Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkich adipocytów za pomocą filtracji i ultrawirowania

DOI:

10.3791/61979

⸱

19 kwietnia 2021

 ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Medicine, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, 2Oxford Centre for Diabetes, Endocrinology and Metabolism, University of Oxford

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z ludzkich adipocytów z tkanki tłuszczowej pośladków i brzucha za pomocą filtracji i ultrawirowania. Charakteryzujemy izolowane EV pochodzące z adipocytów, określając ich wielkość i stężenie za pomocą analizy śledzenia nanocząstek oraz za pomocą western blot pod kątem obecności genu podatności na nowotwór białka EV 101 (TSG101).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to zamknięte w lipidach otoczki, które przenoszą biologicznie aktywny materiał, taki jak białka, RNA, metabolity i lipidy. EV mogą modulować status komórkowy innych komórek lokalnie w mikrośrodowiskach tkankowych lub poprzez uwolnienie do krwi obwodowej. EV pochodzące z adipocytów są podwyższone we krwi obwodowej i wykazują zmiany w swoim ładunku (RNA i białku) podczas zaburzeń metabolicznych, w tym otyłości i cukrzycy. EV pochodzące z adipocytów mogą regulować stan komórkowy sąsiednich komórek naczyniowych, takich jak komórki śródbłonka i makrofagi rezydujące w tkance tłuszczowej, aby promować stan zapalny tkanki tłuszczowej. Badanie zmian w EV pochodzących z adipocytów in vivo jest złożone, ponieważ EV pochodzące z krwi obwodowej są wysoce niejednorodne i zawierają EV z innych źródeł, a mianowicie płytek krwi, komórek śródbłonka, erytrocytów i mięśni. Dlatego hodowla ludzkich adipocytów stanowi system modelowy do badania EV pochodzących z adipocytów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół ekstrakcji całkowitych małych EV z pożywek do hodowli komórkowych ludzkich adipocytów pośladkowych i brzusznych przy użyciu filtracji i ultrawirowania. Ponadto demonstrujemy zastosowanie analizy śledzenia nanocząstek (NTA) do ilościowego określania wielkości i stężenia EV oraz wykazujemy obecność genu podatności guza na białko EV 101 (TSG101) w EV pochodzących z adipocytów pośladkowych i brzusznych. Wyizolowane EV z tego protokołu mogą być wykorzystywane do dalszej analizy, w tym transmisyjnej mikroskopii elektronowej, proteomiki, metabolomiki, sekwencjonowania małych RNA, mikromacierzy i mogą być wykorzystywane w funkcjonalnych badaniach in vitro/in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to otoczki zamknięte w lipidach, które przenoszą biologicznie aktywny materiał, taki jak białka, mikroRNA, metabolity i lipidy. Termin EVs oznacza różne subpopulacje, które obejmują egzosomy, mikropęcherzyki (mikrocząstki/ektosomy) i ciała apoptotyczne1. EV mogą służyć jako biomarkery, ponieważ biorą udział w sygnalizacji patologicznej i są uwalniane do płynów biologicznych, w tym krwi i moczu. EV mogą modulować status komórkowy innych komórek lokalnie w mikrośrodowiskach tkankowych lub poprzez uwolnienie do krwi obwodowej2. EV mają cechy komórki macierzystej, ale różnicowanie każdej subpopulacji opiera się przede wszystkim na wielkości EV i zawartości białka, takich jak markery EVs, w tym obecność tetraspanin (CD9, CD63 i CD81), gen podatności na nowotwór 101 (TSG101) i białko X oddziałujące z ALG-2 (ALIX). Te markery białkowe są reprezentatywne dla pochodzenia endosomalnego (CD9, CD63 i CD81) dla egzosomów, które są generowane wewnątrz ciał wielopęcherzykowych lub reprezentują białka związane z pączkowaniem lub pęcherzykami bezpośrednio z błony plazmatycznej dla mikropęcherzyków. Jednak te subpopulacje w znacznym stopniu się pokrywają i trudno jest odróżnić poszczególne subpopulacje w złożonych płynach biologicznych, takich jak osocze, surowica lub mocz.

Zaburzenia metaboliczne, w tym otyłość, insulinooporność, zaburzenia w zewnątrzkomórkowym poziomie glukozy, tlenu i stany zapalne mogą zmienić rozmiar i stężenie EV oraz ich ładunek. EV pochodzące z adipocytów przenoszą Perilipinę A, adiponektynę i wykazują zmiany w ładunku białka i RNA podczas otyłości i cukrzycy3,4,5,6. EV pochodzące z adipocytów regulują stan komórkowy sąsiednich komórek śródbłonka naczyń krwionośnych7 i makrofagów rezydujących w tkance tłuszczowej w celu promowania stanu zapalnego tkanki tłuszczowej i insulinooporności8,9,10,11. Badanie zmian w EV pochodzących z adipocytów in vivo jest złożone, ponieważ populacje EV pochodzące ze złożonych płynów biologicznych, takich jak osocze, surowica lub mocz, zawierają EV z wielu źródeł, takich jak płytki krwi, komórki śródbłonka, erytrocyty i mięśnie, które są zaangażowane w patogenezę dysfunkcji metabolicznej i choroby.

Hodowla i różnicowanie in vitro ludzkich preadipocytów dostarcza zatem modelowego systemu do badania EV pochodzących z adipocytów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół ekstrakcji całkowitych małych EV z pożywek do hodowli komórkowych ludzkich adipocytów za pomocą filtracji strzykawkowej i ultrawirowania. Ultrawirowanie pozostaje popularną metodą izolacji pojazdów elektrycznych, ponieważ jest łatwo dostępne i wymaga niewielkiej wcześniejszej wiedzy specjalistycznej. Jednak inne metody, takie jak wytrącanie, chromatografia wykluczania wielkości i wychwytywanie powinowactwa immunologicznego przy użyciu tetraspanin, umożliwiają izolację EV z szeregu płynów biologicznych, w tym osocza, surowicy, moczu i kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych. Każda metoda, w tym opisany tutaj protokół ultrawirowania, wytwarza preparaty EV o różnej czystości, ponieważ metody te mogą koizolować rozpuszczalne białka i lipoproteiny, które mogą maskować się jako EV. Połączenie tego protokołu ultra-wirowania z innymi metodami, takimi jak wirowanie gęstości, chromatografia wykluczania wielkości i wychwytywanie powinowactwa immunologicznego, radykalnie zwiększa czystość izolowanych EV. Ale podobnie jak w przypadku ultrawirowania, te inne metody nie pozwalają na wychwycenie niezależnych subpopulacji EV ze złożonych próbek, takich jak krew, osocze i mocz. W związku z tym hodowle wybranych populacji komórek pozostają jedną z najbardziej niezawodnych metod generowania wysokiej wydajności EV specyficznych dla komórek. Każda metoda EV ma szereg zastrzeżeń, a wybór metody może mieć wpływ na rodzaje izolowanych EV i ich stężenia, co może wpływać na dalsze badania mechanistyczne nad sygnalizacją komórkową i tkankową oraz określanie ładunku EV do badań diagnostycznych; te metodologiczne kwestie izolacji EV są omówione w innym miejscu oraz w sekcjach ograniczeń poniżej4,12. W tym miejscu opisujemy izolację EV pochodzących z ludzkich adipocytów za pomocą filtracji i ultrawirowania. Ponadto demonstrujemy zastosowanie analizy śledzenia nanocząstek (NTA) do ilościowego określania wielkości i stężenia EV oraz wykazujemy obecność genu podatności guza 101 białka EV (TSG101) w naszych ludzkich EV pochodzących z adipocytów. Wyizolowane EV z tego protokołu mogą być wykorzystywane do dalszej analizy, w tym transmisyjnej mikroskopii elektronowej, proteomiki, metabolomiki, sekwencjonowania małego RNA, mikromacierzy i mogą być wykorzystywane w funkcjonalnych badaniach in vitro/in vivo.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie metody zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną Uniwersytetu Oksfordzkiego. Tkankę tłuszczową uzyskano metodą biopsji igłowej w znieczuleniu miejscowym od zdrowych ochotników.

1. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych i

  1. Przygotować bufor do wytrawiania kolagenazy, rozpuszczając kolagenazę H (1 mg/ml) w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) (bez chlorku wapnia i bez chlorku magnezu) i sterylnym filtrze za pomocą filtra strzykawkowego o porach 0,2 μm.
    1. Przygotuj bufor do trawienia kolagenazy nie później niż 10 minut przed użyciem.
  2. Przygotuj pożywkę wzrostową (GM) w następujący sposób: Zmodyfikowana mieszanka składników odżywczych F12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco, uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 jednostkami/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy i 0,5 ng/ml czynnika wzrostu fibroblastów (FGF).
  3. Przygotować podstawową pożywkę różnicującą (zasadową DM) w następujący sposób: DMEM/F12 uzupełniony o 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 17 μM pantotenianu, 100 nM insuliny ludzkiej, 10 nM trijodo-L-tyroniny, 33 μM biotyny, 10 μg/ml transferyny i 1 μM deksametazonu.
  4. Przygotować pożywkę do całkowitego różnicowania (kompletna zawartość masy), uzupełniając zasadową zawartość masa z kroku 1.3 0,25 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyną i 4 μM troglitazonu.
  5. Przygotować 10 mM roztworów podstawowych kwasów tłuszczowych skompleksowanych do 10% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) zasadniczo wolnej od kwasów tłuszczowych w następujący sposób.
    1. Rozpuścić 16 g BSA w 160 ml pożywki DMEM/F12 i ogrzać do temperatury 37 °C. W trzech oddzielnych probówkach stożkowych o pojemności 50 ml odważyć 150 mg oleinianu sodu, 139 mg palmitynianu sodu i 151 mg linoleinianu sodu. Dodać 50 ml podgrzanego roztworu BSA do każdej probówki i dobrze wymieszać przez wielokrotne wirowanie.
    2. Umieścić probówki z oleinianem i linoleinianem z powrotem w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut. Mieszać przez wirowanie, aż do całkowitego rozpuszczenia.
    3. Aby uzyskać roztwór palmitynianu, umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C na 2-3 minuty. Energicznie wymieszaj przez wirowanie.
    4. Powtarzać krok 1.5.3 aż do całkowitego rozpuszczenia – około 30 min.
      UWAGA: Niektóre małe cząstki mogą być nadal widoczne.
    5. Sterylne przefiltruj roztwory kwasów tłuszczowych za pomocą filtra strzykawkowego o porach 0,2 μm.
    6. Potwierdzić stężenie nieestryfikowanych kwasów tłuszczowych w każdym roztworze podstawowym za pomocą odpowiedniego oznaczenia.
      UWAGA: Zapasy kwasów tłuszczowych powinny wynosić 10 mM (±10%), aby uzyskać stosunek molowy 6:1 między kwasem tłuszczowym a BSA. Jeśli stężenie wykracza poza ten zakres, roztwór podstawowy należy ponownie przygotować. Roztwory podstawowe mogą być porcjowane i przechowywane w temperaturze -30 °C.

2. Trawienie biopsji ludzkiej tkanki tłuszczowej

  1. Powoli przecedzić zawartość strzykawki do biopsji przez sterylne sitko o pojemności 200 μm przymocowane do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, tak aby tkanka tłuszczowa została zebrana w sitku.
  2. Przenieść sitko do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i trzykrotnie przemyć tkankę tłuszczową 10 ml HBSS.
    UWAGA: Może być konieczne usunięcie skrzepów krwi i tkanki włóknistej nożyczkami chirurgicznymi lub powtórzenie płukania HBSS w celu usunięcia nadmiaru czerwonych krwinek.
  3. Zważ umytą chusteczkę.
    UWAGA: Zazwyczaj uzyskujemy 400-800 mg tkanki za pomocą biopsji igłowej.
  4. Umieść bufor do trawienia kolagenazy w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj umytą tkankę. Na tym etapie można użyć nożyczek chirurgicznych, aby zmielić tkankę na równe kawałki.
    UWAGA: Użyj 5 ml buforu na 0,5 g tkanki. W przypadku większych tkanek próbki można zmielić na szalce Petriego.
  5. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 35-40 min.
    UWAGA: Po pomyślnym strawieniu roztwór powinien wydawać się mleczny. Jeśli małe kawałki tkanki są nadal widoczne, potrząsaj ręką przez kolejne 10-20 sekund.

3. Izolacja preadipocytów

  1. Aby zagnieździć frakcję preadipocytów, odwirować przy 1 000 x g przez 5 min.
  2. Odessać i odrzucić pływającą warstwę adipocytów i supernatant, pozostawiając około 1 ml HBSS pokrywającego osad komórkowy.
  3. Zawiesić osad w 5 ml HBSS i przepuścić zawiesinę komórek przez siatkę o wielkości porów 250 μm, a następnie przez siatkę 100 μm w celu usunięcia niestrawionego materiału. Zawiesinę komórkową należy zebrać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  4. Wirować przy 1 000 x g przez 5 min.
    UWAGA: Po tym kroku frakcję preadipocytów można leczyć roztworem do lizy czerwonych krwinek, jeśli problemem jest zanieczyszczenie czerwonych krwinek.
  5. Odessać i wyrzucić supernatant.
  6. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml GM (krok 1.2) i umieścić nasiona w kolbie do hodowli tkankowych o długości 25cm2. Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO2, 37 °C).

