (dostarczonym przez producenta) przez noc w temperaturze 16 °C.
UWAGA: W tym momencie reakcja podwiązania może być przechowywana w temperaturze 4 °C do dalszego użycia. - Przekształć komórki właściwe DH5α (tabela materiałów) lub inny odpowiedni szczep E. coli z reakcją ligacji w następujący sposób.
- Wymieszać kompetentną E. coli z całkowitą objętością reakcji ligacji i schłodzić na lodzie przez 15 minut, umieścić w łaźni o temperaturze 42 °C na 2 minuty, a następnie ponownie schłodzić na lodzie przez 15 minut.
- Przenieść całkowitą objętość poddaną szokowi termicznemu do probówki o pojemności 15 ml i uzupełnić objętość do 1000 μl płynnym podłożem Luria-Bertani (LB), które wcześniej utrzymywało się w temperaturze 37 °C. Wstrząsać bakteriami przez 90 minut w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością około 330 obr./min.
- Odwirować je przy 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić 900 μl supernatantu. Użyć pozostałego supernatantu do ponownego zawieszenia osadu. Zawiesinę bakterii rozprowadzić równomiernie na stałej płytce LB z ampicyliną (100 μg/ml).
- Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, a następnie sprawdzić rozwój bakterii. W tym momencie bakterie mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez 4-5 dni.
- Wybierz pojedynczą kolonię do przeniesienia do probówki o pojemności 50 ml z 10 ml płynnej pożywki LB i ampicyliną (100 μg/ml). Wstrząśnij bakteriami w temperaturze 37 °C przy około 330 obr./min.
- Odwirować kulturę w celu osadzenia bakterii w temperaturze 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i zakonserwować osad bakteryjny. Można go przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Oczyść plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania DNA z osadu bakteryjnego zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów). Obliczyć stężenie DNA, mierząc absorbancję przy 260 nm i mnożąc przez współczynnik rozcieńczenia, stosując następującą zależność: A260 z 1,0 = 50 μg/ml czystego dwuniciowego (ds) DNA.
3. Zakażenie lentiwirusem
UWAGA: Wykonaj procedurę generowania lentiwirusa w okapie z przepływem laminarnym klasy II.
- 24 godziny przed transfekcją wysiewać 1-5 × 106 komórek HEK 293 na szalki hodowlane o średnicy 100 mm w 8 ml pożywki wzrostowej i inkubować je w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
- Wymieszaj 14 μg wektora pKLO.3G ze specyficzną wkładką, 10,5 μg plazmidu pakującego psPAX i 3,5 μg plazmidu otoczkowego pMD2.G (tabela materiałów). Rozcieńczyć 45 μl odczynnika do transfekcji plazmidu (tabela materiałów) w 700 μl zredukowanej pożywki surowicy (tabela materiałów) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie połącz mieszaninę DNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji plazmidu, delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- W międzyczasie zmień na świeży DMEM pożywkę z naczynia hodowlanego kultur komórkowych HEK 293 (70% zlewających się w czasie transfekcji). Następnie kropla po kropli dodawaj całą objętość roztworu DNA. Delikatnie kołysz naczyniem. Nie ma potrzeby dodawania/zmiany pożywki po transfekcji.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 48 godzin-72 godzin, aby umożliwić shRNA osiągnięcie optymalnej transdukcji sprawdzanej przez fluorescencję GFP przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Następnie zebrać pożywkę z lentiwirusem i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przefiltrować supernatant wirusa za pomocą membrany nylonowej 0,45 μm. Podwielokrotność przepływu w 1 ml. Następnie odwirować przy 17 000 x g przez 4 godziny. Odrzucić supernatant i zachować osad. Pozostawić niewidoczne granulki do wyschnięcia, a po wysuszeniu przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Przeprowadzić miareczkowanie wirusa za pomocą cytometrii strumieniowej. Wysiewać 4 x 105 komórek HEK 293 na płytkach 24-dołkowych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Następnie ponownie zawieś cząsteczki wirusa w 200 μl pożywki hodowlanej DMEM (tabela materiałów) i dodaj 0,05, 0,02 i 0,005 μl do każdej studzienki.