4. Utrzymanie kultur preadipocytów

  1. Wymieniaj GM co 2 dni, gdy komórki się rozmnażają
    UWAGA: Tempo proliferacji komórek może się różnić w zależności od dawcy.
    1. Gdy komórki osiągną około 80% zbieżności, przenieś je do kolby do hodowli tkankowych o długości 75cm2. Usuń GM i umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
    2. Wyrzuć PBS i dodaj 0,5 ml wysoce oczyszczonych enzymów dysocjacji komórek, aby oddzielić przyłączone komórki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    3. Postukać ostro w kolbę, aby uwolnić komórki i dodać 5 ml GM. Zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  2. Wirować przy 1 000 x g przez 5 min.
  3. Odessać i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml GM i przenieść do kolby o średnicy75 cm2. Uzupełnić GM do końcowej objętości 12 ml i umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO2, 37 °C).
    UWAGA: Aby utrzymać komórki, kontynuuj zmianę GM co 2-3 dni. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, powtórz kroki 4.2-4.3 i podziel komórki 1:3 na nowe kolby o długości 75 cm2. Można to powtarzać przez kilka pasaży, aż do wygenerowania wystarczającej liczby komórek do zestawu doświadczalnego. Nie zalecamy więcej niż 10 pasaży, ponieważ zdolność preadipocytów do proliferacji i różnicowania spada.

5. Wysiewanie preadipocytów w celu różnicowania adipogennego

  1. Policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiej 200 000 komórek do wielu dołków 6-dołkowej płytki w 2 ml GM. Alternatywnie, zasiew 3,5 miliona komórek na 175 cm2 kolba w 22 ml pożywki GM.
  2. Pozwól komórkom namnażać się przez kolejne 2-4 dni, aż osiągną pełną konfluencję, zmieniając GMO w drugim dniu hodowli.
  3. Aby rozpocząć różnicowanie adipogenne, usuń GM i zastąp go kompletną suchą masą na 4 dni (2 ml całkowitej masy na dołek 6-dołkowej płytki lub 22 ml na kolbę 175 cm).
    UWAGA: Zastąp świeżą kompletną DM w dniu 2.
  4. W 4 dniu usunąć całą masę i zastąpić ją 2 ml zasadowej masy uzupełnionej 22,5 μM oleinianem, 15 μM palmitynianem i 12,5 μM linoleinianem, aby uzyskać całkowite stężenie kwasów tłuszczowych 50 μM na basenie na płytce 6-dołkowej lub 22 ml na kolbę o długości175 cm2. Wymieniaj na nośnik co 2 dni przez kolejne 10 dni.
    UWAGA: Od 7 dnia w różnicujących się preadipocytach powinny być widoczne kropelki lipidów.
  5. W 14 dniu hodowli zbierz pożywkę z komórek w celu wyizolowania EV pochodzących z adipocytów.

6. Przygotowanie supernatantu do hodowli komórkowej do izolacji lub przechowywania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i przyszłej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

  1. Usunąć supernatanty z hodowli komórkowych z każdej płytki 6-dołkowej i połączyć. Dodać do probówki o pojemności 15 ml lub usunąć wszystkie supernatanty z kolby o średnicy 175cm2 i dodać do probówki o pojemności 50 ml.
  2. Wirować przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Zdekantować supernatant do nowej, czystej probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml, odpowiednio przez wlanie.
  4. Wyjmij cylinder strzykawki o pojemności 10 ml i podłącz filtr strzykawkowy 0,45 μm.
  5. Wlać supernatant do zbiornika strzykawki i delikatnie docisnąć kciukiem lub dłonią otwór cylindra strzykawki, aż supernatant do hodowli komórkowej swobodnie przejdzie przez filtr.
    UWAGA: Szybkość tego etapu filtracji może się różnić w zależności od typu filtra strzykawkowego.
  6. Zebrać filtrat do czystej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: W razie potrzeby kondycjonowane przefiltrowane media można przechowywać w tym momencie w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni. W razie potrzeby rozmrozić supernatanty do hodowli komórkowych w temperaturze 4 °C i odwirować w temperaturze 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant do czystej probówki, wlewając go przed kontynuowaniem izolacji EV.

7. Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

  1. Oznacz probówkę do ultrawirowania o pojemności 13 ml, rysując okrąg na dnie probówki, w którym utworzy się oczekiwana osadka EV i zaznacz linię wokół szyjki probówki w celu orientacji w wirniku probówki do ultrawirówki. Oznacz probówkę identyfikatorem próbki.
  2. Umieść rurkę w uchwycie probówki.
  3. Podłączyć igłę 16 G do strzykawki o pojemności 10 ml i wyjąć cylinder strzykawki.
  4. Zdjąć osłonę ochronną z igły i włożyć igłę w szyjkę probówki do ultrawirówki.
  5. Wlać supernatant do hodowli komórkowej bezpośrednio do cylindra strzykawki, aby napełnić probówkę do ultrawirówki.
  6. W razie potrzeby uzupełnij probówkę PBS, aż do pełnego napełnienia.
    UWAGA: W razie potrzeby pozwól, aby probówka nieznacznie się przelała, upewniając się, że w probówce ultrawirówki nie ma przestrzeni powietrznych ani pęcherzyków powietrza.
  7. Uszczelnij probówkę ultrawirówki za pomocą lutownicy, upewniając się, że probówka jest szczelna, delikatnie ściskając rurkę.
  8. Umieść probówki do ultrawirowania w wirniku do ultrawirówki; upewnij się, że linia zaznaczona na górze probówki i okrąg narysowany u podstawy probówki są skierowane na zewnątrz, gdzie utworzy się granulka EV.
  9. Ultrawirować przy 120 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
  10. Ostrożnie wyjmij wirnik z ultrawirówki.
  11. Wyjmij probówki do ultrawirowania z wirnika i umieść w uchwycie probówki.
  12. Podłączyć igłę 16 G do strzykawki o pojemności 10 ml.
  13. Przekłuć górną część probówki do ultrawirowania i wprowadzić igłę na 2 cm do górnej części probówki i zassać supernatant do strzykawki.
  14. Zdekantowany supernatant o pojemności EV przelać do probówki o pojemności 1,5 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C.
  15. Ponownie włożyć igłę do probówki i ostrożnie odessać pozostały supernatant i wyrzucić.
  16. Przetnij górną część rurki nożyczkami.
  17. Odlej pozostały supernatant w jednym szybkim ruchu.
  18. Pozostaw rurkę do góry nogami na 1 minutę.
  19. Osusz ręcznikiem papierowym płyn, który tworzy się na tubie.
  20. Odwróć rurkę i umieść ją w uchwycie probówki.
  21. Dodać 100 μl PBS do probówki.
  22. Za pomocą końcówki pipety delikatnie usuń granulkę EV u podstawy probówki, wykonując okrężne ruchy w obszarze zaznaczonym w kroku 7.1.
  23. Wir krótko (1-2 sekundy), dwa razy.
  24. Oznacz nową probówkę do ultrawirowania o pojemności 13 ml, rysując okrąg na dnie probówki, w którym utworzy się oczekiwana osada EV i zaznacz linię wokół szyjki probówki w celu orientacji w wirniku probówki do ultrawirówki. Oznacz probówkę identyfikatorem próbki.
  25. Umieść rurkę w uchwycie probówki.
  26. Dodać 12 ml PBS do nowej probówki do ultrawirowania za pomocą czystej strzykawki i igły.
  27. Za pomocą strzykawki i igły pobrać próbkę o objętości 100 μl EV i dodać ją do probówki. Ostrożnie wymieszać EVs i PBS, a następnie przepłukać strzykawkę i igłę, delikatnie zbierając PBS i zasysając do probówki.
    UWAGA: Unikaj tworzenia bąbelków.
  28. Uszczelnij probówkę ultrawirówki za pomocą lutownicy, upewniając się, że probówka jest szczelna, delikatnie ściskając rurkę.
  29. Umieść probówki do ultrawirowania w wirniku do ultrawirówki; upewnij się, że linia zaznaczona na górze probówki i okrąg narysowany u podstawy probówki są skierowane na zewnątrz.
  30. Ultrawirować przy 120 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  31. Ostrożnie wyjmij wirnik z ultrawirówki.
  32. Podłączyć igłę 16 G do strzykawki o pojemności 12 ml.
  33. Przekłuć górną część probówki do ultrawirówki i wprowadzić igłę na głębokość do 2 cm w górną część probówki; zassać supernatant do strzykawki i wyrzucić.
  34. Przetnij górną część rurki nożyczkami.
  35. Odlej pozostały supernatant w jednym szybkim ruchu.
  36. Pozostaw rurkę do góry nogami na 1 minutę.
  37. Osusz każdy płyn, który tworzy się na krawędzi tuby.
  38. Umieść rurkę w uchwycie probówki.
  39. Dodać 100 μl PBS do probówki.
  40. Za pomocą końcówki pipety delikatnie usuń granulkę EV u podstawy probówki, wykonując okrężne ruchy w obszarze oznaczonym w kroku 7.24.
  41. Wir krótko (1-2 sekundy), dwa razy.
  42. Odpipetować 100 μl roztworu PBS/EV do czystej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać na wilgotnym lodzie.
    UWAGA: EV są gotowe do dalszego przetwarzania i mogą być zamrażane i przechowywane w temperaturze -80 °C.