- Inkubować infekcję wirusową przez 72 godziny, usunąć pożywkę i trypsynizować (0,05% trypsyny, 1 ml) przez 3 min. Dodać 1 ml DMEM w 10% roztworze FCS i wirować przy 500 x g przez 5 min. Wyrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć osad PBS.
- Zawiesić osad za pomocą 100 μl PBS i utrwalić komórki za pomocą 100 μl 2% paraformaldehydu (PFA) w PBS. Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru strumieniowego i określ procentową zawartość komórek fluorescencyjnych GFP. Zbierz te dane, aby obliczyć miareczkowanie wirusa przy użyciu następującego wzoru:
Miareczkowanie wirusowe
4. Pierwotne hodowle neuronów poddane akumulacji gangliozydów GM2 i immunocytochemii przy użyciu przeciwciała anty-MAP2
- Zainfekować pierwotne kultury neuronów korowych (15 dni in vitro) specyficznymi oligonukleotydami shRNA ukierunkowanymi na 3' UTR CN-Aα lub CHOP i inkubować je w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1 dzień.
UWAGA: Pierwotne hodowle neuronów korowych trwające 7-8 dni in vitro mogą być również stosowane, jeśli komórki wykazują wysoki wzrost neurytów.- Przygotować 500 μM roztwór podstawowy gangliozydu GM2 w etanolu i poddać go sonikacji przez 1 godzinę.
- Dodać roztwór podstawowy GM2 do pożywki z szalkami hodowlanymi o końcowym stężeniu 2 μM. Pozostawić do inkubacji w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 16, 24 i 48 godzin.
- Użyj niektórych kultur do przygotowania homogenatu komórkowego do analizy western blot (specyfikacja przeciwciał znajduje się w Tabeli materiałów).
- Postępuj zgodnie z krokami 1.4 i 1.5, a następnie utrwal komórki 4% PFA i 120 mM sacharozy w PBS przez 20 minut w temperaturze 37 °C, a następnie przemyj je PBS. Wykonaj tę procedurę na membranie antypoślizgowej w mokrej komorze. Następnie dodać roztwór permeabilizacyjny (0,2% Triton X-100 w PBS) przez 5 minut i przemyć PBS.
- Stosować 5% BSA rozcieńczony w PBS przez 45 minut, aby umożliwić blokowanie, a następnie inkubować z przeciwciałem anty-MAP2, rozcieńczonym w stosunku 1:800 w roztworze blokującym, w temperaturze 4 °C przez noc.
- Pod koniec czasu inkubacji przemyć dwukrotnie PBS i inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (tabela materiałów) przez 1 godzinę. Następnie umyć komórki PBS i zamontować okulary na szkiełkach za pomocą wodnego podłoża montażowego (tabela materiałów).
5. Analiza atrofii neurytów
- Uzyskaj obrazy za pomocą soczewki powietrznej 20x (NA 0,8) za pomocą mikroskopu odwróconego epifluorescencji wyposażonego w kamerę CCD. Analizuj obrazy za pomocą wtyczek ImageJ. W tym celu załaduj obraz do ImageJ i odejmij tło, klikając Procesowy | Odejmij tło.
- Kliknij na Obrazek | Dostosuj | Wprowadź próg lub wpisz następujące: Ctrl (lub Cmd) + Shift + T. Otworzy się okno, w którym można dostosować wartości minimalne, umożliwiając rozróżnienie śladów ścieżki i somy. Kliknij na obrazek binarny (neuryty i somy są koloru białego). Na tym obrazie użyj zaznaczania odręcznego, aby usunąć somy; Zaznaczony obszar SOMA ponownie zmieni kolor na.
- Zaznacz ślady i kliknij Edytuj | Selekcja | Utwórz zaznaczenie. Uzyskaj zwrot z inwestycji, klikając Ctrl (lub Cmd) i T zaznaczenia i zachowaj go. Otwórz oryginalny obraz, a następnie kliknij panel menedżera ROI i wybierz należący wcześniej uzyskany ROI. Następnie kliknij oryginalny obraz.
- Po obrysowaniu zwrotu z inwestycji na obrazie wpisz Ctrl (lub Cmd) i M (Analizuj | Środek). Otwiera się okno; Skopiuj wartość średnią (dowolne jednostki j.a.) w celu przetworzenia analizy statystycznej.
UWAGA: Aby uzyskać wartości w μm, kliknij Analizuj | Ustaw skalę. Pojawi się otwarte okno, w którym można ustawić wartości. Upewnij się, że dodano poprawną skalę (punkt menu Analizuj | Ustaw skalę) w zależności od charakterystyki używanego mikroskopu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Tutaj zajmujemy się pytaniem, czy wyciszenie dwóch komponentów PERK wpływa na fazę przejściową UPR w modelu komórki stresu ER. Aby to osiągnąć, wyciszamy gen CN-Aα, a także gen CHOP za pomocą dwóch specyficznych sekwencji shRNA dla każdej (Tabela 1) w pierwotnej hodowli komórek neuronów przez 1 dzień10. Wyrażenie jest analizowane za pomocą Western blotting (Rysunek 1 i Rysunek 2). Obserwuje się wyraźne za...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisujemy eksperymentalny system, który umożliwia molekularną modulację przejścia od fazy przeżycia do apoptotycznej fazy UPR w modelu komórki neuronalnej.
Do prawidłowej analizy atrofii neurytów niezbędne jest uzyskanie pierwotnych kultur neuronów z licznymi, długimi, silnie rozgałęzionymi wyrostkami 9,11. Ułatwia to badanie wydłużenia procesów neuronalnych, co pozwala na wykrycie wyraźnych różnic między terapiami. Ważne jest, aby zau...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy dr Gonzalo Quasollo za jego nieocenioną pomoc w obrazowaniu oraz dr Andrei Pellegrini za wsparcie techniczne w hodowli komórek.
Badania te były wspierane przez granty od: National Institute of Health, USA (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 between UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) oraz z Narodowej Agencji Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Argentyna (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 anty-mysz | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anty-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 - 250 | |
| anty-CN-A&alfa; | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | # 1961 | |
| anty-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anty-β-aktyna | Thermo Fisher | # PA1 - 183 | |
| aprotynina | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Mikroskop epifluorescencyjny Axiovert 200 | Zeiss | ||
| B27 suplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Zmodyfikowany Eagle's Medium (DMEM) | Technologie życia | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Surowica dla cieląt płodowych (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Kleszcze z cienkimi końcówkami styl #5 | Dumonta | ||
| styl #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW przeciwciało drugorzędowe | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 przeciwciało drugorzędowe | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW przeciwciało drugorzędowe | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW przeciwciało drugorzędowe | LI-COR Nauki biologiczne | #92632211 | |
| plazmid otoczki lentiwirusowej pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiwirusowy plazmid pakujący psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| wektor lentiwirusowy pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Hemisulfate leupeptyny | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Odczynnik (odczynnik do transfekcji plazmidu) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Membrana nitrocelulozowa 0,45 & Mikro; m | BIO-RAD | #1620115 | |
| System obrazowania w podczerwieni Odyssey | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicylina-streptomycyna | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatyna A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| fluorek fenylometylosulfonylu | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poli-L-lizyna | sigma aldrich | P#2636 | |
| Proste, ostre, małe nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligaza | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0,25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Ultradźwiękowy procesor cieczowy Vibra-Cell (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps system oczyszczania DNA | Promega | #A1330 |
Bibliografia
- Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).
- Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).
- Bollo, M., et al. Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs. PLoS One. 5, 11925(2010).
- Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response. Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).
- Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).
- Hetz, C., Saxena, S. ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).
- Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability. PLoS One. 4, 4170(2009).
- Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).
- Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2. The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).
- Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Rusnak, F., Mertz, P. Calcineurin: form and function. Physiological Reviews. 80, 1483-1521 (2000).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).
- Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