8. Określanie wielkości i stężenia EV za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA)

  1. Przygotowanie systemu
    UWAGA: Szczegółowa metoda wykorzystania analizy śledzenia nanocząstek (NTA) do określania wielkości i stężenia EV została opisana przez Mehdiani et al.13.
    1. Rozmrażać próbki i przechowywać je w temperaturze 4 °C.
    2. Uruchom oprogramowanie NTA, klikając ikonę oprogramowania.
    3. Oprogramowanie otworzy się w "kontroli komórki" i poprosi o napełnienie komory przepływowej wodą dejonizowaną. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml wodą dejonizowaną i wepchnij do urządzenia, upewniając się, że żadne pęcherzyki powietrza nie przedostają się do komory ładowania.
    4. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby przygotować system do kontroli jakości (QC). Oprogramowanie przeprowadzi kontrolę ogniwa i poda miarę jego jakości. To powinno być bardzo dobre lub doskonałe.
    5. Przygotuj kontrolę jakości składającą się z kulek polistyrenowych o grubości 100 nanometrów. Odpipetować 1 μl wzorca do 999 μl wody dejonizowanej (rozcieńczony bulion). Następnie dodać 10 μl rozcieńczonego wywaru do 2,5 ml wody dejonizowanej (próbka QC). Wymieszać roztwór, delikatnie wirując przez 2-3 sekundy i pipetując.
      UWAGA: Próbki do kontroli jakości powinny być przygotowywane codziennie na świeżo, ale początkowa rozcieńczona próbka podstawowa jest stabilna przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C.
    6. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml 1 ml próbki kontroli jakości i usuń wszystkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki.
    7. Wstrzyknąć, bez wprowadzania pęcherzyków powietrza, do komory ładowania próbki NTA, delikatnie przechylając końcówkę strzykawki do komory iniekcyjnej, jednocześnie popychając tłok. Wstrzyknąć do 950 μl próbki QC do komory.
      UWAGA: Nie wprowadzaj pęcherzyków powietrza do komory ładowania próbki.
    8. Poczekaj, aż oprogramowanie wykona automatyczne wyrównanie (aby ustawić ostrość kamery) i sprawdzi napięcie pod kątem odczytów potencjału Z - wykres napięcia powinien być gładką krzywą w kształcie litery U.
      UWAGA: Jeśli pojawi się komunikat o błędzie "voltage zbyt niski błąd", ogniwo może być mokre od czyszczenia lub niezabezpieczone lub może występować pęcherzyk powietrza.
    9. Po zakończeniu automatycznego wyrównywania/kontroli napięcia użyj listy rozwijanej pozycji kamery, aby sprawdzić wszystkie pozycje (0,1-0,9) pod kątem nietypowych śladów - ich obecność wskazuje, że ogniwo może wymagać przepłukania i/lub czyszczenia. Po kontroli jakości system wyświetli komunikat "gotowy do pomiarów".
    10. Zalać komorę przepływową PBS. Otwórz kartę Pompa/Temperatura i w obszarze Pompa kliknij Uruchom dla pompy 2 (zbiornik PBS). Spowoduje to przepuszczenie PBS przez komórkę przez 1 minutę, a następnie automatyczne zatrzymanie.
      UWAGA: W komorze mogą znajdować się cząstki, ale można je usunąć, przepychając 10 ml PBS przez port ładowania.
    11. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml PBS i załaduj do komory bez pęcherzyków powietrza.
    12. Utwórz protokół dla urządzenia, który będzie mierzył wiele pozycji lasera i uśredniał cząstki na klatkę.
    13. Przed kontynuowaniem sprawdź, czy liczba cząstek jest mniejsza niż 5 (jak najbardziej bliska 0) - w razie potrzeby przepłucz większą ilością PBS.
    14. Przed rozcieńczeniem wymieszać próbkę EV przez pipetowanie.
    15. Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:1 000 w PBS i wymieszać pipetując. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml próbką i załaduj do komory bez pęcherzyków powietrza.
    16. Sprawdź, czy liczba cząstek mieści się w dopuszczalnym zakresie (pasek powyżej wartości liczby powinien znajdować się w zielonym obszarze lub w jego pobliżu). Jeśli nie, należy odpowiednio dostosować rozcieńczenie próbki. Pomiędzy próbkami i rozcieńczeniami próbek załaduj 10 ml PBS na przód maszyny, aby oczyścić komorę, a następnie załaduj 1 ml rozcieńczonej próbki.
      UWAGA: Każda próbka będzie miała niezależne rozcieńczenie w zależności od stężenia próbki. Liczba cząstek w urządzeniu powinna wynosić od 50 do 200 cząstek na klatkę, aby zapewnić dokładne pomiary.
    17. Przejdź do zakładki Pomiar w oprogramowaniu.
    18. Kliknij przycisk Uruchom pobieranie wideo.
    19. Wprowadź nazwę próbki i wybierz folder docelowy, aby zapisać pomiar.
  2. Stwórz standardową procedurę operacyjną (SOP) dla pojazdów elektrycznych.
    1. Utwórz > Zapisz > Załaduj EV SOP, który zmierzy liczbę i rozmiar cząstek przy czasie otwarcia migawki 100 i czułości kamery 80, 11 pozycjach kamery przez 2 cykle.
      UWAGA: O ile próbka nie ma specjalnych wymagań, nie ma potrzeby zmiany tych ustawień.
    2. Wprowadź rozcieńczenie próbki i dodaj wszelkie inne nuty, które chcesz dodać.
    3. Kliknij OK, a oprogramowanie automatycznie rozpocznie nagrywanie. Po zakończeniu oprogramowanie automatycznie załaduje wyskakującą tabelę pokazującą średnią liczbę i rozmiary cząstek dla każdej pozycji kamery.
      UWAGA: W tym czasie nie dotykaj maszyny ani pobliskich blatów, ponieważ wibracje wpłyną na końcowe odczyty.
    4. Pozycje kamery ze statystycznie nietypowymi odczytami zostaną automatycznie wykluczone - aby ręcznie wykluczyć dowolne pozycje kamery (lub ponownie uwzględnić wykluczone z dowolnego powodu), kliknij pole wyboru po lewej stronie szczegółów próbki.
    5. Kliknij przycisk Kontynuuj, a oprogramowanie utworzy i otworzy plik PDF próbki z wynikami dotyczącymi wielkości i stężenia.
  3. analiza statystyczna
    1. Analizuj dane NTA za pomocą jednokierunkowej lub dwukierunkowej ANOVA z poprawką Tukeya post-hoc. Wykreśl dane jako średnią ± średniej odchylenia standardowego. Wartość P wynosząca <0,05 została uznana za znaczącą.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określiliśmy ilość EV wyizolowanych z ludzkich adipocytów pośladkowych zgodnie z opisanym protokołem. Obliczyliśmy wielkość i stężenie EV pochodzących z adipocytów za pomocą NTA (Rysunek 1A,B). Użyliśmy pożywek kontrolnych pozorowanych, które były równymi objętościami pożyw, które nie miały kontaktu z komórkami, ale były hodowane i poddawane procedurze izolacji opisanej powyżej. Zmierzyliśmy stężenie EV pochodzącego z adipocytów po początkowej izolacji i po umyciu wyizolowanych EV adipocytów w PBS (Rysunek 1A,B) i wykreśliliśmy średnie grupy ± odchylenie standardowe (SD), które analizowano za pomocą dwukierunkowej ANOVA z poprawką Tukeya post hoc.

Stężenie EV pochodzących z adipocytów określone przez NTA z pierwszej izolacji wahało się od 6,10 x 106 do 2,70 x 107 z medianą 2,60 x 107 EVs/ml (Rysunek1 A,B). Po płukaniu PBS na próbkę przypada znacznie mniej EV pochodzących z adipocytów (Rysunek 1A,B) (P < 0,001), która wahała się od 5,00 x 105 do 4,30 x 106 z medianą 2,70 x 106 EV / ml. Kontrole fikcyjnych nośników nie zawierały żadnych EV określonych przez NTA (Rysunek 1A,B). Rozmiar modalny EV z pierwszej izolacji wynosił 125 nm i 105 nm po płukaniu PBS (Rysunek 1A,B). Opisany protokół został następnie zastosowany do adipocytów pochodzących z brzucha i pośladków z większych kolb T175 cm2. Te próbki EV pośladków pochodzące z kolb T175 cm2 miały stężenie od 3,60 x 107 do 7,50 x 107 / ml z medianą 5,40 x 107 EV / ml. EV pochodzące z adipocytów brzusznych z kolb T175 cm2 w stężeniu wahały się od 6,30 x 107 do 8,60 x 107 / ml z medianą 7,60 x 107 EV / ml (Rysunek 1C,D). Modalny rozmiar EV wywodzący się z kolb T175 cm2 wynosił 115 nm dla EV pośladkowych i 125 nm EV brzusznych. Potwierdziliśmy obecność białka EV w EV pochodzących z pośladków i brzucha poprzez immunoblotting genu podatności na guz 101 (TSG101) i stwierdziliśmy, że granulki komórek adipocytów brzusznych i pośladkowych oraz EV pochodzące z adipocytów brzusznych i pośladkowych były dodatnie dla TSG101, podczas gdy jako pożywka kontrolna pozorowana, która nie miała kontaktu z komórkami, była ujemna (Figura 1E).

figure-results-1
Rysunek 1: Wielkość i profil dystrybucji EV pochodzących z adipocytów z pożywek do hodowli komórkowych oraz oznaczanie białka EV TSG101. Całkowite stężenia EV oraz profile rozkładu wielkości i stężeń określone za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA) z 1. izolacji (N = 5) i po przemyciu PBS (N = 6). (C) Stężenia całkowite oraz (D) profile wielkości i rozkładu stężeń określone przez NTA dla EV pochodzących z jamy brzusznej i pośladków z kolb T175cm2 (N = 4 na grupę). (E) Western blot EV pochodzących z pośladków i brzucha dla TSG101. Granulki komórkowe i pożywki pozorowane zastosowano odpowiednio jako kontrole pozytywne i negatywne. Dane są średnimi grupowymi ± odchyleniem standardowym (SD). Jednokierunkowa lub dwukierunkowa ANOVA z korektą Tukeya post-hoc. P < 0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstrujemy protokół izolacji EV pochodzących z adipocytów pośladkowych i brzusznych z supernatantów z hodowli komórkowych i określamy ich wielkość i stężenie za pomocą NTA 7,14,15. Pokazujemy, że hodowane ludzkie adipocyty wytwarzają i uwalniają EV do pożywki do hodowli komórkowych, które można następnie wyizolować za pomocą filtracji i ultrawirowania. Określiliśmy wielkość i profil stężeń izolowanych EV pochodzących z adipocytów i wykazaliśmy, że ultrawirowanie prawdopodobnie wyizolowało zanieczyszczenia z pożywki do hodowli komórkowych, a mycie izolowanych granulek EV w PBS znacznie obniża ich stężenie w drugim pomiarze NTA. Następnie określiliśmy czystość izolowanych EV pochodzących z pośladków i brzucha za pomocą western blotting dla TSG101, markera EV. Preparaty EV pochodzące z pośladków i brzucha były pozytywne dla TSG101, ale, co ważne, nie było go w pożywkach kontrolnych, które nie były wystawione na działanie komórek. W prezentowanych eksperymentach wykorzystano ludzkie adipocyty jako komórkę macierzystą generującą EV, ale opisana metoda jest odpowiednia dla innych typów komórek, w tym komórek śródbłonka, mięśni gładkich naczyń krwionośnych, mięśni szkieletowych, komórek odpornościowych oraz do izolacji EV z osocza lub surowicy pacjenta ubogiego w płytki krwi.

EV pochodzące z adipocytów są podwyższone w chorobach metabolicznych, a określenie zmian w wielkości i liczbie EV adipocytów in vivo jest złożone, ponieważ płyny biologiczne, takie jak krew, zawierają EV z wielu źródeł komórkowych, które są również zaangażowane w patogenezę choroby metabolicznej, w tym EV z komórek śródbłonka, mięśni szkieletowych, erytrocytów i komórek odpornościowych. Opisana tutaj metoda pozwala na wyznaczenie ludzkich adipocytów EV, co może stanowić użyteczny model do badań mechanistycznych badających czynniki prowadzące do biogenezy EV w adipocytach, co jest obecnie nieznane. Co ważne, określenie biogenezy EV adipocytów i sposobu organizowania obciążenia poszczególnych RNA, białek i metabolitów w EV adipocytów może ujawnić nowe możliwości terapeutyczne w zakresie zaburzeń patogennej sygnalizacji EV adipocytów w dysfunkcji metabolicznej. Szczegółowe badania pozwolą lepiej zrozumieć, w jaki sposób rozmiar, liczba, szlak biogenezy i ładunek EV (RNA, białka i metabolity) są zmieniane w odpowiedzi na chorobę lub bodźce, takie jak zaburzenia tlenu, glukozy, lipidów i insuliny. Informacje na temat roli czynników środowiskowych w sygnalizacji EV adipocytów w chorobach metabolicznych oraz tego, w jaki sposób EV pochodzące z adipocytów przyczyniają się do zapalenia tkanki tłuszczowej, mogą odkryć nowe cele terapeutyczne w chorobach metabolicznych.

Ograniczenia
Wytwarzanie in vitro EV pochodzących z adipocytów
Wykorzystanie ludzkich preadipocytów in vitro zapewnia system modelowy do badania uwalniania i generowania EV pochodzących z adipocytów w następstwie różnicowania adipocytów in vitro, ale istnieje szereg ograniczeń. W szczególności EV adipocytów uzyskane in vitro mogą różnić się od EV pochodzących z tkanki tłuszczowej pobranych z płynów biologicznych, takich jak osocze14 , pod względem wielkości, stężenia, białka EV, -RNA, -metabolitów i funkcji. Na te różnice EV mogą mieć wpływ inne komórki nieadipocytowe, które znajdują się w tkance tłuszczowej in vivo, takie jak komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej, komórki śródbłonka i makrofagi, które są ściśle związane z fizjologią tkanki tłuszczowej i wykazały rolę w patologii tkanki tłuszczowej, w tym w zapaleniu tkanki tłuszczowej.

Należy zauważyć, że opisany tutaj 2-tygodniowy protokół różnicowania in vitro może nie być wystarczający do wytworzenia w pełni dojrzałych adipocytów równoważnych z tymi obserwowanymi in vivo; Adipocyty zróżnicowane in vitro hodowane w formacie dwuwymiarowym (2D) wykazują inną morfologię niż komórki in vivo i nie wytwarzają jednolokowych kropelek lipidów. Ponadto preadipocyty opisane w tym protokole są uzyskiwane z frakcji zrębu tłuszczowego i nie oceniliśmy udziału w puli EV innych typów komórek, które nie zostały całkowicie wyeliminowane podczas izolacji komórek.

Utrata ważnych interakcji międzykomórkowych adipocytów z innymi nieadipocytami w tkance tłuszczowej może wpływać na wytwarzanie, uwalnianie adipocytów EV, białko EV i EV-RNA z adipocytów oraz komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej16. Jednak ocena, w jaki sposób adipocyty pochodzące z badań in vitro różnią się od tych wytwarzanych in vivo, nie została przeprowadzona w sposób wyczerpujący.

Biopsje tkanek pierwotnych zawierają krew, a zatem uzyskane hodowle komórkowe mogą zawierać erytrocyty i EV pochodzące z erytrocytów, niezależnie od wielokrotnych płukań i zmian pożywki podkreślonych w naszym protokole. Dodatkowy etap lizy krwinek czerwonych po wyizolowaniu frakcji zrębowo-naczyniowej może być konieczny w celu wyeliminowania wpływu erytrocytów na adipocyty. Jest to ważne, ponieważ EV pochodzące z erytrocytów mogą wpływać na funkcję komórkową innych komórek17, a EV pochodzące z erytrocytów są podwyższone w obecności stresu oksydacyjnego18 oraz u pacjentów z zespołem metabolicznym19,20. Dlatego tkanka tłuszczowa pochodząca od pacjentów z chorobami metabolicznymi może zawierać podwyższony poziom EV pochodzących z erytrocytów, co może wpływać na fenotyp adipocytów in vitro.

Eliminacja FBS
Opisany protokół wykorzystywał FBS w pożywkach wzrostowych podczas różnicowania adipogennego, ale następnie adipocyty poddano wielu zmianom pożywki przed ostatecznym pobraniem pożywki w celu wyizolowania EV pochodzących z adipocytów. W związku z tym założyliśmy, że ogólne ryzyko zanieczyszczenia EV pochodzących z FBS w preparatach EV jest niskie, a następnie potwierdziliśmy, że resztkowe EV nie były obecne w pożywkach do hodowli komórkowych przez western blot dla TSG101. Izolacja EV hodowanych komórkowo ze źródeł komórkowych, które wymagają FBS, musi wykorzystywać FBS zubożone w EV lub zubożone EV bydlęce poprzez ultrawirowanie, aby zapobiec zakłóceniom EV bydlęcych stężeń EV adipocytów i analizie ładunku EV adipocytów. Wiadomo, że zubożenie surowicy adipocytów zmienia ich odpowiedzi komórkowe21 i dlatego badania muszą zapewnić, że zubożenie surowicy lub wyczerpanie EV z surowicy sprawia, że ich kultury adipocytów są naprawdę reprezentatywne dla biologii adipocytów.

Techniczne ograniczenie izolacji EV za pomocą filtracji i ultrawirowania
Opisujemy metodę ultrawirowania za pomocą jednorazowych probówek z tworzywa sztucznego, które wymagają uszczelnienia przed ultrawirowaniem w celu izolacji pojazdów elektrycznych. Zdajemy sobie sprawę, że te jednorazowe zamknięte tuby mogą nie być ekonomiczną opcją dla wielu osób i sugerujemy zbadanie podobnych tub, które nie wymagają uszczelniania i są wielokrotnego użytku. Badacze muszą jednak upewnić się, że mycie probówek wielokrotnego użytku jest odpowiednie i nie prowadzi do postępującej akumulacji zanieczyszczeń białkowych, lipidowych i RNA w miarę upływu czasu, co może mieć wpływ na dalsze badania ładunku związanego z EV lub wpływ na badania funkcji komórkowych.

Opisany tutaj protokół filtracji i ultrawirowania jest stosowany od wielu lat, a wiele badań podkreśliło krótkie braki tej metody, w tym niespecyficzne izolacje zanieczyszczających składników komórkowych, takich jak mitochondria komórkowe, obecność fragmentów jądrowych i składników błony komórkowej. Co więcej, opisana tutaj metoda pozwoli na koizolację lipoprotein obecnych w FBS zubożonym w EV. Metoda ta może być dalej rozwijana poprzez zastosowanie ultrawirowania gęstości i chromatografii wykluczania wielkości (SEC) w celu wyeliminowania zanieczyszczających rozpuszczalnych białek i niektórych lipoprotein. W połączeniu z myciem PBS izolowanych pojazdów elektrycznych i SEC, współizolowane zanieczyszczenia można ograniczyć, ale nie całkowicie wyeliminować. W związku z tym użytkownicy powinni zapewnić włączenie odpowiednich kontroli, w tym pożywki pozorowanej, która nie miała kontaktu z komórkami, w celu uwzględnienia rozpuszczalnych białek i lipoprotein w pożywce hodowlanej, oraz kontroli supernatantu zubożonej w EV, aby wykazać pomyślną izolację EV z kondycjonowanych pożywek, które nadal zawierają rozpuszczalne białka i lipoproteiny.

Izolacja EV za pomocą filtracji i ultrawirowania polega na tym, że operator upewnia się, że supernatanty z hodowli komórkowych nie są poddawane nadmiernemu ciśnieniu, gdy przechodzą one przez otwór filtra lub otwór igły/strzykawki. Użycie nadmiernej siły na tym etapie opisanego protokołu może spowodować rozerwanie EV, wpłynąć na końcowe stężenia EV i wygenerować wolne RNA, białka i metabolity, które kiedyś były zamknięte w EV. Opisaliśmy tutaj metodę, która nie wymaga cylindra strzykawki, a tym samym przykładania siły do pojazdów elektrycznych w kondycjonowanych mediach, gdy przechodzą one przez filtr lub igłę do zbiorników zbiorczych i probówek ultrawirówek. Niemniej jednak należy zachować dalszą ostrożność podczas ponownego zawieszania pelletu EV w PBS. Należy użyć tylko krótkiego wiru, ponieważ energiczne wirowanie może rozerwać błony EV.

Po ultrawirowaniu operatorzy muszą uważać na probówki do ultrawirowania, aby nie naruszyć granulatu EV. Można to osiągnąć poprzez ostrożne obchodzenie się z probówkami i powolne przesuwanie ich między wirnikiem ultrawirówki a stojakiem na probówki. Należy zachować dalszą ostrożność podczas przebijania otworu w górnej części probówki do ultrawirowania w celu zasysania supernatantów zubożonych w EV. Włożenie igły do górnej części probówki i szybkie zassanie supernatantów wytworzy podciśnienie w cylindrze strzykawki, które może gwałtownie wepchnąć supernatant z powrotem do probówki ultrawirówkowej i zakłócić działanie granulki EV. Po przecięciu rurki ultrawirówki w celu wylania pozostałego supernatantu należy zachować ostrożność, ponieważ granulat EV może się poluzować, a nalewanie spowoduje wyrzucenie granulatu EV. Alternatywnie, strzykawka i igła mogą być użyte do powolnego usuwania pozostałego supernatantu bez nalewania lub odwracania probówki.

Filtracja i ultrawirowanie supernatantów do izolacji pojazdów elektrycznych jest przydatną i wydajną metodą. Ale jest podatny na koizolację lipoprotein i rozpuszczalnych białek. Można je złagodzić, myjąc pojazdy elektryczne za pomocą PBS (zgodnie z opisem), ale nie wyeliminuje to wszystkich zanieczyszczeń. Rozpuszczalne białka można eluować z frakcji EV za pomocą SEC, jednak metoda ta nie rozróżnia lipoprotein i EV. Eliminacje SEC, które zawierają EV, można łączyć z ultrawirowaniem w celu granulowania EV. Filtracja i ultrawirowanie różnicowe jest preferowaną metodą izolacji EV w porównaniu z technikami wytrącania, które wykorzystują glikol polietylenowy, ponieważ te metody wytrącania koizolują duże ilości rozpuszczalnych białek i lipoprotein w supernatantach hodowli komórkowych i innych płynach biologicznych. Ultrawirowanie prawdopodobnie pozostanie najbardziej dostępną formą izolacji pojazdów elektrycznych dla wielu osób, ponieważ większość laboratoriów jest wyposażona w ultrawirówkę, co zmniejsza początkowe koszty uruchomienia. Jednak dla wielu osób ultrawirowanie w celu izolacji pojazdów elektrycznych jest utrudnione ze względu na objętość probówek do ultrawirowania i początkową objętość materiału. Kilkaset mililitrów supernatantów hodowlanych może być potrzebnych do wytworzenia wystarczającej ilości EV do dalszej proteomiki lub sekwencjonowania RNA. Jest jednak prawdopodobne, że technikom ultrawirowania do izolacji EV będą towarzyszyć inne techniki, takie jak SEC i wychwytywanie powinowactwa immunologicznego przy użyciu tetraspanin CD9, CD63 i CD81 w celu poprawy czystości izolowanych EV. Inne techniki, takie jak dostępne na rynku roztwory opadowe i cytometria przepływowa, mogą być przydatne w określonych badaniach.

Czystość preparatów EV
Potwierdziliśmy izolację EV pochodzących z adipocytów metodą western blot dla TSG101, ale ta pojedyncza western blot nie spełnia wytycznych opublikowanych przez Międzynarodowe Towarzystwo Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych (ISEV). Dalsza charakterystyka tych EV pochodzących z adipocytów byłaby idealna przy użyciu tetraspanin CD9, CD63 i CD81 do identyfikacji egzosomów i markerów zanieczyszczenia komórkowego, takich jak histon H3, albumina i apolipoproteina A1.

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia izolację EV z supernatantów hodowli komórkowych z różnych źródeł komórkowych, w tym adipocytów, w celu określenia wielkości EV, stężenia, markerów EV za pomocą western blot i użyteczności w technologiach opartych na omice, takich jak proteomika i sekwencjonowanie RNA.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N.A. i R.C. dziękują za wsparcie grantami badawczymi British Heart Foundation, Centrum Doskonałości Badawczej, Oxford (N.A. i R.C.; RE/13/1/30181 i RE/18/3/34214), British Heart Foundation Project Grant (N.A. i R.C.; PG/18/53/33895), Trójstronne Konsorcjum Immunometabolizmu, Fundacja Novo Nordisk (NNF15CC0018486), Narodowy Instytut Badań nad Zdrowiem (NIHR), Oxford Biomedical Research Centre (BRC), Nuffield Benefaction for Medicine oraz Wellcome Institutional Strategic Support Fund (ISSF). Wyrażone poglądy są poglądami autora (autorów), a niekoniecznie poglądami NHS, NIHR lub Departamentu Zdrowia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 &mikro; m siatkaSefar03-250/50
15 mL Rurka stożkowaSarstedt62.554.002
250 µ m siatkaSefar03-100/44 
Probówka stożkowa 50 mlSarstedt62.547.004
Beckman Coulter, Optima MAX-XP UltrawirówkaBeckman Coulter393315
Test kwasu bicunchoninowego (BCA)Thermo Scientific23225
BiotynaSigmaB4639
BSA (zasadniczo bez kwasów tłuszczowych)SigmaA7030
Kolagenaza HSigma11074032001
DeksametazonSigmaD2915
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Szynka's Mieszanka składników odżywczych F12 SigmaD6421
Płodowa surowica bydlęcaLabtechFCS-SA
Czynnik wzrostu fibroblastówBio-Techne233-FB-025
GlutaminaThermoFisher25030024
Hanks zrównoważony roztwór soli SigmaH9394
Insulina ludzkaThermoFisher12585-014
Igły podskórne, Microlance 16GVWR613-3897
IBMXSigmaI7018
Analiza śledzenia nanocząstek, ZetaviewParticle Metrix  PODSTAWOWY PMX-120 
Zestaw NEFARandoxFA115
PantotenianSigmaP5710
Penicylina i StreptomycynaThermoFisher15140122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemThermoFisher Scientific10010056
PluriStrainer 200 µ mCambridge Bioscience43-50200-03
Poliallomer Quick-Seal ultra-przezroczyste rurki 16 mm i 76 mmBeckman Coulter342413
Strzykawki jednorazowe, 2-częściowe, Injekt SoloVWR20-2520
Linoleinian soduSigmaL8134
Oleinian soduSigmaO7501
PalmityniansoduSigmaP9767
Lutownica kolbowaZacro7.14954E+11
Filtr strzykawkowy 0,2 i mikro; m Sarstedt83.1826.001
Filtr strzykawkowy 0,45 &mikro; m TermoFisher195-2545
Kolby do hodowli tkankowych T175 cm2Sarstedt83.3912.002
Kolby do kultur tkankowych T25 cm2Sarstedt83.3910.002
Kolby do hodowli tkankowych T75 cm2Sarstedt83.3911.002
Transferyna SigmaT8158
Trijodo-L-tyroninaSigmaT5516
TroglitazonSigmaT2573
TrypLE ExpressEnzyme Fisher Scientific 
12604021

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Akbar, N., et al. Endothelium-derived extracellular vesicles promote splenic monocyte mobilization in myocardial infarction. JCI Insight. 2 (17), (2017).
  3. Xiao, Y., et al. Extracellular vesicles in type 2 diabetes mellitus: key roles in pathogenesis, complications, and therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1625677(2019).
  4. Akbar, N., Azzimato, V., Choudhury, R. P., Aouadi, M. Extracellular vesicles in metabolic disease. Diabetologia. 62 (12), 2179-2187 (2019).
  5. Kobayashi, Y., et al. Circulating extracellular vesicles are associated with lipid and insulin metabolism. The American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 574-582 (2018).
  6. Eguchi, A., et al. Circulating adipocyte-derived extracellular vesicles are novel markers of metabolic stress. Journal of Molecular Medicine. 94 (11), Berlin, Germany. 1241-1253 (2016).
  7. Crewe, C., et al. An Endothelial-to-adipocyte extracellular vesicle axis governed by metabolic state. Cell. 175 (3), 695-708 (2018).
  8. Flaherty, S. E., et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363 (6430), 989-993 (2019).
  9. Deng, Z. B., et al. Adipose tissue exosome-like vesicles mediate activation of macrophage-induced insulin resistance. Diabetes. 58 (11), 2498-2505 (2009).
  10. Kranendonk, M. E., et al. Human adipocyte extracellular vesicles in reciprocal signaling between adipocytes and macrophages. Obesity. 22 (5), Silver Spring. 1296-1308 (2014).
  11. Song, M., et al. Adipocyte-derived exosomes carrying sonic hedgehog mediate M1 macrophage polarization-induced insulin resistance via Ptch and PI3K pathways. Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (4), 1416-1432 (2018).
  12. Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
  13. Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e50974(2015).
  14. Connolly, K. D., et al. Evidence for adipocyte-derived extracellular vesicles in the human circulation. Endocrinology. 159 (9), 3259-3267 (2018).
  15. Camino, T., et al. Vesicles shed by pathological murine adipocytes spread pathology: characterization and functional role of insulin resistant/hypertrophied adiposomes. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2252(2020).
  16. Zhu, Y., et al. Extracellular vesicles derived from human adipose-derived stem cells promote the exogenous angiogenesis of fat grafts via the let-7/AGO1/VEGF signalling pathway. Scientific Reports. 10 (1), 5313(2020).
  17. Sadallah, S., Eken, C., Schifferli, J. A. Erythrocyte-derived ectosomes have immunosuppressive properties. Journal of Leukocyte Biology. 84 (5), 1316-1325 (2008).
  18. Sudnitsyna, J., et al. Microvesicle formation induced by oxidative stress in human erythrocytes. Antioxidants. 9 (10), Basel. (2020).
  19. Helal, O., et al. Increased levels of microparticles originating from endothelial cells, platelets and erythrocytes in subjects with metabolic syndrome: relationship with oxidative stress. Nutrition, Metabolism and Cardiovascular Diseases. 21 (9), 665-671 (2011).
  20. Agouni, A., et al. Endothelial dysfunction caused by circulating microparticles from patients with metabolic syndrome. The American Journal of Pathology. 173 (4), 1210-1219 (2008).
  21. Park, J., Park, J., Nahm, S. -S., Choi, I., Kim, J. Identification of anti-adipogenic proteins in adult bovine serum suppressing 3T3-L1 preadipocyte differentiation. BMB Reports. 46 (12), 582-587 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Adipocyte EVsExtracellular VesiclesFiltration UltracentrifugationNanoparticle Tracking AnalysisTSG101 ProteinTransmission Electron MicroscopyProteomics MetabolomicsSmall RNA SequencingFunctional StudiesCell Culture Media
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły